Automatic Translation

This translation into Norwegian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Medicine

Utføre Permanent Distal Middle Cerebral med arteria carotis communis okklusjon i eldre rotter å studere kortikal iskemi med vedvarende Disability

*1,2, *1,2, 3, 1, 4, 4,5,6, 7, 2, 1

1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, University of London, 2Department of Neuroimaging, James Black Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, University of London, 3Institute of Neuroscience and Psychology, Wellcome Surgical Institute, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, 4Research Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 5Neurology Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 6Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Neuroscience Research Institute, Loyola University Chicago, 7Department of Oncology, The Gray Institute for Radiation, Oncology and Biology, University of Oxford

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Her presenterer vi en protokoll for å produsere permanent distal midten cerebral arterie okklusjon hos eldre hunnrotter med samtidig okklusjon av halspulsårene å generere store kortikale infarkter og vedvarende underskudd. Vi viser bekreftelse av lesjon størrelse ved hjelp av strukturelle MR på 24 timer og 8 uker etter hjerneslag.

    Date Published: 2/23/2016, Issue 108; doi: 10.3791/53106

    Cite this Article

    Wayman, C., Duricki, D. A., Roy, L. A., Haenzi, B., Tsai, S. Y., Kartje, G., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. J. Vis. Exp. (108), e53106, doi:10.3791/53106 (2016).

    Abstract

    Stroke vanligvis forekommer hos eldre mennesker med en rekke samtidige sykdommer, inkludert carotis (eller annen arteriell) aterosklerose, høyt blodtrykk, fedme og diabetes. Følgelig, ved vurdering av terapi for slag hos dyr, er det viktig å velge en modell med utmerket ansikt gyldighet. Iskemisk hjerneslag står for 80% av alle slag, og de fleste av disse forekommer i territoriet til midten cerebral arterie (MCA), ofte indusere infarkter som påvirker sensorimotor cortex, forårsaker vedvarende plegia eller pareser på motsatt side av kroppen. Vi viser i dette video en fremgangsmåte for fremstilling av iskemisk slag hos eldre rotter, noe som fører til vedvarende sensorimotoriske uførhet og betydelige kortikale infarkter. Nærmere bestemt, induserer vi permanent distale tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO) i eldre hunnrotter ved hjelp av diatermirelatert tang for å okkludere et kort segment av denne arterie. Halspulsåren på den ipsilaterale side til lesjonen ble deretter permanently okkludert og den kontralaterale halsarterie ble okkludert transient i 60 min. Vi måler infarktstørrelsen ved hjelp av strukturelle T2-vektet magnetisk resonans imaging (MRI) på 24 timer og 8 uker etter hjerneslag. I denne studien var det midlere infarktvolum var 4,5% ± 2,0% (standardavvik) av den ipsilaterale hemisfæren ved 24 timer (korrigert for hjerne hevelse ved hjelp Gerriet likning, n = 5). Denne modellen er mulig og klinisk relevant da den tillater induksjon av vedvarende sensorimotor underskudd, noe som er viktig for klarlegging av patofysiologiske mekanismer og nye behandlinger.

    Introduction

    Hjerneslag er i dag den tredje vanligste dødsårsaken i verden og den ledende årsaken til uførhet 1. Iskemisk hjerneslag, som består av 80% av alle slag, ofte resulterer i infarkter i cortex forårsake tap i sensasjon (f.eks propriosepsjon), i motorisk funksjon og oppmerksomhet til den berørte side 2-4. Den midterste cerebral arterie (MCA) er den største av fartøyene som trekker forsyning fra sirkelen av Willis og stammer fra den interne carotisar 5. MCA er cerebral fartøyet mest berørt i iskemisk slag, med slag i dette området står for 65% av alle iskemisk slag 6,7. MCA leverer både kortikale og subkortikale regioner og nevrologiske abnormiteter forårsaket av MCA hjerneslag varierer avhengig av den nøyaktige plasseringen av okklusjon 7. Proksimale MCA okklusjoner påvirke dypt territorium gjennom lenticulostriatal arteriene og forårsake store infarkter omfatter både Cortical og subkortikale regioner. I kontrast, mer distale okklusjoner som fratar utelukkende kortikale regioner av blodstrøm tendens til å produsere mindre kortikale infarkter.

    I store befolkningsstudier, menneske hjerneslag lesjoner varierer fra 5-14% av den ipsilaterale halvkule 8,9; ondartet slag står for 10% av slag og gir opphav til større infarkter, som krever en hemicraniectomy å redusere intrakranielt trykk, og pasienter med mindre skader er mer sannsynlig å overleve 10. Vi viser en reproduserbar modell som produserer lesjoner som opptar en tilsvarende andel av halvkulen som mange menneskelige slag.

    Hjerneslag er en heterogen sykdom; 75% av iskemisk slag blir indusert av enten lakunære infarkter (fra obstruksjon av intrakranielle små fartøy); kardioembolisk slag; eller stor arterie aterosklerose, som står for 30% av slag. Symptomatisk aterosklerose er mest hyppig observert ved det punkt hvor den felles carotid arterie (CCA) grener i de interne og eksterne carotis 11.

    Prekliniske modeller av hjerneslag bør være så lik den menneskelige tilstand som mulig for å simulere sin patofysiologi og bør innarbeide risikofaktorer for hjerneslag. 92% av iskemisk hjerneslag oppstår hos personer over 65 år, og andre risikofaktorer er overvekt, høyt blodtrykk, og aterosklerose, som tidligere omtalt 12. For bedre å representere disse risikofaktorene, er det anbefalt å bruke en modell som kan dele noen av de patofysiologiske trekk ved den naturlige tilstanden. I denne protokollen, har vi inkludert høy alder og hindret blodstrømmen gjennom carotis.

    Den klassiske modellen av midten cerebral arterie okklusjon (MCAO) er intraluminal filament modell av proksimale MCA okklusjon, som reduserer blodgjennomstrømningen i fremre og midtre cerebrale arterier. Korte okklusjon ganger med denne modellen fokuserer lesion til subkortikale region, mens lengre okklusjon ganger kan føre til store skader rekruttere områder av både kortikale og subkortikale områder, noe som resulterer i en høyere dødelighet hos eldre rotter. Til sammenligning, innebærer den modellen som brukes ved vår gruppe utfører en kraniotomi og åpning av dura, etterfulgt av koagulering av blod og ødeleggelse av en liten del av MCA ved hjelp av bipolare cauterizing tang. Dette diatermi modellen er tilpasset fra 1981 artikkel av Tamura et al. 23 og bruk av craniectomy kan begrense forhøyet intrakranielt trykk, som er en funksjon av den lukkede hodeskallen, og resulterer i høyere reproduserbarhet og lavere dødelighet i våre kirurgi kohort sammenlignet med noen andre modeller 13. For å generere reproduserbare infarkter og vedvarende uførhet vi tilstoppe permanent proksimale CCA og forbigående tilstoppe distale CCA som per Chen et al. 14 Vi bruker non-invasiv T2-vektet magnetisk resonans imaging (MRI) For å evaluere graden og plassering av cerebralt infarkt, og graden av hjerne svelling i sensorisk-cortex.

    Protocol

    Denne protokollen ble godkjent av institusjonelle føringer fra Kings College London, og ble utført i samsvar med de britiske hjemmekontoret retningslinjer og Dyr (vitenskapelige prosedyrer) loven av 1986. Retningslinjene kan variere mellom institusjoner; må du sørge for tilslutning til institusjonelle retningslinjer før du prøver denne prosedyren. For å opprettholde aseptisk teknikk når du berører utstyr, autoklav et stort stykke aluminiumsfolie og bruke dette til å vikle rundt utstyret håndterer eksempel på mikroskopet og anestesi maskin. Steril plastfolie (plastfolie) kan også brukes.

    1. Forberedelse

    1. Gjør rotter med gel væske pakker (veterinær utvinning gel) og myk chow i minst 48 timer før hjerneslag kirurgi. Som dyr ofte finner problemer med å spise og drikke etter inngrepet, introdusere dyrene til disse elementene før operasjonen, for å minimere neophobia. Hus eldre rotter med tre tygge blocks å redusere forekomsten av overgrodde tenner (se kapittel 6).
    2. Steriliser alle kirurgiske verktøy før du begynner kirurgiske prosedyrer ved autoklave (minimum 121 ° C, 15 PSI, for 15 min). Desinfisere alle arbeidsoverflater ved å bruke 1% klorheksidin i 70% etanol og bruke kirurgiske forheng og opprettholde en aseptisk teknikk for varigheten av prosedyren.
    3. Fremkall lesjoner på halvkule kontralateral til den foretrukne labben. Fordele lesjoner til enten venstre eller høyre hjernehalvdelen avhengig av hver rotte foretrukne forpoten, bestemmes av pre-operative grunnlinjene i Montoya trapp test 15 (se figur 4). For enkelhets skyld, når de beskriver denne prosedyren i dette manuskriptet, er den venstre pote den foretrukne pote, og operasjoner er utført på den høyre hjernehalvdelen. Bruk Lister Hooded eller Long Evans rotter for disse adferdstester som de lærer raskt.
      Merk: Trappen testen er utformet for å måle endringer i både fin- og grov dyktig movements følgende motorskader. Trappen består av syv trinn på hver side av en sentral plattform. Dersom utstyr for trapp testen ikke er tilgjengelig, er sylinderen test et egnet alternativ for testing håndbruk, men oppmerksom på at det er bare en forbigående underskudd på denne testen i denne modellen for slag, og vil derfor være uegnet til å måle langtids restitusjon etter behandling.
      1. Plasser tre sukker pellets i brønnen av hvert trinn (21 pellets pr side). Plasser rotter i trappeoppgangen apparat i 10 minutter og registrere antall pellets hentet og antallet pellets ford på hver side.
        Merk: For å være med i oppgaven postoperativt, må rotter hente minimum 75% pellets ved baseline.

