Early Viral entrée dosages pour l'identification et l'évaluation des composés antiviraux

Immunology and Infection

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Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).

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Abstract

Protocol

Remarque: Veiller à ce que toutes les procédures impliquant la culture cellulaire et infection par le virus sont menées dans les hottes de biosécurité certifiés qui sont appropriés pour le niveau des échantillons de biosécurité être manipulé. Aux fins de la description des protocoles, la luciférase de Gaussia VHC à marquage rapporteur est utilisé comme un modèle de virus 32. Dans le contexte des résultats représentatifs, l'acide des composés de chébulagique (CHLA) et punicalagin (PUG) sont utilisés comme antiviraux candidats qui ciblent les interactions avec les glycosaminoglycanes glycoprotéine virale de surface cellulaire lors de l'entrée virale premières étapes 31. L'héparine, qui est connu pour interférer avec l'entrée de nombreux virus 30,31,33,34, est utilisé comme un traitement de contrôle positif dans ce contexte. Pour des informations de base sur des techniques de virologie, la propagation de virus, la détermination du titre du virus, et l'expression de la dose infectieuse en unités formant des plages (PFU), concentrer les unités de formage (FFU), ou multiplicité d'infection (MOI), le lecteur est re35 préféré pour référencer. Pour des exemples antérieurs et des conditions optimisées utilisés pour les virus indiqués dans les résultats représentatifs, le lecteur est renvoyé aux références 30-32,36-39 ainsi que les détails figurant au tableau 1, figure 1A et la figure 2A.

1. Culture cellulaire, Préparation composé et composé de cytotoxicité

  1. Cultiver la lignée cellulaire respectif pour le système d'infection par le virus à analyser (tableau 1). Pour le HCV, cultiver les cellules Huh-7,5 dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 200 U / ml de pénicilline G, 200 ug / ml de streptomycine et 0,5 pg / ml d'amphotéricine B.
  2. Préparation des composés d'essai et les témoins en utilisant leurs solvants respectifs: par exemple, dissoudre ABSC et PUG dans le diméthylsulfoxyde (DMSO); préparer l'héparine dans l'eau double distillée stérile. Pour tous les autres dilutions, utiliser des milieux de culture.
    Remarque: Le concent finaleration de DMSO dans les traitements composés de test est inférieure à 1% dans les expériences; 1% de DMSO est comprise comme traitement témoin négatif dans les tests de comparaison.
  3. Déterminer la cytotoxicité des composés à tester (par exemple, ABSC et PUG) sur les cellules pour l'infection virale en utilisant une viabilité cellulaire déterminer réactif tel que le XTT (2,3-bis [2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl] -5-phénylamino) carbonyl] -2H-tétrazolium hydroxyde):
    1. Pour le VHC, ensemencer 7,5 Huh-cellules dans une plaque de 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur O / N pour obtenir une monocouche.
    2. Appliquer témoin de DMSO (1%) ou des concentrations croissantes de composés d'essai ABSC et PUG (ex. 0, 10, 50, 100, et 500 pM) dans les puits de culture en triple exemplaire.
    3. Incuber à 37 ° C pendant 72 heures, puis jeter le milieu dans la plaque et laver les cellules avec 200 pi de tampon phosphate salin (PBS) deux fois.
    4. Ajouter 100 pi de assaying de solution du kit test in vitro en toxicologie-XTT dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant encore 3 heures pour permettre la production XTT formazan.
    5. Déterminer l'absorbance avec un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de test de 492 nm et une longueur d'onde de 690 nm de référence.
    6. Calculer le pourcentage de survie des cellules en utilisant la formule suivante: viabilité cellulaire (%) = A / As x 100%, où «A» et «sous» se référer à l'absorbance des composés d'essai et le témoin de solvant (par exemple 1% de DMSO. ) traitements, respectivement. Déterminer la concentration de 50% de cytotoxicité cellulaire (CC 50) des composés d'essai à partir d'un logiciel d'analyse tel que GraphPad Prism selon le protocole du fabricant.

2. Lecture de l'infection virale

Remarque: La lecture d'une infection virale dépend du système de virus utilisé et peut impliquer des procédés tels que des dosages de plaques ou meaSuring signaux rapporteurs de virus rapporteurs marqués. Procédé pour détecter une infection par le VHC reporter sur la base de l'activité rapporteur de la luciférase est décrite ci-dessous.

  1. Recueillir les surnageants des puits infectés et de clarifier à 17.000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C.
  2. Mélanger 20 ul de surnageant de test à 50 ul de substrat de la luciférase à partir de la trousse de dosage de la luciférase de Gaussia et de mesurer directement avec un luminomètre selon les instructions du fabricant.
  3. Exprimer HCV infectieux tel que log 10 d'unités lumineuses relatives (RLU) de détermination de l'inhibition virale (%) et de calculer la concentration efficace 50% (EC50) des composés d'essai contre une infection par le VHC en utilisant des algorithmes de logiciel GraphPad Prism selon le protocole du fabricant.

3. Inactivation virale Assay

Remarque: Des exemples de période d'incubation et la dose virale de différents virus aRE admises à la figure 1A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU.

  1. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche.
  2. Incuber les composés ou des contrôles essai (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) avec les particules de VHC à 37 ° C (figure 1A, «à long terme» ) dans un rapport de 1: 1. Par exemple, pour un inoculum de virus de 100 pi contenant 1 x 10 4 FFU, ajouter 100 ul d'une dilution de travail de 100 uM ABSC; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM.
  3. On dilue le mélange virus-drogue de concentration (sans effet) "sous-thérapeutique" des composés d'essai. Par exemple, la concentration inefficace de l'ABSC et PUG contre le VHC est à 1 uM 31; doncceci nécessite une dilution de 50 fois du mélange virus-médicament qui peut être accompli avec 9,8 ml de milieu basal (milieu de culture cellulaire avec 2% de FBS).
    Remarque: La dilution à la concentration de sous-thérapeutique empêche l'interaction significative entre les composés d'essai et la surface de la cellule hôte et permet l'examen de l'effet du traitement sur les virions exempts de cellules. Notez que cette dilution est dépendante de la dose-réponse antivirale des composés d'essai contre l'infection virale particulière, et il est déterminé avant de réaliser cet essai particulier 31.
  4. A titre de comparaison, le virus mélanger avec les composés d'essai et dilué immédiatement (pas de période d'incubation) de concentration sub-thérapeutique avant l'infection (Figure 1A, «à court terme»).
  5. Ajouter 100 pi du mélange VHC-médicament dilué sur le Huh-7,5 monocouche de cellules (la quantité de virus est maintenant à 1 x 10 2 FFU; finale MOI = 0,01) et incuber pendant 3 heures à 37 ° C pour permettre viraleadsorption.
  6. Suite à l'infection, retirer le inoculum dilué et laver délicatement les puits avec 200 pi de PBS deux fois.
    Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules.
  7. Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures.
  8. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale.

4. virale Attachment Assay

Remarque: Les exemples de la période d'incubation et la dose virale pour divers virus sont répertoriés dans la figure 2A, «attachement». Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU.

  1. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche.
  2. Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C for 1 h.
  3. Co-traiter les cellules infectées par le VHC inoculum (MOI = 0,01) et les composés d'essai ou de contrôle (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) à 4 ° C pour 3 h. Par exemple, pour un inoculum de virus de 90 ul contenant 1 x 10 2 FFU, ajouter 10 ul d'une dilution de travail de 500 uM ABSC; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM et une infection par le VHC à une MOI = 0,01 sur la monocouche cellulaire.
    Remarque: Il est important de réaliser l'expérience à 4 ° C, car elle permet la liaison du virus mais empêche l'entrée qui se produit le plus efficacement à 37 ° C. Effectuer l'addition de composés de virus et de test sur de la glace et l'incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour garantir que la température est maintenue à 4 ° C.
  4. Retirer le surnageant et laver délicatement la monocouche cellulaire avec 200 pi de PBS glacé deux fois.
    Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules <./ li>
  5. Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures.
  6. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale.

5. virale Entrée / Fusion Assay

Remarque: Exemple de périodes d'incubation et dose virale pour divers virus sont répertoriés dans 'Entrée / Fusion' Figure 2A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU.

  1. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche.
  2. Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C pendant 1 heure.
  3. Infecter les cellules infectées par le VHC (MOI = 0,01) à 4 ° C pendant 3 heures. Par exemple, utiliser un inoculum viral 100 ul contenant 1 x 10 2 FFU.
    Remarque: Effectuez l'Addition de l'inoculum viral sur de la glace et l'incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour maintenir la température à 4 ° C, ce qui permet l'entrée virale, mais non obligatoire.
  4. Retirer le surnageant et laver délicatement les monocouches de cellules avec 200 pi de PBS glacé deux fois.
    Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules.
  5. Traiter les puits avec les composés d'essai ou de contrôle (concentrations finales sont les suivantes: 50 uM = ABSC; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) et incuber à 37 ° C pendant 3 heures. Par exemple, ajouter 10 ul d'une dilution de travail 500 um CHLA à 90 pi de milieu, mélanger, et de traiter les puits; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM.
    Remarque: Le passage de 4 ° C à 37 ° C facilite désormais l'événement d'entrée / fusion virale et permet donc l'évaluation de l'effet de composés de test sur cette étape particulière.
  6. Aspirer le surnageant contenant le médicament et enlever non intérioriséles virus extracellulaires, soit par lavage avec 200 ul de tampon citrate (citrate de sodium 50 mM, chlorure de potassium 4, pH 3,0) ou du PBS. Appliquer 100 ul de milieu de base avant l'incubation à 37 ° C pendant 72 h.
  7. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale.

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Representative Results

Dans la figure 1, le «test d'inactivation virale» a été réalisée pour examiner si deux composés naturels CHLA et PUG spécifiques pourraient inactiver les virus enveloppés dans différents état ​​libre-cellulaire et prévenir l'infection ultérieure. La réponse à la dose antivirale et la cytotoxicité de ces composés ont été déterminées avant l'exécution de l'étude mécaniste 31. Les virus ont été pré-traitées avec les composés d'essai et ensuite les mélanges virus-médicament ont été dilués à des concentrations sous-thérapeutiques avant l'inoculation sur la monocouche de cellule respectif pour chaque système de virus. Comme le montre la figure 1, les deux ABSC et PUG sont apparus pour interagir avec les virions exempts de cellules, ce qui entraîne des effets irréversibles qui protégeaient la monocouche de cellules à partir de l'infection ultérieure. Les deux composés d'essai réalisé un près de 100% d'inhibition contre le HCMV, le VHC et DENV-2, alors qu'un 60 - bloc 80% a été observée contre MV et RSV. Ces résultats SuggEst ce que l'ABSC et PUG ont un impact direct sur ces particules virales libres en les neutralisant l'inactivation et leur infectivité.

Dans la figure 2, l'attachement et d'entrée / essais de fusion ont été réalisées pour étudier l'effet de l'ABSC et PUG contre ces événements virales précoces liées entrée-de HCMV, VHC, DENV-2, MV, et RSV. Les deux CHLA et PUG efficacement empêché liaison des virus étudiés sur la cellule hôte respective comme indiqué par l'inhibition de l'infection virale résultante (Figure 2, «attachement»: barres gris clair). L'effet inhibiteur sur l'attachement du virus par les deux composés était semblable contre HCMV (figure 2B), le VHC (figure 2C), DENV-2 (figure 2D), et RSV (Figure 2F), allant de 90 - 100%. D'autre part, PUG semblait être plus efficace que l'ABSC contre MV liaison (Figure 2E), le taux de la tw d'inhibitioncomposés o variant entre 50 - 80%. L'héparine de traitement de commande, qui est connu pour bloquer l'entrée de nombreux virus, aussi inhibé la fixation de HCMV, DENV-2, RSV, annonce MV, mais est moins efficace contre le VHC. Le suivi 'essai entrée / fusion virale' examiner si CHLA et PUG ont conservé leur activité au cours de la phase entrée du virus / fusion (Figure 2, 'Entrée / Fusion ": barres gris foncé). Encore une fois, les deux ABSC et PUG ont été observés à altérer efficacement l'étape d'entrée / de fusion virale des virus examinés (Figure 2B - F), ce qui donne un 50 - effet protecteur de 90% sur la monocouche de cellule respectif. Héparine aussi puissamment inhibé entrée / fusion dans DENV-2 et les infections à VRS, mais était moins efficace contre le HCMV, le VHC et MV (<40% d'inhibition en moyenne).

<td> HEL
Virus Type de cellule
HCMV
VHC Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tableau 1:. Hôte type de cellule à une infection virale du type de cellule utilisé pour chaque système d'infection virale décrit dans les résultats représentatifs est indiquée. Des détails supplémentaires concernant les cellules peuvent être trouvés dans la référence 31.

Figure 1
Figure 1. L'inactivation des infections virales par les composés de test CHLA et PUG Différents virus ont été traités avec les composés d'essai pendant une longue période. (Incubé pendant 1,5 à 3 h avant le titrage; barres gris clair) ou une période courte (dilué immédiatement; gris foncé bars) à 37 ° C avant une dilution de concentration sub-thérapeutiquetion et l'analyse ultérieure de l'infection sur les cellules hôtes respectives. (A) Schéma de l'expérience (montré sur la gauche) avec la concentration de virus final (PFU / puits ou MOI), à long terme période virus médicament incubation (i), et le temps d'incubation subséquente (ii) indiqué pour chaque virus dans le tableau sur la droite. Les analyses de (B) de HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) de RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les résultats sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif DMSO pour infection par le virus ainsi que les données représentées sont les moyennes ± l'erreur-type de la moyenne (SEM) à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. L'évaluation des activités antivirales de composés d'essai ABSC et PUG contre l'attachement du virus et l'entrée / fusion. (A) Le mode opératoire expérimental, la concentration en virus (PFU / puits ou MOI), et le moment de l'addition et le traitement avec les composés d'essai (i, ii, iii) sont présentés pour chaque virus dans les schémas et les tableaux associés. Dans l'analyse de fixation de virus (barres gris clair), des monocouches de différents types de cellules ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 heure, puis co-traités avec les virus respectifs et les composés d'essai à 4 ° C (1,5 - 3 h, i) avant de rincer les inoculats et les composés d'essai à une incubation ultérieure (37 ° C, ii) et de l'examen de l'infection par le virus. Dans l'entrée du virus / analyse de fusion (barres gris foncé), des monocouches de cellules ensemencées ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 h et ensuite provoqués avec chacun des virus à 4 ° C pendant 1,5 - 3 h (i). Les cellules ont ensuitelavé et traité avec des composés d'essai pendant une période d'incubation supplémentaire (ii) au cours de laquelle la température a été décalé à 37 ° C pour faciliter l'événement d'entrée / fusion virale. A la fin de l'incubation, les virus extracellulaires ont été retirés soit par un tampon citrate (pH 3,0) ou lavages au PBS et les cellules ont été encore incubées (iii) pour l'analyse d'une infection par virus. Résultats pour (B) HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les données sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif de DMSO infection par le virus et sont présentées comme moyenne ± SEM à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Thermo Scientific 89087-320
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405

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