Udførelse Permanent Distal Mellemøsten Cerebral med Common Arteria carotis Okklusion i Aged Rotter at studere Kortikal Iskæmi med vedvarende handicap

1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, University of London, 2Department of Neuroimaging, James Black Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, University of London, 3Institute of Neuroscience and Psychology, Wellcome Surgical Institute, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, 4Research Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 5Neurology Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 6Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Neuroscience Research Institute, Loyola University Chicago, 7Department of Oncology, The Gray Institute for Radiation, Oncology and Biology, University of Oxford
* These authors contributed equally
Published 2/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine
 

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at producere permanent distal midterste cerebral arterie okklusion hos ældre hunrotter med samtidig okklusion af carotis arterierne til at generere store kortikale infarkter og vedvarende underskud. Vi viser bekræftelse af læsionens størrelse under anvendelse strukturel MRI ved 24 timer og 8 uger efter slagtilfælde.

Cite this Article

Copy Citation

Wayman, C., Duricki, D. A., Roy, L. A., Haenzi, B., Tsai, S. Y., Kartje, G., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. J. Vis. Exp. (108), e53106, doi:10.3791/53106 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Slagtilfælde typisk forekommer hos ældre mennesker med en række følgesygdomme herunder carotis (eller anden arteriel) atherosklerose, forhøjet blodtryk, fedme og diabetes. Derfor når de evaluerer terapier for slagtilfælde hos dyr, er det vigtigt at vælge en model med fremragende ansigt gyldighed. Iskæmisk slagtilfælde tegner sig for 80% af alle slagtilfælde, og størstedelen af ​​disse forekommer i det område af den midterste cerebrale arterie (MCA), ofte fremkalde infarkter, der påvirker sensomotoriske cortex, der forårsager vedvarende plegia eller lammelse på den kontralaterale side af kroppen. Vi demonstrerer i denne video en fremgangsmåde til fremstilling iskæmisk slagtilfælde hos ældre rotter, som forårsager vedvarende sensomotoriske handicap og betydelige corticale infarkter. Specifikt vi give varige distale mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) hos ældre hunrotter ved hjælp diatermi pincet til at okkludere et kort segment af denne arterie. Carotidarterien på den ipsilaterale side til læsionen blev derefter permanently okkluderet og den kontralaterale halspulsåre blev transient okkluderet i 60 minutter. Vi måler infarkt størrelse ved hjælp af strukturelle T2-vægtet magnetisk resonans imaging (MRI) ved 24 timer og 8 uger efter slagtilfælde. I denne undersøgelse var den gennemsnitlige infarktvolumen var 4,5% ± 2,0% (standardafvigelse) på den ipsilaterale hemisfære efter 24 timer (korrigeret for hævelse af hjernen under anvendelse Gerriet ligning, n = 5). Denne model er mulig og klinisk relevant, da den tillader induktionen af ​​vedvarende sensomotoriske mén, hvilket er vigtigt for belysning af patofysiologiske mekanismer og nye behandlinger.

Introduction

Slagtilfælde er for tiden den tredje mest almindelige dødsårsag på verdensplan og den hyppigste årsag til invaliditet 1. Iskæmisk slagtilfælde, der omfatter 80% af alle slagtilfælde, resulterer ofte i infarkter i cortex forårsager tab i sensation (f.eks proprioception), i motorik og i opmærksomhed på den ramte side 2-4. Den midterste cerebrale arterie (MCA) er den største af de fartøjer, der trækker forsyning fra kredsen af Willis og stammer fra den interne halspulsåre 5. MCA er den cerebrale kar mest berørt i iskæmisk slagtilfælde, med slag på dette område tegner sig for 65% af alle iskæmisk slagtilfælde 6,7. MCA leverer både kortikale og subkortikale regioner og neurologiske abnormaliteter forårsaget af MCA slagtilfælde varierer afhængigt af den nøjagtige placering af okklusionen 7. Proksimal MCA okklusioner påvirker den dybe område gennem lenticulostriatal arterier og forårsage store infarkter der omfatter både cortical og subkortikale regioner. I modsætning hertil mere distale okklusioner, der fratager udelukkende kortikale regioner af blodgennemstrømningen tendens til at producere mindre kortikale infarkter.

I store befolkningsundersøgelser, menneskelige slagtilfælde læsioner spænder fra 5-14% af de den ipsilaterale hemisfære 8,9; malign slagtilfælde tegner sig for 10% af slag og giver anledning til større infarkter, der kræver en hemicraniectomy at reducere intrakranielt tryk, og patienter med mindre læsioner er mere tilbøjelige til at overleve 10. Vi demonstrerer en reproducerbar model, der producerer læsioner, der optager en tilsvarende andel af halvkuglen som mange humane slagtilfælde.

Slagtilfælde er en heterogen sygdom; 75% af iskæmisk slagtilfælde er fremkaldt af enten lakunære infarkter (fra obstruktion af intrakranielle små fartøjer); cardioembolic slagtilfælde; eller stor arterie åreforkalkning, som tegner sig for 30% af slagtilfælde. Symptomatisk atherosklerose er hyppigst observeret ved det punkt, hvor den fælles carotid arterie (CCA) filialer i de interne og eksterne halspulsårer 11.

Prækliniske modeller af slagtilfælde skal være så lig den menneskelige tilstand som muligt at simulere sin patofysiologi og bør indarbejde risikofaktorer for slagtilfælde. 92% af iskæmisk slagtilfælde opstår i mennesker over en alder af 65, og andre risikofaktorer omfatter fedme, forhøjet blodtryk, og åreforkalkning, som tidligere diskuteret 12. For bedre at repræsentere disse risikofaktorer, anbefales det at bruge en model, der kan dele nogle af de patofysiologiske funktioner i den naturlige tilstand. I denne protokol, har vi inkluderet fremskreden alder og blokeret blodgennemstrømning gennem carotis arterierne.

Den klassiske model af mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) er den intraluminale filament model af proximal MCA-okklusion, hvilket reducerer blodtilførslen i den forreste og midterste cerebrale arterier. Korte okklusion gange ved hjælp af denne model fokuserer lesion til subkortikale region, hvorimod længere okklusion tider kan resultere i store læsioner rekruttere områder i begge de kortikale og subkortikale områder, hvilket resulterer i en højere dødelighed hos ældre rotter. Til sammenligning indebærer den model, som vores gruppe udfører en kraniotomi og åbning af dura efterfulgt af koagulation af blod og ødelæggelse af en lille del af MCA hjælp bipolære ætsende pincet. Denne diatermi model er tilpasset fra 1981 papir ved Tamura et al. 23 og anvendelse af kraniektomi kan begrænse forhøjet intrakranielt tryk, hvilket er et træk ved den lukkede kraniet, og resulterer i højere reproducerbarhed og en lavere dødelighed i vores kirurgi kohorte i forhold til nogle andre modeller 13. For at generere reproducerbare infarkter og vedvarende handicap vi permanent lukke den proksimale CCA og forbigående okkludere den distale CCA som pr Chen et al. 14 Vi bruger ikke-invasiv T2-vægtet magnetisk resonans imaging (MRI) At vurdere omfanget og placeringen af ​​cerebralt infarkt, og graden af ​​hævelse af hjernen i sensomotoriske cortex.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af institutionelle retningslinjer, som Kings College London, og blev udført i overensstemmelse med det britiske indenrigsministerium retningslinjer og Dyr (videnskabelige procedurer) Act of 1986. Retningslinjer kan variere mellem institutionerne; du sikre overholdelse af institutionelle retningslinier, før du forsøger denne procedure. For at opretholde aseptisk teknik ved berøring udstyr, autoklaveres et stort stykke alufolie og bruge denne til at ombryde omkring udstyr håndtag som på mikroskopet og anæstesiapparatet. Steril plastfolie (plastfolie), kan også anvendes.

1. Fremstilling

  1. Bekendt rotter med gel væske packs (veterinær opsving gel) og blød chow i mindst 48 timer forud for slagtilfælde kirurgi. Som dyr ofte problemer med at spise og drikke efter indgrebet, præsentere dyrene på disse punkter før operation, for at minimere neophobia. Hus ældre rotter med træ tygge blocks at reducere forekomsten af ​​tilgroede tænder (se afsnit 6).
  2. Sterilisere alle kirurgiske værktøjer, før du begynder kirurgiske procedurer ved autoklavering (minimum 121 ° C, 15 PSI, i 15 min). Sanitize alle arbejdsflader anvendelse af 1% chlorhexidin i 70% ethanol og anvende kirurgiske afdækningsstykker og opretholde aseptisk teknik under hele proceduren.
  3. Inducere læsioner på halvkugle kontralaterale den foretrukne pote. Afsætte læsioner til enten venstre eller højre hjernehalvdel afhængigt af den enkelte rotte foretrukne forpote, bestemt af de præ-operative basislinjer i Montoya trappe test 15 (se figur 4). For enkelthedens skyld når der beskriver denne procedure i dette manuskript, venstre pote er den foretrukne pote, og operationer udføres på den højre hjernehalvdel. Brug Lister hætte eller lang Evans rotter i disse adfærdsmæssige tests som de lærer hurtigt.
    Bemærk: Trappen Testen er designet til at måle ændringer i både fint og groft dygtige movements følgende motor-system skader. Trappen består af syv trin på hver side af en central platform. Hvis udstyr til trappen testen ikke er tilgængelig, cylinderen test er et velegnet alternativ til test håndethed, men bemærk, at der kun er en forbigående underskud på denne test i denne model af slagtilfælde, og derfor vil være uegnet til at måle langsigtede genopbygning efter behandling.
    1. Placer tre sukker pellets i brønden af ​​hvert trin (21 pellets pr side). Placer rotter i trappen apparat i 10 minutter og registrere antallet af pellets hentes og antallet af pellets fordrevet på hver side.
      Bemærk: For at indgå i opgaven postoperativt, skal rotter hente minimum 75% pellets ved baseline.

2. Kirurgi

  1. Brug kvindelige ældre Lister-hætte rotter i 16-18 måneder (250-400 g) og fremkalde anæstesi med 5% isofluran i 1,5 l / min O 2. Efter induktion af anæstesi, reducererniveauet af isofluran og fastholde den på et passende men minimerede dybde for kirurgi (fx 1,5-2%). Levere anæstesi til dyret ved en ansigtsmaske, og bruge en latrintømning system til begrænsning af kirurgens eksponering for isofluran.
    1. Udfør alle procedurer op til, men ikke inklusive kraniotomi på fingeret dyr, da denne procedure kan producere adfærdsmæssige mangler 16. Overvej eksperimentelle mål ved udformningen MCAO eksperimenter, og beslutte, om en fingeret gruppe til at kontrollere for kraniotomi eller ikke skal medtages.
  2. Administrer smertelindring præ- eller regelmæs- operativt (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Klippe).
    1. Tilsæt 1 ml til 19 ml sterilt 0,9% saltvand at gøre stamopløsningen og injicere 0,6 ml pr 300 g rotte. Anvendelsen af ​​Carprieve er foretrukket frem Carprofen fordi førstnævnte er stabilt ved stuetemperatur.
  3. Barbere pelsen på den ventrale halsområde og tidsmæssige region på den højre hemisfære ved at udsætte huden. Desinficer de kirurgiske steder usynge ethanol podninger. Vær sikker på at følge de lokale IACUC retningslinjer for hårfjerning.
    1. Udfør dette trin væk fra arbejdsområdet for at minimere mængden af ​​pels på incisionssted.
  4. Placer rotte på en opslagstavle dækket med et sterilt afdækningsstykke i liggende position på en varmepude. Påfør lidocain creme den barberede områder i hoved og hals. Indsæt en rektal sonde til at overvåge og vedligeholde dyrets temperatur mellem 36,5-37,5 ° C med et homeotermisk system.
    1. Sæt lacrilube salve på øjnene for at forhindre udtørring. Giv rotten en injektion af atropin sulfat-opløsning (0,05 ml af en 600 ug / ml opløsning, subkutant) for at reducere tracheale sekreter.
      Bemærk: Forskere bør overveje at måle fysiologiske variable såsom blod gasser og tryk.
  5. Inden du begynder kirurgi, kontrollere bagpote knivspids tilbagetrækning og blinke reflekser at bekræfte fuld bedøvelse.
  6. Under en dissekere mikroanvendelsesområde, lave en 2 cm central midtlinieincision på den eksponerede halsen ved hjælp af en skalpel. Flyt spytkirtlerne forsigtigt laterale til luftrøret på begge sider.
  7. Loop ikke-absorberbar silkesutur omkring huden, der ligger over den fælles carotidarterie på den ene side. Træk forsigtigt væk huden fra stedet ved hjælp af silke sutur og holde disse ned til opslagstavlen ved hjælp kirurgiske tape til at afsløre den fælles halspulsåren. Omhyggeligt blunt dissekere arterierne fri fra omgivende fascia og det vagale nerver ved hjælp fine tænger.
    1. Pas på ikke at beskadige muskel eller vagus nerver under dette trin, da dette vil forringe fodring, synke og trække vejret.
  8. Når den fælles halspulsåre er udsat for, bruge ikke-absorberbar silkesutur (5/0) for at isolere carotis, først adskille carotis fra vagus nerve ved omvendt dissekere med fine pincet og være omhyggelig med ikke at komme i kontakt med nerve. Når skibet er sløjfet (men ikke bundet) med suturen, tefterabe enderne af suturen sammen ved hjælp af kirurgisk tape for at forhindre dette trin bliver ugjort. Fjern suturerne holder tilbage den overliggende hud.
  9. Gentag for den anden side (afsnit 2,7-2,8)
  10. Placer en steril saltopløsning gaze i såret for at holde væv fugtig under den resterende del af operationen. Løst sutur huden og placere en ekstra saltvand gaze over området for at forhindre yderligere dehydrering.
  11. Placere rotter i en lateral position og lave et snit i huden ved midtpunktet mellem den højre bane og den ydre øregang. Træk huden ved hjælp af op til fem elastiske 3 mm krog retraktorer fastgjort til opslagstavlen og derefter sløve dissekerer temporalis musklen til at afsløre kraniet.
  12. Placer en tommelfinger hjul-justeret tyngdekraft-drevne saltvand drypper over det åbne stedet (flow rate ca. 2 ml / min) og oprette en aspirator system til at fjerne knogle rester og rydde mindre blødning fra den udsatte sted i hele denne fase af operationen ( Sektioner 2.13-2.16).
    1. Placer saltvand mundstykke på det højeste punkt af kraniet nær øret, og aspiratoren dyse på det laveste punkt. Juster hjulet under blødninger at levere mere saltvand til området bedre at visualisere kilden til enhver bløder for cautery af fartøjet, hvilket reducerer den tid dyrene er under anæstesi.

Figur 1
Figur 1. Kirurgisk opsætning af den permanente distale midterste cerebral arterie okklusion model. Det udstyr, der anvendes i den sat op til rotte kraniotomi er vist for den højre hjernehalvdel, og indsat, positionering af emhætte og saltvand drypper omkring kraniektomi webstedet. Også vist er de vigtigste elementer i karrene; den midterste cerebrale arterie (rød) og ringere cerebral vene (blå) er vist, og det skraverede område angiver hvor koagulering af arterien indtræder.Bekræftelse af okklusionen udføres ved at skære MCA under ringere cerebral vene. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Udfør en kraniotomi på den eksponerede region (ca. 5 mm x 5 mm) under anvendelse af en tandlægebor med en grov 1,6 mm diamantbelagt bore grat ved ca. 8.000 rpm, sikre anvendelsen af ​​cirkulære og lateralt tryk og ikke nedadgående pres, mens boring det blotlagte område . Når knoglen er tyndt nok, at det ser helt gennemsigtigt, fjerne med pincet.
  2. Brug en hjemmelavet dura-krog, lavet ved at bøje en spids af fine tænger ca. 180 ° til dannelse af en bue, til forsigtigt åbne dura, at være forsigtig for at undgå de store overflade blodkar, som de er sarte og let at briste.
    Bemærk: Det eksponerede areal af hjernen vil afsløre den midterste cerebrale arterie (MCA); den ønskede segmentforanstaltninger ca. 2 mm i længde (se figur 1, indsat).
  3. Koagulere MCA fra, når den ringere cerebral vene krydser, til punktet af arterien bifurkation og derefter langs den kaudale grene af MCA anvendelse af et par diatermi pincet indtil fuldt okkluderet 17. Brug vinklede Juvelér Diatermi pincet med 0,25 mm spidse tips.
    1. Når okkluderende arterien, ændre saltvand flyde som nødvendigt for at holde dette område køligt, forhindrer den koagulerende pincet klæbe til blodkarret. Når okkluderet, vises sort blodkarret og intet tegn på blodgennemstrømningen bør være til stede; blodgennemstrømning kan ses i delvist okkluderet kar.
    2. Skær MCA på dette tidspunkt for at bekræfte fuldstændig okklusion. Brug mikrovaskulære saks, skåret under, når den ringere cerebral vene krydser MCA.
    3. Dække det udsatte område med en saltopløsning gaze pad før der fortsættes til næste trin.
  4. Vend rotten tilbage til en liggende position og genåbne løst bundet sutur på halsen til at re-eksponere halspulsårer. Ligere carotidarterien på samme side som den okkluderede MCA (højre) permanent ved at binde en knude på silkesutur omkring carotis, mens den venstre carotidarterie okkluderes transient anvendelse af en 13 mm rustfrit stål arterie klip med 125 g tryk i 60 min. Løst sutur op indsnit i nakken i løbet af denne tid og sted en steril saltopløsning gaze på toppen for at forhindre dehydrering.
  1. Bemærk, at dyrets højre side vil være på kirurgens venstre siden, i betragtning af den liggende positionering.
  2. For falske dyr, åbne den ventrale del af halsen og tidsmæssige regioner og adskille muskler til at lokalisere de fælles halspulsårer, men ikke okkludere. Har sham dyr gennemgå procedurer op til men ikke inklusive kraniotomi, da denne procedure kan producere adfærdsmæssige mangler 16. For at opretholde blinding af andre team medlemmer (f.eks under senere adfærdsmæssige test), udføre indsnit og suturering.

Figur 2
Figur 2. Tandem carotis okklusion efter mellem-cerebral arterieokklusion. Den højre carotis arterie (CCA) er permanent okkluderet ved at binde en silkesutur (5/0) omkring blodkarret (på venstre side af billedet). Den venstre CCA (på højre side) okkluderes i 1 time under anvendelse af en mikrovaskulær klemme. Disse operationer blev udført pas på ikke at komme i kontakt med vagusnerven på hver side (hvid). Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Sy snittet i den tidsmæssige region i 1 time af venstre carotis okklusion.
  2. Giv rotter 20 ml saltvand subkutant (5 ml til to steder på hver flanke) for at opretholde hydrering (se6.2).
  3. Når 60 min er gået, fjerne klippet. Anvend saltvand topisk til det omgivende muskler, og luk snit i halsen ved hjælp af subkutan kontinuerlig syning af absorberbare suturer (4/0).

3. Skriv operative Care

  1. Placer rotte i en 31 ° C inkubator til at komme sig anæstesi i op til 4 timer.
    Bemærk: Forskere kan foretrækker at bruge andre temperaturer og varigheder efter lokal praksis.
  2. Gentag carprieve (0,25 mg / kg), for smertelindring ved 24 timer. Fordi alle dyr modtager den samme dosis af Carprieve, er denne faktor styres til systematisk. Enhver neuroprotektive effekt af Carprieve sandsynligvis være ubetydelig.
  3. Giv saltvandsinjektioner dagligt for at undgå dehydrering i mindst de første tre dage. Hvis det antages, at en rotte kræver 65 ml væske pr kg legemsvægt (hver 24 timer), sikre, at hver 300 g rotte modtager ~ 22 ml væske om dagen.

4. Conbekræftelse af infarkt

  1. For at måle infarkt volumen bruge strukturel MRI.
    Bemærk: En alternativ fremgangsmåde kunne være at bruge histologisk farvning, såsom tetrazoliumchlorid (TTC), som tidligere er blevet korreleret til strukturelle MRI data 18. Dette kan imidlertid kun anvendes ved slutpunktet for undersøgelsen, og ikke i længderetningen.
    1. Fireogtyve timer efter induktionen af MCAO, bedøver rotter med isofluran (5% til induktion, 1-1,5% for vedligeholdelse) i 0,9 l / min Medical Air og 1 l / min O 2, sikker i en kvadratur fuglebur magnetisk resonans spole (43 mm diameter) og sted i en 7 Tesla vandret boring scanner.
    2. Opnå T2 vægtet scanninger med en hurtig-spin-ekko sekvens: echo tid (TE) 60 msek, gentagelse tid (TR) 4000 msek, synsfelt (FOV) 40 x 40 mm, erhvervelse matrix 128 x 128, erhverve 40 x 0,5 mm tykke skiver i ca. 8 min. Efterfølgende konvertere 40 skiverne i 20 x 1 mm tykke skiver ved hjælp af resampling funktion i medicinsk billedbehandling software.
  2. Opnå læsion mængder i en medicinsk billede display pakke ved måling af tværsnitsarealet af infarkt i 20 volumener. Opnå det samlede volumen ved at multiplicere summen af ​​disse områder med tykkelsen (1 mm). Beregn gruppen betyder volumen og standardafvigelse. For læsion volumen beregninger procent, også erhverve mængder af de ipsilesional og contralesional halvkugler.
  3. For at korrigere for hjernen hævelse på grund af ødem, justere disse værdier ved hjælp Gerriets 'formler 18. Medtag kun skiver, der indeholder cortex og ikke indeholder lillehjernen eller olfaktoriske pærer i henhold til en standard rotte atlas 19 for at undgå over-korrektion, da dette kan generere negative læsioner mængder.
    1. Anskaf T2 vægtede billeder igen 8 uger efter slagtilfælde kirurgi.

5. Prøve Size Beregninger for Fremtidsforskning Vurdering Neuroprotektion og adfærdsmæssige Recovery </ P>

  1. Udfør prøve størrelse beregninger til at estimere den mindste stikprøvestørrelse, der ville blive nødvendige i fremtidige hypotetiske neurobeskyttende eksperimenter ved hjælp af to grupper (kontrol vs. Behandling) for at identificere behandlingseffekt af tre forskellige størrelser (25% reduktion, 50% reduktion, 75% reduktion) ved hjælp af de a priori algoritmer implementeret i magten analyse software 20.
    Bemærk: For at gøre det muligt for læserne at gøre lignende beregninger med deres egne data, der er screenshots fra frit tilgængelige effekt analyse software (se Repræsentative resultater). Brug følgende parametre: acceptabel falsk positiv rate (dvs. type I fejl tærskel, α) ≤0.05 og magt (hvilket svarer til 1-β) ≥0.80 (dvs. mere end 80% effekt). Se nedenfor for forklaringer og en diskussion 21.

6. Ældre dyrevelfærd Efter Stroke Surgery

  1. Gør tilgængelig ekstra blød chow ennd rehydrering gel packs, at rotterne blev vænnet til før operationen, udover vandflasker med udvidede tips til nemmere at nå. Derudover har en absorberbar opsving pad i bure i stedet for løs strøelse (dvs. undgå træflis) for den første 24 timer, og give ekstra nesting sengetøj. Brug ikke pureret mad (f.eks, babymad) som rotter med dysfagi kan kvalt.
  2. Afvej dyr dagligt i 7 dage for at overvåge genvinding. Vægttab er en primær indikation af dehydrering og stress. Vægttab i de første dage efter operationen hovedsagelig afspejler dehydrering (snarere end tab af kropsvægt som følge af nedsat fødeindtagelse).
  3. Når en aldrende rotte viser vægttab relateret til kirurgi, erstatte tabt kropsvægt med en tilsvarende vægt af væske og inspicere de øverste og nederste tænder. Hvor tænder er tilgroet, bedøver rotte med isofluran (som i afsnit 2.1), og sted i rygleje
    1. Placer en 1 ml sprøjte tønde bag teETH at beskytte det bløde væv. Skær ved hjælp af en håndholdt rundsav (f.eks ca. 3 cm i diameter) ved høj rotationshastighed, men med langsomme, faste håndbevægelser (f.eks 3 sek cuts). Tillad rottens tænder til at køle ned mellem udskæringer. Sikre, at den roterende sav er monteret på dornen, således at savens tænder vender i rotationsretningen. Det er værd at holde individuelt indpakket, steriliseret roterende save klar til sådanne eventualiteter.
      Bemærk: Overgrowth kan forekomme hos ældre rotter, selv når det holdes på en hård pellet diæt. Vi anbefaler, at tænderne er tjekket hos ældre rotter regelmæssigt.
  4. Når en ældre rotte viser vægttab og piloerektion relateret til kirurgi, diskutere behandlingsmuligheder med en dyrlæge. Overvej humant dræbe dyret. MR-scanning af sådanne dyr kan vise en hypofysetumor (ofte i ældre hunrotter), der er ubrugelig og dødelig.

Representative Results

Permanent MCAO blev induceret ved at udføre kraniotomi, efterfulgt af koagulering og destruktion af den midterste cerebrale arterie ved diatermi kombineret med permanent okklusion af den ipsilesional fælles carotidarterie og 60 min okklusion af contralesional fælles carotidarterie. En skematisk af opsætningen af udstyret og okkluderet MCA er vist i figur 1, og af carotidarterierne i figur 2 (ovenfor).

Stroke resultat blev vurderet 24 timer og 8 uger efter slagtilfælde ved at måle infarkt volumen på 40 x 0,5 mm skiver (fra rostral ende af lugtekolben til rostral ende af rygmarven) ved hjælp interesseområdet toolkit i en medicinsk billedvisning pakke. En repræsentativ T2 vægtet strukturelle MR-scanning er vist for det samme dyr ved 24 timer og 8 uger (figur 3A). Infarktvolumenet blev identificeret ved de områder af rottehjernen, der viser en hyperintens signal; som T2 vægted billeder viser vand eller plasma som et lyst hvidt område. Det vides, at der er en stigning i ødem og hævelse af hjernen efter slagtilfælde, og dette kan måles fra et T2-vægtet scanning, som er blevet korreleret til histologiske målinger af infarktvolumen 18. Men ødem stede tidligt efter slagtilfælde (fx ved 24 timer) kan føre til en overvurdering af den endelige læsion volumen (fx ved 8 uger), og derfor har vi også til stede gennemsnitlige infarktvolumener justeret med Gerriet formler. Figur 3B viser middelværdier data fra den rå (ikke-justerede) læsion volumen på 24 timer som 62,8 mm 3 (± 25,4 mm 3 SD, øverste graf); dette indtager 9,8% af det ramte halvkugle (± 4,2% SD, midterste graf). Når korrigeret for hjernen hævelse hjælp Gerriets 'formler denne værdi er reduceret til 4,5% (± 2,0% SD, nederste graf).

Slagtilfælde sværhedsgraden blev også målt ved hjælp af Montoya trappetest 15. Kort fortalt, etnimals blev for-trænet til at hente sukkeropløsninger pellets i 4 uger før MCAO slagtilfælde kirurgi, og testet for 8 uger efter slagtilfælde (figur 4) for at bekræfte en vedvarende underskud. Rotter blev anbragt i trappen apparat i 10 min, og antallet af pellets hentes blev registreret (ud af 21 pellets) og vises i procent (gruppe betyder ± standardfejl). En regressionsanalyse blev udført for at passe til linien til dataene.

Figur 5 viser beregning prøvens størrelse ved hjælp infarkt volumen data (for potentielle virkninger af kandidat behandlingsformer), analyseres ved hjælp af en algoritme ved magten analyse software til en t-test ved hjælp af "Forskel mellem to uafhængige midler (to grupper)", og ved hjælp af (ikke-korrigeret ) gennemsnit og standardafvigelser fra figur 3B. Oplysningerne i figur 5 og tabel 1 viser, at der bliver behov 12 rotter per gruppe til at detektere en terapi, der reducerede infARCT volumen med 50% på 24 timer, mens Figur 6 viser en "XY plot" af magt opnås ved hjælp varierende antal dyr. Tabel 1 opsummerer prøve størrelse beregninger for alle tidspunkter.

Figur 3
Figur 3. T2-vægtede strukturelle MRI anvendes til at måle størrelsen af infarkt og hævelse af hjernen efter slagtilfælde. (A) en T2-vægtet magnetisk resonans-billede af samme rottehjerne 24 timer og 8 uger efter induktion af slagtilfælde. Det hvide område er læsionen, men indeholder også nogle vasogent ødem, der løser ved 8 uger. (B) Infarktvolumener blev målt under anvendelse af et medicinsk billede visningspakke Region of Interest Toolkit, og plottes på en graf, der repræsenterer middelværdien ± SD for de 3 tidspunkter anvendte (n = 6). Rå læsion volumen (ikke korrigeret for hjernen hævelse på grund af edEMA), er procentdelen læsion af påvirkede halvkugle (ikke korrigeret for hævelse), og procent læsion af halvkugle korrigeret for hjernen hævelse hjælp Gerriets 'formler vist her. SD blev anvendt i stedet for SEM for at udføre prøve størrelse beregninger (se figur 5). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Trappen test viser nedskrivninger i gribe og hente piller. I denne slagtilfælde model der var meget lidt spontan helbredelse. Slagtilfælde hos ældre rotter vedvarende forringer fingerfærdighed, vist ved ugentlige test ved hjælp af "trappe test" af pellet nå. Indsat: Et billede af en rotte udfører adfærdsmæssige test. Grafen viser den gennemsnitlige (± stativard fejl) antal pellets hentes (ud af 21, udtrykt i procent) per uge af den påvirkede forpote. n = 5. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Eksempel på størrelse beregninger for at bestemme gruppenumre af rotter, der kræves til at detektere en ønsket terapeutisk virkning. Dette skærmbillede, taget fra magt analyse software, viser, at 12 rotter per gruppe ville være påkrævet for at detektere en terapi, der reducerede infarktvolumen med 50% på 24 timer. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Effekt opnået under anvendelse af forskellige totale antal af dyr. En "XY plot for et interval af værdier" fra magt analyse software viser den effekt, der ville blive opnået for forsøg med forskellige (i alt) antallet af ældre rotter, i betragtning af de parametre vist i figur 5. tabel 1 opsummerer alle vores resultater. klik her for at se en større version af dette tal.

Tid efter slagtilfælde: Antal rotter per gruppe kræves til påvisning af en reduktion i læsionsvolumen af:
75% 50% 25%
24 timer 6 12 42
8 uger 4 5 17

Tabel 1. Beregninger af stikprøvestørrelser per gruppe for hypotetiske fremtidige eksperimenter. Beregnet ved hjælp af magt analyse software (se figur 5 og 6). Tabellen viser antal rotter per gruppe kræves for en to-gruppe eksperiment for at påvise en 25%, 50% og 75% reduktion i læsionsvolumen ved hver af tidspunkter i denne undersøgelse.

Discussion

MCAO i gnavere er en teknik, der ofte anvendes til at modellere humant slagtilfælde. Denne model har et par detaljer at bemærke i protokollen. For det første er det vigtigt at opretholde dyrets kropstemperatur hele forsøget da dette påvirker størrelsen af ​​infarktet og antallet af døde i en undersøgelse. Det kan være muligt at afbryde isofluran under forbigående okklusion af den højre CCA og holde rotter i et opvarmet, roligt miljø at øge overlevelsesprocenten ved at reducere eksponering for isofluran. Forskerne bør overveje, om en kortere anæstesi periode opvejer stress af ekstra induktion. Vaskulaturen (f.eks MCA forgrening) af rotterne varierer i og mellem kohorter af dyr 22. Det er vigtigt at huske dette, når der begynder en ny undersøgelse. Forskellige CCA okklusion gange kan evalueres (fx 30, 45, 60 og 90 min). I denne undersøgelse anvendes en okklusion på cirka 60 minutter. I andre undersøgelser har vi fundet, at 45min okklusioner forårsage en tilsvarende størrelse kortikal infarkt, men med anekdotiske beviser af forbedrede overlevelse. Følgelig har de kirurger begynder med en kort occlusionstid (f.eks, 30 min) for at se, om der opnås tilstrækkelige læsioner volumener (og / eller krævede adfærdsmæssige mangler) og først derefter at øge okklusion gange om nødvendigt. Adfærdsmæssige underskud er ikke opretholdt i voksne rotter sammenlignet med ældre rotter med identiske okklusion gange.

MR kan bruges til at vurdere, om (efter en bestemt okklusion tid) læsion mængder er passende for undersøgelsen mål. En lille læsion ville spænde mindre end ti 0,5 mm koronale skiver (ud af 40). En medium størrelse læsion ville spænde mellem ti og tyve koronale skiver. En stor læsion ville spænde mellem tyve og tredive koronale skiver. En meget stor læsion ville spænde mere end tredive af de fyrre skiver. Det er vores erfaring, rotter med meget store læsioner (mere end tredive skiver) og / eller dokumentation for brok akroers midterlinjen normalt har dårlig prognose: kortere okklusion gange kan overvejes. MR er også nyttigt til vurdering af infarkt placering: nogle er mere kaudalt placeret og nogle er mere rostrally placeret.

Vær ekstra forsigtig, når adskillelse vagusnerven fra både almindelige halspulsårer. Rales (raspende) kan forekomme efter slagtilfælde kirurgi og dette kunne være på grund af nerveskader i nogle dyr, selv om årsagen er endnu uklart: i vores erfaring, prognose er meget dårlig for disse dyr, og det er normalt anbefales til humant dræbe dem.

De permanente diatermi MCAO modelresultater i reproducerbare kortikale infarkter og acceptable postoperative overlevelse hos ældre rotter. Teknikken gør dog kræve invasiv kirurgi under et stereomikroskop. Det er vigtigt at opretholde aseptisk teknik, hvis dyrene skal genoprettes godt fra kirurgi. Der skal udvises forsigtighed for ikke at beskadige MCA mens udsætter og koagulering arterien,og beskadigelse af kortikale overflade bør minimeres ellers blotlagte område af cortex kan udgøre en del af infarktområde. Det anbefales at få så meget erfaring som muligt at etablere proceduren og opnå ensartede infarkter og bestemme okklusion gange før en undersøgelse er udført for at teste kandidat terapier, f.eks. Eksperimentatorer bør randomisere nogen behandlinger indenfor kirurgi sessioner ( "blok randomisering"), hvor det er muligt. Det er værd at bemærke, at denne model ikke omfatter MCA reperfusion (medmindre transient MCA ligering anvendes i stedet for diatermi). Dødeligheden kan være høj i ældre rotter med disse store kortikale infarkter, men det skulle være muligt at nedbringe dødeligheden ved at bruge kortere okklusion gange, og ved at minimere eksponeringen for generel anæstesi hvor det er muligt (fx under okklusion). Anvendelsen af 70% N 2 O og 30% O2 som en bærer kan tillade lavere niveauer af isofluran skal anvendes: denne reducerede eksponering for isoflurane kan resultere i højere overlevelsesrater.

Et andet punkt at overveje, er, at åreforkalkning er en gradvis proces, mens vi i denne protokol simulere det med akut CCA okklusion. Men den betydelige reduktion i blodgennemstrømningen og vedvarende underskud simulere tandem okklusioner, der forekommer i mange patienter med slagtilfælde. Permanent distale MCAO uden tandem CCA okklusion hos rotter formår at fremkalde slagtilfælde reproducerbart 14: øvrigt uden tandem CCA okklusion, har vi fundet betydelig spontan helbredelse indtræffer som udelukker langsigtede adfærdsmæssige evaluering af slagtilfælde terapier over 8 uger. I modsætning hertil viser vi, at distal MCAO med tandem CCA okklusion inducerer langsigtede underskud hos ældre rotter.

Afslutningsvis denne procedure i rotter forårsager streger, der er ens i størrelse og placering til dem, der ses i den menneskelige tilstand, med vedvarende handicap, at man kan bruge til at aktivere afprøvning af nye behandlinger og udredning af remekanismer par efter iskæmisk slagtilfælde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 0.25 mg/kg
Atropine Sulfate AmTech RXATRINJ-100
Alcohol swabs UHS 20021
Lidocaine cream (Emla) AstraZeneca 0012901 Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
Forceps Fine Science Tools 11019-12
Isoflurane Abbott B506
Silk sutures Harvard Apparatus 723288
Cautery system Eschmann
0.25 mm Jeweler cautery forceps Eschmann 8330349
fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
Thumb driven saline drip system
Vacusafe aspirator system INTEGRA BIOSCIENCES 158320
1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs K801 104 016
Handheld dental drill NSK NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
Microvascular scissors World Precision Instruments 501790
4-0 Vicryl sutures Ethicon
Vascular clip and applicator
Operating microscope Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
25 g needles Terumo NN-2525R
syringes (1 ml and 5 ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
gauze sterilize before use
Medical Imaging Package (Jim) Xinapse Free software
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) UCL Free software
Power Analysis Software (G*Power) Universität Düsseldorf Free software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
  2. Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
  3. Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
  4. Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
  5. Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. Elsevier. 384-424 (2011).
  6. Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
  7. Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 1-27 (2009).
  8. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
  9. Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
  10. Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
  11. Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 28-39 (2009).
  12. Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
  13. Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
  14. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
  15. Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
  16. Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
  17. Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
  18. Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
  19. Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
  20. Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
  21. Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
  22. Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
  23. Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats