Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Herstellung von Kulturmedien, Antibiotika, und 2- [2-Nitro-4- (trifluormethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexandion (NTBC)

  1. Machen LB-Brühe (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl in H 2 O) und Aliquot in angemessenen Mengen. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren. Lagerung bei Raumtemperatur.
  2. Auf 100 ml LB-Agar (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl, 1,5% Agar in H 2 O) in 250 ml-Kolben. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Stellen Sie sicher, dass der Agar wird vor dem Gießen in Platten geschmolzen.
    HINWEIS: Kolben, die 100 ml LB-Agar-Platten werden 4 ergeben. Die Menge des LB-Agar kann verändert werden, um der Anzahl von Platten für den Assay benötigt entsprechen.
  3. Machen PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren oder Filtration und bei Raumtemperatur lagern.
  4. Bereiten Sie die Antibiotika-Stammlösungen für Gentamicin, Kanamycin, eind Tobramycin.
    1. Bereiten entsprechenden Antibiotikum stock Konzentrationen für P. aeruginosa-Stämme, die 100 mg / ml Gentamicin, 30 mg / ml Kanamycin und 10 mg / ml Tobramycin. Lösen Sie den Antibiotika in Wasser, Filter zu sterilisieren (0,2 um), und bei 4 ° C. Ändern Sie die Antibiotika und Konzentrationen je nach Bakterium untersucht.
  5. Bereiten Sie die NTBC Stammlösungen. Auflösen 10 mg NTBC in 400 ul DMSO. Dies ergibt eine Konzentration von 75,9 mM NTBC. Shop NTBC Stammlösungen bei -20 ° C. Tau-Lösungen bei Raumtemperatur nach Bedarf.
    HINWEIS: Verschiedene Quellen von NTBC haben Unterschiede in der Löslichkeit. Bestimmen Sie das passende Fahrzeug, in dem die NTBC basierend auf den Empfehlungen des Herstellers zu lösen und anpassen Schritt 1.5 entsprechend.

2. NTBC Titrationen von Bakterienstämmen

  1. Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme zu testen. 2 ml LB-Brühe zu 16 x 150 mm Teströhrchens (einer pro-Stamm) und zu impfen mit 1 isoliert Kolonie aus jedem Stamm. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Belüftung auf einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator.
  2. Am folgenden Tag vorzubereiten Titrationen von NTBC in LB-Brühe. Starten Sie mit einem Bereich von 0 bis 900 um NTBC da verschiedene Stämme haben Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber NTBC.
    1. 1 ml LB-Medium auf 4 bis 5 Teströhrchen (16 x 150 mm) pro Stamm.
    2. Fügen Sie den NTBC Stammlösung (75,9 mm), um die Teströhrchen (16 x 150 mm) in einem Bereich von Konzentrationen. Siehe Tabelle 1 für NTBC Konzentrationen und entsprechende Aktienvolumen auf 1 ml LB-Brühe hinzufügen.
  3. Messen Sie die OD600 der Übernachtkulturen. Kulturen vor der Einnahme von OD 600 Lesungen zu beseitigen in den Medien präsent pyomelanin waschen.
    1. Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand und keine lose pelletierten Zellen miteine Mikropipette und Resuspendieren der festen Zellpellet in 1 ml LB
  4. Impfen Titration Röhrchen bei OD 600 0.05. Berechnung der Menge der Kultur gewaschen erforderlich, um die Rohre anzuimpfen.
    HINWEIS: Verwenden Sie die gewaschenen Kulturen für Impfungen seit pyomelanin sollte nicht vorhanden sein.
  5. Die Titration Rohre etwa 24 h bei 37 ° C inkubieren mit Belüftung unter Verwendung einer Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator.
  6. Fotografieren Sie die Titration Rohre und vergleichen Pigmentproduktion innerhalb und zwischen den Stämmen, die Menge an NTBC bestimmen, die für MIC und oxidativer Stress-Tests zu verwenden. Verwenden OD 600 Lesungen, die Menge an pyomelanin in zellfreien Kulturüberstand zu bestimmen, und um die Zelldichte zu bestimmen.
    HINWEIS: Der OD 600-Verhältnis von pyomelanin in Kulturüberstand von Zellen berechnet werden kann, um Unterschiede in pyomelanin Produktion nach Behandlung mit NTBC quantifizieren.

3. Antibiotika Mindest InhibiTory-Konzentration (MIC) Assay in 96-Well-Platten

  1. Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC getestet werden.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wird mit dem repräsentativen Niveau von 300 um NTBC beschrieben. Die angemessene Höhe der NTBC verwendet werden in Schritt 2.6 festgelegt.
    1. In 300 um NTBC bis 2 ml LB Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB für die kein NTBC Zustand.
    2. Mit einer sterilen Zahnstocher, zu impfen Rohre mit einem isolierten Bakterienkolonie. Es wird eine Kultur mit NTBC und einer Kultur ohne NTBC für jeden Stamm sein. Inkubieren über Nacht bei 37ºC unter Belüftung mit einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator.
  2. Am nächsten Tag machen LB + NTBC und LB + DMSO Stammlösungen für die Einrichtung des MIC-Assay. Hinzufügen NTBC bei einer Konzentration von 600 & mgr; M, wie dies zweifach verdünnt, als Impfmaterial zugesetzt werden, wodurch man eine Endkonzentration von 300 uM.
    1. Einem antibi testenOhr für einen Stamm, fügen 600 um NTBC bis 2 ml LB und mischen, um den NTBC Stammlösung zu machen. Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB und mischen, die keine NTBC Stammlösung zu machen. Mit diesen Lösungen für die Erstellung Antibiotikum Stammlösungen als auch für den Aufbau der Verdünnungsreihe in 96-Well-Platten.
      HINWEIS: Die Stammlösung Formulierungen zusätzliche Lösung für Pipettierfehler-Konto zu erhalten. Die Stammlösungen kann nach oben oder unten skaliert, wie abhängig von der Anzahl von Antibiotika und getesteten Stämmen erforderlich.
  3. Bereiten Sie die Antibiotika-Lösungen in den LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen.
    HINWEIS: Die Konzentration des Antibiotikums in diesen Lösungen sollte das Doppelte der gewünschten Endkonzentration sein. Genug Lösung sollte, um 100 & mgr; l bis vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen übertragen.
    1. Bereiten Gentamicin +/- NTBC Stammlösung bei 64 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen Sie 0,288 & mgr; l von Gentamicin Lager (100 mg / ml) auf 450ul LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung.
      HINWEIS: Die maximale Konzentration von Gentamicin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 32 & mgr; g / ml.
    2. Machen Sie das Kanamycin +/- NTBC Stammlösung bei 256 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 3,84 & mgr; l Kanamycin Lager (30 mg / ml) und 450 & mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen.
      HINWEIS: Die maximale Konzentration von Kanamycin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 128 ug / ml.
    3. Bereiten Tobramycin +/- NTBC Stammlösung bei 8 & mgr; g / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 0,36 & mgr; l von Tobramycin Lager (10 mg / ml) und 450 & mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen.
      HINWEIS: Für P. aeruginosa PAO1, die maximale Konzentration von Tobramycin beträgt 4 & mgr; g / ml.
      HINWEIS: Die Antibiotika und Konzentrationen eingestellt, damit das Bakterium getestet werden kann.
  4. Füge 100 ul je 2x Antibiotikalösung zu vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Legen Sie diese Lösungen in der Reihe A. Für example sollte Gentamycin in den A1 bis A4 platziert werden sollte Kanamycin in A5 bis A8 angeordnet werden und Tobramycin sollte A9 bis A12 gelegt werden. Siehe 1A für ein Schaltbild einer 96-Well-Platte einzurichten.
    HINWEIS: Mehrere Antibiotika kann in einer Platte getestet werden, aber nur ein Stamm sollte pro Platte getestet, um das Risiko einer Kreuzkontamination von anderen Stämmen zu beseitigen.
  5. In 50 ul der LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung, um Zeilen B bis H der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass eine Platte LB + NTBC und eine Platte LB + DMSO. Siehe 1A.
    1. Verwenden Sie LB + NTBC für die Antibiotika in LB + NTBC. Verwenden Sie LB + DMSO für die Antibiotika in LB + DMSO.
  6. Mit einer Mikroführen zweifachen Reihenverdünnungen der Antibiotika durch die Übertragung von 50 ul der Lösung von Reihe zu Reihe A B. Mischen Sie die Lösung, ändern Sie die Pipettenspitzen, und übertragen Sie 50 ul der Lösung von Reihe B C. Wiederholen Sie zum zu rudern die remaining Zeilen. Nach Verdünnen Reihe G, entfernen Sie 50 ul der Lösung aus dieser Reihe und entsorgen. Verwenden Reihe H als ohne Antibiotika-Steuerung für das Bakterienwachstum. Siehe Abbildung 1B.
    HINWEIS: Jedes der gut in den Reihen A bis G enthält nun 50 ul von Antibiotika in LB + NTBC oder LB + DMSO bei 2X die endgültige gewünschte Konzentration. Row H enthält LB + NTBC oder LB + DMSO ohne Antibiotika.
  7. Messen Sie die OD600 der Übernachtkulturen. Alle Kulturen vor der Einnahme von OD 600 Lesungen in den Medien präsent pyomelanin beseitigen waschen.
    1. Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und Zellpellet in 1 ml LB
  8. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen zu 2.75x10 5 CFU / ml in LB.
    HINWEIS: Es sei angenommen, dass eine OD 600-Einheit ist das Äquivalent von 1x10 & sup9; CFU / ml von P. aeruginosa. OD, um CFU / ml Umwandlungen können d werdenifferent in anderen Bakterien.
  9. Dann werden 50 ul der verdünnten Bakterienkultur zu dem geeigneten gut.
    HINWEIS: Kulturen in NTBC wachsen sollten an die Vertiefungen, die NTBC und Kulturen in DMSO wachsen sollten an die Vertiefungen, die DMSO hinzugefügt werden, hinzugefügt werden. Siehe Abbildung 1B.
    1. In Bakterien drei Brunnen für jeden Stamm und Antibiotikakonzentration. Dann werden 50 ul LB dem vierten gut, um als Kontrolle für die bakterielle Kontaminierung zu handeln. Siehe Abbildung 1B.
    2. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um die Brunnen zu impfen. Sicher, dass die Pipettenspitzen sich in der Nähe der Boden der Vertiefungen beim Hinzufügen Inokulum um eine Kontamination benachbarter Vertiefungen zu verhindern.
      HINWEIS: Durch Hinzufügen Bakterienkultur in die Vertiefungen wird der Antibiotikum und NTBC Konzentrationen zu verdünnen zweifach.
  10. Decken Sie die 96-Well-Platten mit Parafilm und Inkubation etwa 24 Stunden bei 37 ° C. Inkubieren Platten mit 96 Vertiefungen statisch in einem Luft Inkubator.
  11. Untersuchendie Platten für das Bakterienwachstum in den Vertiefungen. Die MHK ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums in der kein Bakterienwachstum wird für alle drei Wiederholungen jedes Stammes gesehen.
    1. Optisch prüfen Sie die Platte für das Wachstum oder lesen unter Verwendung eines Plattenlesegerät-Set bis zu einer OD 600.

4. Spot-Platten-Assay für die oxidative Stressreaktion

  1. Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC wie in Schritt 3.1 beschrieben, getestet werden.
  2. Am nächsten Tag vorzubereiten LB-Agarplatten, die H 2 O 2 als oxidative Stressor. Eine Reihe von H 2 O 2 -Konzentrationen von 0 auf 1 mM ist ein guter Ausgangspunkt.
    1. Schmelzen Sie die LB-Agar-Kolben. Kühles Medium auf etwa 50 ° C bei Raumtemperatur.
    2. Hinzuzufügen H 2 O 2 direkt an den gekühlten Medien in den gewünschten Konzentrationen. Swirl Flaschen zu mischen. Siehe Tabelle 2 für die Konzentration von H 2 O 2und Volumina konzentrierter H 2 O 2 zu. Diese Werte beziehen sich auf 100 ml LB-Agar basiert.
    3. Platten gießen unmittelbar nach Zugabe von H 2 O 2 und Flamm der Oberfläche, um Blasen zu entfernen. Die Ausbeute beträgt 4 Platten pro 100 ml LB-Agar. Markieren die Platten mit dem H 2 O 2 -Konzentration.
    4. Legen Sie die Platten in einer biologischen Flow-Haube mit dem Lüfter läuft für 30 Minuten unbedeckt, um überschüssige Feuchtigkeit aus den Platten zu entfernen.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Platten am selben Tag sie hergestellt werden. Bei Nichtbeachtung kann zu inkonsistenten Daten führen.
      HINWEIS: Oxidativer Stressfaktoren wie Paraquat für H 2 O 2 in diesem Test ausgewechselt werden. Die für andere oxidative Stressoren verwendeten Konzentrationen kann anders als die für H 2 O 2 verwendet wird.
  3. Waschen Sie und Messen der OD 600 der Übernacht-Kulturen wie in Schritt 3.7 beschrieben.
  4. Normalisieren die OD 600 von der ganzen Nacht cultures auf den niedrigsten Wert für die Menge der Stämme getestet. P. aeruginosa hat im allgemeinen eine OD 600 von etwa 2,5, wenn über Nacht in LB + NTBC oder LB + DMSO gewachsen.
    1. Bestimmung der Kulturvolumen benötigt wird, um die Kultur auf die niedrigste OD 600 in einem Gesamtvolumen von 1 ml zu verdünnen. Zum Beispiel, wenn eine Kultur eine OD 600 von 3 und der niedrigste OD 600 für die Menge der Stämme ist 2.5, die folgende Rechnung aus: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert werden.
    2. Berechnung der Menge an LB + NTBC (300 uM) oder LB + DMSO benötigt, um das Kulturvolumen auf 1 ml zu bringen. Zum Beispiel in Schritt 4.4.1 wird die Menge an LB + NTBC oder LB + DMSO zu der Kultur gegeben wäre 0,167 ml (1 ml Gesamtvolumen - 0.833 ml Kultur) sein. Machen Stammlösungen LB + NTBC und LB + DMSO für diese Verdünnungen auf der Basis des zum Verdünnen aller Stämme benötigte Volumen zu verwenden.
    3. Mischen Sie die Kultur und LB + NTBC oder LB + DMSO durch Vortexen.
  5. Kulturen in einer konstanten Konzentration von NTBC oder DMSO zu erhalten, auszuführen zehnfache serielle Verdünnungen der normalisierten Übernachtkulturen in PBS + NTBC oder PBS + DMSO.
    1. Machen Stammlösungen von PBS + NTBC und PBS + DMSO. Für einen Satz von Verdünnungen für einen Stamm, mix 300 um NTBC oder eine gleichwertige Menge von DMSO mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 720 & mgr; l zu ergeben. Skalieren Sie diese Aktien nach oben oder unten, je nachdem, wie viele Stämme getestet.
    2. Label-Mikrozentrifugenröhrchen für 10 -1 bis 10 -7 Verdünnungsreihen. Werden 90 & mgr; l PBS + NTBC oder PBS + DMSO in die entsprechenden Tuben. Verwenden PBS + NTBC für die Stämme in LB + NTBC gewachsen und benutzen PBS + DMSO für die Stämme in LB + DMSO gewachsen.
    3. Zugabe von 10 & mgr; l der Kultur in die entsprechende 10 -1 Verdünnungsröhrchen. Vortexen und übertragen 10 ul der 10 -1 Verdünnung auf 10 -2 Verdünnungsröhrchen. Wiederholen, bis alle Verdünnungen wurden perfoRMED. Ändern Pipettenspitzen zwischen Verdünnungen.
  6. Spot 5 ul der 10 -3 bis 10 -7 Verdünnungen auf LB + H 2 O 2 Platten in doppelter Ausführung für jeden Stamm. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, wenn Flecken überzogen von den meisten zu verdünnen, um mindestens verdünnter (10 -7 bis 10 -3). Nicht kippen oder neigen Sie die Platte, bis die Flüssigkeit in die Platte getrocknet.
  7. Die Platten für 24-48 h bei 37 ° C (Luftinkubator) in Abhängigkeit von der Belastung.
    HINWEIS: P. aeruginosa PAO1 wird recht großen Kolonien auf LB nach 24 Stunden Inkubation haben. Stämmen inkubieren, bis sie Kolonien etwa die gleiche Größe wie PAO1.
  8. Fotografieren Sie die Platten unter Verwendung einer CCD-Kamera über einem transluminator. Bearbeiten Sie optional die Fotos für Kontrast und Ernte auf die gleiche Größe. Zählen die Anzahl der Kolonien in jedem Spot zu Veränderungen in der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress zu bestimmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC Titrationen

Die NTBC Titrationen wurden verwendet, um festzustellen, ob NTBC konnte pyomelanin in P. reduzieren aeruginosa, und auch die Konzentration von NTBC, die eliminiert oder reduziert pyomelanin Produktion für die Verwendung in weiteren Assays identifizieren. Es können Variationen in der Höhe der pyomelanin in verschiedenen Replikationen hergestellt sein, aber allgemeine Trends konstant bleiben. Die NTBC Titrationsassay könnte auch modifiziert werden, um andere Verbindungen, die Pigmentproduktion in andere Bakterien beeinflussen können testen. Dies funktioniert nur, aber wenn es eine phänotypische Veränderung, die visuell bestimmt oder quantifiziert werden kann.

Behandlung pyomelanin produzierende Stämme von P. aeruginosa mit NTBC führte zu einer dosisabhängigen Abnahme in der Pigmentproduktion 12. 2 zeigt, dass verschiedene Stämme von P. aeruginosa haben Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber NTBC, geändert durch die Ebenen der Pyo angegebenMelanin-Produktion. Höhere Konzentrationen an NTBC waren erforderlich, um in der klinischen Isolat PA1111 17 (von Dara Frank erhalten), verglichen mit dem Laborstamm HMGA- :: TN 18 (University of Washington PAO1 Transposon Mutantenbibliothek) reduzieren pyomelanin Produktion. Stämme, die nicht produzieren pyomelanin [PAO1 (von Carrie Harwood erhalten) und HPD :: tn 18 (University of Washington PAO1 Transposon Mutantenbibliothek)] zeigte keine Veränderung in der Pigmentierung mit NTBC Behandlung. Wir haben beschlossen, 300 & mgr; M NTBC für unsere Tests verwenden, da pyomelanin Produktion wurde im wesentlichen in der Laborstamm HMGA reduziert :: tn mit dieser Konzentration (vergleiche 300 & mgr; M bis 0 uM NTBC). Alle Stämme in dieser Studie verwendet wurden bei -80 ° C in 15% Glycerol gelagert.

Antibiotikum MICs

Antibiotika-Mikrofone können mit mehreren Methoden getestet werden. Die hier beschriebene Mikrotiterplatte Verfahren wird die Nutzung zu ermöglichenr, um eine Reihe von Antibiotika-Konzentrationen testen und ressourcenschonend. Ergebnisse werden einfach wiederholt und der Test kann modifiziert werden, um Unterschiede in der Antibiotikasensitivität des Organismus erlauben, getestet werden. Eine gewisse Abweichung zwischen unabhängigen Experimenten zu sehen, aber Trends sind relativ konsistent. Technische Wiederholungen sollten die gleiche MIC aufweisen.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse für verschiedene P. aeruginosa-Stämmen mit und ohne NTBC und verschiedene Aminoglycosid-Antibiotika behandelt. Drei unabhängige Kolonien wurden in dreifacher Ausführung im Folgenden beschriebenen Verfahren getestet. MICs wurden als die niedrigste Konzentration des Antibiotikums, die das Wachstum von Bakterien in allen drei technische Replikate gehemmt aufgezeichnet. NTBC Behandlung hatte keine Auswirkung auf den Aminoglykosid MICs für die getesteten Stämme.

Oxidativer Stress Tüpfelplatte Assay

Der Spot-Platten-Assay zum Testen oxidativen Stress verursacht reproducible Ergebnisse mit niedrigeren H 2 O 2 als die in anderen Assays verwendet. Die Platte ohne H 2 O 2 ist eine Steuerplatte, um die Genauigkeit der Verdünnungsreihe für jeden Stamm zu bestimmen sowie festzustellen, Koloniegröße und die Anzahl der Kolonien in jeder Stelle ohne die Zellen einer oxidativen Stress. In einem geeigneten Verdünnungsreihe, sollte die endgültige Stelle nur sehr wenige Kolonien, während die erste Stelle wird eine unzählige Anzahl der Kolonien auf H 2 O 2 freie Medien. Sollte es eine zehnfache Differenz in der Anzahl der Kolonien in jeder Fleck innerhalb einer Verdünnungsreihe sein. Für alle getesteten Stämme, sollten ähnliche Zahlen von Kolonien in der gleichen Verdünnung auf der H 2 O 2 frei Steuerplatte zu sehen.

Als verschiedene Bakterienstämme können unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber oxidativem Stress, einen Bereich von H 2 O 2 -Konzentrationen getestet werden sollte. Zunehmende Konzentrationen von H 2 O 2 O 2 induzierten oxidativen Stress zeigen. Die Wachstumseigenschaften verschiedener Bakterienstämme können im Vergleich zu der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress in eine bestimmte H 2 O 2 -Konzentration zu bestimmen. Der Test kann modifiziert werden, um die Wirkung einer bestimmten Verbindung oder Reagenz, wie NTBC bestimmen, an einem einzigen Bakterienstamm, wenn die Bakterien gegenüber oxidativem Stress ausgesetzt werden. Kolonien können auch gezählt, um die prozentuale Reduktion der Bakterienkolonie-bildenden Einheiten zwischen den verschiedenen Versuchsbedingungen zu bestimmen.

Figur 3 zeigt eine Tüpfelplatte Assay pyomelanin und nicht pyomelanin produzierende Stämme von P. aeruginosa mit und ohne NTBC behandelt und zu H 2 O 2 induzierten oxidativen Stress ausgesetzt. Es gibt eine klare differenz in der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress bei pyomelanin produzierenden Bakterien werden mit NTBC auch zwischen Bakterien, die nicht pyomelanin Vergleich zu denen, die produzieren Pigment tun produzieren behandelt und. Stämme, die nicht produzieren wollte pyomelanin, entweder natürlich oder durch NTBC Behandlung waren empfindlicher gegenüber oxidativem Stress als Stämme, die pyomelanin produziert.

Abbildung 1
Abb. 1: Schematische Darstellung der Antibiotika-MIC-Assay 96-Lochplatte einzurichten (A) 100 ul 2x Antibiotika der höchsten Ausgangskonzentration sind in der Reihe A. Reihen B bis H werden mit 50 ul entweder LB + NTBC oder LB gefüllt + DMSO ohne Antibiotika. (B) Zwei fache Reihenverdünnungen in Reihen A bis G durchgeführt, was in 50 ul verdünnt Antibiotikum, das in jeder Vertiefung bei 2x die gewünschte Endkonzentration. Row H ist ein Steuer auch für bacterial Wachstum ohne Antibiotika. 50 ul LB oder Inokulum in die entsprechenden Vertiefungen aufgenommen Verdünnen der Antibiotika zweifach auf die Endkonzentration. LB dient als Kontrolle für die bakterielle Kontamination in den Antibiotika. Gm, Gentamicin, Km, Kanamycin; Tob, Tobramycin.

Figur 2
Figur 2: NTBC Titrationen pyomelanin Produzenten und Nichtproduzenten von P. aeruginosa. NTBC reduziert pyomelanin Produktion in einer dosisabhängigen Weise im Labor- und klinischen pyomelanin Erzeuger, aber hatte keine Wirkung auf die Pigmentproduktion in Stämmen, die nicht pyomelanin produzieren. Geändert von Referenz 12.

Figur 3
Abbildung 3: Spot-Platten-Assay für die oxidative Stressantwort Bakterienstämme wurden verdünnte.d zu demselben OD 600, serielle 10-fache verdünnt und auf LB-Platten mit verschiedenen Konzentrationen von H 2 O 2 gesichtet. Die 0 mm H 2 O 2 Platte Ergebnisse zeigten, dass alle Stämme wurden auf geeignete Weise verdünnt, wie durch eine ähnliche Anzahl von Kolonien in jeder der Punkte für die gleiche Verdünnung für verschiedene Stämme angegeben. Die Platten, die H 2 O 2 zeigen, dass die Stämme waren empfindlicher gegenüber oxidativem Stress, wenn die Konzentration von H 2 O 2 erhöht. Dies wird durch eine verringerte Keimzahl in den Spots gegenüber dem kein H 2 O 2 erhalten, ebenso wie eine Verringerung der Koloniegröße angegeben. Geändert von Referenz 12.

Endkonzentration NTBC (um) Volumen NTBC (75,9 mm), um hinzuzufügen (ul)
0 0
50 </ td> 0,659
100 1,318
200 2.64
300 3.95
600 7.91
900 11,86

Tabelle 1: NTBC Konzentrationen für die Einrichtung Titrationen in LB. Diese Tabelle gibt verschiedene NTBC Konzentrationen und die entsprechende Menge an NTBC Lager auf 1 ml LB hinzufügen

Endkonzentration von H 2 O 2 (mM) Menge 9,79 MH 2 O 2 (30% wt) hinzufügen (ul)
0 0
0,2 2.04
0,4 4.09
0.6 6.13
0.8 8.17
1 10,21

Tabelle 2:. Die Konzentrationen von H 2 O 2 auf LB-Agar für den oxidativen Stress Tüpfelplatte Assay hinzufügen Diese Tabelle gibt verschiedene H 2 O 2 Konzentrationen und die entsprechende Menge an konzentrierter H 2 O 2 auf Lager In den auf 100 ml LB-Agar hinzuzufügen.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC HMGA :: tn - NTBC HMGA :: tn + NTBC HPD :: tn - NTBC HPD :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamicin 1 0,5 2 2 1 1 0,5 0,5
Kanamycin 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramycin 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,5 0,5

Tabelle 3: Antibiotic MIC Ergebnisse Drei unabhängige Kolonien wurden in dreifacher Ausfertigung für jede Stra getestet.in. mit Genehmigung aus Lit. 12 neu gedruckt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics