No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Immunology and Infection

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Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).

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Abstract

Protocol

Nota: Certifique-se de que todos os procedimentos que envolvem cultura celular e infecção pelo vírus são realizados em capuzes de biossegurança certificados que são apropriadas para o nível de biossegurança das amostras sendo manipulado. Para a finalidade de descrever os protocolos, Gaussia luciferase de VHC marcada com repórter é utilizado como um vírus modelo 32. No contexto dos resultados representativos, o ácido compostos chebulagic (CHL) e punicalagina (PUG) são utilizados como medicamentos antivirais candidatos que têm como alvo as interacções de glicoproteínas virais com os glicosaminoglicanos da superfície celular durante a entrada viral precoce passos 31. A heparina, que é conhecida por interferir com a entrada de muitos vírus 30,31,33,34, é utilizada como um tratamento de controlo positivo, em tal contexto. Para o fundo de base em técnicas de virologia, propagação de vírus, a determinação do título do vírus e a expressão de dose infecciosa em unidades formadoras de placas (PFU), concentrar unidades formadoras de FFU (), ou multiplicidade de infecção (MOI), o leitor é rerido para fazer referência a 35. Para exemplos anteriores e condições otimizadas utilizados para vírus mostrados nos resultados representativos, o leitor é remetido para referências 30-32,36-39, bem como detalhes listados na Tabela 1, Figura 1A e 2A.

1. Cultura celular, Composto de preparação, e o Composto Citotoxicidade

  1. Crescer a linha celular correspondente para o sistema de infecção por vírus a ser analisado (Tabela 1). Para o HCV, crescer as células Huh-7.5 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS), 200 U / ml de penicilina G, 200 ug / ml de estreptomicina, e 0,5 ug / ml de anfotericina B.
  2. Preparar os compostos de teste e controlos utilizando os seus respectivos solventes: por exemplo, dissolver CHL e PUG em sulfóxido de dimetilo (DMSO); preparar heparina em água bidestilada estéril. Para todas as diluições subseqüentes, utilize meios de cultura.
    Nota: O último concentração de DMSO nos tratamentos composto do teste é inferior a 1% nas experiências; 1% de DMSO é incluído como um tratamento de controlo negativo nos ensaios para comparação.
  3. Determinar a citotoxicidade dos compostos de teste (por exemplo, Chla PUG) e sobre as células para a infecção virai utilizando uma determinação de viabilidade celular, tais como reagente de XTT (2,3- bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5-fenilamino) -carbonil] -2H-tetrazólio):
    1. Para o HCV, sementes células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada.
    2. Aplicar controlo de DMSO (1%) ou concentrações crescentes de compostos de teste a CHL e PUG (ex. 0, 10, 50, 100, e 500 ^ M) aos poços de cultura em triplicado.
    3. Incubar a 37 ° C durante 72 h, em seguida, descartar o meio na placa e lavar as células com 200 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes.
    4. Adicionar 100 ul de assaying de solução a partir do kit de ensaio de toxicologia in vitro na base de XTT-se a cada poço e incubar as placas a 37 ° C durante mais 3 horas para permitir a produção de formazano XTT.
    5. Determinar a absorvência com um leitor de microplacas a um comprimento de onda de teste de 492 nm e um comprimento de onda de referência de 690 nm.
    6. Calcula-se a percentagem de células sobreviventes com a seguinte fórmula: viabilidade celular (%) = A / Como × 100%, em que 'A' e 'As' referem-se a absorvância dos compostos de teste e o controlo de solvente (1% de DMSO ex. ) tratamentos, respectivamente. Determinar a concentração de 50% de citotoxicidade celular (CC50) dos compostos de teste a partir de um software de análise, tais como o GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante.

2. Leitura de infecção viral

Nota: A leitura da infecção virai depende do sistema de vírus utilizado e pode envolver métodos tais como ensaios de placa ou MEAsuring sinais repórter de vírus marcado-repórter. O método para detectar a infecção por HCV-repórter com base na actividade repórter da luciferase é descrito abaixo.

  1. Recolhe-se os sobrenadantes dos poços infectados e clarificar a 17000 xg numa microcentrífuga durante 5 min a 4 ° C.
  2. Misturar 20 ul de sobrenadante de teste a 50 ul de substrato de luciferase a partir do kit de ensaio de luciferase e Gaussia medir directamente com um luminómetro de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Expresso de infecciosidade de HCV como log 10 de unidades relativas de luz (RLU) para a determinação da inibição virai (%) e calcular a concentração 50% eficaz (CE 50) dos compostos de ensaio contra a infecção pelo HCV usando algoritmos de software GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante.

3. Inactivação Viral Assay

Nota: Os exemplos de período de incubação e a dose virai de vários vírus deestá listada na Figura 1A. Concentrações mais elevadas do vírus também pode ser testado através do aumento da MOI / UFP.

  1. Semente células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada.
  2. Incubar os compostos de teste ou controles (concentrações finais são: CHLA = 50 mM; PUG = 50 mM; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) com as partículas de HCV a 37 ° C (Figura 1A, "a longo prazo" ) em uma proporção de 1: 1. Por exemplo, para um inoculo de vírus de 100 ul contendo 1 x 10 4 FFU, adicionar 100 ul de uma diluição de trabalho 100 uM CHL; este tratamento proporciona CHLA a uma concentração final de 50 uM.
  3. Dilui-se a mistura de vírus-droga (ineficaz) concentração de "sub-terapêutica" dos compostos de teste. Por exemplo, a concentração da CHL ineficaz e PUG contra o HCV é a 1 uM 31; portantoisto requer uma diluição de 50 vezes da mistura de vírus-droga que pode ser realizada com 9,8 ml de meio basal (meio de cultura de células com 2% de FBS).
    Nota: A diluição para a concentração sub-terapêutica impede interacção significativa entre os compostos de teste e da superfície da célula o hospedeiro e permite o exame do efeito do tratamento sobre os viriões livres de células. Note-se que esta diluição é dependente da dose resposta antiviral dos compostos de ensaio contra a infecção virai em particular, e é determinada antes de se efectuar este ensaio particular 31.
  4. Para comparação, o vírus misturar com os compostos de ensaio e imediatamente diluídas (sem período de incubação) a concentração sub-terapêutica antes da infecção (Figura 1A, "Short-Term").
  5. Adicionar 100 ul da mistura de HCV-droga diluída para o Huh-7,5 monocamada de células (a quantidade de vírus é agora a 1 x 10 2 FFU; finais MOI = 0,01) e incubar durante 3 horas a 37 ° C para permitir viraladsorção.
  6. Após a infecção, remover os inóculos diluído e lava-se suavemente os poços com 200 ul de PBS, duas vezes.
    Nota: Execute as lavagens com cuidado para evitar levantar as células.
  7. Adicionar 100 ul de meio basal de cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 72 h.
  8. Analisar a infecção resultante por doseamento do sobrenadante para a actividade de luciferase tal como descrito em '2. Leitura de infecção viral '.

4. Acessório viral Assay

Nota: Os exemplos de período de incubação e a dose viral para vários vírus são listados na Figura 2A, "Anexo". Concentrações mais elevadas do vírus também pode ser testado através do aumento da MOI / UFP.

  1. Semente células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada.
  2. Pré-relaxar as monocamadas de células em placas a 4 ° C FoR 1 h.
  3. Co-tratar as células com HCV inoculo (MOI = 0,01) e os compostos de teste ou os controlos (concentrações finais são: CHL = 50 | iM; PUG = 50 | iM; heparina = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) a 4 ° C durante 3 hr. Por exemplo, para um inoculo de vírus de 90 ul contendo 1 x 10 2 FFU, adicionar 10 ul de uma diluição de trabalho de 500? M CHL; este tratamento proporciona CHLA a uma concentração final de 50 uM e uma infecção por HCV a MOI = 0,01 na monocamada de células.
    Nota: É importante realizar a experiência a 4 ° C uma vez que permite a ligação do vírus, mas impede a entrada que ocorre mais eficientemente a 37 ° C. Realizar a adição de compostos de vírus e de ensaio em gelo e o que se seguiu incubação num frigorífico a 4 ° C para assegurar que a temperatura é mantida a 4 ° C.
  4. Remover o sobrenadante e lavar cuidadosamente a monocamada de células com 200 ul de PBS gelado duas vezes.
    Nota: Execute as lavagens com cuidado para evitar levantar as células <./ li>
  5. Adicionar 100 ul de meio basal de cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 72 h.
  6. Analisar a infecção resultante por doseamento do sobrenadante para a actividade de luciferase tal como descrito em '2. Leitura de infecção viral '.

5. Viral Entrada / ensaio de fusão

Nota: Exemplo de períodos de incubação ea dose viral para vários vírus são listados na 'Entry / Fusão' Figura 2A. Concentrações mais elevadas do vírus também pode ser testado através do aumento da MOI / UFP.

  1. Semente células Huh-7.5 numa placa de 96 poços (1 x 10 4 culas por po) e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora O / N para se obter uma monocamada.
  2. Pré-relaxar as monocamadas de células em placas a 4 ° C durante 1 h.
  3. Infectar as células com VHC (MOI = 0,01), a 4 ° C durante 3 h. Por exemplo, usar um inoculo de vírus de 100 ul contendo 1 x 10 2 UFF.
    Nota: Execute o addição do inoculo virai em gelo e o que se seguiu incubação num frigorífico a 4 ° C para manter a temperatura a 4 ° C, o que permite a entrada de ligação mas não virai.
  4. Remover o sobrenadante e lavar suavemente as monocamadas de células com 200 ul de PBS gelado duas vezes.
    Nota: Execute as lavagens com cuidado para evitar levantar as células.
  5. Tratar os poços com os compostos de teste ou os controlos (concentrações finais são: CHL = 50 | iM; PUG = 50 | iM; heparina = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) e incuba-se a 37 ° C durante 3 h. Por exemplo, adicionar 10 ul de uma diluição de trabalho 500 mm CHLA para 90 l de mídia, misture, e tratar os poços; este tratamento proporciona CHLA a uma concentração final de 50 uM.
    Nota: A passagem de 4 ° C a 37 ° C agora facilita o evento de entrada / fusão viral e, portanto, permite a avaliação do efeito de compostos de teste 'sobre este passo particular.
  6. Aspirar o sobrenadante que contém o fármaco e remover não-internalizadovírus extracelulares através de lavagem com 200 ul de tampão citrato (citrato de sódio 50 mM, cloreto de potássio a 4 mM, pH 3,0) ou PBS. Adicionar 100 ul do meio de base antes da incubação a 37 ° C durante 72 h.
  7. Analisar a infecção resultante por doseamento do sobrenadante para a actividade de luciferase tal como descrito em '2. Leitura de infecção viral '.

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Representative Results

Na Figura 1, foi realizado o "ensaio de inactivação virai" para examinar se dois compostos específicos e CHLA PUG natural poderia inactivar os vírus com envelope diferentes em estado isento de células e prevenir a infecção subsequente. A citotoxicidade e de resposta à dose antiviral destes compostos foram determinados antes de se efectuar o estudo mecanicista 31. Os vírus foram pré-tratadas com os compostos de teste e, em seguida, as misturas de vírus-drogas foram diluídas para concentrações sub-terapêuticos antes da inoculação para a respectiva monocamada de células para cada sistema vírus. Como mostrado na Figura 1, tanto CHL e PUG apareceu para interagir com os viriões livres de células, resultando em efeitos irreversíveis que a monocamada de células protegidas da infecção subsequente. Os dois compostos de teste alcançou uma inibição quase 100% contra HCMV, HCV e DENV-2, enquanto que um 60 - bloco de 80% foi observada contra MV e RSV. Estes resultados suggest que CHLA e PUG têm impacto direto sobre estas partículas virais livres, desativando-os e neutralizando sua infectividade.

Na Figura 2, o anexo e entrada / ensaios de fusão foram realizados para explorar o efeito da CHLA e PUG contra esses eventos relacionados à entrada virais início de HCMV, HCV, DENV-2, MV, e RSV. Ambos CHL e PUG prevenida eficazmente a ligação dos vírus investigados para a respectiva célula hospedeira, como mostrado pela inibição da infecção viral resultante (Figura 2, 'anexo': barras cinzentas claras). O efeito inibitório sobre a fixação do vírus por ambos os compostos foi semelhante contra HCMV (Figura 2B), HCV (Figura 2C), DENV-2 (Figura 2D), e RSV (Figura 2F), variando de 90 - 100%. Por outro lado, PUG pareceu ser mais eficaz do que CHLA contra MV ligação (Figura 2E), com a taxa de inibição do TWS compostos que variam entre 50 - 80%. O tratamento de controlo de heparina, que é conhecido por bloquear a entrada de muitos vírus, também inibiu a fixação de HCMV, DENV-2, RSV, anúncio MV, mas foi menos eficaz contra o HCV. O 'ensaio de entrada / fusão viral "que se seguiu examinou se CHLA e PUG mantido a sua actividade durante a fase de entrada do vírus / fusão (Figura 2,' Entry / Fusão ': barras cinza escuro). Novamente, tanto CHL e PUG foram observados para prejudicar a eficácia do passo de entrada / fusão viral dos vírus examinados (Figura 2B - F), obtendo-se um 50 - efeito protector de 90% no respectivo monocamada de células. A heparina também inibiu potencialmente entrada / fusão em infecções de RSV e DENV-2, mas foi menos eficaz contra CMVH, VHC, e MV (<40% de inibição, em média).

<td> HEL
Vírus Tipo celular
HCMV
HCV Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tabela 1:. Tipo de célula hospedeira por infecção viral O tipo de célula utilizado para cada sistema de infecção virai descrito nos resultados representativos está indicado. Detalhes adicionais referentes as células podem ser encontradas na referência 31.

figura 1
Figura 1. A inactivação de infecções virais por o CHLA compostos de teste e PUG vírus diferentes foram tratadas com os compostos de teste durante um longo período. (Incubadas durante 1,5 - 3 horas antes da titulação; barras cinzentas claras) ou curto prazo (imediatamente diluída; cinzento escuro bares) a 37 ° C antes de uma diluição à Concentra sub-terapêuticação e subsequente análise de infecção sobre as células respectivo hospedeiras. (A) Esquema da experiência (mostrada à esquerda) com a concentração de vírus final (PFU / poço ou MOI), período de incubação de vírus-drogas de longo prazo (i), e tempo de incubação posterior (ii) indicada para cada vírus no quadro à direita. Análise para (B) de HCMV, (C) de HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) de RSV são indicados em cada painel adicional. Os resultados são representados graficamente contra o tratamento de DMSO de controlo negativo para a infecção pelo vírus e os dados apresentados são as médias ± erros padrão da média (EPM) de três experiências independentes. Esta figura foi modificado a partir da referência 31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A avaliação das actividades anti-virais dos compostos de teste a CHL e PUG fixação contra vírus e entrada / fusão. (A) O procedimento experimental, a concentração de vírus (pfu / poço ou MOI), e o tempo de adição e o tratamento com os compostos de ensaio (I, II, III) são apresentados para cada virus nos esquemas e as tabelas associadas. Na análise acessório do vírus (barras cinzentas claras), as monocamadas de diferentes tipos de células foram pré-arrefecidas a 4 ° C durante 1 h, em seguida, co-tratadas com os respectivos vírus e os compostos de teste a 4 ° C (1,5 - 3 h; i) antes de lavar os inóculos e compostos de teste para a subsequente incubação (37 ° C, ii) e exame da infecção pelo vírus. Na entrada do vírus / análise de fusão (barras cinza escuro), as monocamadas de células semeadas foram pré-refrigerada a 4 ° C durante 1 hr e depois desafiado com os respectivos vírus a 4 ° C durante 1,5 - 3 h (i). As células foram entãolavados e tratados com os compostos de teste durante um período de incubação adicional (ii) durante o qual a temperatura foi mudada para 37 ° C para facilitar o evento de entrada / fusão viral. No final da incubação, os vírus extracelulares foram removidos por qualquer tampão de citrato (pH 3,0) ou de lavagens com PBS e as células foram incubadas adicionalmente (iii) para a análise da infecção pelo vírus. Os resultados para (B) de HCMV, (C) de HCV, (D) DENV-2, (E) MV, e (F) de RSV são indicados em cada painel adicional. Os dados são representados graficamente contra o controlo negativo DMSO tratamento da infecção pelo vírus e são apresentados como médias ± SEM de três experiências independentes. Esta figura foi modificado a partir da referência 31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Thermo Scientific 89087-320
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405

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