    2. kirurgi

    1. Bruk kvinnelige eldre Lister-hetterotter ved 16-18 måneder (250-400 g) og indusere anestesi med 5% isofluran i 1,5 L / min O 2. Etter induksjon av anestesi, reduserenivået av isofluran og opprettholde den ved en tilstrekkelig, men reduseres til et minimum dybde for kirurgi (for eksempel 1,5-2%). Lever anestesi til dyret av en ansiktsmaske, og bruke en scavenging system for å begrense kirurgens eksponering for isofluran.
      1. Utfør alle prosedyrer opp til, men ikke inkludert craniotomy på narre dyr, som denne prosedyren kan gi adferdsmessige mangler 16. Tenk eksperimentelle mål ved utforming MCAO eksperimenter, og avgjøre om en falsk gruppe å kontrollere for kraniotomi eller ikke bør inkluderes.
    2. Administrere smertelindring før eller peri- operativt (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Kuttes).
      1. Tilsett 1 ml til 19 ml steril 0,9% saltoppløsning for å gjøre stamløsningen og injisere 0,6 ml per 300 g rotte. Bruken av Carprieve er foretrukket fremfor karprofen fordi det tidligere er stabil ved romtemperatur.
    3. Barbere pelsen på ventral nakkeregionen og tinning på den høyre hjernehalvdelen til å eksponere huden. Desinfisere kirurgiske områder usynge etanol vattpinner. Pass på å følge lokale IACUC retningslinjer for hårfjerning.
      1. Utføre dette trinnet bort fra operasjonsområdet for å minimere mengden av pelsen ved innsnitt området.
    4. Plasser rotte på en korktavle dekket med en steril drapere i liggende stilling på en varmepute. Påfør lidokain krem ​​til de barbert regioner i hode og nakke. Sett inn en rektal probe for å overvåke og opprettholde dyrets temperatur mellom 36,5 til 37,5 ° C med en homeothermic system.
      1. Sett lacrilube salve på øynene for å hindre uttørking. Gi rotten en injeksjon av atropin sulfatløsning (0,05 ml av en 600 pg / ml oppløsning, subkutant) for å redusere tracheal sekret.
        Merk: Forskere bør vurdere å måle fysiologiske variabler som blodgasser og trykk.
    5. Før du begynner kirurgi, sjekk bakpote klype tilbaketrekking og blinke reflekser for å bekrefte fulle anestesi.
    6. Under en dissekere mikroomfang, gjør en 2 cm sentral midtlinjesnitt på den eksponerte halsen ved hjelp av en skalpell. Flytt spyttkjertlene forsiktig side til luftrøret på begge sider.
    7. Loop ikke-absorberbare silkesutur rundt den huden som ligger over arteria carotis communis på den ene side. Trekk forsiktig bort huden fra stedet ved hjelp av silke sutur og hold disse ned til korktavle ved hjelp av kirurgisk tape for å avdekke felles halspulsåren. Nøye sløv dissekere arteriene gratis fra omkringliggende fascia og vagalnervene bruker fine tang.
      1. Vær forsiktig så du ikke skader muskel eller nervus vagus i dette trinnet, da dette vil svekke fôring, svelge og puste.
    8. Når arteria carotis communis er utsatt, bruke ikke-absorberbare silke sutur (5/0) for å isolere carotis, først skille carotis fra nervus vagus ved omvendt dissekere med fine tang og være forsiktig med å ta kontakt med nerve. Når fartøyet har vært i sløyfe (men ikke bundet) med sutur, tape endene av suturen sammen ved hjelp av kirurgisk tape for å hindre at dette trinn er ugjort. Fjern sting holder tilbake den overliggende huden.
    9. Gjenta for den andre siden (§§ 2,7-2,8)
    10. Plasser en steril saltløsning-gjennomvåt gasbind inn i såret for å holde vevet fuktig under resten av operasjonen. Løst sutur huden og plassere en ekstra saltvann-fuktet gasbind over området for å forhindre ytterligere dehydrering.
    11. Plasser rotter i en sideleie og lage et snitt i huden på midtpunktet mellom rett bane og ytre øregangen. Trekk huden med opptil fem elastiske 3 mm krok haker festet til korktavle og deretter sløv dissekere temporalis muskelen til å avsløre skallen.
    12. Plasser en tommelhjulet justert gravitasjon-drevet salt drypp over det åpne området (strømningshastighet ca. 2 ml / min) og sette opp en vifte system for å fjerne bein rusk og for å fjerne mindre blødning fra konkurranseutsatt område i hele denne fasen av operasjonen ( Sektioner 2.13-2.16).
      1. Plasser saltvann levering munnstykket på det høyeste punktet av skallen nær øret, og aspirator munnstykket på det laveste punktet. Juster hjul under bleed å tilføre mer saltløsning til området for å bedre visualisere kilden for en hvilken som helst lufte for kirurgi til fartøyet, å redusere mengden av tid dyrene er under anestesi.

    Figur 1
    Figur 1. Kirurgisk satt opp av den permanente distal midten cerebral arterie okklusjon modell. Utstyret som brukes i oppsettet for rotte kraniotomi er vist for den høyre hjernehalvdelen, og innfelt, plasseringen av aspirator og saltvann dryppe rundt craniectomy nettstedet. Også vist er de viktigste funksjonene i blodkar; midten cerebral arterie (rød) og dårligere cerebral blodåre (blå) er vist, og det skraverte området indikerer hvor koagulering av arterien oppstår.Bekreftelse av okklusjon utføres ved å kutte MCA under dårligere cerebral blodåre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    1. Utføre en kraniotomi på den eksponerte område (omtrent 5 mm x 5 mm) under anvendelse av en dental drill med en grov 1,6 mm diamantbelagt bore graden ved omtrent 8000 rpm, noe som sikrer anvendelsen av sirkulære og sidetrykk og trykk ikke nedad mens boring av det eksponerte området . Når benet er tynn nok til at det ser helt gjennomsiktig, fjerne ved hjelp av tang.
    2. Bruke en hjemmelaget dural krok, laget ved å bøye en spiss av fin pinsett omtrent 180 ° for å danne en bue, for å nøye åpne dura, ved å være forsiktig for å unngå store overflate blodkar, som de er skjøre og lett for å sprekke.
      Merk: eksponert område av hjernen vil avdekke midten cerebral arterie (MCA); ønsket segmentmåler omtrent 2 mm i lengde (se figur 1, innfelt).
    3. Koagulere MCA fra hvor underlegne cerebral vein kors, til det punktet av arterien delinger og deretter langs hale grener av MCA ved hjelp av et par diatermirelatert tang til den er helt innesluttet 17. Bruk vinklede gullsmeden diatermirelatert pinsett med 0,25 mm spisse tips.
      1. Når occluding arterien, endre saltvann strømmer som er nødvendig for å holde dette området kjølig, hindrer koagulere tang fester seg til blodkaret. Når tildekket, vises blodåre svart og ingen tegn til blodstrømmen bør være til stede; blodstrømmen kan sees i delvis okkludert fartøy.
      2. Kutt MCA på dette punktet for å bekrefte fullstendig okklusjon. Ved hjelp av mikrovaskulære saks, klippe under der dårligere cerebral blodåre krysser MCA.
      3. Dekk eksponert område med en salt-gjennomvåt gasbind puten før du fortsetter til neste trinn.
    4. Slå rotta tilbake til en liggende posisjon og åpne løst knyttet sutur på halsen for å re-eksponere carotis. Ligere halspulsåren på samme side som det okkluderte MCA (høyre) permanent ved å knyte en knute i den silkesutur rundt carotis, mens den venstre halspulsåren blir okkludert forbigående ved hjelp av en 13 mm rustfri stål arterie klips med 125 g trykk for 60 min. Løst sutur opp snittet i nakken i løpet av denne tiden, og plassere et sterilt saltvann gjennomvåt gasbind på toppen for å unngå dehydrering.
    1. Merk at dyrets høyre side vil være på kirurgens venstre side, gitt liggende posisjonering.
    2. For narre dyr, åpne ventrale del av halsen og timelige regioner og skille muskler til å finne felles carotis, men ikke tilstoppe. Har humbug dyr gjennomgå prosedyrer opp til, men ikke inkludert kraniotomi, som denne prosedyren kan gi adferdsmessige mangler 16. For å opprettholde blinding av andre tEAM medlemmer (for eksempel under senere atferds testing), utføre snitt og suturering.

    Figur 2
    Figur 2. Tandem karotid okklusjon etter tilstopping av midtre cerebralarterie. Den høyre arteria carotis communis (CCA) er permanent okkludert ved å binde en silkesutur (5/0) rundt blodkaret (på den venstre side av bildet). Den venstre CCA (på høyre side) er blokkert i 1 time ved anvendelse av en mikrovaskulær klemme. Disse operasjonene ble utført tar seg ikke å få kontakt med vagusnerven på hver side (hvit). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    1. Sy snitt i tinning under en time fra venstre felles carotis okklusjon.
    2. Gi rotter 20 ml saltvann subkutant (5 ml til to steder på hver flanke) for å opprettholde hydrering (se6.2).
    3. Når 60 min har gått, fjerne klippet. Påfør saltvann lokalt på omliggende muskler, og lukk snitt i halsen ved hjelp av subkutan kontinuerlig søm av absorberbare suturer (4/0).

    3. Postoperativ Care

    1. Plasser rotte i en 31 ° C inkubator for å gjenopprette fra anestesi for opp til fire timer.
      Merk: Forskere kan foretrekke å bruke andre temperaturer og varigheter i henhold til lokal praksis.
    2. Gjenta carprieve (0,25 mg / kg), for smertelindring på 24 timer. Fordi alle dyr mottar den samme dose av Carprieve, er denne faktoren kontrollert for systematisk. Enhver nevrobeskyttende virkning av Carprieve er sannsynlig å være neglisjerbar.
    3. Gi saltvannsinjeksjoner daglig for å forebygge dehydrering i minst de første tre dagene. Under forutsetning av at en rotte krever 65 ml væske per kg kroppsvekt (hver 24 time), sikre at hver 300 g rotte får ~ 22 ml væske per dag.

    4. Contelse av Infarkt

    1. For å måle infarktvolum bruke strukturell MR.
      Merk: En alternativ metode kan være å benytte histologisk farging, såsom tetrazoliumklorid (TTC), som på forhånd var korrelert for å strukturelle MRI data 18. Dette kan imidlertid bare brukes ved endepunktet av studien, og ikke i lengderetningen.
      1. Tjuefire timer etter induksjon av MCAO, bedøve rotter med isofluran (5% for induksjon, 1-1,5% for vedlikehold) på 0,9 l / min Medical Luft og en l / min O 2, sikker i en kvadratur fuglebur magnetisk resonans polen (43 mm diameter) og plasser i en 7 Tesla horisontal boring skanner.
      2. Skaff T2 vektet skanner ved hjelp av en fast-spin ekko sekvens: echo tid (TE) 60 msek, repetisjon tid (TR) 4000 ms, synsfeltet (FOV) 40 x 40 mm, anskaffelse matrise 128 x 128, anskaffe 40 x 0,5 mm tykke skiver i ca 8 min. Deretter konvertere 40 skiver til 20 x 1 mm tykke skiver ved hjelp av resampling funksjon i medisinsk bildebehandling.
    2. Oppnå lesjon volumer i et medisinsk bildeskjerm pakke ved å måle tverrsnittsarealet av infarkt i 20 volumer. Skaff totale volumet ved å multiplisere summen av disse områdene av tykkelsen (1 mm). Beregn gruppen mener volum og standardavvik. For prosent lesjon volumberegning, også tilegne volumene av de ipsilesional og contralesional halvkuler.
    3. For å korrigere for hjernen hevelse på grunn av ødem, justere disse verdiene ved hjelp Gerriets 'formler 18. Omfatter bare skiver som inneholder cortex og ikke inneholder lillehjernen eller lukt pærer i henhold til en standard rotte atlas 19 for å unngå over-korreksjon, da dette kan generere negative lesjon volumer.
      1. Acquire T2 vektede bildene igjen 8 uker etter hjerneslag kirurgi.

    5. utvalgsstørrelse Beregninger for fremtidige studier Vurdere neuroprotection og Behavioral Recovery </ P>

    1. Utføre eksempelstørrelsesberegninger for å beregne den minste prøvestørrelse som ville være nødvendig i fremtiden hypotetiske nevrobeskyttende eksperimenter ved hjelp av to grupper (kontroll vs. Behandling) for å identifisere effekt av behandling av tre forskjellige størrelser (25% reduksjon 50% reduksjon 75% reduksjon) ved hjelp a priori algoritmer implementert i maktanalyse programvare 20.
      Merk: For at leserne til å gjøre tilsvarende beregninger med egne data, er skjermbilder fra fritt tilgjengelige maktanalyse programvare (se Representant Resultater). Bruk følgende parametre: akseptabel falsk positiv rate (dvs. type I feil terskel, α) ≤0.05 og kraft (som tilsvarer 1-β) ≥0.80 (dvs. mer enn 80% effekt). Se nedenfor for forklaring og diskusjon 21.

    6. Eldre Animal Welfare Etter Stroke Surgery

    1. Gjør tilgjengelig ekstra myk chow ennd rehydrering gel pakker som rottene ble tilvendt før operasjonen, i tillegg til vannflasker med utvidede tips for lettere å nå. I tillegg har en absorberbare utvinning pad i merdene i stedet for løs sengetøy (dvs. unngå treflis) for den første 24-timers, og gir ekstra hekkende senger. Ikke bruk most mat (f.eks, babymat) som rotter med dysfagi kan kvele.
    2. Veie dyrene daglig i 7 dager for å overvåke utvinning. Vekttap er en primær indikasjon for dehydrering og stress. Vekttap i de første dagene etter operasjonen er i hovedsak dehydrering (i stedet for tap av kroppsvekt på grunn av redusert fôring).
    3. Hvor en aldrende rotta viser vekttap som ikke er relatert til kirurgi, erstatte tapt kroppsvekt med en ekvivalentvekt av væsker og inspisere de øvre og nedre tenner. Der tenner er overgrodd, bedøve rotte med isofluran (som i kapittel 2.1), og plasser i en liggende stilling
      1. Plasser en 1 ml sprøyte fat bak teeth å beskytte myke vev. Skjær bruker en håndholdt sirkelsag (f.eks, ca 3 cm diameter) ved høy rotasjonshastighet, men med langsomme, faste håndbevegelser (f.eks 3 sek kutt). La rotte tenner for å kjøle ned mellom kutt. Sørge for at den roterende sag er montert på doren, slik at sagens tenner vender i rotasjonsretningen. Det er verdt å holde pakket enkeltvis, sterilisert roterende sager klar for slike eventualiteter.
        Merk: Gjengroing kan forekomme hos eldre rotter selv når opprettholdes på en hard pellet kosthold. Vi anbefaler at tennene blir sjekket hos eldre rotter regelmessig.
    4. Hvor en eldre rotte viser vekttap og piloereksjon relatert til kirurgi, diskutere behandling med en veterinær. Tenk humant å drepe dyret. MR av slike dyr kan vise en hypofyse svulst (ofte hos eldre hunnrotter) som er ubrukelige og dødelig.

    Representative Results

    Permanent MCAO ble indusert ved å utføre kraniotomi, etterfulgt av koagulering og ødeleggelse av den midtre cerebrale arterie ved diatermi kombinert med permanent okklusjon av den ipsilesional arteria carotis communis og 60 min okklusjon av contralesional felles halsarterie. En skjematisk av oppsettet av utstyret og okkluderte MCA er vist i figur 1, og av halspulsårene i figur 2 (ovenfor).

    Stroke utfall ble vurdert 24 timer og 8 uker etter hjerneslag ved å måle infarktvolum på 40 x 0,5 mm skiver (fra rostral slutten av luktelappen til rostralt enden av ryggmargen) ved hjelp av det aktuelle området, verktøykasse i en medisinsk bildeskjerm pakken. En representant T2 vektet strukturell MR-undersøkelse er vist for samme dyr på 24 timer og 8 uker (figur 3A). Den infarktvolum ble identifisert ved områder av rottehjernen som viser en hyperintense signal; som T2 vekted bildene viser vann eller plasma som et skinnende hvitt område. Det er kjent at det er en økning i ødem og hjerne hevelse etter hjerneslag, og dette kan måles fra en T2-vektet scan som er blitt korrelert til histologiske målinger av infarktvolum 18. Imidlertid ødem liggende tidlig etter slag (som ved 24 timer) kan føre til en overestimering av det endelige lesjon volum (som ved 8 uker) og derfor også til stede midlere infarktvolum justeres ved hjelp Gerriet formler. Figur 3B viser gjennomsnittsdata fra rå (ujusterte) lesjon volum på 24 timer som 62,8 mm 3 (± 25,4 mm 3 SD, topp graf); Dette opptar 9,8% av det berørte halvkule (± 4,2% SD, midt graf). Korrigert for hjernen hevelse ved hjelp Gerriets 'formler denne verdien redusert til 4,5% (± 2,0% SD, bunn graf).

    Stroke alvorlighetsgrad ble også målt ved hjelp av Montoya trapp test 15. I korte trekk, ennimals ble pre-trenet til å hente sukker pellets i 4 uker før MCAO slag kirurgi, og testet i 8 uker etter hjerneslag (figur 4) for å bekrefte en vedvarende underskudd. Rotter ble plassert i trappe apparat i 10 minutter, og antallet pellets hentes ble registrert (av 21 pellets) og vist som en prosentandel (gruppe gjennomsnitt ± standardfeil). En regresjonsanalyse ble utført for å passe linje til dataene.

    Figur 5 viser beregningen utvalgsstørrelsen ved hjelp av infarktet volumdata (for potensielle effektene av kandidat terapi), analysert ved hjelp av en algoritme i maktanalyse programvare for en t-test med "Forskjellen mellom to uavhengige midler (to grupper)" og bruker (ukorrigert ) gjennomsnitt og standardavvik fra figur 3B. Informasjonen i figur 5, og tabell 1 viser at for 12 rotter ville være nødvendig for hver gruppe for å detektere en terapi som reduseres infarct volum med 50% på 24 timer, mens figur 6 viser en "XY plott" av makt oppnås ved hjelp av varierende antall dyr. Tabell 1 oppsummerer sample size beregninger for alle tidspunkter.

    Figur 3
    Figur 3. T2-vektet MRI strukturelle brukes til å måle størrelsen av infarktet og hjernen hevelse etter hjerneslag. (A) En T2-vektet magnetisk resonans bilde av den samme rottehjerne 24 timer og 8 uker etter induksjon av slag. Den hvite området representerer lesjon, men inneholder også noen vasogenic ødem som løser ved 8 uker. (B) Infarkt volum ble målt ved hjelp av en medisinsk bildevisning pakke aktuelle området Toolkit, og er plottet på en graf som representerer gjennomsnitt ± SD for de 3 tidspunkter brukes (n = 6). Raw lesjon volum (ikke korrigert for hjernen hevelse på grunn av edEMA), er prosent lesjon i påvirket halvkule (ukorrigert for hevelse), og prosent lesjon av halvkule korrigert for hjernen hevelse ved hjelp Gerriets 'formler vist her. SD ble brukt i stedet for SEM for å utføre prøvestørrelsesberegninger (se figur 5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4. trapp testen viser svekkelser i fatte og hente pellets. I denne slag modellen var det svært lite spontan bedring. Stroke hos eldre rotter vedvarende svekker behendighet, vist ved ukentlig testing med "trapp test" av pellet nå. Innfelt: Et bilde av en rotte som utfører atferds test. Grafen viser gjennomsnittlig (± stativard feil) antall pellets hentede (ut fra 21, uttrykt som en prosent) per uke ved at det berørte forpoten. n = 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur 5. Eksempel på størrelsesberegninger for å bestemme gruppe antall rotter som kreves for å detektere en ønsket terapeutisk effekt. Dette skjermskudd som tas fra strømanalyseprogramvare, viser at 12 rotter pr gruppe ville være nødvendig for å detektere en terapi som redusert infarktvolum med 50% på 24 timer. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6. Effekt oppnås ved anvendelse av forskjellige totale antall av dyrene. En "XY plottet for et område av verdier" fra strømanalyseprogramvare viser den kraft som ville bli oppnådd for forsøkene ved hjelp av ulike (totalt) antall av eldre rotter, gitt parametrene vist i figur 5. Tabell 1 oppsummerer alle våre resultater. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Tid etter hjerneslag: Antall rotter pr gruppe som kreves for å detektere en reduksjon i volum av lesjon:
    75% 50% 25%
    24-timers 6 12 42
    8 uker 4 5 17

    Tabell 1. Beregning av utvalgsstørrelser per gruppe for hypotetiske fremtidige eksperimenter. Beregnet ved hjelp av maktanalyse programvare (Se figur 5 og 6). Tabellen viser antallet rotter pr gruppe som kreves for en to-gruppe eksperiment for å detektere en 25%, 50% og 75% reduksjon i lesjonen volum ved hver av de tidspunktene i denne studien.

    Discussion

    MCAO hos gnagere er en teknikk som ofte brukes til å modellere human slag. Denne modellen har et par detaljer å merke seg i protokollen. For det første er det viktig å opprettholde dyrets kroppstemperatur gjennom hele forsøket, da dette påvirker størrelsen av infarktet og antall død fisk i en studie. Det kan være mulig å avbryte isofluran under den transiente okklusjon av den høyre CCA og holde rotter i en oppvarmet, rolig miljø for å øke overlevelsesraten ved å redusere eksponering for isofluran. Forskere bør vurdere om en kortere anestesi periode oppveier stresset av ytterligere induksjon. Blodkar (f.eks MCA forgrening) av rottene varierer innen og mellom årskull av dyr 22. Det er viktig å ha dette i bakhodet når du starter en ny studie. Ulike CCA okklusjon ganger kan evalueres (f.eks, 30, 45, 60 og 90 min). I denne studien blir brukt en okklusjon tid på 60 min. I andre studier har man funnet at 45min okklusjoner føre til en lignende størrelse kortikale infarkt, men med anekdotiske bevis for økt overlevelse. Følgelig har kirurger starter med en kort tid okklusjon (for eksempel, 30 min) for å se hvorvidt tilstrekkelige lesjon volumer (og / eller nødvendige adferdsmessige mangler) oppnås, og bare da å øke okklusjon tider hvor det er nødvendig. Atferds underskudd er ikke vedvarende hos voksne rotter sammenlignet med eldre rotter med identiske okklusjon ganger.

    MR kan brukes til å bedømme om (etter en bestemt okklusjon tid) lesjon volumer som er aktuelle for studien mål. En liten lesjon ville span mindre enn ti 0,5 mm koronale skiver (av 40). En middels størrelse lesjon ville strekke seg mellom ti og tjue koronale skiver. En stor lesjon ville strekke seg mellom tjue og tretti koronale skiver. En svært stor lesjon ville strekke seg mer enn tretti av de førti skiver. I vår erfaring, rotter med svært store lesjoner (mer enn tretti stykker) og / eller bevis for prolaps across midtlinjen har vanligvis dårlig prognose: kortere okklusjon tider kan bli vurdert. MR er også nyttig for å vurdere lokalisering av infarktet: noen er mer caudally plassert og noen er mer rostrally plassert.

    Vær ekstra forsiktig når du skiller vagus nerve fra både vanlige carotis. Rales (rasping) kan oppstå etter hjerneslag kirurgi, og dette kan være på grunn av nerveskader hos noen dyr, selv om årsaken er foreløpig uklart: i vår erfaring, er prognosen svært dårlig for disse dyrene, og det er vanligvis anbefalt å humant drepe dem.

    De permanente diatermi MCAO modellresultater i reproduserbare kortikale infarkter og akseptable postoperative overlevelse hos eldre rotter. Teknikken gjør imidlertid kreve invasiv kirurgi under et stereomikroskop. Det er viktig å opprettholde aseptisk teknikk hvis dyrene er å komme godt fra kirurgi. Hensyn må tas for ikke å skade MCA mens utsette og koagulere arterien,og skader på kortikale overflate bør minimaliseres ellers eksponerte areal av cortex kan utgjøre en del av infarktområdet. Det anbefales å oppnå så mye erfaring som mulig å etablere fremgangsmåten og for å oppnå konsistente infarkter og bestemme okklusjon ganger før en studie er utført for å teste kandidatbehandlingsformer, for eksempel. Forskere bør random noen behandlinger innenfor kirurgi økter ( "block randomisering") der det er mulig. Det er verdt å merke seg at denne modellen ikke innebærer MCA reperfusjon (med mindre forbigående MCA ligering anvendes i stedet for diatermi). Dødelighet kan være høy i eldre rotter med disse store kortikale infarkter, men det bør være mulig å redusere dødeligheten ved hjelp av kortere okklusjon ganger, og ved å minimere eksponering for generell anestesi der det er mulig (for eksempel i løpet av okklusjon). Bruken av 70% N 2 O og 30% O 2 som en bærer kan tillate lavere nivåer av isofluran som skal brukes: denne reduserte eksponering for isoflurane kan resultere i høyere overlevelse.

    Et annet punkt å vurdere er at aterosklerose er en gradvis prosess, mens i denne protokollen vi simulere den med akutt CCA okklusjon. Den betydelige reduksjonen i blodstrømmen og vedvarende underskudd simulere tandem okklusjoner som forekommer i mange slagpasienter. Permanent distal MCAO uten tandem CCA okklusjon hos rotter ikke klarer å indusere slag reproduserbart 14: dessuten uten tandem CCA okklusjon, har vi funnet betydelig spontan bedring oppstår som utelukker langsiktig atferds evaluering av hjerneslag behandlinger over 8 uker. I kontrast, viser vi at distal MCAO med tandem CCA okklusjon induserer langsiktige underskudd hos eldre rotter.

    Som konklusjon, denne prosedyren hos rotter forårsaker slag som er like i størrelse og plassering som hos den menneskelige tilstand, med vedvarende funksjonshemming som man kan bruke for å muliggjøre testing av nye behandlinger og belysning av repair mekanismer etter iskemisk hjerneslag.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 0.25 mg/kg
    Atropine Sulfate AmTech RXATRINJ-100
    Alcohol swabs UHS 20021
    Lidocaine cream (Emla) AstraZeneca 0012901 Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
    Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
    Forceps Fine Science Tools 11019-12
    Isoflurane Abbott B506
    Silk sutures Harvard Apparatus 723288
    Cautery system Eschmann
    0.25 mm Jeweler cautery forceps Eschmann 8330349
    fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
    Thumb driven saline drip system
    Vacusafe aspirator system INTEGRA BIOSCIENCES 158320
    1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs K801 104 016
    Handheld dental drill NSK NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
    Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
    Microvascular scissors World Precision Instruments 501790
    4-0 Vicryl sutures Ethicon
    Vascular clip and applicator
    Operating microscope Zeiss
    Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
    Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
    25 g needles Terumo NN-2525R
    syringes (1 ml and 5 ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
    Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
    cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
    gauze sterilize before use
    Medical Imaging Package (Jim) Xinapse Free software
    Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) UCL Free software
    Power Analysis Software (G*Power) Universität Düsseldorf Free software

    References

    1. Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
    2. Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
    3. Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
    4. Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
    5. Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. Elsevier. 384-424 (2011).
    6. Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
    7. Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 1-27 (2009).
    8. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
    9. Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
    10. Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
    11. Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 28-39 (2009).
    12. Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
    13. Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
    14. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
    15. Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
    16. Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
    17. Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
    18. Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
    19. Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
    20. Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
    21. Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
    22. Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
    23. Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter