Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Kültür Ortamı Antibiotics hazırlanması 1. ve 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil] -1,3-sikloheksandion (NTBC)

  1. Uygun birimlere LB suyu (% 1 Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 NaCl, H 2 O) ve kısım sağlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayınız.
  2. 100 ml LB agar (% 1 tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 NaCl, H2 O% 1.5 ağar) 250 ml'lik şişelere sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. Agar tabak içine dökülmeden önce eritilir emin olun.
    Not: 4 plakayı verecektir LB agar 100 ml ihtiva eden şişeler. LB agar miktarı tayini için gereken levha sayısı uygun şekilde değiştirilebilir.
  3. (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16 PBS sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav veya filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin.
  4. Gentamisin antibiyotik stok çözümleri hazırlayın, kanamisin, bird tobramisin.
    1. P. uygun antibiyotik stok konsantrasyonları hazırlayın 100 mg / ml gentamisin, 30 mg / ml kanamisin ve 10 mg / ml tobramisin ihtiva eden aeruginosa suşu. 4 ° C'de su, filtre ile sterilize (0,2 um) ve deposunda antibiyotik çözülür. Çalışılan bakteriye bağlı antibiyotik ve konsantrasyonları değiştirin.
  5. NTBC stok çözümleri hazırlayın. DMSO 400 ul NTBC 10 mg eritin. Bu 75,9 mM NTBC bir konsantrasyon elde edilir. -20 ° C'de saklayın NTBC stok çözümleri. Oda sıcaklığında çözülme çözümler gerektiği gibi.
    NOT: NTBC Farklı kaynaklardan çözünürlüğündeki farklılıklar var. Üreticinin önerilerine dayanan NTBC çözülür ve Adım 1.5 buna göre ayarlamak için hangi uygun araç belirleyin.

2. Bakteriyel Suşlarının NTBC Titrasyonları

  1. Suşların kurmak gecede kültürleri test edilecek. 2 ml LB suyu 16 x 150 mm test tüpünü ekles (suş başına bir tane) ve her bir suş 1 izole koloni aşılamak. Bir hava kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator havalandırma ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Ertesi gün, LB suyu NTBC arasında titrasyonları hazırlar. Farklı suşları NTBC duyarlılık farklılıkları beri 0'dan 900 mcM NTBC bir başlangıç ​​aralığı kullanın.
    1. Suş başına 4 ila 5 test tüpleri (16 x 150 mm) 1 ml LB suyu ekleyin.
    2. Bir konsantrasyon aralığında test tüpleri (16 x 150 mm) NTBC stok solüsyonu (75,9 mM) eklenir. LB brot, 1 ml eklemek NTBC konsantrasyonları ve karşılık gelen hazır hacimleri için Tablo 1'e bakınız.
  3. Gece boyunca kültürler OD 600 ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD 600 okuma almadan önce kültürleri yıkayın.
    1. 2 dakika boyunca 16.000 x g'de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Süpernatantı ve herhangi gevşek pelet hücreleri ile kaldırBir mikropipet ve 1 ml LB katı hücre pelletini
  4. OD 600 0.05 titrasyon tüpleri inoküle edin. Tüpleri aşılamak için gerekli yıkanmış kültür miktarını hesaplayın.
    NOT: Bu olmamalı pyomelanin beri ekimlerde için yıkanmış kültürleri kullanın.
  5. Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C sıcaklıkta yaklaşık 24 saat için titrasyon inkübe edin.
  6. Titrasyon tüpleri fotoğraf ve MIC ve oksidatif stres testleri için kullanmak NTBC miktarını belirlemek için içinde ve suşları arasında pigment üretimini karşılaştırın. Hücre içermeyen kültür süpernatanında pyomelanin miktarını belirlemek ve hücre yoğunluğu belirlemek için OD 600 değerlendiriniz.
    Not: hücrelere kültür yüzey maddesinde pyomelanin OD 600 oranı NTBC ile muamele edildikten sonra pyomelanin üretim farklılıkları ölçmek için hesaplanabilir.

3. Antibiyotik Asgari inhibitörlerinin96 oyuklu plakalar içerisinde edici Konsantrasyon (MİK) Deneyi

  1. Suşların ayarlama gece boyunca kültürler ile NTBC olmadan LB içinde test edilmelidir.
    NOT: Bu protokol, 300 mcM NTBC temsilcisi seviyesini kullanarak tarif edilir. Kullanılacak NTBC uygun düzey Aşama 2,6 belirlenir.
    1. 2 ml LB 300 uM NTBC ekleme Herhangi bir NTBC durum için 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim.
    2. Steril kürdan kullanarak, bakteri, bir izole edilen bir koloninin Tüpleri inoküle. NTBC ile tek kültür ve her bir suş için NTBC olmadan tek kültür olacak. Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Ertesi gün, MIC tahlil kurmak için LB + NTBC ve LB + DMSO usta çözümleri yapmak. Aşı ilave edildiğinde, bu da 600 uM bir konsantrasyonda NTBC ekleyin 300 uM'lik bir nihai konsantrasyon verecek şekilde, iki kat seyreltilmiş olacaktır.
    1. Bir antibi test etmek içintek zorlanma, 2 ml LB 600 mcM NTBC ekleyebilir ve NTBC ana çözüm yapmak mix otik. 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim ilave edin ve herhangi bir NTBC ana çözelti yapmak için karıştırın. Antibiyotik stok solüsyonları oluşturmak için hem de 96-yuvalı plakalar içinde bir seyreltme serisi ayarlamak için bu çözüm kullanın.
      NOT: Master çözüm formülasyonları pipetleme hataları hesaba ekstra bir çözüm sağlayacaktır. Test antibiyotik ve suşların sayısına bağlı olarak gerektiği gibi usta çözümleri yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir.
  3. LB + NTBC veya LB + DMSO usta çözümleri antibiyotik çözümler hazırlayın.
    Not: Bu çözeltiler antibiyotik konsantrasyonu iki istenen son konsantrasyonu olmalıdır. Yeterli çözelti 96 oyuklu bir plaka içerisinde dört gözeneğe 100 ul aktarma yapılmalıdır.
    1. Gentamisin +/- 64 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. 450 gentamisin stokunun 0.288 ul (100 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmakul LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözüm.
      NOT: P. gentamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 32 ug / ml'dir.
    2. Kanamisin +/- 256 ug / ml NTBC stok solüsyonu olun. 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere kanamisin stokunun 3,84 ul (30 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmak için.
      NOT: P. kanamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 128 ug / ml'dir.
    3. Tobramisin +/- 8 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti yapmak 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere tobramisin stokunun 0,36 ul (10 mg / ml) ekleyin.
      NOT: P. İçin aeruginosa PAO1 tobramisin maksimum konsantrasyonu 4 ug / ml'dir.
      Not: Test edilecek bakteriler için antibiyotikler ve konsantrasyonlar ayarlanabilir.
  4. Bir 96-yuvalı plaka içinde dört gözeneğe her 2x antibiyotik çözeltisinin 100 ul ekle. Exampl için satır A'da bu çözümleri yerleştirine, gentamisin A4 boyunca A1 yerleştirilmelidir, kanamisin A8 ile A5 yerleştirilmelidir ve tobramisin A12 ile A9 yerleştirilmelidir. Kurmak 96 oyuklu bir plakanın şeması için Şekil 1A bakınız.
