Cellule étiquetage et le ciblage des nanoparticules d'oxyde de fer Superparamagnetic

Bioengineering

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Tefft, B. J., Uthamaraj, S., Harburn, J. J., Klabusay, M., Dragomir-Daescu, D., Sandhu, G. S. Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (104), e53099, doi:10.3791/53099 (2015).

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Abstract

L'administration ciblée de cellules et des agents thérapeutiques bénéficierait une large gamme d'applications biomédicales, en concentrant l'effet thérapeutique au niveau du site cible tout en minimisant les effets délétères sur les sites hors cibles. Ciblage cellulaire magnétique est une technique de livraison efficace, sûre et simple. Des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques de (spion) sont biodégradables, biocompatibles, et peuvent être endocytose dans des cellules pour les rendre sensibles aux champs magnétiques. Le procédé de synthèse consiste à créer magnétite (Fe 3 O 4) suivie d'émulsification nanoparticules à grande vitesse pour former un poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) de revêtement. Les SPIONs PLGA-magnétite sont environ 120 nm de diamètre dont le diamètre de noyau de magnétite d'environ 10 nm. Lorsqu'il est placé dans un milieu de culture, sont naturellement SPIONs endocytose par les cellules et stockées sous forme de petits agrégats à l'intérieur des endosomes cytoplasmiques. Ces particules confèrent masse magnétique suffisant pour les cellulespour permettre le ciblage à l'intérieur des champs magnétiques. Nombreux tri cellulaire et applications ciblant sont activés en rendant divers types sensibles aux champs magnétiques de cellules. SPIONs ont une variété d'autres applications biomédicales, y compris aussi bien l'utilisation comme agent de contraste pour l'imagerie médicale, l'administration de médicaments ou un gène ciblé, des analyses de diagnostic, de génération et hyperthermie locale pour le traitement des tumeurs ou la soudure de tissu.

Protocol

1. Synthèse de magnétite Gel

  1. Laver toute la verrerie à l'aide d'acide chlorhydrique concentré puis de l'eau désionisée, suivi par l'alcool éthylique. Laisser sécher O / N, de préférence dans un four de séchage.
    ATTENTION! l'acide chlorhydrique est nocif - porter un équipement de protection individuelle et de travailler dans une hotte; alcool éthylique est nocif - porter un équipement de protection individuelle.
  2. Utilisez une bouteille Dreschel dégazer 500 ml de H 2 O déminéralisée par barbotage doucement gaz N 2 pendant 30 minutes.
  3. Mise en place de l'appareil de synthèse de la magnétite dans un hotte chimique.
    1. Placer un flacon ml à trois cols à fond rond de 500 au sein d'un chauffe manchon isotherme et sécuriser le col de centre à l'aide d'une pince et d'éligibilité.
    2. Installation d'un septum en caoutchouc dans l'un des cols latéraux du ballon à fond rond et d'un condenseur à reflux avec un septum en caoutchouc dans le goulot de côté restant. Fonctionner en continu de l'eau froide à travers le condenseur de reflux.
    3. Puncture ee septum en caoutchouc du flacon à fond rond avec une aiguille reliée à une conduite de gaz N 2 et à la perforation de la cloison en caoutchouc pour le réfrigérant à reflux avec une aiguille reliée à une conduite de gaz en cours d'exécution à un barboteur (c.-à-ballon avec de l'eau) pour visualiser les sorties de gaz.
    4. Installez une palette de lame dans le cou de centre du ballon rond via un adaptateur de pagaie. Fixez l'arbre de la palette de la lame à un agitateur monté sur un stand.
  4. Purger le ballon à fond rond avec du gaz N 2 et N 2 laisser gaz circulant à un taux faible, mais détectable.
  5. Retirer le condenseur à reflux de la ballon à fond rond et ajouter 1,000 g de fer (III) chlorure, 0,6125 g de fer (II) tétrahydraté, et 50 ml de dégazée H 2 O.
    ATTENTION! fer (III) et le chlorure de fer (II) tétrahydraté sont nuisibles - porter un équipement de protection individuelle.
  6. Remplacer le condenseur de reflux et agiter à 1000 tours par minute tout en chauffant à 50° C. L'agitation dans ces conditions produit 10 nm de diamètre nanoparticules de magnétite.
  7. Une fois à 50 ° C, ajouter 10 ml de solution d'hydroxyde d'ammonium à 28% en injectant à travers le septum en caoutchouc dans le ballon à fond rond tout en agitant.
    ATTENTION! hydroxyde d'ammonium est néfaste - porter un équipement de protection individuelle.
    REMARQUE: La solution d'hydroxyde d'ammonium est utilisé pour précipiter la magnétite et la solution doit virer au noir.
  8. Retirez le bouchon de caoutchouc et de N 2 conduite de gaz du ballon rond et de la chaleur à 90 ° C pour faire bouillir le gaz d'ammoniac tout en remuant.
    NOTE: Il est facultatif pour maintenir le flux de N 2 dans le ballon à fond rond en perforant la cloison de caoutchouc le condenseur de reflux, cependant, l'oxydation de la magnétite à maghémite est négligeable lors de cette étape.
  9. Une fois à 90 ° C, ajouter 1 ml d'acide oléique dans le ballon à fond rond, tout en remuant. L'acide oléique est utilisé pour revêtir la magnétite nanoparticles pour former un gel de la magnétite.
    ATTENTION! l'acide oléique est nocif - porter un équipement de protection individuelle.
  10. Remplacez le septum en caoutchouc et N 2 conduite de gaz sur le ballon à fond rond et retirez le condenseur de reflux.
  11. Éteindre le feu et remuer à 500 rpm pendant 2 heures.
  12. Retirer le flacon à fond rond à partir de l'appareil de chauffage et un manchon isotherme décanter tandis que le reste du liquide en utilisant un aimant fort maintenue contre la partie inférieure de la fiole pour retenir le gel de magnétite.
    ATTENTION! face à la forte aimant avec un soin extrême pour éviter des dommages ou des blessures.
  13. Laisser gel de magnétite sécher à l'air O / N (en option).

2. Purification de magnétite Gel

  1. Ajouter 40 ml d'hexane dans le ballon à fond rond pour dissoudre le gel de magnétite
    ATTENTION! hexane est nocif - porter un équipement de protection personnelle et de travailler dans une hotte.
  2. Utilisez une ampoule à décanter avec 40 ml d'dégazée H 2 O pour éliminer H 2 O résiduelle from la solution de magnétite.
    1. Verser lentement la solution de magnétite sur le H 2 O au sein de l'ampoule à décanter et agiter doucement le liquide à deux phases pendant 5 minutes.
    2. Égoutter et jeter la fraction aqueuse inférieure.
    3. Lentement, ajouter 40 ml de dégazée H 2 O à l'ampoule à décanter telle qu'elle installe sous la solution de magnétite et de tourbillonner et égoutter délicatement comme avant.
    4. Répétez l'opération pour laver pour une troisième fois.
  3. Transfert solution de magnétite dans un erlenmeyer, ajouter quelques spatules valeur de sulfate de sodium anhydre, et agiter pour éliminer tout restant H 2 O résiduelle de la solution de magnétite.
  4. Filtrer la solution de magnétite travers un papier filtre de 1 pm dans un entonnoir à filtre pour éliminer le sulfate de sodium résiduel et H 2 O.
    REMARQUE: l'aide du vide est recommandé.
  5. Transférer la solution de magnétite à un ballon d'évaporation de 50 ml et en utilisant un évaporateur rotatif pour évaporer l'hexane pour2 h dans les conditions suivantes: vitesse de rotation modérée, appliquée sous vide, l'évaporation ballon dans un bain d'eau à 50 °, et 24 ° C l'eau circulant dans le condenseur.
    NOTE: En option, stocker le gel de magnétite avec avant le revêtement de PLGA.

3. Revêtement de magnétite nanoparticules PLGA avec Shell

  1. Dissoudre 3,60 g de PLGA (75/25 mélange) dans 240 ml d'acétate d'éthyle pour créer un (m / v) de solution à 1,5%. ATTENTION: acétate d'éthyle est nocif - porter un équipement de protection personnelle et de travailler dans une hotte.
  2. Dissoudre 25,00 g de Pluronic F-127 dans 500 ml de dégazée H 2 O avec un agitateur magnétique pour créer un (m / v) de solution 5,0%.
    REMARQUE: Pluronic F-127 est un copolymère à blocs amphiphile non-ionique qui agit comme un agent tensioactif biocompatible. Il permet de stabiliser l'émulsion huile-dans-eau dans l'étape 3.3.2.
  3. Utiliser une microspatule, recueillir le gel de la magnétite en six 0,040 g aliquotes dans des flacons de verre pondérés. Perform le processus de revêtement et de lavage suivant pour chaque aliquote.
    REMARQUE: Les aliquotes sont nécessaires pour assurer une gestion efficace et décantation magnétique, ce qui permettra de maximiser pureté et le rendement tout en minimisant la dégradation avant lyophilisation à l'étape 4.
    1. Ajouter une fraction aliquote de 0,040 g du gel de magnétite et de 40 ml de la solution de PLGA dans un bêcher en matière plastique et de traitement par ultrasons dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes.
    2. Ajouter 80 ml de la solution de Pluronic dans le bêcher en plastique et immédiatement émulsionner avec un mélangeur de laboratoire à la position la plus élevée pendant 7 minutes pour former le revêtement sur les nanoparticules PLGA de magnétite comme une émulsion huile-dans-eau.
    3. Immédiatement diluer la solution de SPION dans 1 litre de H 2 O déminéralisée et de traitement par ultrasons pendant 1 h dans une hotte chimique pour évaporer l'acétate d'éthyle.
    4. Placez un aimant puissant à côté de la solution de SPION et remuer doucement pour recueillir SPIONs brunâtres à l'aimant.
      NOTE: Il peut être nécessaire d'agiter par intermittence pendant plusieurs heuress avant que la solution devient blanchâtre indiquant que la plupart des SPIONs ont été recueillis.
    5. Décanter la solution aqueuse tout en conservant les SPIONs dans le bécher avec l'aimant.
    6. Laver les SPIONs trois fois comme suit.
      1. Suspendre les SPIONs dans 1 L d'H 2 O. déminéralisée
      2. Soniquer la solution de SPION pendant 20 minutes.
      3. Placez un aimant puissant à côté de la solution de SPION et remuer doucement pour recueillir SPIONs brunâtres à l'aimant. Il peut être nécessaire d'agiter par intermittence pendant plusieurs heures avant que la solution devient claire indiquant que la plupart des SPIONs ont été recueillis.
      4. Décanter la solution aqueuse tout en conservant les SPIONs dans le bécher avec l'aimant.
  4. Recueillir les SPIONs synthétisés à partir de chacune des six parties aliquotes de gel de magnétite dans un seul flacon de verre pondéré en tant que suspension aqueuse. Eventuellement décanter l'eau en excès magnétiquement au besoin.

4. Gel-Séchage de SPIONs

  1. Congeler la solution de SPION.
  2. Lyophiliser la solution de SPION O / N dans un lyophilisateur.
  3. Peser les SPIONs lyophilisés. SPIONs lyophilisées peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à son utilisation pour l'étiquetage de la cellule.
    REMARQUE: stockage à -20 ° C réduit considérablement la cinétique de dégradation et augmente la durée de vie.

5. marquage des cellules avec SPIONs

  1. Suspendre une partie aliquote de SPIONs dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 40 mg / ml et sonication pendant 30 min.
  2. Ajouter la solution dans un ballon SPION presque confluente de cellules à une concentration de 5 ul / ml de milieu de culture cellulaire. Assurer une distribution uniforme en secouant délicatement le flacon.
  3. Incuber les cellules pendant 16 heures à 37 ° C.
  4. Aspirer doucement milieu de culture et laver les cellules deux fois avec PBS.
  5. Recueillir des cellules magnétiquement marquées et utiliser pour des expériences.
  6. Solution de SPION utilisé peut être conservé à 4 ° C et devrait nous êtreed dans quelques mois. Sonication pendant 30 min avant chaque utilisation.

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Representative Results

Des nanoparticules de magnétite sont d'environ 10 nm de diamètre par suite d'une agitation une solution aqueuse de fer (III) et le chlorure de fer (II) tétrahydrate de chlorure à 50 ° C et 1 000 tours par minute (figure 1). Ces résultats démontrent la synthèse réussie de nanoparticules de magnétite. Il est important de vérifier la taille et la forme de nanoparticules de magnétite prises à partir d'un petit échantillon de la charge lors d'une tentative de synthèse pour la première fois. Microscopie électronique à transmission (MET) est la méthode préférée pour la visualisation de ces particules. La charge doit être jeté et la synthèse doit être tentée à nouveau si les nanoparticules de magnétite sont pas environ 10 nm de diamètre et sphérique comme représenté sur la figure 1.

Revêtir les nanoparticules de magnétite avec un PLGA en utilisant à grande vitesse des résultats d'émulsifiant dans SPIONs PLGA-magnétite avec un diamètre de 120 nm (figure 2). Ces résultats démontrent réussisynthèse de SPIONs PLGA-magnétite. Il est important de vérifier la taille et la forme de SPIONs PLGA-magnétite prises à partir d'un petit échantillon de la charge lors d'une tentative de synthèse pour la première fois. Microscopie électronique à balayage (MEB) est la méthode préférée pour la visualisation de ces particules. La charge doit être jeté et la synthèse doit être tentée à nouveau si les SPIONs PLGA-magnétite sont pas environ 120 nm de diamètre et sphérique comme représenté sur la Figure 2. Alors que des particules plus grandes ou plus petites peuvent être souhaitables pour certaines applications, la composition sera inconnu et donc la cellule étiquetage, la susceptibilité magnétique, et la cytotoxicité sera imprévisible.

L'incubation des cellules endothéliales excroissance de sang avec SPIONs pendant 16 h dans les résultats de l'endocytose des nanoparticules (Figure 3). Ces résultats démontrent l'étiquetage réussie de cellules avec SPIONs. Il est important de vérifier la présence au sein de SPIONs cellules prélevéesun petit échantillon de la charge lors de la tentative de l'étiquetage pour la première fois. Microscopie électronique par transmission est la méthode préférée pour la visualisation de ces cellules spion marqué. Les cellules doivent être jetés et l'étiquetage doivent être tentée à nouveau si les SPIONs PLGA-mangetite ne semblent pas aussi rond particules noires regroupés au sein des endosomes cytoplasmiques comme le montre la figure 3. En outre, des concentrations plus faibles de SPIONs peuvent échouer pour permettre magnétique des cellules de ciblage et des concentrations plus élevées de SPIONs peuvent être cytotoxique. Si nécessaire, la concentration de SPIONs utilisés pour marquer les cellules peut être ajustée en conséquence.

La quantité de fer est chargé dans les cellules est suffisante pour obtenir capture magnétique de cellules viables aux dispositifs médicaux implantables ferromagnétiques (figure 4). Ces résultats démontrent la réussite magnétique des cellules de ciblage SPION médiation. Si une cellule plus fort effet de ciblage est souhaitée, la stratégie préférée consiste à IncreaSE force ou gradient du champ magnétique généré ou appliqué 8,30. L'augmentation de la concentration de SPIONs utilisés pour marquer les cellules ne devrait être jugé comme un dernier recours en raison de cytotoxicité préoccupations. Si l'amélioration de la viabilité des cellules est souhaitée, la concentration de SPIONs utilisés pour marquer les cellules doit être diminué.

