El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University
Published 8/20/2015
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Biology

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Nauli, A. M., Whittimore, J. D. Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine. J. Vis. Exp. (102), e53086, doi:10.3791/53086 (2015).

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Abstract

Introduction

Los estudios de absorción intestinal de grasas en la dieta, y las drogas y vitaminas solubles en lípidos pueden llevar a cabo in vivo mediante el uso de un modelo de fístula linfática de 1 - 4. Sin embargo, las técnicas quirúrgicas que participan no sólo son un reto, pero también costoso. Aunque in vivo enfoques basados ​​en el análisis fecal pueden ser utilizados, que se utilizan principalmente para determinar el porcentaje de absorción por el tracto gastrointestinal 2,5. El modelo in vitro descrito en este artículo es más rentable, y las técnicas utilizadas son sin duda menos difícil. Estudios de modificación genética también son más económicos y menos tiempo cuando se llevaron a cabo utilizando este modelo in vitro.

Dado que los materiales solubles en lípidos que son absorbidos por los enterocitos son empaquetados en lipoproteínas de 6,7, la eficacia de este modelo in vitro para producir las lipoproteínas es crucial. Los dos intestina principall lipoproteínas son quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Los quilomicrones, definidos como lipoproteínas con 80 nm de diámetro o más, se producen estrictamente por el intestino delgado cuando los lípidos son abundantemente presentes en el lumen gastrointestinal. Puesto que son las lipoproteínas más grandes, los quilomicrones son posiblemente los transportadores de lípidos más eficientes. Este modelo in vitro, que es capaz de producir los quilomicrones 8, se puede utilizar para estudiar la absorción de grasa dietética, soluble en lípidos vitamina absorción por el intestino, y la biodisponibilidad oral de fármaco lipofílico. La presencia de moléculas solubles en lípidos, vitaminas, medicamentos o en la fracción de lipoproteína es un indicador de su absorción por el intestino delgado. Como se discutió anteriormente, este modelo se puede utilizar para mejorar la biodisponibilidad oral de fármaco lipofílico 6.

Este artículo describe cómo se deben mantener células Caco-2 en la membrana permeable o platos regulares de cultivo de tejidos, cómo las millas de lípidosxture para estimular la producción de lipoproteínas debe prepararse, cómo el sistema de expresión lentivirus puede ser empleado para lograr la sobreexpresión efectiva, y cómo se debe analizar las lipoproteínas aisladas.

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Protocol

1. Mantenimiento de las células Caco-2

  1. El uso de platos regulares de cultivo de tejidos
    1. Descongelar las 2-Caco células de un vial congelado colocando el vial en un baño de agua a 37 ° C, e inmediatamente añadirlos a una placa de cultivo tisular de 10 cm que contenía 10 ml de medio de crecimiento (suero bovino fetal pre-calentado 15% (FBS ) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)).
      1. Cuando las células Caco-2 han llegado a 50-70% de confluencia, ellos dividido 1: 6 mediante la incubación de las células con 3 ml de 0,05% / 0,53 mM de ácido etilendiaminotetraacético Tripsina (EDTA) a 37 ° C hasta que se separan (15 min) . Para evitar la formación de grumos de células, mezclar las células varias veces por pipeteo suave. Añadir 0,5 ml de las células tripsinizadas a una placa de cultivo de tejido de 10 cm que contenía 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado.
    2. Agitar suavemente los platos varias veces en una dirección hacia adelante y hacia atrás seguido de una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha. Evite remolinos de los platosya que puede resultar en una dispersión de células desigual.
    3. Colocar las cápsulas en una superficie plana en una incubadora a 37 ° se suministra con 5% de CO 2. Superficies inclinadas también pueden resultar en una dispersión de células desigual.
    4. Cambie los medios de crecimiento de un día después de comenzar la incubación.
    5. Monitorear las células y registrar el día que lleguen a la confluencia. Tomará alrededor de 1 semana para que las células alcanzan la confluencia del día en que se dividen.
    6. Cambiar el medio de crecimiento dos veces a la semana antes de que las células alcanzan la confluencia. Una vez que las células han alcanzado la confluencia, cambiar los medios de cultivo cada dos días. Después de que las células son 7 días post-confluentes, cambiar el medio de crecimiento diario.
      Nota: Las células están listas para experimentos cuando son 13 días post-confluentes (Figura 1). Dado que las células con el tiempo se vuelven menos efectivos para producir lipoproteínas, utilizar células que se encuentran entre 13 y 17 días post-confluentes 8. Vaya al paso 3 en la forma de realizar el experimento.
  2. Usando el sistema de membrana permeable
    1. Semilla las células Caco-2 en el inserto membrana permeable como se describe en el paso 1.1.1.1. arriba. Evitar el uso de células de un vial congelado debido a que su crecimiento celular es normalmente más lenta (período de recuperación). Brevemente, añadir 0,5 ml de las células tratadas con tripsina a la cámara apical (compartimiento superior) que contiene 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado. Además, añadir 10 ml de medio de crecimiento pre-calentado a la cámara basolateral (compartimiento inferior).
      Nota: Para obtener las mejores prácticas, agregue los medios de cultivo a la cámara apical primero y luego a la cámara basolateral. Al retirar los viejos medios, retire los medios basolateral ante los medios apicales. Evite meter la membrana de policarbonato, ya que puede romper la membrana.
    2. Debido a la visibilidad celular pobres a través de la membrana de policarbonato, sembrar las células Caco-2 en una placa de cultivo de tejidos regular con densidad similar, y el uso de este plato para juzgar la confluencia celular.
    3. Siga steps 1.1.2-1.1.6 anteriores.

2. La sobreexpresión de genes

  1. Utilizando el método ordinario transfección
    1. Semilla las células Caco-2 en una placa de cultivo de tejidos como se describe en 1.1.1.1.-1.1.4.
      Nota: Cuando las células son alrededor de 40-50% de confluencia, que están listos para ser transfectadas.
    2. Añadir 67 l de reactivo de transfección a 472 l de los medios de comunicación séricos reducidos en un tubo de microcentrífuga. Evite el contacto del reactivo de transfección sin diluir con la pared del tubo.
    3. Añadir 23 g de pLL3.7 aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) 9 en el reactivo de transfección / reducido mezcla de medio de suero.
    4. Incubar la mezcla durante 20 min a TA.
    5. Reemplace el medio de crecimiento de las células Caco-2 'con 8 ml de 10% de FBS en DMEM.
    6. Añadir la mezcla de ADN / reactivo de transfección / media suero reducido gota a gota al plato.
    7. Agite con cuidado los platos varias veces en un delantero y backward dirección seguida por una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha.
    8. Coloque el plato en el 37 ° C incubadora.
    9. Vuelva a colocar los medios de comunicación en el plato con 10 ml de medio de crecimiento un día después de comenzar la incubación.
    10. Supervisar la expresión génica.
      1. Controlar la expresión génica sin 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) tinción. Utilizando un microscopio fluorescente, determinar el porcentaje de células que son verde. El porcentaje representa la eficiencia de transfección.
      2. Supervisar la expresión génica con DAPI.
        1. Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces.
        2. Fijar las células mediante la adición de 10 ml de formaldehído al 4% en PBS (10 min de incubación a RT).
        3. Lavar las células con PBS tres veces.
        4. Se incuban las células en la oscuridad durante 15 min a TA con 8 ml de PBS que contenía 1: 500 DAPI, 1% de BSA, 0,01% de digitonina.
        5. Lavar las células con PBS tres veces.
        6. Ucantar un microscopio de fluorescencia, determinar el número de células que son verde / azul con relación a los que son de color azul (Figura 2 panel superior). El porcentaje calculado representa la eficiencia de transfección.
  2. Utilizando el sistema de sobreexpresión lentivirus 10
    1. Semilla de riñón embrionario (HEK) células humanas 293T en un 15 cm placa de cultivo de tejidos (10% de FBS en DMEM como su medio de crecimiento).
      Nota: Cuando las células son aproximadamente 60-70% de confluencia, que están listos para ser transfectadas.
    2. Añadir 162 l de reactivo de transfección de 1.133 l de los medios de comunicación séricos reducidos en un tubo de microcentrífuga de 11. Evite el contacto del reactivo de transfección sin diluir con la pared del tubo.
    3. Añadir 24 g de pLL3.7 eGFP (u otro constructo), 15,6 g de elemento de respuesta Rev (RRE), 6,0 g de REV, y 8,4 g de glicoproteína de virus de la estomatitis vesicular (VSVG) en el reactivo de transfección / rrelucida mezcla de medio de suero.
    4. Incubar la mezcla durante 20 min a TA.
    5. Reemplace el medio de crecimiento con 16 ml de 10% de FBS en DMEM.
    6. Añadir la mezcla de ADN / reactivo de transfección / media suero reducido gota a gota al plato.
    7. Agitar suavemente los platos varias veces en una dirección hacia adelante y hacia atrás seguido de una dirección hacia la izquierda y hacia la derecha. Es normal ver algunas de las células HEK293T unifamiliares en este punto.
    8. Coloque el plato en la incubadora.
    9. Después de 24 h de incubación, sustituir los medios de comunicación en el plato con 25 ml de medio de crecimiento.
    10. Al día siguiente, recoger el medio de crecimiento que contiene el lentivirus (primera colección).
    11. Repita el paso 2.2.10 para recoger más lentivirus (la segunda colección).
    12. Agrupar la primera y la segunda colección, y eliminar los restos celulares por centrifugación (2.500 xg durante 5 min).
    13. Se filtra la colección con un filtro desechable botella-superior (0,45 micras de poro), yconcentrar el virus por centrifugación de la colección a 31.400 xg durante 2 horas a RT (JA-20 rotor). Marque la parte inferior del tubo de centrífuga donde se encuentra el sedimento. Decantar el sobrenadante, y dejar el tubo invertido a temperatura ambiente durante unos 15 minutos.
    14. Resuspender el sedimento que contiene el virus con 100 l de 1X PBS. Evite las burbujas.
    15. Guarde el virus concentrado a -80 ° C. Evite los ciclos de congelación-descongelación.
    16. Determinar la cantidad óptima de virus necesaria para transducir las células Caco-2 por titulación. Para ahorrar costes, utilizar una placa de 24 pocillos (0,3 ml de crecimiento de los medios de comunicación / pocillo) en lugar de una placa de 10 cm de cultivo de tejidos para la titulación.
      1. Añadir cantidades crecientes del virus concentrado (0, 1, 2, 5, 10, 25, y 50 l / pocillo) suplementado con polibreno (concentración final = 5 g / ml) para el 40-70% de confluencia células Caco-2. Agite la placa de 24 pocillos con cuidado como se describe en 1.1.2.
      2. Vigile su expresión génica (Paso 2.1.10.) (Figura 2 inferior4 paneles).
    17. Dado que la expresión de transgén es generalmente sostenido, mantener las células transducidas para futuros experimentos y controlar continuamente su expresión génica (Paso 2.1.10.).

3. Estimular la secreción de lipoproteínas

  1. Usando el tejido plato normal cultura
    1. Preparar una mezcla de lípidos 100X mezclando 50 mg de ácido oleico, 40 mg de lecitina y 48 mg de taurocolato de sodio. Llevar el volumen a 900 l con PBS (suficiente para 8 platos). Agite la mezcla de lípidos vigorosamente.
    2. Añadir 900 l de la mezcla de lípidos 100X en 89,1 ml de medio de crecimiento. Mezclar y filtrar los medios de comunicación que contiene lípidos. Las concentraciones finales (1X) de ácido oleico, lecitina, y taurocolato de sodio son 2,0 mM, 1,36 mM, y 1,0 mM, respectivamente.
    3. Añadir 10 ml de los medios de comunicación que contiene lípidos a las células.
    4. Se incuban las células con los medios de comunicación que contiene lípidos durante 4 horas en un 37° C incubadora.
    5. Lavar las células con PBS tres veces.
    6. Añadir 10 ml de medio de crecimiento a las células para recoger la secreción de lipoproteínas.
    7. Incubar durante 2 horas en una incubadora a 37 °.
    8. Se recoge el medio que contiene lipoproteínas.
  2. Usando el sistema de membrana permeable
    1. Siga los pasos 3.1.1-3.1.2 para preparar la mezcla de lípidos.
    2. Añadir 10 ml de los medios de comunicación que contiene lípidos a la cámara apical y 10 ml de medio de crecimiento a la cámara basolateral.
    3. Incubar durante 4 horas en una incubadora a 37 °. Se recoge el medio que contiene lipoproteínas en la cámara basolateral.

4. Aislamiento lipoproteína (Figura 3)

  1. Eliminar los restos celulares de los medios de comunicación que contiene lipoproteína mediante centrifugación (2.000 xg durante 5 min).
  2. Decantar los medios de comunicación en un tubo de 50 ml.
  3. Añadir 5,95 g de cloruro de sodio a los medios.
  4. Si la sample será analizada por el TEM, añadir 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa para mantener la integridad de las lipoproteínas.
  5. Llevar el volumen a 23 ml con agua (1,2 g / ml NaCl solución de densidad).
  6. Disolver los solutos completamente.
  7. Decantar toda la solución en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato.
  8. Superponer suavemente la solución de densidad de 1,2 g / ml con 0,5 ml de agua (1,0 g / ml de densidad).
  9. Equilibrar el tubo en peso y no por volumen.
  10. Cargar suavemente los tubos en el rotor T865.
  11. Haga girar las muestras en la ultracentrífuga a 429.460 xg durante 24 horas a 4 ° C.
  12. Inmediatamente aislar la parte superior solución de 0,5 ml por pipeteo suave. Mantenga el tubo lo más quieto posible.

Análisis 5. TEM

  1. Preparar 5 ml de ácido fosfotúngstico al 2% (w / v) y ajustar el pH a 6,0.
  2. Filtrar el ácido fosfotúngstico al 2% con un filtro de jeringa (tamaño de poro: 0,2 micras).
  3. Caída de 20 l de la muestra de la lipoproteína en un plato estéril.
  4. Caída de 20 l de ácido fosfotúngstico filtrada 2% junto a la muestra en el mismo plato.
  5. Caer suavemente una rejilla EM con el lado opaco descansando en la muestra.
  6. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
  7. Golpear suavemente el lado de la rejilla EM sobre un papel de filtro para eliminar la muestra de la red.
  8. Caer suavemente la rejilla EM con el lado opaco que descansa sobre el ácido fosfotúngstico al 2%.
  9. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
  10. Golpear suavemente el lado de la rejilla EM sobre un papel de filtro para eliminar el ácido fosfotúngstico de la red.
  11. El uso de un TEM, la captura de las imágenes de las lipoproteínas (Figura 4).

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Representative Results

Figura 13-días post-confluentes células normales Caco-2 1 muestra. La aparición de estructuras en forma de cúpula y las gotas de lípidos intracelulares son característicos de diferenciadas Caco-2 células. Cuando las células Caco-2 no se dispersan igualmente durante la siembra, se aglutinan y crecer demasiado en ciertas áreas del plato; y habrá algunas áreas en el plato sin células. Remolina y colocando el plato en una superficie inclinada debe ser evitado. También es importante señalar que post-confluentes de células Caco-2 son más susceptibles al desprendimiento cuando se añade nuevo medio de crecimiento a las células demasiado áspero. Por lo tanto, se deben agregar los nuevos medios de comunicación con cuidado para evitar el desprendimiento de células.

Sobre la base de estos estudios, la eficacia de transfección de células Caco-2 fue de entre 30 a 60% (Figura 2 paneles superiores). En contraste, la eficacia de transducción de células Caco-2 usando el sistema de expresión lentivirus fue de aproximadamente 100% (Figura 2 Figura 2 también mostró que la cantidad óptima de lentivirus concentrado era 10 l. Las células Caco-2 células transducidas se mantuvieron hasta 12 pasajes. Como se muestra, incluso después de 12 pasajes las células transducidas todavía expresan eGFP. La eficacia de transducción depende claramente de la concentración de lentivirus. La confirmación de la eficiencia de la transfección / transducción es crítico, y debe realizarse como un análisis preliminar de rutina antes de los experimentos reales. Aunque el análisis de transferencia Western se puede utilizar para estimar el porcentaje de aumento de la expresión de genes, que no debería ser el principal método para determinar la eficiencia de transfección / transducción.

Utilizando el método de ultracentrifugación en gradiente de densidad de NaCl (Figura 3), las lipoproteínas secretadas por las células Caco-2 se aislaron y se analizaron en un TEM. Algunos de los quilomicrones, lipoproteínas más grande que 80 nm de diámetro, fueron representados en la figura4. Las lipoproteínas más pequeñas, las VLDL, también estuvieron presentes. Es esencial para confirmar el aislamiento con éxito de ambos quilomicrones y VLDL en un TEM. Como se discutió previamente 8, análisis bioquímico no debe ser el principal método de confirmación. La ausencia de lipoproteínas, específicamente los quilomicrones, indica que el transporte de lípidos por las células Caco-2 no es eficiente. En consecuencia, no van a servir como un buen modelo para estudiar el transporte de lípidos. El número de partículas de quilomicrones en relación con el número total de partículas de lipoproteínas se puede contar 8. Un alto porcentaje indica el transporte de lípidos eficiente.

Figura 1
Figura 1. micrografía Representante de post-confluentes de células de 13 días Caco-2. Intracelular gotitas de lípidos son visibles en algunas células (flecha roja). Las estructuras en forma de cúpula únicos (flecha negro) FOrmado por algunas células Caco-2 son generalmente presentes sólo después que las células han alcanzado la confluencia. Aumento = 100X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Comparación de la eficacia de la transfección a base de lípidos y el sistema de expresión lentivirus Panel superior:. Caco-2 células fueron transfectadas con pLL3.7 eGFP usando el reactivo de transfección no liposomal (barra de escala = 20 m). 4 paneles inferiores: Caco-2 células fueron transducidas con pLL3.7 eGFP usando el sistema de expresión de lentivirus con cantidades variables (1, 2, 5, o 10 mu l) de la lentivirus concentrado (LV). Las células mostradas eran del 12 º paso de las células transducidas originales. Los paneles de la izquierda muestran la tinción DAPI, el pa medioNels muestran la fluorescencia de GFP, y los paneles de la derecha muestran las imágenes fusionadas. El sistema de expresión lentivirus evidentemente era más eficaz que la transfección basado en lípidos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Aislamiento de lipoproteínas intestinales utilizando NaCl ultracentrifugación en gradiente de densidad. La densidad de medios de comunicación que contiene la lipoproteína-se ajusta a 1,2 g / ml mediante la adición de la cantidad apropiada de NaCl. El volumen de la muestra también necesita ser ajustado para que se llene el tubo de ultracentrífuga todo para evitar el colapso. Para lograr un gradiente de densidad, 0,5 ml de agua se superpone suavemente en la g / ml de solución de densidad 1,2. La muestra se centrifuga luego a 429.460 xg durante 24 horas utilizando un T865rotor (equivalente a 2,15 unidades Svedberg). Las lipoproteínas intestinales deben ser recuperados inmediatamente por pipeteo suave. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Micrografía electrónica de Representante de las lipoproteínas producidos por las células Caco-2. Las lipoproteínas aisladas por ultracentrifugación en gradiente de densidad de NaCl se tiñeron negativamente con ácido fosfotúngstico al 2% (pH 6,0). Los quilomicrones, partículas lipídicas más grande que 80 nm de diámetro, y VLDL, los menores de 80 nm, están ambos presentes. Barra de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este papel, los dos sistemas que se pueden utilizar para mantener las células Caco-2 se describen, a saber, el plato de cultivo de tejido normal y la membrana permeable. Los beneficios de usar el sistema de membrana permeable incluyen la separación de la apical y basolateral de los compartimentos, y la capacidad de incubar la mezcla de lípidos y recoger la secreción de lipoproteínas de forma simultánea. Sin embargo, los insertos de membrana permeable son caros, y su membrana de policarbonato no permite una buena visibilidad de la célula. Una de las ventajas de este modelo in vitro es que los estudios de manipulación genética será más económico y menos tiempo. Para una mejor eficacia, se debe utilizar el sistema de expresión lentivirus. Las células Caco-2 células transducidas generalmente mantienen la expresión de su transgén.

La capacidad de las células Caco-2 para producir los quilomicrones es de suma importancia. Sin esta capacidad, Caco-2 células no serían capaces de efficiently transportar materiales lipófilos, incluyendo pero no limitado a las drogas liphophilic, vitamina A, D, E, y K, y los nutrientes solubles en lípidos. Los métodos adecuados para desafiar células Caco-2 para producir ambas partículas VLDL y quilomicrones se describen. El aislamiento con éxito de estas partículas de lipoproteínas debe confirmarse en un TEM. Con base en la literatura actual, este modelo Caco-2 ofrece el transporte de lípidos más eficiente entre otras Caco-2 modelos de 12 a 14. Sin embargo, el modelo de la canulación linfáticos in vivo todavía transporta lípidos más eficiente que cualquier modelo in vitro. Las razones subyacentes se han discutido recientemente 8, a saber, porque Caco-2 células producen 2 isoformas diferentes de la apolipoproteína B, células Caco-2 no pueden sintetizar triglicéridos de monoglicéridos, y el componente de suero crítico para la biogénesis de quilomicrones pueden ser inferiores en el medio de crecimiento . También es importante darse cuenta de la limitación de este enmodelo in vitro; este modelo in vitro excluye algunos potenciales factores importantes, tales como la motilidad intestinal, la anatomía del intestino, y la interacción con otros sistemas de órganos.

Los principales factores que permiten a las células Caco-2 células para producir eficientemente quilomicrones son el tipo / cantidad de lípidos utilizados y la diferenciación celular 8. Sin la adecuada combinación de estos factores, Caco-2 células no producirán un número significativo de los quilomicrones 8. De la nota, NaCl ultracentrifugación en gradiente de densidad debe realizarse correctamente. El aislamiento exitoso de lipoproteínas depende del momento (inmediata y sin demora significativa), buen manejo de la muestra (robusto sin mucha agitación), y pipeteo cuidado (recibiendo sólo la capa superior). La técnica apropiada puede ser practicado por el uso de lípidos pre-manchado para ayudar a visualizar la capa de lipoproteínas de 8. Además de TEM, análisis bioquímicos, es decir, la apolipoproteína B y de triglicéridos análisis, también puede ser Used para confirmar el aislamiento con éxito de las lipoproteínas. Estos análisis bioquímicos, que hemos informado anteriormente 8, también pueden servir como métodos para cuantificar la absorción. Sin embargo, TEM todavía debe realizarse debido a la tendencia de las lipoproteínas de agregar 2, provocando una sobreestimación potencial de la producción de quilomicrones.

Este modelo in vitro es particularmente útil para el estudio de la absorción de grasa de la dieta y la absorción intestinal de fármacos lipófilos, vitaminas y otros nutrientes solubles en lípidos. También puede servir como un modelo para mejorar la pobre biodisponibilidad de los fármacos lipófilos orales. Dado que los materiales solubles en lípidos se empaquetan en los quilomicrones por los enterocitos para el transporte a la circulación, las células productoras de quilomicrones Caco-2 serán más eficientes en la absorción de fármacos lipófilos. Además, este modelo permite a los investigadores determinar el papel de un gen específico en la absorción del fármaco por el intestino (farmacogenética). También permite eninves- para comparar el efecto de diferentes grasas de la dieta sobre la biodisponibilidad oral de fármaco lipofílico. Todas estas aplicaciones se han discutido previamente 6.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM VWR 16750-112 Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells
FBS Fisher 3600511 We do not heat inactivate our serum
Trypsin VWR 45000-660 Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment 
Permeable membrane system Fisher 7200173 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane
10 cm dish Fisher 08-772-E Tissue culture dish
15 cm dish Fisher 08-772-24 Tissue culture dish
24 well plate Fisher 12565163 Tissue culture plate
Lipid-based transfection reagent Fisher PRE2691 Can be substituted with other transfection reagent
Reduced serum media Invitrogen 11058021 For transfection
pLL3.7 eGFP Addgene 11795 https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filter Fisher 9761120 0.45 mm pore
Polybrene Fisher NC9840454 10 mg/ml
Oleic acid Sigma 01383-5G Prevent freeze-thaw cycle
Lecithin  Fisher IC10214625 Egg lecithin 
Sodium taurocholate Fisher NC9620276 Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) Fisher 5892791001 Used mainly for samples that need TEM analysis
Polycarbonate ultracentrifuge tube Fisher NC9696153 Reusing it multiple times will collapse the tube
Lid for ultracentrifuge tube Fisher NC9796914 A tool is required to remove the tube/lid from rotor
Syringe Fisher 50-949-261 Disposable
Syringe filter Fisher 09-719C Pore size = 0.2 mm; nylon
Phosphotungstic acid Fisher AC208310250 For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0
Tweezer Fisher 50-238-62 Extra fine and strong tips
Formvar/carbon grid Fisher 50-260-34 Formvar/carbon film square grid 400 Copper

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References

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