    Not: Çoklu antibiyotik bir plaka olarak test edilebilir, ancak yalnızca tek bir suş başka türlerden gelen çapraz kirlenme ihtimalinin ortadan kaldırılması için plaka başına test edilmelidir.
  5. 96 oyuklu plakanın H den satır B LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözeltisi 50 ul ekle. Bu bir tabak olun LB + NTBC ve bir tabak LB + DMSO olduğunu. Şekil 1A bakınız.
    1. LB + antibiyotiklerin NTBC LB + NTBC kullanın. LB + DMSO antibiyotikler için LB + DMSO kullanın.
  6. Bir mikropipet pipet ipuçları değiştirmek, B. karıştırın çözüm satır satır A solüsyonu 50 ul aktararak antibiyotik iki kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek kullanarak ve satır B solüsyonu 50 ul transferi C. tekrarlayın satır remaining satırlar. Satır G sulandırarak sonra o satır ve artıklar gelen çözelti 50 ul çıkarın. Bakteriyel büyüme için hiçbir antibiyotik kontrol olarak satır H kullanın. Şekil 1B bakınız.
    NOT: G aracılığıyla her biri iyi satırlarda A şimdi 2X LB + NTBC veya LB + DMSO antibiyotiğin 50 ul nihai istenen konsantrasyon içerir. Satır H hiçbir antibiyotik LB + NTBC veya LB + DMSO içerir.
  7. Gece boyunca kültürler OD 600 ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD 600 okuma almadan önce tüm kültürleri yıkayın.
    1. 2 dakika boyunca 16.000 x g'de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Bir mikropipetöre ile Süpernatantı ve 1 ml LB hücre pelletini
  8. LB içinde 2.75x10 5 CFU / ml gecede kültürleri sulandırınız
    NOT: Bir OD 600 adet P. 1x10 9 CFU / ml eşdeğer olduğunu varsayalım aeruginosa. CFU / ml dönüşümleri OD d edilebilirDiğer bakteri ifferent.
  9. Uygun kuyuya seyreltilmiş bakteri kültürü 50 ul ekleyin.
    Not: NTBC yetiştirilen kültürler DMSO içinde yetiştirilen NTBC ve kültürler DMSO ihtiva eden oyuklara ilave edilmelidir içeren oyuklara ilave edilmelidir. Şekil 1B bakınız.
    1. Her bir suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç kuyu bakteriler ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon için bir kontrol olarak hareket etmek dördüncü kuyuya LB 50 ul ekleyin. Şekil 1B bakınız.
    2. Boşlukların aşılanması için çok kanallı bir micropipettor kullanın. Komşu kuyuların kirlenmesini önlemek için inokulum eklerken ipuçları kuyuların dibine yakın olduğu pipet olun.
      NOT: kuyulara bakteri kültürü eklemek antibiyotik ve NTBC yoğunluklanyla iki kat sulandırmak olur.
  10. Parafilm, 96 gözlü levhalar kapatılır ve 37 ° C'de yaklaşık 24 saat inkübe edilir. Bir hava kuluçka makinesi içinde, statik 96 oyuklu inkübe edin.
  11. Incelemekkuyularda bakteriyel büyüme için plakalar. MIC bakteriyel büyüme her suşun her üç kopya için görülebilir olduğu en düşük antibiyotik konsantrasyonu.
    1. Görme büyüme için plaka incelemek veya OD 600 plaka okuyucu seti kullanarak okuyun.

Oksidatif Stres Tepki için 4. Nokta Plaka Testi

  1. Aşama 3.1'de tarif edildiği gibi suşların ayarlama gece boyunca kültürler NTBC LB ve olmaksızın test edilecek.
  2. Sonraki gün, bir oksitleyici zor olarak H2O 2 ihtiva eden LB agar plakaları hazırlamak. 0 ila 1 mM, H bir dizi 2 O 2 konsantrasyonları için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır.
    1. LB agar şişeler eritin. Oda sıcaklığında, yaklaşık 50 ° C'ye soğutun ortam.
    2. Arzu edilen konsantrasyonlarda soğutuldu ortam doğrudan O 2 H 2 ekleyin. Girdap şişeler karıştırın. H konsantrasyonları için Tablo 2'ye bakınız 2 O 2ve konsantre H 2 O 2 hacimleri ekleyin. Bu değerler, LB agar 100 ml dayanmaktadır.
    3. Hemen kabarcıklarını çıkarmak için H 2 O 2 ve alev yüzeyi ekledikten sonra plakaları dökün. Verim LB agar 100 ml başına 4 plakalarının. H 2 O 2 konsantrasyonu ile plakaları işaretleyin.
    4. Plakalardan fazla nemi çıkarmak için 30 dakika boyunca çalışan fan ile biyolojik akış kaputu ele tabak yerleştirin.
      NOT: tabak onlar hazırlanır aynı gün kullanın. Bunu yapmamak tutarsız verileri neden olabilir.
      NOT: paraquat oksidatif stres, bu tahlilde, H2O 2 ikame edilebilir. Diğer oksidatif stres için kullanılan konsantrasyonlar, H2O 2 için kullanılanlardan farklı olabilir.
  3. Yıkayın ve adım 3.7'de açıklandığı gibi OD gecede kültürlerin 600 ölçün.
  4. Bütün gece boyunca cu OD 600 Normalesuşları seti için en düşük değere ltures denenmektedir. P. aeruginosa genel LB + NTBC ya da LB + DMSO içinde gece boyunca büyütülmüştür, yaklaşık 2.5 OD 600 yer alır.
    1. 1 ml 'lik bir toplam hacim içinde düşük OD 600 kültürün seyreltilmesi için ihtiyaç duyulan kültür hacminin belirlenmesi. Bir kültür OD 3 600 ve suşlar grubu için en düşük OD 600 yer alır, örneğin, 2.5 olan aşağıdaki hesaplamayı gerçekleştirmek: (2.5) (1 mi) = (3) (x). x = 0.833 mi. Kültür 0,833 ml kadar bir mikrofüj tüpüne yerleştirilir.
    2. 1 ml kültür hacmi getirmek için gerekli LB + NTBC (300 uM) ya da LB + DMSO miktarını hesaplayın. Aşama 4.4.1 Örneğin, LB + NTBC ya da LB + DMSO miktarı 0,167 ml (- 0,833 ml kültür, 1 ml toplam hacim) olacak kültüre ilave edildi. LB + NTBC ve LB + DMSO stok çözeltileri, tüm suşları seyreltilmesi için gerekli hacme dayanarak bu dilüsyonları için kullandığınızdan emin olun.
    3. Kültür ve LB + N MixVorteks TBC veya LB + DMSO.
  5. NTBC veya DMSO sabit bir konsantrasyonda kültürleri korumak için, PBS + NTBC veya PBS + DMSO normalize gece boyunca kültürler on kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek.
    1. PBS + NTBC ve PBS + DMSO stok çözümleri olun. Bir suşu için seyreltileri bir set için, 720 ul bir toplam hacim elde etmek üzere 300 uM NTBC veya PBS ile eşdeğerli bir DMSO hacmi karıştırın. Test kaç suşları bağlı yukarı veya aşağı bu stokları Scale.
    2. 10 -7 seri seyreltme ile 10 -1 Label mikrofuge'de tüpleri. Uygun tüplere PBS + NTBC veya PBS + DMSO 90 ul ekle. LB + NTBC yetiştirilen suşları için PBS + NTBC kullanımı ve LB + DMSO içinde yetiştirilen suşları için PBS + DMSO kullanılır.
    3. Uygun 10 -1 seyreltme tüp kültür 10 ul ekleyin. Vorteks karıştırın ve 10 -2 seyreltme tüpüne 10 -1 seyreltme 10 ul aktarın. Tüm seyreltmeler perfo olmuştur kadar tekrarlayınonaylanmamis. Seyreltilerde arasındaki pipet ipuçları değiştirin.
  6. Her bir suş için kopya halinde LB + H 2 O 2 plakaları üzerinde 10 -7 seyreltileri 10 -3 Spot 5 ul. Noktalar kaplanır, en az seyreltilmiş (10 -7 -3 10) sulandırmak itibaren bir pipet ucu kullanın. İpucu veya sıvı plakasına kuruyana kadar plaka eğmeyin.
  7. Suşuna bağlı olarak 37 ° C'nin (hava kuluçka makinesinde) de 24-48 saat süreyle inkübe edin.
    NOT: P. aeruginosa PAO1 inkübasyon 24 saat sonra LB iyi ölçekli koloniler olacaktır. Bunlar koloniler PAO1 ile yaklaşık olarak aynı boyuta sahip olana kadar suşları inkübe edin.
  8. Bir transluminator üstünde bir CCD kamera kullanarak plakaları fotoğrafını. İsteğe bağlı olarak, aynı boyutta aksine ve ekme için fotoğraflarınızı düzenleyebilir. Oksidatif strese duyarlılık değişiklikleri belirlemek için her yerde koloni sayısını sayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC titrasyonları

NTBC P. pyomelanin üretimini azaltmak mümkün olsaydı NTBC titrasyonları belirlemek için kullanıldı aeruginosa ve aynı zamanda ortadan kaldırır ya da ek tahlillerinde kullanım için üretim pyomelanin azaltır NTBC konsantrasyonunu belirler. Farklı tekrarlamalı üretilen pyomelanin seviyelerindeki varyasyonlar olabilir, ama genel eğilimler sabit kalabilir. NTBC titrasyon testi, diğer bakterilerde pigment üretiminin etkileyebilecek diğer bileşikleri test etmek için modifiye edilebilir. Görsel tespit veya ölçülebilir bir fenotipik değişiklik varsa bu sadece, ancak çalışacaktır.

P. pyomelanin üreten suşların tedavisi NTBC ile aeruginosa pigment üretimi 12 doza bağlı bir azalma ile sonuçlanmıştır. Şekil 2 göstermektedir ki, P. çeşitli tipleri Pyo ve seviyelerinin işaret ettiği gibi aeruginosa, NTBC duyarlılık farklılıklar vardırmelanin üretimi. NTBC yüksek konsantrasyonlarda laboratuvar zorlanma hmgA :: tn 18 (Washington Üniversitesi PAO1 transpozon mutant kütüphane) ile karşılaştırıldığında (Dara Frank elde) klinik izolat PA1111 17 yılında üretime pyomelanin azaltmak için gerekli bulundu. NTBC tedavi ile pigmentasyon hiçbir değişiklik gösterdi pyomelanin [18 (Washington Üniversitesi PAO1 transpozon mutant kütüphanesi) tn (Carrie Harwood elde edilmiştir) PAO1 ve HPD ::] üretemezler suşları. Üretim pyomelanin ölçüde laboratuar suşu hmgA azaldı çünkü :: tn o konsantrasyonu (300 uM 0 uM NTBC karşılaştırın) kullanarak bizim deneyleri için 300 mcM NTBC kullanmaya karar verdi. Bu çalışmada kullanılan tüm suşlar% 15 gliserol içinde -80 ° C'de saklandı.

Antibiyotik MIC

Antibiyotik MIC değerleri çeşitli yöntemler kullanılarak test edilebilir. Burada anlatılan mikrotitre plaka yöntemi kullanılmasını sağlayacakr, antibiyotik konsantrasyonları bir dizi test etmek ve bir kaynak, en az kullanımı. Sonuçlar, kolayca çoğaltılabilecek ve deney, test edilecek organizma, antibiyotik duyarlılığı farklılıklara izin vermek için değiştirilebilir. Bazı değişiklikler bağımsız deneyler arasında görülebilir, ancak eğilimler oldukça tutarlıdır. Teknik çoğaltır aynı MIC göstermelidir.

Tablo 3 farklı P. sonuçlarını gösterir aeruginosa suşu ile NTBC ve çeşitli aminoglikosid antibiyotikler olmadan işlemden geçirildi. Üç bağımsız koloniler tarif edilen yöntem takip üç kopya halinde test edildi. MIC değerleri, her üç teknik çoğaltır bakteri gelişimini inhibe en düşük antibiyotik konsantrasyonu olarak kaydedilmiştir. NTBC tedavisi test suşları için aminoglikosit MIC üzerinde herhangi bir etki.

Oksidatif stres nokta plaka deneyi

Test oksidatif stres spot plaka tahlil reproducibl verirH diğer deneylerde kullanılan daha 2 O 2 daha düşük seviyelerde kullanarak e sonuçlanır. H2O 2 olmadan plakası, her bir suş için seyreltme serisi doğruluğunu saptamak, hem de oksidatif stres hücrelerin tabi tutmadan, koloni büyüklüğü ve her bir nokta koloni sayısını belirlemek için bir kontrol plakadır. İlk nokta H 2 O 2 ücretsiz medya üzerindeki kolonilerin bir sayılamayan sayıda olurken uygun bir seyreltme serisinde son nokta, çok az koloniler olmalıdır. Bir seyreltme serisi içinde her bir nokta kolonilerin sayısında on kat bir fark olması gerekir. Tüm suşlar test için kolonilerin benzer sayılar H 2 O 2 ücretsiz kontrol plaka üzerinde aynı seyreltme görülmelidir.

Şöyle farklı bakteri suşları oksidatif strese farklı duyarlılıklar, 2 O 2 konsantrasyonları test edilmelidir H, bir dizi olabilir. H 2 O konsantrasyonlarının artırılması 2 O 2 uyarılan oksidatif stresi H duyarlı varsayılarak her bir nokta koloni boyutu ve sayısında bir azalma ile gösterildiği gibi büyüme azalması miktarlarda, göstermelidir. Farklı bakteri suşlarının büyüme özellikleri, belirli bir H2O 2 konsantrasyonunun altında oksidatif strese duyarlılığını belirlemek için karşılaştırılabilir. Deney bakterileri oksidatif strese maruz bırakıldığında, tek bir bakteri suşu ile ilgili, örneğin NTBC gibi belirli bir bileşik ya da bir reaktif, etkilerini belirlemek için modifiye edilebilir. Koloniler, aynı zamanda, bakteri kolonisi, farklı deneysel koşullar arasında oluşturucu birimlerin yüzde azalma belirlemek üzere sayılır edilebilir.

Şekil 3 P. pyomelanin ve non-pyomelanin üreten suşlar spot levha deneyi gösterir aeruginosa ve NTBC olmadan tedavi ve H 2 O 2 uyarılan oksidatif stres maruz. Açık bir differe varoksidatif strese duyarlılık üreten bakteri pyomelanin nce NTBC ile işlemden geçirildi, ve aynı zamanda pigment üreten yapmak kıyasla pyomelanin üretmeyen bakteriler arasındaki edilir. Pyomelanin, ya doğal ya da bağlı NTBC tedavisine vermedi suşları pyomelanin üretilen suşları daha oksidatif strese daha duyarlı idi.

Figür 1
Şekil 1:. Antibiyotik MIC deneyi 96-çukurlu plaka şematik ayarlamak (A) en yüksek başlangıç ​​konsantrasyonunun 2x antibiyotik 100 ul H yoluyla B LB + NTBC veya LB da 50 ul ile doldurulur satır A. satırları bulunmaktadır + antibiyotikler olmadan DMSO. (B) iki misli seri seyreltme her oyuğa 2x nihai istenen konsantrasyonda seyreltildi antibiyotiğin 50 ul sonuçlanan G vasıtasıyla sıralar A gerçekleştirilir. Satır H b iyi bir denetim olduğunuantibiyotiksiz İçeriği: Bakteri büyümesi. LB ve inokulum 50 ul nihai konsantrasyona kadar antibiyotik, iki kat seyreltilmesi, uygun oyuklara ilave edilir. LB antibiyotikler bakteriyel kontaminasyon için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Gm, gentamisin; Km, kanamisin; Tob, tobramisin.

Şekil 2,
Şekil 2: pyomelanin üretici ve P. olmayan üreticilerin NTBC titrasyonları aeruginosa. NTBC laboratuar ve klinik pyomelanin üretici doza bağımlı bir şekilde üretimi pyomelanin azaltılabilir, ancak pyomelanin üretmeyen suşları pigment üretimi üzerinde hiçbir etki yapmamıştır. Referans 12 Modifiye.

Şekil 3,
Şekil 3: oksidatif stres yanıtı Spot plaka deneyi bakteriyel suşlar seyreltik idi.Aynı OD 600 d, seri 10-misli seyreltilmiş ve H2O 2 çeşitli konsantrasyonlarını içeren LB plakaları üzerine gördü. 0 mM H2O 2 plaka sonuçlar farklı suşlar aynı seyreltme için noktalardan her kolonilerin benzer bir sayısı ile belirtilen tüm suşlar, uygun şekilde seyreltilmiş olduğu tespit edilmiştir. Suşları H 2 O 2 konsantrasyonu olarak oksidatif strese karşı daha duyarlı olduğu H 2 O 2 gösteri içeren plakalar arttı. Bu, H2O 2 koşulu, hem de koloni boyutu bir azalmaya kıyasla noktalarda azalmış koloni sayımı ile belirtilmiştir. Referans 12 Modifiye.

NTBC (uM) nihai konsantrasyon NTBC (75.9 mM) eklemek için (ul) Hacmi
0 0
50 </ td> 0,659
100 1,318
200 2.64
300 3.95
600 7.91
900 11.86

Tablo 1: Bu tablo, çeşitli NTBC konsantrasyonları ve NTBC stokunun gelen miktarda verir LB içinde titrasyonları kurma NTBC konsantrasyonları 1 ml LB eklemek için

H nihai konsantrasyon 2 O 2 (mM) 9.79 MH 2 O 2 (% 30 wt) miktarı eklemek için (ul)
0 0
0,2 2.04
0.4 4.09
0.6 6.13
0,8 8.17
1 10.21

Tablo 2:. H 2 O 2 konsantrasyonları oksidatif stres nokta plaka tahlil için LB agar eklemek için Bu tablo, farklı H 2 O 2 konsantrasyonları ve 2 O 2 stok 100 ml LB agar eklemek için konsantre H karşılık gelen miktarı verir.

"L65> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC hmgA :: tn - NTBC hmgA :: tn + NTBC HPD :: tn - NTBC HPD :: tn + NTBC PA1111 - NTBC
Gentamisin 1 0.5 2 2 1 1 0.5 0.5
Kanamisin 16 8 32 32 32 32 16 16
Tobramisin 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25 0.25 0.5 0.5

Tablo 3: Antibiotic MIC sonuçları Üç bağımsız koloniler, her bir stra için üç kopya halinde test edildi.içinde. Referans 12. izni ile yeniden basılmış.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics