腸によって脂質輸送を研究するためのCaco-2細胞を用いました

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University
Biology

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Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

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Abstract

Introduction

4 -食事脂肪の腸管吸収に関する研究、および脂溶性薬物とビタミンは、リンパ瘻モデル1を用いて、in vivoで行うことができます。しかし、関連する外科技術は、困難でなく、高価なだけでなく、です。糞便分析に基づいて、in vivoでのアプローチを利用することができるが、それらは、胃腸管2,5パーセントの取り込みを決定するために主に使用されています。この論文に記載のin vitroモデルは、よりコスト効果的であり、関係する技術は、おそらくあまり挑 ​​戦しています。遺伝的修飾研究は、時間がかかり、それらは、このin vitroモデルを使用して行われる場合に、より経済的かつ少ないです。

腸細胞によって取り込まれる脂溶性物質は、リポタンパク質6,7にパッケージ化されているので、リポタンパク質を生成するために、このin vitroモデルの有効性が重要です。二つの主要なintestinaLのリポタンパク質は、カイロミクロン及び超低密度リポタンパク質(VLDL)です。脂質は、胃腸内腔に豊富に存在する場合、直径が80nm以上とリポタンパク質として定義されるキロミクロンは、小腸により厳密に製造されています。彼らは最大のリポタンパク質であるため、カイロミクロンは考えられる最も効率的な脂質トランスポーターです。カイロミクロン8を生成することができる。このインビトロモデルは、食事の脂肪吸収、消化管による脂溶性ビタミンの吸収、および親油性薬物の経口バイオアベイラビリティを研究するために使用することができます。リポタンパク質画分中の脂溶性分子、ビタミン、または薬物の存在は、小腸によるその吸収の指標です。前述のように、このモデルは、経口バイオアベイラビリティ、親油性薬剤6を改善するために使用することができます。

本稿では、Caco-2細胞はどのように脂質マイル、透過膜または通常の組織培養皿で維持されるべきである方法を説明しますリポタンパク質の産生を刺激するための固定装置は、レンチウイルス発現系は、効果的な過剰発現を達成するために使用する方法、調製方法、および単離されたリポタンパク質を分析するべきであるべきです。

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Protocol

のCaco-2細胞の1メンテナンス

  1. 正規の組織培養皿を用いて、
    1. 37℃の水浴中にバイアルを配置することによって、凍結バイアルからのCaco-2細胞を解凍し、直ちに予め温めた増殖培地(15%ウシ胎児血清(FBS、10 mlを含む10cmの組織培養皿に追加))ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で。
      1. (15分間)、それらが分離されるまで、37℃で0.05%3mlのトリプシン/ 0.53 mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で細胞をインキュベートすることにより、6:たCaco-2細胞は、50〜70%コンフルエンスに達したときに、それらを1分割。細胞凝集を回避するために、穏やかなピペッティングにより細胞を数回混ぜます。予熱した増殖培地10 mlを入れた10cmの組織培養皿にトリプシン処理した細胞を0.5mlを加えます。
    2. 静かに左右方向に続く前後方向に皿を数回振ります。料理を旋回しないでくださいように、不等細胞分散をもたらすことができます。
    3. 5%CO 2を供給し、37℃のインキュベーターで平らな面に皿を置きます。傾斜面は、また、不等細胞分散をもたらすことができます。
    4. インキュベーションを開始した後、増殖培地1日を変更します。
    5. 細胞を監視し、それらがコンフルエンスに達する日を記録。細胞は、それらが分割された日から合流点に到達するのは約1週間かかります。
    6. 細胞がコンフルエンスに到達する前に週に二度、増殖培地を変更します。細胞がコンフルエンスに達した後は、一日おきに成長培地を変更します。細胞は、7日後にコンフルエントになったら、毎日の成長培地を変更します。
      注:彼らは13日後コンフルエント( 図1)である場合、細胞が実験のための準備ができています。細胞は、最終的にリポタンパク質の生産にあまり有効になりますので、8コンフルエント後の13から17日間の間にあるセルを使用。実験を行う方法については、手順3に進みます。
  2. 透過膜システムを使用して
    1. ステップ1.1.1.1で説明したように、透過膜インサートでのCaco-2細胞を播種します。上記。その細胞増殖が(回復期)通常遅いため凍結バイアルから細胞を使用しないでください。簡単に説明すると、予め温めた増殖培地の10ミリリットルが含まれている頂端チャンバー(上部コンパートメント)にトリプシン処理した細胞の0.5ミリリットルを追加します。また、基底外側室(下部コンパートメント)に予熱した増殖培地の10ミリリットルを追加します。
      注:ベストプラクティスについては、側底チャンバーに最初にして頂端チャンバーに増殖培地を追加します。古いメディアを取り外すときは、頂端メディアの前に側底メディアを削除します。それが膜を破裂としてポリカーボネート膜を突っついは避けてください。
    2. によるポリカーボネート膜を介して、悪い細胞の可視性のために、同様の密度との定期的な組織培養皿中のCaco-2細胞を播種すると、細胞コンフルエンスを判断するためにこの料理を使用しています。
    3. のフォローTEPS上記1.1.2-1.1.6。

2.遺伝子の過剰発現

  1. 定期的なトランスフェクション法を用いて、
    1. 1.1.1.1.-1.1.4上記で説明したように組織培養皿上でのCaco-2細胞をシード。
      注:細胞が約40〜50%コンフルエントである場合、それらは、トランスフェクトされる準備ができています。
    2. マイクロチューブ中の還元血清培地の472μlにトランスフェクション試薬の67μlを添加します。管壁と希釈されていないトランスフェクション試薬との接触を避けてください。
    3. pLL3.7の23μgのトランスフェクション試薬/低血清培地混合物に緑色蛍光タンパク質(EGFP)9を強化加えます。
    4. RTで20分間混合物をインキュベートします。
    5. DMEM、10%FBSの8ミリリットルでのCaco-2細胞の増殖培地を交換してください。
    6. 滴下皿にDNA /トランスフェクション試薬/縮小血清培地の混合物を追加します。
    7. 軽く前方およびBaで料理を数回振ります左右方向に続くckward方向。
    8. 37℃のインキュベーターで皿を置きます。
    9. 成長培地10mlのインキュベーションを開始した後の日と皿の中でメディアを交換してください。
    10. 遺伝子発現を監視します。
      1. 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色することなく、遺伝子発現をモニターします。蛍光顕微鏡を使用して、緑である細胞の割合を決定します。パーセンテージは、トランスフェクション効率を表します。
      2. DAPI染色と遺伝子発現を監視します。
        1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回細胞を洗浄します。
        2. PBS中の4%ホルムアルデヒド(室温で10分間のインキュベーション)を10mlを加えることにより細胞を固定します。
        3. PBSで細胞を3回洗浄します。
        4. 500 DAPI、1%BSA、0.01%ジギトニン:1を含む8mlのPBSで室温で15分間、暗所で細胞をインキュベートします。
        5. PBSで細胞を3回洗浄します。
        6. U蛍光顕微鏡を歌う、青色であるものに緑/青の相対的な( 図2上部パネル)である細胞の数を決定します。計算された割合は、トランスフェクション効率を表します。
  2. レンチウイルス過剰発現システム10を使用して
    1. 15cmの組織培養皿(それらの増殖培地としてDMEM中10%FBS)中に種子ヒト胚腎臓(HEK)293T細胞。
      注:細胞が60〜70%コンフルエントである場合、それらは、トランスフェクトされる準備ができています。
    2. マイクロチューブ11に減少血清培地の1,133μlにトランスフェクション試薬の162μlを添加します。管壁と希釈されていないトランスフェクション試薬との接触を避けてください。
    3. トランスフェクション試薬/ RにpLL3.7のeGFP(または他の構造物)、のRev応答エレメント(RRE)の15.6μgの、REVの6.0μgの、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVG)の8.4μgの24μgのを追加します。析出血清培地混合物。
    4. RTで20分間混合物をインキュベートします。
    5. DMEM、10%FBSを16 mlの増殖培地を交換してください。
    6. 滴下皿にDNA /トランスフェクション試薬/縮小血清培地の混合物を追加します。
    7. 静かに左右方向に続く前後方向に皿を数回振ります。それは、この時点で剥離しHEK293T細胞のいくつかを見るために、通常です。
    8. インキュベーターで皿を置きます。
    9. インキュベーションの24時間後、増殖培地を25 mlの皿の中でメディアを交換してください。
    10. 翌日、レンチウイルス(最初のコレクション)を含む増殖培地を収集します。
    11. より多くのレンチウイルス(第2集)を収集するための手順を繰り返し2.2.10。
    12. (5分間、2,500×gで)第一および第二の収集をプールし、遠心分離により細胞破片を除去。
    13. 使い捨てボトルトップフィルター(0.45μmの孔)を持つコレクションをフィルタリングし、RT(JA-20ローター)で2時間31,400×gでコレクションを遠心分離することにより、ウイルスを濃縮します。ペレットが配置されている遠心分離管の底部をマーク。上清を除去し、約15分間室温で反転チューブを残します。
    14. 1×PBS100μlのウイルス含有ペレットを再懸濁します。泡を避けます。
    15. -80℃で濃縮したウイルスを保管してください。凍結融解の繰り返しは避けてください。
    16. 滴定によってのCaco-2細胞を形質導入するために必要なウイルスの最適量を決定します。コストを節約するために、代わりに滴定のための10cmの組織培養皿の(増殖培地/ウェルの0.3ミリリットル)を24ウェルプレートを使用しています。
      1. 濃縮したウイルスの増加量を加える(0、1、2、5、10、25、50μL/ウェル)を40%〜70%コンフルエントのCaco-2細胞へのポリブレン(最終濃度=5μg/ mlの)を補充しました。 1.1.2で説明したように静かに24ウェルプレートを振ります。
      2. それらの遺伝子発現(ステップ2.1.10。)( 図2下のを監視4パネル)。
    17. 導入遺伝子の発現は、一般的に維持されるので、将来の実験のために形質導入​​された細胞を維持し、継続的な遺伝子発現(ステップ2.1.10。)を監視します。

3.リポタンパク質分泌を刺激

  1. 定期的な組織培養ディッシュを使用して
    1. オレイン酸、レシチン40 mg及びタウロコール酸ナトリウム48mgの50mgを混合することにより、100Xの脂質混合物を準備します。 (8皿のための十分な)PBSで900μlにボリュームをもたらします。勢いよく脂質混合物をボルテックスし。
    2. 増殖培地の89.1ミリリットルに100Xの脂質混合物の900μlを添加します。混合し、脂質含有培地をフィルタリングします。オレイン酸、レシチン、およびタウロコール酸ナトリウムの最終濃度(1×)は、それぞれ2.0ミリメートル、1.36ミリメートル、および1.0 mMです。
    3. 細胞への脂質含有培地10mlのを追加します。
    4. 37で4時間脂質含有培地で細胞を培養しますCのインキュベーターを°。
    5. PBSで細胞を3回洗浄します。
    6. リポタンパク質の分泌を収集するために、細胞を増殖培地を10mlを加えます。
    7. 37℃のインキュベーターで2時間インキュベートします。
    8. リポ蛋白質含有培地を収集します。
  2. 透過膜システムを使用して
    1. 手順に従ってください3.1.1-3.1.2脂質混合物を調製しました。
    2. 頂端チャンバへの脂質含有培地10ml及び側底チャンバへの成長培地10mlのを追加します。
    3. 37℃のインキュベーター内で4時間インキュベートします。基底外側チャンバ内にリポ蛋白質含有培地を収集します。

4.リポタンパク質の分離(図3)

  1. 遠心分離(5分間2,000×gで)によってリポタンパク質含有培地から細胞破片を除去。
  2. 50mlのチューブにメディアをデカントします。
  3. メディアへの塩化ナトリウムの5.95グラムを追加します。
  4. SAの場合mpleはリポタンパク質の完全性を維持するために1プロテアーゼインヒビターカクテル錠を追加、TEMによって分析されます。
  5. 水で23ミリリットル(1.2グラム/ mlの濃度のNaCl溶液)にボリュームをもたらします。
  6. 完全に溶質を溶解させます。
  7. ポリカーボネート超遠心管にソリューションのすべてをデカント。
  8. ゆっくり水0.5ml(1.0グラム/ mlの濃度)と1.2グラム/ mlの濃度の溶液を重ねます。
  9. 体積重量ではなく、チューブのバランスをとります。
  10. ゆっくりT865ローターにチューブをロードします。
  11. 4℃で24時間、429460×gで超遠心機でサンプルをスピン。
  12. すぐに穏やかにピペッティングすることによって、トップ0.5ミリリットルの溶液を分離します。できるだけまだチューブを保管してください。

5. TEM分析

  1. 2%リンタングステン酸の5ミリリットル(V / W)を準備し、pHを6.0に調整します。
  2. シリンジフィルター(0.2μmの孔サイズ)で2%リンタングステン酸をフィルタリングします。
  3. 無菌皿にリポタンパク質サンプルの20μlのを削除します。
  4. 同じ皿に次のサンプルを濾過し、2%リンタングステン酸20μlのを削除します。
  5. ゆっくり鈍い側が試料上に載っているとEMグリッドをドロップします。
  6. 1分間室温でインキュベートします。
  7. ゆっくりグリッドからサンプルを除去するために、濾紙上のEMグリッドの側をタップします。
  8. ゆっくり鈍い側は2%リンタングステン酸で休んでEMグリッドをドロップします。
  9. 1分間室温でインキュベートします。
  10. ゆっくりグリッドからリン酸を除去し、濾紙上のEMグリッドの側をタップします。
  11. TEMを使用して、リポタンパク質( 図4)の画像を取り込みます。

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Representative Results

13日間コンフルエント後のCaco-2細胞1が表示され、正常な。ドーム状構造体の外観および細胞内脂質小滴は、分化したCaco-2細胞の特徴です。のCaco-2細胞を播種時に均等に分散されていないときは、皿の特定の領域に凝集し、過増殖う。任意の細胞を含まない皿の中のいくつかの領域が存在することになります。旋回および傾斜面に皿を置くことは避けるべきです。これは、新たな増殖培地は、あまりにおおよそ細胞に添加されたときに後コンフルエントのCaco-2細胞は、剥離を受けやすいことに注意することも重要です。そのため、新しいメディアは細胞の剥離を防止するために、穏やかに追加する必要があります。

これらの研究に基づいて、のCaco-2細胞のトランスフェクション効率は、30%〜60%( 図2上パネル)の間でした。対照的に、レンチウイルス発現系を用いたCaco-2の形質導入効率は約100%であった( 図2 、図2は、濃縮されたレンチウイルスの最適量は10μlであったことを示しました。形質導入されたCaco-2細胞は、12継代まで維持しました。図に示すように、でも12継代後、形質導入した細胞は、まだのeGFPを発現しました。形質導入効率は、明らかに、レンチウイルス濃度に依存します。トランスフェクション/形質導入効率の確認は重要であり、実際の実験の前に、ルーチンの予備的分析として実行する必要があります。ウェスタンブロット分析は、遺伝子発現の増加率を推定するために使用することができるが、それはトランスフェクション/形質導入効率を決定する主な方法であってはなりません。

NaClの濃度勾配超遠心分離法( 図3)を使用して、のCaco-2細胞によって分泌されるリポタンパク質を単離し、TEMで分析しました。カイロミクロンのいくつかは、直径がより大きく80nm以下のリポタンパク質、 に示されました4。小さいリポタンパク質、VLDLsは、も存在しました。これは、TEMの両方のカイロミクロンとVLDLsの成功の分離を確認することが不可欠です。以前8を議論したように、生化学分析、確認の主要な方法ではありません。リポタンパク質の非存在は、特にカイロミクロン、のCaco-2細胞による脂質輸送が効率的でないことを示しています。その結果、彼らは脂質輸送を研究するための優れたモデルとして役立つことはありません。リポタンパク質粒子の総数に対するカイロミクロン粒子の数が8をカウントすることができます。高い割合は、効率的な脂質輸送を示しています。

図1
13日後、コンフルエントのCaco-2細胞の図1.代表的な顕微鏡写真。細胞内脂肪滴は、いくつかの細胞(赤矢印)で表示されます。ユニークなドーム状構造体(黒矢印)FOいくつかのCaco-2細胞によってrmed細胞がコンフルエンスに達した後にのみ存在します。倍率= 100倍。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
図脂質ベースのトランスフェクションの有効性およびレンチウイルス発現系の2比較上部パネルたCaco-2細胞を、非リポソームトランスフェクション試薬(スケールバー= 20μm)を用いて、pLL3.7 eGFPをトランスフェクトしました。ボトムパネル4:たCaco-2細胞を濃縮レンチウイルス(LV)の様々な量(1、2、5、または10μl)を有するレンチウイルス発現系を用いたpLL3.7 eGFPを形質導入しました。表示されたセルは、元の形質導入細胞の12 番目の通路からのものでした。左パネルは、DAPI染色を示し、中央のPAネルは、GFP蛍光を示し、右パネルは、マージされた画像を示します。レンチウイルス発現系は明らかに脂質ベースのトランスフェクションよりも効果的であった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
NaClの濃度勾配超遠心分離を使用して腸のリポタンパク質の図3単離リポタンパク質を含有する培地の濃度をNaClの適当な量を添加することによって1.2グラム/ mlに調整されます。それが崩壊を防ぐために全体超遠心管を充填するように試料の量も調整する必要があります。密度勾配を達成するために、水0.5ml、1.2グラム/ mlの濃度の溶液に静かに重ねられます。次いで、試料をT865を用いて24時間429460×gで回転させローター(2.15スベドベリ単位に相当)。腸のリポタンパク質は、すぐに穏やかにピペッティングすることによって回収されるべきである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4
のCaco-2細胞によって産生されるリポタンパク質の、図4の代表的な電子顕微鏡写真。NaClの密度勾配超遠心分離によって単離されたリポタンパク質は、負の2%リンタングステン酸(pH6.0)で染色しました。カイロミクロン、80直径がナノメートル、およびVLDLsより大きな脂質粒子、80ナノメートル未満のものは、両方が存在します。スケールバー= 100 nmの。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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Discussion

この論文では、使用できる2つのシステムは、Caco-2細胞は、すな​​わち、正規の組織培養皿や透過膜に記載されている維持します。透過膜システムを使用する利点は、頂端の分離および基底外側コンパートメント、および脂質混合物をインキュベートし、同時にリポタンパク質分泌を収集する能力を含みます。しかし、透過膜インサートは高価であり、それらのポリカーボネート膜は、良好な細胞の可視性を可能にしません。このin vitroモデルの利点の1つは、遺伝子操作の研究は、より経済的かつ時間のかかる少なくなるということです。より良い効果のために、レンチウイルス発現系を使用する必要があります。形質導入したCaco-2細胞は、一般に、それらの導入遺伝子の発現を維持します。

カイロミクロンを生成するためのCaco-2細胞の能力が最も重要です。この能力がなければ、のCaco-2細胞はefficieすることができませんntly親油性薬物、ビタミンA、D、E、およびK、ならびに任意の脂溶性栄養素を含むがこれらに限定されない、親油性材料を運びます。適切な方法は、VLDL粒子とカイロミクロンの両方が記載されて生成するためのCaco-2細胞に挑戦します。これらのリポタンパク質粒子の成功の分離は、TEMで確認する必要があります。 14 -現在の文献に基づいて、こののCaco-2モデルは、他のCaco-2モデル12の中で最も効率的な脂質輸送を提供しています。しかし、in vivoでリンパカニュレーションモデルは、より一層効率的に任意のin vitroモデルよりも脂質を輸送します。根底にある理由は、最近のCaco-2細胞は、アポリポタンパク質Bの2つの異なるアイソフォームを生成するので、すなわち、のCaco-2細胞は、モノグリセリドからトリグリセリドを合成することができず、カイロミクロンの生合成のための重要な血清成分は、増殖培地中に低くすることができる、8は議論されています。これは、この中での制限を実現することも重要ですvitroモデル;このin vitroモデルは、腸運動性、腸の解剖学、および他の器官系との相互作用などのいくつかの潜在的な重要な要素が、除外されます。

のCaco-2細胞は、カイロミクロンを生成することを可能にする主な要因は、効率的に用いられる脂質と細胞分化の8種類/量です。これらの要素の適切な組み合わせがなければ、のCaco-2細胞は、カイロミクロン8のかなりの数を生成しません。注目すべきは、NaClの密度勾配超遠心分離を適切に行うべきです。リポタンパク質の正常な分離(ずっと撹拌せずに頑丈)を取り扱う(大幅な遅延なしに即時)タイミングに依存し、良いサンプル、および慎重なピペット操作(最上層のみを取得)。適切な技術は、リポタンパク質層8を視覚化するために予め染色された脂質を使用することによって実施することができます。 TEMに加え、生化学的分析は、 すなわち 、アポリポタンパク質Bおよびトリグリセリドの分析、またUすることができますリポタンパク質の正常な分離を確認するためのsed。我々は以前に8を報告しているこれらの生化学的分析は、また、吸収を定量化のメソッドとして機能することができます。しかし、TEMは、まだカイロミクロンの生産の潜在的な過大評価の原因となる、2を集約するリポタンパク質の傾向のために行われるべきです。

このインビトロモデルは、食事脂肪の吸収および親油性薬物、ビタミン、および他の脂溶性栄養素の腸吸収を研究するために特に有用です。また、経口親油性薬物の乏しい生物学的利用能を改善するためのモデルとして役立つことができます。脂溶性物質が循環への輸送のための腸によるカイロミクロンにパッケージ化されているので、カイロミクロン産のCaco-2細胞は、親油性薬物の吸収に、より効率的になります。また、このモデルは、研究者は、腸(薬理遺伝学)により、薬剤吸収における特定の遺伝子の役割を決定することができます。それはまたにできますvestigators経口親油性薬物の生物学的利用能に対する様々な食事脂肪の効果を比較します。これらのアプリケーションはすべて、6以前に議論されています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

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References

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