Figure 1
Figure 1. image TEM de nanoparticules de magnétite. Nanoparticules de magnétite sont d'environ 10 nm de diamètre comme on le voit par microscopie électronique à transmission (MET). Les particules sont sphériques et de taille uniforme. Barre d'échelle = 100 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 /> Figure 2. image SEM de SPIONs PLGA-magnétite. SPIONs de magnétite revêtues de PLGA sont d'environ 120 nm de diamètre comme on le voit par microscopie électronique à balayage (SEM). Les particules sont sphériques et de taille uniforme. Barre d'échelle = 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. image MET d'une cellule endothéliale magnétiquement marqué. Une cellule endothéliale excroissance de sang magnétiquement marqué visualisé par microscopie électronique à transmission (MET). Les SPIONs sont naturellement endocytose par les cellules et stockées en petites grappes à l'intérieur des endosomes cytoplasmiques. Gauche barre d'échelle = 2 pm et à droite barre d'échelle = 0,5 um. Re-imprimer avec la permission de 24./files/ftp_upload/53099/53099fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure image de microscopie de fluorescence 4. de la capture magnétique des cellules. Cellules endothéliales marqué magnétiquement sont attirés par un stent vasculaire ferromagnétique (à droite) à un taux significativement plus élevé que d'un stent non magnétique (à gauche). Les barres d'échelle = 100 um. Re-print avec la permission de 24. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Comme pour tout protocole de synthèse de nanoparticules, la pureté des substances chimiques réactifs est critique pour la réalisation de SPIONs de haute qualité qui auront des effets cytotoxiques minimales. Il est donc important d'acheter des réactifs très purs dont l'acide oléique (≥99%), le fer (II) tétrahydrate de chlorure (≥99.99%), le fer (III) chlorure (≥99.99%), l'acétate d'éthyle (qualité HPLC, ≥99.9% ), de l'hexane (de qualité pour CLHP, ≥97.0%), de l'hydroxyde d'ammonium (de ≥99.99%), et du sulfate de sodium (de ≥99.0%). Il est d'une importance particulière pour l'achat très pur et de haute qualité PLGA, qui peut être relativement coûteux. En outre, toute la verrerie doit être soigneusement lavé avec de l'acide chlorhydrique, de l'eau désionisée et de l'alcool éthylique et on laisse sécher avant de l'utiliser.

De même, la purification et des étapes de lavage dans le protocole sont essentiels pour assurer les SPIONs définitifs seront de haute qualité et ont des effets cytotoxiques minimes. Le gel de magnétite doit être exempt deautant d'hydroxyde d'ammonium, de l'eau et de l'hexane que possible avant le revêtement avec du PLGA. En conséquence, une grande partie du protocole est consacrée à assurer la pureté du gel de magnétite. Par la suite, les SPIONs PLGA-magnétite doivent être libres d'acétate d'éthyle, Pluronic, et l'excès de PLGA. Les dernières étapes de lavage SPION sont la plupart du temps partie du protocole de consommer, mais doivent être complétés pour assurer une haute pureté. Plus précisément, la collecte magnétique des particules au cours de chaque étape de lavage peut être très coûteuse en temps. En agitant la solution peut augmenter considérablement la vitesse de collecte de particules, mais barreaux d'agitation magnétiques peut pas être utilisé. Des agitateurs fonctionnant à basse vitesse sont les moyens les plus efficaces pour la collecte de particules rapide. Assurer une grande collection brunâtre de SPIONs apparaît à l'aimant et la solution apparaît blanc ou clair avant décantation. Cela peut souvent nécessiter plusieurs heures d'agitation, mais se traduira par un rendement final supérieur. Les étapes de décantation magnétiques servent également à assurer que magnétique particules sont retenues tandis que tous les matériaux non-magnétiques sont jetés.

Taux de fer excessive peut être cytotoxique, de sorte que la quantité de masse magnétique qui peut être conférée à une cellule en utilisant cette technique est limitée. La concentration de fer peut être nécessaire de diminuer pour les types de cellules particulièrement sensibles ou augmenté pour les champs magnétiques particulièrement faibles, mais le protocole décrit ici fournit un point de départ avéré équilibre entre la sécurité et l'efficacité. Les SPIONs synthétisés par ce protocole sont fabriqués à partir d'une solution avec un rapport en masse de 1:15 à magnétite et les PLGA SPIONs sont introduits dans des cellules à une concentration de 200 ug / ml de milieu de culture cellulaire. Chacune de ces paramètres peuvent être ajustés pour modifier la quantité de fer par endocytose chaque cellule si nécessaire.

SPIONs sont sans danger pour l'implantation humaine et biodégrader au fil du temps (demi-vie d'environ 40-50 jours) 31. Tant la magnétite et PLGA forment dégradant inoffensifproduits ation et sont éliminés de l'organisme par les voies naturelles 32. La nature biodégradable des SPIONs désigne tout effet cytotoxiques vont diminuer avec le temps, mais limite également les applications possibles à ceux qui ne nécessitent pas de cellules pour maintenir leurs propriétés magnétiques au-delà de quelques mois. SPIONs présentent également l'avantage de conférer marquage de cellules et de leurs effets magnétiques sans avoir besoin de protéines de surface, ni des ligands de ciblage qui sont sensibles à la formation d'une couronne de protéine par exposition à un milieu biologique 33,34.

Communiquant des propriétés magnétiques des cellules est utile pour un large éventail d'applications biomédicales exigeant la livraison de cellule ciblée ou de tri 29. Une variété de types de cellules ont montré la possibilité d'endocytose SPIONs en toute sécurité y compris les cellules souches mésenchymateuses, des cellules 35 progénitrices endothéliales, des cellules des îlots pancréatiques 36 37 bêta, et les cellules souches neurales 38. Cel magnétiquel ciblage peut être préféré à d'autres techniques de ciblage cellulaire quand un haut degré de contrôle sur les conditions de livraison est nécessaire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis Sigma-Aldrich 338818-100ML  Harmful reagent - wear personal protective equipment
Dreschel bottle, 500 ml Ace Glass 5516-16
Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9%  Sigma-Aldrich 650528-1L Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Harmful reagent - wear personal protective equipment
Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint Sigma-Aldrich Z515558 For use with rotoevaporator
Filter paper, 3 cm dia, grade 1 Fisher 09-805P For use with glass filter funnel
Glass beakers, 1 L Fisher FB-101-1000 For washing SPIONs
Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL Fisher K954100-0344 
Glass vial caps Fisher 03-391-46 For use with glass vials
Glass vials, 2 ml Fisher 03-391-44 For collecting magnetite gel & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC) Sigma-Aldrich 34859-1L  Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758 Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis  Sigma-Aldrich 380024-5G Harmful reagent - wear personal protective equipment
Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis Sigma-Aldrich 451649-1G Harmful reagent - wear personal protective equipment
Isomantle heater, 500 mL Voight Global EM0500/CEX1
Laboratory mixer Silverson L5M-A
Lyophilizer Labconco 7670520
Microspatulas Fisher 21-401-25A For transfering magnetite gel
NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in Amazing Magnets C1000H-M Very strong magnet, handle with care
Oleic acid, ≥99% (GC) Sigma-Aldrich O1008-5G  Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment
Overhead stirrer IKA 2572201
Overhead stirrer clamp IKA 2664000 For use with overhead stirrer
Overhead stirrer H-stand IKA 1412000 For use with overhead stirrer
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010-023
Plastic beakers, 250 ml Fisher 02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend) Purac PDLG 7502 PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer
Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture Sigma-Aldrich P2443-250G 
PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia SciQuip SP4018
PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle Monmouth Scientific PTFE Vessel Adaptor A480 For use with PTFE expandable blade paddle
Recirculating chiller Clarkson 696613 For use with rotoevaporator
Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm Ace Glass 5997-133
Rotoevaporator Clarkson 216949
Rubber septa, fits 24/40 Ace Glass 9096-56
Separatory funnel with stopper, 250 ml Fisher 10-438E
Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular Sigma-Aldrich 239313-500G 
Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml Ace Glass 6948-16
Ultrasonic cleaner perforated pan Fisher 15-335-20A For use with ultrasonic cleaner
Ultrasonic cleaner, 2.8 L Fisher 15-335-20
Vacuum controller Clarkson 216639 For use with rotoevaporator (optional)
Vacuum pump Clarkson 219959 For use with rotoevaporator

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References

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