باستخدام كاتشو-2 خلايا لدراسة نقل الدهون من الأمعاء

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ويمكن إجراء دراسات من امتصاص الأمعاء للدهون الغذائية، وعقاقير الدهون القابلة للذوبان والفيتامينات في الجسم الحي باستخدام نموذج ناسور اللمف 1-4. ومع ذلك، فإن التقنيات الجراحية المعنية ليست صعبة فقط، ولكن مكلفة أيضا. على الرغم من أن في الجسم الحي النهج القائمة على يمكن استخدام تحليل البراز، وأنها تستخدم أساسا لتحديد امتصاص المئة بحلول الجهاز الهضمي 2،5. نموذج في المختبر وصفها في هذه الورقة هو أكثر فعالية من حيث التكلفة، والتقنيات المستخدمة ويمكن القول أقل تحديا. الدراسات تعديل الوراثية هي أيضا أكثر اقتصادا وأقل عندما يتم إجراؤها باستخدام هذا النموذج في المختبر تستغرق وقتا طويلا.

منذ يتم تعبئتها المواد الدهنية القابلة للذوبان التي يتم تناولها من قبل المعوية إلى البروتينات الدهنية 6،7، فإن فعالية هذا النموذج في المختبر لإنتاج البروتينات الدهنية هي الحاسمة. وintestina الرئيسيينالبروتينات الدهنية هي ل كيلومكرونات وجدا البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDL). كيلومكرونات، الذي يعرف بأنه البروتينات الدهنية مع 80 نانومتر أو أكثر في القطر، ويتم إنتاجها بدقة من قبل الأمعاء الدقيقة عند وجود بوفرة في التجويف المعدي المعوي الدهون. لأنها هي أكبر البروتينات الدهنية، كيلومكرونات هي تصور لنقل الدهون الأكثر فعالية. هذا النموذج في المختبر، والتي هي قادرة على انتاج كيلومكرونات ويمكن استخدامها لدراسة امتصاص الدهون الغذائية، الدهون القابلة للذوبان، فيتامين امتصاص الأمعاء، والفم للدهون التوافر البيولوجي المخدرات. وجود الدهون القابلة للذوبان، الجزيئات، والفيتامينات، أو المخدرات في جزء البروتين الدهني هو مؤشر على استيعابهم من قبل الأمعاء الدقيقة. كما نوقش سابقا، يمكن استخدام هذا النموذج لتحسين الشفوي للدهون التوافر البيولوجي المخدرات 6.

توضح هذه الورقة كيف ينبغي الحفاظ كاتشو-2 الخلايا في نفاذية الغشاء أو أطباق زراعة الأنسجة العادية، وكيفية ميل الدهونيجب أن تكون على استعداد xture لتحفيز إنتاج البروتين الدهني، وكيف يمكن استخدامها في نظام التعبير الفيروسة البطيئة لتحقيق overexpression فعال، وكيف ينبغي تحليل البروتينات الدهنية معزولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحفاظ على خلايا كاتشو-2

  1. باستخدام أطباق زراعة الأنسجة العادية
    1. ذوبان الجليد في كاتشو-2 الخلايا من قارورة المجمدة عن طريق وضع القارورة في 37 ° C حمام الماء، وعلى الفور إضافتها إلى صحن 10 سم زراعة الأنسجة التي تحتوي على 10 مل من قبل تحسنت وسائل الاعلام نمو (15٪ مصل بقري جنيني (FBS ) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM)).
      1. عندما وصلت إلى خلايا كاتشو-2 50-70٪ التقاء، تقسيمها 1: 6 التي يحتضنها الخلايا مع 3 مل من 0.05٪ التربسين / 0.53 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل انهم (15 دقيقة) . لتجنب تكتل الخلايا، مزيج خلايا عدة مرات من قبل pipetting لطيف. إضافة 0.5 مل من الخلايا trypsinized إلى صحن 10 سم زراعة الأنسجة التي تحتوي على 10 مل من وسائط النمو قبل تحسنت.
    2. يهز بلطف الأطباق عدة مرات في اتجاه الأمام والخلف تليها الاتجاه اليساري ونحو اليمين. تجنب يحوم الأطباقكما أنه قد يؤدي إلى تشتت خلية غير المتكافئ.
    3. وضع الأطباق على سطح مستو في حاضنة C 37 ° المتوفرة مع 5٪ CO 2. قد يؤدي أسطح مائلة أيضا في تشتت خلية غير المتكافئ.
    4. تغيير وسائط النمو بعد يوم من بدء الحضانة.
    5. رصد الخلايا وسجل يوم وصولها إلى نقطة التقاء. وسوف يستغرق حوالي 1 أسبوع للحصول على الخلايا للوصول إلى نقطة التقاء من اليوم منقسمون فيها.
    6. تغيير وسائط النمو مرتين في الأسبوع قبل الوصول إلى نقطة التقاء الخلايا. مرة واحدة قد وصلت إلى خلايا التقاء، تغيير وسائط النمو كل يوم. بعد الخلايا هي 7 أيام بعد متموجة، تغيير وسائط النمو يوميا.
      ملاحظة: الخلايا جاهزة للتجارب عندما تكون 13 يوما بعد انتهاء متموجة (الشكل 1). منذ الخلايا سوف تصبح في نهاية المطاف أقل فعالية في انتاج البروتينات الدهنية، استخدام الخلايا التي هي بين 13 إلى 17 يوما بعد متموجة 8. انتقل إلى الخطوة 3 على كيفية إجراء التجربة.
  2. باستخدام نظام نفاذية الغشاء
    1. البذور الخلايا كاتشو-2 في إدراج نفاذية الغشاء كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.1. أعلاه. تجنب استخدام الخلايا من قارورة المجمدة بسبب نمو الخلايا الخاصة بهم عادة أبطأ (فترة نقاهة). لفترة وجيزة، إضافة 0.5 مل من الخلايا trypsinized إلى غرفة قمي (المقصورة العليا) التي تحتوي على 10 مل من وسائط النمو قبل تحسنت. أيضا، إضافة 10 مل من وسائط النمو قبل تحسنت إلى غرفة basolateral (أقل المقصورة).
      ملاحظة: للحصول على أفضل الممارسات، إضافة سائط النمو إلى غرفة قمي أولا ثم إلى غرفة basolateral. عند إزالة وسائل الإعلام القديمة، وإزالة وسائل الإعلام basolateral أمام وسائل الإعلام قمي. تجنب بدس الغشاء البولي لأنها قد تمزق الغشاء.
    2. بسبب ضعف الرؤية الخلية من خلال الغشاء البولي، البذور الخلايا كاتشو-2 في صحن زراعة الأنسجة منتظم مع كثافة مماثلة، واستخدام هذا الطبق للحكم على التقاء الخلايا.
    3. اتبع الصورةteps 1.1.2-1.1.6 أعلاه.

2. الجينات Overexpression

  1. باستخدام نهج ترنسفكأيشن العادية
    1. البذور الخلايا كاتشو-2 على طبق زراعة الأنسجة كما هو موضح في 1.1.1.1.-1.1.4 أعلاه.
      ملاحظة: عندما الخلايا هي حوالي 40-50٪ متموجة، هم على استعداد ليكون transfected.
    2. إضافة 67 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى 472 ميكرولتر من وسائل الإعلام المصل انخفاض في أنبوب microcentrifuge. تجنب الاتصال من كاشف ترنسفكأيشن غير مخفف مع جدار الأنبوب.
    3. إضافة 23 ميكروغرام من pLL3.7 تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) 9 في ترنسفكأيشن الكاشف / انخفاض خليط سائل الاعلام المصل.
    4. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في RT.
    5. استبدال وسائط النمو الخلايا كاتشو-2 "مع 8 مل من 10٪ FBS في DMEM.
    6. يضاف خليط الحمض النووي / كاشف ترنسفكأيشن / خفضت وسائل الاعلام المصل الإفلات من الحكمة أن الطبق.
    7. يهز بلطف الأطباق عدة مرات في الأمام وتفلالاتجاه ckward تليها الاتجاه اليساري ونحو اليمين.
    8. وضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    9. استبدال وسائل الإعلام في الطبق مع 10 مل من وسائط النمو بعد يوم من بدء الحضانة.
    10. مراقبة التعبير الجيني.
      1. مراقبة التعبير الجيني دون 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) تلطيخ. باستخدام المجهر الفلورسنت، وتحديد النسبة المئوية للخلايا التي هي الخضراء. وتمثل نسبة كفاءة ترنسفكأيشن.
      2. مراقبة التعبير الجيني مع تلوين دابي.
        1. غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثلاث مرات.
        2. إصلاح الخلايا بإضافة 10 مل من 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة حضانة في RT).
        3. غسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
        4. احتضان الخلايا في الظلام لمدة 15 دقيقة في RT مع 8 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1: 500 دابي، 1٪ BSA، 0.01٪ ديجيتونين.
        5. غسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
        6. Uالغناء المجهر الفلورسنت، وتحديد عدد الخلايا التي هي خضراء / زرقاء بالنسبة إلى تلك التي هي الزرقاء (الشكل 2 لوحة أعلى). وتمثل النسبة المئوية محسوبة كفاءة ترنسفكأيشن.
  2. باستخدام نظام overexpression الفيروسة البطيئة 10
    1. بذور الكلى الجنينية (كلوة) الخلايا البشرية 293T في 15 سم صحن زراعة الأنسجة (10٪ FBS في DMEM وسائل الإعلام نموها).
      ملاحظة: عندما الخلايا هي حوالي 60-70٪ متموجة، هم على استعداد ليكون transfected.
    2. إضافة 162 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى 1133 ميكرولتر من وسائل الإعلام المصل انخفاض في أنبوب microcentrifuge 11. تجنب الاتصال من كاشف ترنسفكأيشن غير مخفف مع جدار الأنبوب.
    3. إضافة 24 ميكروغرام من pLL3.7 EGFP (أو بناء أخرى)، 15.6 ميكروغرام من عنصر استجابة القس (RRE)، و 6.0 ميكروغرام من REV، و 8.4 ميكروغرام من الحويصلي بروتين سكري فيروس التهاب الفم (VSVG) في ترنسفكأيشن الكاشف / صeduced خليط سائل الاعلام المصل.
    4. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في RT.
    5. استبدال وسائط النمو مع 16 مل من 10٪ FBS في DMEM.
    6. يضاف خليط الحمض النووي / كاشف ترنسفكأيشن / خفضت وسائل الاعلام المصل الإفلات من الحكمة أن الطبق.
    7. يهز بلطف الأطباق عدة مرات في اتجاه الأمام والخلف تليها الاتجاه اليساري ونحو اليمين. فمن الطبيعي أن نرى بعض الخلايا HEK293T فصل في هذه المرحلة.
    8. وضع الطبق في الحاضنة.
    9. بعد 24 ساعة من الحضانة، واستبدال وسائل الإعلام في الطبق مع 25 مل من وسائط النمو.
    10. في اليوم التالي، وجمع وسائط النمو التي تحتوي على الفيروسة البطيئة (المجموعة الأولى).
    11. كرر الخطوة 2.2.10 لجمع المزيد من الفيروسة البطيئة (المجموعة الثانية).
    12. تجمع جمع الأول والثاني، وإزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي (2500 x ج لمدة 5 دقائق).
    13. تصفية جمع مع مرشح المتاح زجاجة أعلى (0.45 ميكرون المسام)، وتركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي جمع في 31400 x ج لمدة 2 ساعة على RT (JA-20 الدوار). بمناسبة السفلي من أنبوب الطرد المركزي حيث يقع بيليه. صب طاف، وترك الأنبوب المقلوب في RT لمدة 15 دقيقة.
    14. resuspend الكرية التي تحتوي على الفيروس مع 100 ميكرولتر من 1X PBS. تجنب الفقاعات.
    15. تخزين الفيروس تتركز في -80 ° C. تجنب تجميد أذاب دورات.
    16. تحديد المبلغ الأمثل للفيروس اللازمة لتنبيغ الخلايا كاتشو-2 بواسطة المعايرة. لتوفير التكاليف، واستخدام لوحة 24-جيدا (0.3 مل من وسائط النمو / جيد) بدلا من صحن 10 سم زراعة الأنسجة لالمعايرة.
      1. إضافة كميات متزايدة من الفيروس المركزة (0، 1، 2، 5، 10، 25، و 50 ميكرولتر / جيد) تستكمل مع polybrene (نهائي تركيز = 5 ميكروغرام / مل) إلى متموجة 40-70٪ كاتشو-2 الخلايا. يهز لوحة 24-جيدا بلطف كما هو موضح في 1.1.2.
      2. مراقبة التعبير الجيني على (الخطوة 2.1.10.) (الشكل 2 أسفل4 لوحات).
    17. منذ تعبير عن التحوير هو مستمر بشكل عام، والحفاظ على خلايا transduced للتجارب في المستقبل، ورصد مستمر التعبير الجيني على (الخطوة 2.1.10).

3. تحفيز إفراز البروتين الدهني

  1. باستخدام صحن زراعة الأنسجة العادية
    1. تحضير خليط الدهن 100X عن طريق خلط 50 ملغ من حمض الأوليك، 40 ملغ من الليسيثين، و 48 ملغ من الصوديوم توروكولات. تحقيق وحدة التخزين إلى 900 ميكرولتر مع PBS (ما يكفي لمدة 8 أطباق). دوامة خليط الدهن بقوة.
    2. إضافة 900 ميكرولتر من خليط الدهن 100X إلى 89.1 مل من وسائط النمو. خلط، وتصفية وسائل الإعلام التي تحتوي على الدهون. تركيزات النهائية (1X) من حمض الأوليك، ليستين، وتوروكولات الصوديوم هي 2.0 ملم، 1.36 ملم، و 1.0 ملم على التوالي.
    3. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على الدهون إلى الخلايا.
    4. احتضان الخلايا مع وسائل الإعلام التي تحتوي على الدهون لمدة 4 ساعة في 37° C الحاضنة.
    5. غسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
    6. إضافة 10 مل من وسائط النمو للخلايا لجمع إفراز البروتين الدهني.
    7. احتضان لمدة 2 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    8. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على البروتين الدهني.
  2. باستخدام نظام نفاذية الغشاء
    1. اتبع الخطوات 3.1.1-3.1.2 لإعداد خليط الدهن.
    2. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على الدهون إلى غرفة قمي و 10 مل من وسائط النمو إلى غرفة basolateral.
    3. احتضان لمدة 4 ساعات في الحاضنة 37 درجة مئوية. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على البروتين الدهني في غرفة basolateral.

4. البروتين الدهني عزل (الشكل 3)

  1. إزالة الحطام خلية من وسائل الإعلام التي تحتوي على البروتين الدهني بواسطة الطرد المركزي (2000 x ج لمدة 5 دقائق).
  2. صب سائل الإعلام في أنبوب 50 مل.
  3. إضافة 5.95 غرام من كلوريد الصوديوم إلى وسائل الإعلام.
  4. إذا كان ساوسيتم تحليل mple من قبل TEM، إضافة 1 البروتيني قرص المانع كوكتيل للحفاظ على سلامة البروتينات الدهنية.
  5. تبرزي حجم 23 مل مع الماء (1.2 غرام / مل كلوريد الصوديوم حل الكثافة).
  6. حل المذابة تماما.
  7. صب كل من الحل في أنبوب البولي نابذة فائقة السرعة.
  8. تراكب بلطف الحل كثافة 1.2 جرام / مل مع 0.5 مل من الماء (1.0 غرام / مل الكثافة).
  9. تحقيق التوازن في أنبوب من حيث الوزن وليس من حيث الحجم.
  10. تحميل بلطف الأنابيب في الدوار T865.
  11. تدور العينات في نابذة فائقة السرعة في 429460 x ج لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
  12. عزل فورا الأعلى 0.5 مل من محلول من قبل pipetting لطيف. الحفاظ على أنبوب كما لا تزال ممكن.

5. تحليل TEM

  1. إعداد 5 مل من حمض الفسفوتنغستيك 2٪ (ث / ت) وضبط درجة الحموضة إلى 6.0.
  2. تصفية حمض الفسفوتنغستيك 2٪ مع فلتر حقنة (حجم المسام: 0.2 ميكرون).
  3. إسقاط 20 ميكرولتر من العينة البروتين الدهني على طبق العقيمة.
  4. إسقاط 20 ميكرولتر من تصفيتها حمض الفسفوتنغستيك 2٪ إلى جانب عينة على نفس الطبق.
  5. إسقاط بلطف على شبكة EM مع الجانب مملة يستريح على العينة.
  6. في احتضان RT لمدة 1 دقيقة.
  7. اضغط برفق على جانب الشبكة EM على ورق الترشيح لإزالة عينة من الشبكة.
  8. إسقاط بلطف الشبكة EM مع الجانب مملة يستريح على حمض الفسفوتنغستيك 2٪.
  9. في احتضان RT لمدة 1 دقيقة.
  10. اضغط برفق على جانب الشبكة EM على ورق الترشيح لإزالة حمض الفسفوتنغستيك من الشبكة.
  11. باستخدام TEM، والتقاط الصور من البروتينات الدهنية (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 يعرض العادية 13 يوما بعد متموجة-كاتشو-2 الخلايا. ظهور هياكل على شكل قبة وقطرات الدهون داخل الخلايا هي سمة من يفرق كاتشو-2 الخلايا. عندما لا تفرق الخلايا كاتشو-2 على حد سواء خلال البذر، فإنها تتجمع وكسا الأرض في مناطق معينة من الطبق. وسيكون هناك عدد قليل من المناطق في الطبق دون أي الخلايا. دوامات ووضع الطبق على سطح مائل ينبغي تجنبها. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن بعد متموجة-كاتشو-2 الخلايا هي أكثر عرضة للانفصال عند إضافة وسائط النمو الجديد على الخلايا تقريبا أيضا. لذلك، يجب إضافة وسائل الإعلام الجديدة بلطف لمنع انفصال الخلية.

وبناء على هذه الدراسات، وكانت كفاءة ترنسفكأيشن من كاتشو-2 الخلايا بين 30-60٪ (الشكل 2 أعلى ألواح). في المقابل، كانت كفاءة تنبيغ كاتشو-2 باستخدام نظام التعبير الفيروسة البطيئة ما يقرب من 100٪ (الشكل 2 الشكل 2 أيضا أن المبلغ الأمثل للالفيروسة البطيئة المركزة كان 10 ميكرولتر. تم الحفاظ على transduced كاتشو-2 خلايا تصل إلى 12 الممرات. كما هو مبين، حتى بعد 12 الممرات الخلايا transduced لا يزال أعرب EGFP. يعتمد على كفاءة تنبيغ بوضوح على تركيز الفيروسة البطيئة. تأكيد كفاءة ترنسفكأيشن / تنبيغ أمر بالغ الأهمية، ويجب أن يتم تنفيذ بمثابة تحليل أولي الروتيني قبل التجارب الفعلية. على الرغم من تحليل لطخة غربية يمكن استخدامها لتقدير الزيادة في المئة من التعبير الجيني، فإنه لا ينبغي أن يكون الوسيلة الرئيسية لتحديد كفاءة ترنسفكأيشن / تنبيغ.

باستخدام كلوريد الصوديوم كثافة التدرج طريقة تنبيذ فائق (الشكل 3)، وكانت البروتينات الدهنية التي يفرزها خلايا كاتشو-2 معزولة وتحليلها على TEM. بعض كيلومكرونات، البروتينات الدهنية أكبر من 80 نانومتر في القطر، وصورت في الشكلكانت حاضرة أيضا 4، والبروتينات الدهنية الصغيرة، VLDLs. لا بد من تأكيد العزلة الناجحة لكلا كيلومكرونات وVLDLs على TEM. كما نوقش سابقا يجب تحليل الكيمياء الحيوية لا تكون الوسيلة الرئيسية لتأكيد. غياب البروتينات الدهنية، وتحديدا كيلومكرونات، يشير إلى أن نقل الدهون من الخلايا كاتشو-2 ليست فعالة. وبالتالي، فإنها لن تكون بمثابة نموذج جيد لدراسة نقل الدهون. عدد الجسيمات الكيلومكرونات نسبة إلى العدد الكلي للجزيئات البروتين الدهني يمكن الاعتماد 8. وهناك نسبة عالية تشير نقل الدهون بكفاءة.

الشكل 1
الشكل 1. صورة مجهرية التمثيلية لل13 يوما بعد متموجة-كاتشو-2 الخلايا. جواني قطرات الدهون واضحة في بعض الخلايا (السهم الأحمر). هياكل على شكل قبة فريدة من نوعها (السهم الأسود) FOrmed من قبل بعض كاتشو-2 خلايا موجودة عادة إلا بعد الخلايا قد وصلت التقاء. التكبير = 100X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. مقارنة بين فعالية ترنسفكأيشن الدهون على أساس ونظام التعبير الفيروسة البطيئة لوحة أعلى: و transfected كاتشو-2 الخلايا مع pLL3.7 EGFP باستخدام كاشف ترنسفكأيشن غير liposomal (مقياس بار = 20 ميكرون). أسفل 4 لوحات: تم transduced كاتشو-2 الخلايا مع pLL3.7 EGFP باستخدام نظام التعبير الفيروسة البطيئة مع كميات متفاوتة (1، 2، 5، أو 10 ميكرولتر) من الفيروسة البطيئة المركزة (LV). وكانت الخلايا التي يتم عرضها من مرور 12 عشر من الخلايا transduced الأصلية. تظهر لوحات اليسار تلطيخ دابي، السلطة الفلسطينية المتوسطةتظهر NELS مضان GFP، وتظهر لوحات اليمين الصور المدمجة. كان نظام التعبير الفيروسة البطيئة من الواضح أكثر فعالية من ترنسفكأيشن الدهون على أساس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3. عزل البروتينات الدهنية المعوية باستخدام كلوريد الصوديوم كثافة التدرج تنبيذ فائق. يتم ضبط كثافة وسائل الإعلام التي تحتوي على البروتين الدهني إلى 1.2 جم / مل عن طريق إضافة كمية مناسبة من كلوريد الصوديوم. يحتاج حجم العينة أيضا إلى تعديل بحيث أنه سيتم ملء الأنبوب نابذة فائقة السرعة بأكمله لمنع الانهيار. لتحقيق التدرج الكثافة، 0.5 مل من الماء وغطى بلطف على جم / مل من محلول كثافة 1.2. ثم يتم نسج عينة في 429460 x ج لمدة 24 ساعة باستخدام T865الدوار (أي ما يعادل 2.15 الوحدات سفيدبرغ). والبروتينات الدهنية المعوية يجب استردادها على الفور من قبل pipetting لطيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. مجهرية الإلكترون التمثيلية للالبروتينات الدهنية التي تنتجها الخلايا كاتشو-2، والبروتينات الدهنية التي عزلها كلوريد الصوديوم كثافة التدرج تنبيذ فائق كانت ملطخة سلبا مع حمض الفسفوتنغستيك 2٪ (6.0 درجة الحموضة). كيلومكرونات، جزيئات الدهون أكبر من 80 نانومتر في القطر، وVLDLs، تلك نانومتر أصغر من 80، على حد سواء الحالي. مقياس شريط = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة، والنظامين التي يمكن استخدامها للحفاظ على موصوفة كاتشو-2 الخلايا، وهي طبق زراعة الأنسجة العادية ونفاذية الغشاء. وتشمل مزايا استخدام نظام نفاذية الغشاء فصل قمي والمقصورات basolateral، والقدرة على احتضان خليط الدهن وجمع إفراز البروتين الدهني في وقت واحد. ومع ذلك، فإن إدراج غشاء نفاذية غالية الثمن، والغشاء البولي بهم لا تسمح لرؤية الخلية جيد. واحدة من مزايا هذا النموذج في المختبر هو أن الدراسات الوراثية التلاعب سيكون أكثر اقتصادا وأقل استهلاكا للوقت. لفعالية أفضل، ينبغي استخدام نظام التعبير الفيروسة البطيئة. وtransduced كاتشو-2 خلايا حفاظ عموما التعبير عن التحوير بهم.

قدرة كاتشو-2 إلى الخلايا لإنتاج كيلومكرونات هو أمر بالغ الأهمية. بدون هذه القدرة، فإن كاتشو-2 الخلايا لا تكون قادرة على efficiently نقل المواد محبة للدهون، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على المخدرات liphophilic، فيتامين A، D، E، K و، وأي المغذيات الدهون القابلة للذوبان. الطرق الصحيحة للطعن كاتشو-2 إلى الخلايا لإنتاج وصفت كل من الجسيمات VLDL وكيلومكرونات. وينبغي تأكيد العزلة الناجحة لهذه الجسيمات البروتين الدهني على TEM. استنادا إلى الأدب الحالي، وهذا النموذج كاتشو-2 يقدم نقل الدهون الأكثر كفاءة بين أخرى كاتشو-2 نماذج 12-14. ومع ذلك، فإن في الجسم الحي الليمفاوية نموذج إقناء؛ إدخال القنية لا يزال ينقل الدهون بشكل أكثر كفاءة من أي نموذج في المختبر. تم الأسباب الكامنة وراء ناقشت مؤخرا وهي لكاتشو-2 الخلايا تنتج 2 إيسفورمس مختلفة من ئي B، كاتشو-2 الخلايا لا يمكن توليف الدهون الثلاثية من أحادي الجلسريد، والمكون المصل حاسم لالكيلومكرونات نشوء حيوي قد يكون أقل في وسائل الإعلام نمو . ومن المهم أيضا أن ندرك حدود هذه فينموذج المختبر. ويستبعد هذا النموذج في المختبر بعض العوامل الهامة المحتملة، مثل الحركة القناة الهضمية، وعلم التشريح للامعاء، والتفاعل مع أجهزة الجسم الأخرى.

العوامل الرئيسية التي تسمح كاتشو-2 الخلايا لإنتاج كيلومكرونات هي كفاءة نوع / كمية الدهون المستخدمة والتمايز الخلوي 8. بدون التوليفة المناسبة من هذه العوامل، سوف كاتشو-2 الخلايا لا تنتج عددا كبيرا من كيلومكرونات 8. من المذكرة، يجب أن يتم تنفيذ كلوريد الصوديوم كثافة التدرج تنبيذ فائق بشكل صحيح. العزلة الناجحة من البروتينات الدهنية تعتمد على توقيت (فوري دون تأخير كبير)، التعامل مع عينة جيدة (قوي من دون الكثير من الإثارة)، وpipetting لدقيق (فقط الحصول على الطبقة العليا). الأسلوب السليم يمكن أن تمارس باستخدام الدهون ملطخة مسبقا للمساعدة في تصور طبقة البروتين الدهني 8. إلى جانب TEM، والتحليلات الكيميائية الحيوية، أي ئي B والدهون الثلاثية ويحلل، ويمكن أيضا أن يكون شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لتأكيد العزلة الناجحة من البروتينات الدهنية. هذه التحليلات الكيميائية الحيوية، وهو ما قد ذكرت في وقت سابق ويمكن أيضا أن تكون بمثابة الأساليب في قياس الامتصاص. ومع ذلك، لا يزال ينبغي أن يؤديها تيم نظرا لميل البروتينات الدهنية لتجميع مما تسبب في وجود مبالغة المحتمل لإنتاج الكيلومكرونات.

هذا النموذج في المختبر هو مفيد بشكل خاص لدراسة امتصاص الدهون الغذائية وامتصاص الأمعاء للمخدرات محبة للدهون، فيتامينات، وغيرها من المغذيات الدهون القابلة للذوبان. ويمكن أيضا أن تكون بمثابة نموذج لتحسين التوافر البيولوجي الفقراء المخدرات محبة للدهون عن طريق الفم. منذ يتم تعبئتها المواد الدهنية القابلة للذوبان في كيلومكرونات التي كتبها المعوية لنقلها إلى الدورة الدموية، وكاتشو-2 الخلايا المنتجة للالكيلومكرونات تكون أكثر كفاءة في امتصاص الأدوية محبة للدهون. بالإضافة إلى ذلك، هذا النموذج يسمح للمحققين لتحديد دور جين معين في امتصاص الدواء من الأمعاء (الدوائي). كما أنه يسمح فيvestigators للمقارنة بين تأثير مختلف الدهون الغذائية على طريق الفم للدهون التوافر البيولوجي المخدرات. وكانت كل من هذه التطبيقات التي نوقشت سابقا 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115, (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131, (4), 1197-1207 (2006).
  3. Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, (4), G583-G587 (2003).
  4. Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, (1), G344-G352 (2008).
  5. Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127, (1), 139-144 (2004).
  6. Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8, (3), 247-255 (2013).
  7. Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32, (Pt 1), 75-78 (2004).
  8. Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2, (6), (2014).
  9. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33, (3), 401-406 (2003).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  11. Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4, (5), 921-930 (2013).
  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21, (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439, (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274, (28), 19565-19572 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics