Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von

Immunology and Infection

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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

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Abstract

Introduction

Mycobacterium abscessus ist eine aufstrebende Erreger, die ein breites Spektrum von Krankheitsbildern in den Menschen verursacht. Dazu gehören Hautinfektionen sowie schwere chronische Lungeninfektionen, vor allem bei immungeschwächten und Fibrose-Patienten 1,2,3,4 zystische aufgetreten. M. abscessus wird auch als Haupt schnell wachsenden Mykobakterienarten für nosokomiale und iatrogene Infektionen beim Menschen verantwortlich gemacht. Darüber hinaus hob mehrere jüngsten Berichten die Möglichkeit, daß M. abscessus kann die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden und induzieren wichtig Läsionen im zentralen Nervensystem (CNS) 5,6. Obwohl er eine schnelle Bauer, M. abscessus Exponaten auch einige pathogene Eigenschaften, die denen von Mycobacterium tuberculosis verwandt sind, einschließlich der Fähigkeit, schwieg Jahren innerhalb granulomatöse Strukturen bleiben und käsige Läsionen in der Lunge 7 zu erzeugen. Noch alarmierender ist die geringe senlichkeit von M. abscessus gegen Antibiotika, wodurch diese Infektionen extrem schwierig zu behandeln, die zu einer signifikanten therapeutischen Ausfallrate 8,9. Die wichtige Bedrohung dieser Art ist vor allem seiner intrinsischen Resistenz gegen Antibiotika, die zu großer Besorgnis in der öffentlichen Gesundheitseinrichtungen 10 und einer Kontraindikation für eine Lungentransplantation 11 ist.

M. abscessus Displays glatt (S) oder rauhe (R) Kolonie Morphotypen, die unterschiedlichen klinischen Ergebnissen führen. Im Gegensatz zu dem S-Stamm haben R Bakterien eine Tendenz zu einem Ende zum anderen zunehmen, was zu einem Seil oder schnurartigen Struktur 12,13. Mehrere unabhängige Studien, die entweder auf Zell- oder Tiermodellen ergeben, die hyper-Virulenz Phänotyp der R Morphotyp 14,15. Aus epidemiologischen Studien, den schwersten Fällen von M. abscessus Lungeninfektionen scheinen mit R verbunden sein Varianten 16, die die einzige Variante ist, dasshat sich gezeigt, für viele Jahre in einem infizierten Wirt 3 bestehen. Die Morphotyp Unterschied beruht auf der Gegenwart (in s) oder Verlust (in F) des oberflächenassoziierten glycopeptidolipids (GPL) 12. Jedoch aufgrund der inhärenten Beschränkungen der derzeit verfügbaren zellularen / Tiermodelle verwendet, um M. studieren abscessus Infektion bleibt unser Wissen über die pathophysiologischen Ereignisse der R- oder S-Varianten im Dunkeln. Die Infektion von immunkompetenten Mäusen durch intravenöse oder Aerosol-Routen führt zu vorübergehenden Kolonisierung, behindern die Verwendung von Mäusen zu persistenten Infektionen und für die in vivo Arzneimittelempfindlichkeitsprüfung 17 zu studieren. Daher ist die Entwicklung von Tiermodellen offen für die Manipulation der Wirtsantwort ist eine große Herausforderung. In diesem Zusammenhang haben die Nicht-Säugetiermodellen der Infektion vor kurzem entwickelt worden, einschließlich Drosophila melanogaster 18, die mehrere Vorteile, wie beispielsweise Kosten, Geschwindigkeit und ethischen Akzeptanz o bietetn den Maus-Modell. Der Zebrafisch (Danio rerio) Modell der Infektion wurde ebenfalls untersucht, um sichtbar zu machen, durch nicht-invasive Bildgebung, das Fortschreiten und die Chronologie der M. abscessus Infektion in einem lebenden Tier 19. Wichtig ist, dass ein Proof of Concept auch gegründet, um seine Tauglichkeit für die in vivo-Antibiotikum, Einschätzungen gegen M. demonstrieren abscessus 17,20.

Der Zebrafisch wurden weit verbreitet in den letzten zwei Jahrzehnten verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts 21 zu studieren. Der zunehmende Erfolg dieses alternativen Wirbeltiermodell stützt sich auf große und einzigartige Möglichkeiten, die motiviert und validiert seine Verwendung für ein besseres Verständnis der zahlreichen viralen und bakteriellen Infektionen 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Wie die meisten anderen Tiermodellen gegenüberliegen, sind Zebrafischembryonen optisch transparent, so dass nicht-invasive Fluoreszenzbildgebung 30 ha. Dieses führte zu M. studieren abscessus infiziert Zebrafischembryonen mit beispiellosen Details, die ihren Höhepunkt mit der Beschreibung der extrazellulären Aufzeichnung, die ein Beispiel der bakteriellen morphologische Plastizität zu vertreten. Cording stellt einen neuen Mechanismus der Subversion des Immunsystems und einen Schlüsselmechanismus zur Förderung Pathogenese der akuten M. abscessus Infektion 19.

Dieser Bericht beschreibt neue Werkzeuge und Methoden unter Verwendung des Zebrafischembryo, um die pathophysiologischen Merkmale des M. entziffern abscessus Infektion und die intime Wechselwirkungen zwischen der Bazillen und das angeborene Immunsystem zu untersuchen. Zuerst wird ein detailliertes Protokoll, das die Mikroinjektion Verarbeitung des bakteriellen Inokulums Embryo Herstellung und Infektion per se beinhaltet, wird vorgestellt. Methoden spezifisch angepasst, um M. bewerten abscessus Virulenz durch Messung verschiedener Parameter, wie beispielsweise Wirts Überleben und bakterielle Belastung, werden vorgestellt. Ein besonderer Fokus liegt auf, wie angegebenzur Überwachung, in einem räumlich-zeitlichen Ebene das Schicksal und die Progression der Infektion und dem Wirtsimmunantwort auf M. abscessus mittels Videomikroskopie. Darüber hinaus, um den Beitrag und die Rolle von Makrophagen bei M. untersuchen abscessus Infektion, Methoden, um Makrophagen verarmten Embryonen (entweder genetically- oder chemisch basierte Ansätze) beschrieben zu erzeugen. Schließlich Protokolle, um die spezifischen Wechselwirkungen mit Makrophagen oder Neutrophile mit festen oder lebenden Embryonen dokumentiert sind zu visualisieren.

Das Ziel dieses Berichts ist es, weitere Untersuchungen anzuregen, neue Licht in M. vergossen abscessus Virulenzmechanismen und insbesondere die Rolle der Aufzeichnung in der Einrichtung einer akuten und unkontrollierte Infektionsprozess.

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Protocol

Zebrafisch experimentellen Verfahren müssen die relevanten institutionellen und staatlichen Vorschriften. Für die vorliegende Studie wurden Zebrafisch-Experimenten an der Universität Montpellier getan, nach EU-Richtlinien für den Umgang mit Labortieren (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) und unter dem Referenz zugelassen CEEA-LR-13007.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Mikroinjektion Ausrüstung

  1. Bereiten Fischwasser durch Lösen von 0,06 g Instant Ocean Meersalz in 1 l destilliertem Wasser 31, dann im Autoklaven sterilisiert (120 ° C für 20 min) und lagern bei 28,5 ° C für bis zu 1 Monat.
  2. Bereiten Methylenblau-Lösung durch Auflösen von 1 g Methylenblau in 1 L destilliertem Wasser. Fügen Sie 300 ul Methylenblau-Lösung in 1 l Wasser, um Fische blaue Fische Wasser zu erhalten, dann Autoklaven bei 28,5 ° C für bis zu 1 Monat zu sterilisieren und zu lagern.
    HINWEIS: Die additiauf Methylenblau in Fischwasser verhindert Schimmelbildung.
  3. Herstellung von Phosphat-gepufferter Saline (PBS)
    1. Vorbereitung einer 10 X PBS-Stammlösung durch Auflösen von 5,696 g Na 2 HPO 4, 680 mg KH 2 PO 4, 969 mg KCl und 78,894 g NaCl in 1 l destilliertem Wasser und Einstellen des pH auf 7,0 mit HCl. Um 1 X PBS zu erhalten, zu verdünnen 100 ml der 10 X PBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser und Autoklaven während 20 min bei 120 ° C zu sterilisieren.
    2. In 0,05% Tween 80 bis 1 x PBST erhalten und speichern, bei RT bis zu 1 Jahr.
  4. Vorbereitung Oleinsäure Dextrose Catalase (OADC) Anreicherung durch Auflösen von 8,5 g NaCl, 50 g Rinderserumalbumin, 20 g D-Glucose, 40 mg Katalase aus Rinderleber und 0,5 g Ölsäure in 1 l destilliertem Wasser, filtriere dann Sterilisieren der Lösung und im Kühlschrank bei 4 ° C für bis zu 6 Monate.
  5. Vorbereitung 100 ml Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonsäure (Tricaine) Stammlösung, die durch Auflösen von 400 mg tricaine Pulver in 97,9 ml destilliertem Wasser. Hinzuzufügen 2,1 ml 1 M Tris (pH 9), um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen versetzt und die Lösung bei -20 ° C.
  6. Bereiten Sie die Mikrokapillare Injektionsnadeln durch Ziehen Borosilikatglas Kapillaren (1 mm OD X 0,78 mm ID) mit einer Mikropipette Abzieher Gerät mit den folgenden Einstellungen: Luftdruck 650; Erhitzen Sie 999; Ziehen Sie 50; Velocity 80; Zeit 200.
  7. Bereiten Sie eine 1,5% Agar-Lösung in blauen Fisch Wasser vermischen und 25 ml geschmolzenem Agar in 100 mm Petrischalen. Auf der Oberseite des geschmolzenen Agar, platzieren hausgemachten Formen, um bestimmte Kanäle prägen. "V" -förmigen Kanäle auf Position Embryonen verwendet werden, während der "U" -förmigen für Eier (1), 31 eingesetzt werden. Einmal verfestigt, entfernen Sie vorsichtig den Abdruck.
    HINWEIS: Decken Sie die Agar mit blauen Fisch Wasser, um Austrocknung und Speicher für bis zu 2 Monaten zu vermeiden, bei 4 ° C.

Abbildung 1 Abbildung 1. Positionierung Kammern zur Zebrafisch-Injektionen. (A) U-förmige Kanäle für Eier (linkes Bild) und V-förmige Kanäle für Embryonen (rechtes Bild). Zebrafisch-Eier / Embryonen werden in die Kanäle verlegt und entlang der gleichen Achse ausgerichtet sind. (B) Viewing Kammern zur mikroskopischen Beobachtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Herstellung und Lagerung des M. abscessus Inokulum

  1. M. abscessus Wachstumsbedingungen
    1. Teller aus M. abscessus aus einem -80ºC Glycerolstammlösung auf eine Middlebrook 7H10-Agar, der 10% OADC und 0,5% Glycerin (7H10 OADC) und mit dem entsprechenden Antibiotikum, je nach dem Resistenzmarker des Vektors, der das fluoreszierende Protein kodiert, durchgeführt wird, ergänzt. Die Inkubationbei 30 ° C für 4-5 Tage.
    2. Pick-up ein Fluoreszenz-positiven mykobakteriellen Kolonie und zu impfen 1 ml Middlebrook 7H9 Bouillon mit OADC ergänzt, 0,2% Glycerin, 0,05% Tween 80 (7H9 OADC / T) mit der erforderlichen Antibiotikum, das in einem 15 ml sterile Kunststoffröhrchen. Inkubation bei 30 ° C für 1 Woche ohne Schütteln.
      HINWEIS: Tween 80 schränkt Klumpenbildung und Bakterienaggregation.
    3. Resuspendieren in 2.1.2 erhaltenen Vorkultur in 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T in 150 cm 2 Gewebekulturflaschen auf eine endgültige OD 600 von 0,1 (entspricht ca. 5,10 7 Bakterien / ml) und Inkubation weiter bei 30 ° C für 4 Tage, um eine exponentiell wachsende Kultur (OD 600 = 0,6 bis 0,8) zu erhalten.
      WICHTIG: Um Klumpenbildung zu minimieren, vor allem der Grobvariante, sollte Inkubationszeit 5 Tage nicht überschreiten. Sowohl glatte und raue Varianten zeigen eine ähnliche Wachstumsrate.
  2. Herstellung des M. abscessus Inokula60;
    HINWEIS: Aufgrund der hohen Neigung der rauen M. abscessus um große Aggregate zu bilden und Schnüre zu produzieren, erforderlich ist eine besondere Behandlung, um eine homogene und quantitativ gesteuert Inokula vor der Mikroinjektion in Embryonen zu erzeugen. Diese Behandlung wird auch angewendet, um Bakterien, die Aggregate zu erzeugen, wenn auch in geringerem Ausmaß als der rauen Stamm glätten.
    1. Ernte exponentiell wachsende Kulturen von 150 cm 2 Gewebekulturkolben durch Zentrifugation bei 4 000 g für 15 min bei RT in 50 ml sterile Kunststoffrohr und Resuspendieren der Bakterienpellet in 1 ml 7H9 OADC / T. Aliquot 200 ul Bakteriensuspensionen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Arbeiten mit kleinen Volumina in 1 ml-Spritzen ist notwendig, um sehr homogene Suspensionen zu erhalten.
    2. Homogenisieren der Bakteriensuspensionen mit einer 26-G-Nadel (15 up-and-down-Sequenzen), beschallen dreimal für 10 sec (bei 10 s Pausen zwischen jeder Beschallung SEquenz) mit einem Wasserbad Ultraschallgerät. 1 ml 7H9 OADC / T und kurz vortexen. Zentrifuge 3 min bei 100 x g.
    3. Sorgfältig sammeln die Mykobakterien-haltigen Überständen, um die Klumpen zu vermeiden und bündeln die homogene Suspensionen in einem 50 ml sterile Kunststoffröhrchen.
    4. Sichtprüfung auf das Vorhandensein von etwaigen verbliebenen bakteriellen Aggregate.
      HINWEIS: Wenn Aggregate noch vorhanden sind, zu einer zusätzlichen Zentrifugationsschritt gehen bei 100 × g für 2 min, und sammeln Sie den Überstand.
    5. Zentrifuge die Suspension bei 4.000 g für 5 min, das Pellet in 200 ul 7H9 OADC / T und zur Injektion.
    6. Beurteilung der abschließenden Bakterienkonzentration durch Plattieren serielle Verdünnungen (in 1 x PBST) auf 7H10-Agar OADC und Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) nach 4 Tagen Inkubation bei 30 ° C. KBE sollte für jede neue Charge bestimmt werden.
    7. Bereiten gefrorenen Inokula Aktien durch die Speicherung 5 ul Aliquots bei -80 & #176; C.
      HINWEIS: Die Beurteilung der CFU -80ºC gefroren Aliquots ist eine Voraussetzung, um die genaue Anzahl der lebensfähigen Bakterien zu bestimmen, wie Einfrieren / Auftauen können bakterielle Lebensfähigkeit des Inokulums beeinflussen. Diese gefrorenen Inokula sind bereit, für nachfolgende Injektionen verwendet werden. Da alle Aliquots enthalten die gleiche Anzahl von CFU, erlauben sie die Injektion von Bakterien in einer reproduzierbaren Art und Weise von einem Experiment zum anderen.
  3. Inokulum Qualitätskontrolle
    HINWEIS: Ziehl-Neelsen Färbung (spezifisch für Mykobakterien) verwendet, um die Qualität der Bakteriensuspensionen vor und nach der in 2.2 beschriebene Homogenisierungsverfahren zu vergleichen.
    1. Spot und breitete ein Tröpfchen der homogenisierten Bakteriensuspension auf einen Objektträger und lassen Sie es vollständig trocknen, fixieren Sie die Abstrich für mindestens 30 Minuten auf einer heißen Platte auf 65-70 ° C und Flecken mit einem Ziehl-Neelsen-Färbung Protokoll eingestellt .
    2. Beachten Sie die bakteriellen Abstrich mit einem Mikroskop mit einer 100X Ziel und vergleichen mit einem Abstrich eines nicht verarbeiteten Bakteriensuspension (Abbildung 2).

Figur 2
Abbildung 2. Herstellung dispergiert M. abscessus Inokula. Ziehl-Neelsen Färbung von R- oder S-Varianten auf Nährmedium vor jeder Behandlung (obere Felder) angebaut oder nach der Behandlung (untere Felder), um die Größe und Anzahl der mykobakteriellen Aggregate (aufeinanderfolgende Schritte Ausspritzen, Beschallung und Dekantieren) zu reduzieren . Die Bakterien wurden mit einem Mikroskop mit 100 X APO Öl 1,4 NA-Objektiv) beobachtet. Maßstabsbalken:. 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Vorbereitung Zebrafischembryonen

  1. Laich- und Sammeln Zebrabärblingeier
    1. Am Tag vor sPfändung, Rasse erwachsenen Zebrafisch, indem 2 Rüden und 1 Hündin (in der Regel ein 2: 1-Verhältnis ermöglicht eine optimale Befruchtungsrate) in eine Brutkammer, die aus einem separaten Aquarium mit einem Ei Sammelkorb 31.
      HINWEIS: Eiersammlung Körbe werden verwendet, um die Eier aus, die von den Eltern gegessen zu schützen und zu erleichtern Ei Ernte.
    2. Bei 1 HPF, Ernte Eier und nur richtig entwickelt Embryonen in einer 100 mm Petrischale mit 25 ml blaue Fisch Wasser (maximal 100 Embryonen pro Schale) und halten sie bei 28,5 ° C gefüllt. Nicht befruchtete Eier werden verworfen.
  2. Herstellung von Zebrafischembryonen für Injektionszwecke
    1. Bei etwa 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF), dechorionate die Embryonen mit feinen Pinzette in einer 100 mm Petrischale und halten sie bei 28,5 ° C.
    2. Sammeln Sie die HPF 30-48 Embryonen mit einer Pipette und Übertragung auf einen "V" -förmigen Positionierungskammer mit 25 ml Wasser, das Fisch 270 mg / L Tricaine gefüllt.Verlegen Sie die Embryonen richtig in den Kanälen mit einem hausgemachten Microloader tool (hausgemachte abgeschnitten Mikro loader Spitze) für eine einfachere Mikromanipulation optimiert.
      HINWEIS: Richten Sie die Rückenseite nach unten zur intravenösen Injektion in die Schwanzvene oder der Rückenseite nach oben für Rückmuskel Injektionen.

4. Mikroinjektionsverfahren

HINWEIS: Die Mikroinjektionsverfahren für M. abscessus ist ähnlich zu dem zuvor beschriebenen für M. marinum Injektionen 32. Um die Chronologie der M. bewerten abscessus Infektion (Überleben, bakterielle Belastungen, kinetische und Eigenschaften der Infektion), sind Injektionen in die Schwanzvene von 30 HPF Embryonen bevorzugt. Die Rekrutierung von Immunzellen sichtbar zu machen, sind Injektionen in lokalisierten Websites getan wie in Schwanzmuskeln in 48 HPF Embryo.

  1. Verdünnt das mycobakterielle Inokulum in 1 X PBST (abhängig von der Anzahl der CFUwie in Schritt 2.2.6) bestimmt wird, die 10% roten Phenol, um eine ordnungsgemäße Injektion überprüfen, verabreicht werden.
  2. Legen Sie eine Mikrokapillare Injektionsnadel mit 5-10 & mgr; l der bakteriellen Impfstoff unter Verwendung eines Microloader Spitze, schließen Sie das Mikroinjektionsnadel in die Halterung der dreidimensionalen Mikromanipulator mit dem Injektor verbunden ist, und brechen Sie die Spitze der Nadel mit feinen Pinzette, um ein zu erhalten Öffnungsdurchmesser von 5-10 um.
  3. Kalibrieren der Einspritzmenge durch Einstellen der Mikroinjektionsdruck (20-50 hPa) und der Zeit (0,2 Sekunden).
    HINWEIS: Die erforderliche Injektionsvolumen wird durch visuelle Bestimmung des Durchmessers eines Tropfens in den Dotter eines Embryos vertrieben kalibriert.
  4. Für Schwanzveneninjektion, positionieren Sie den Embryo mit der ventralen Blick auf die Nadel (wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben) Seite und setzen Sie die Nadelspitze in der Nähe des urogenitalen Öffnung, zur Förderung der Schwanzvene, und drücken Sie vorsichtig die Spitze der Nadel in den Embryo bis sie gerade durchstößt die caudal Venenregion. Geben Sie die gewünschte Lautstärke der bakteriellen Zubereitung, in der Regel 1-3 nl mit jeweils etwa 100 KBE / nl.
  5. Für die intramuskuläre Injektion, positionieren Sie den Embryo mit Blick auf die Nadel (wie in Abschnitt 3.2.2) der Rückenseite, legen Sie die Nadel über einen Somiten und injizieren ein kleines Volumen (1 nl) Inokulum.
    HINWEIS: Wie bei Schwanzvene Injektionen sind auch intramuskuläre Infektionen schwierig zu führen. Es muss darauf geachtet werden, um eine Überladung, die das umliegende Gewebe schädigen können, zu vermeiden.
  6. Am Ende des Einspritzvorgangs sowie die Größe des Inokulums durch Injektion des gleichen Volumens an Bakteriensuspension in einem Tropfen steriler PBST, gefolgt von Plattieren auf 7H10 OADC und Zählen der CFU. Etwa 100 Embryonen können mit einer Nadel injiziert werden.
    Hinweis: Da grobe M. abscessus können weiterhin Zuschlagstoffe in der Nadel zu bilden, müssen Injektionen unmittelbar nach der Herstellung der Impfkultur vorgenommen werden.
  7. Übertragen Sie die infizierten fish einzeln in 24-Well-Platten mit 2 ml / Vertiefung Fischwasser und Inkubation bei 28,5 ° C. Embryos mit 1-3 nl 1 X PBST injiziert werden als Kontrollen verwendet werden.
  8. Ordnungsgemäße Infektion von fluoreszierenden Bakterien in Embryos wird mit einem Fluoreszenzmikroskop überwacht.

5. Generation von Makrophagen-Depleted Embryos

HINWEIS: Die selektive Abreicherung von Makrophagen aus dem Gewebe verwendet wird, um ihren Beitrag und die Rolle während der Infektion zu untersuchen. Um die richtige Erschöpfung der Makrophagen zu visualisieren, ist es empfehlenswert, eine transgene Linie mit fluoreszierenden Makrophagen, wo mCherry gezielt unter der Steuerung des Makrophagen spezifische MPEG1 Promotor 19 ausgedrückt verwenden.

  1. Lipo-Clodronat-basierte Verfahren
    HINWEIS: Die Lipo-Clodronat Verfahren ermöglicht eine selektive Depletion von Makrophagen aus Geweben (aber keine Neutrophile) 19. Diese Verbindung hat weder verändern das Überleben der Embryonen noch affect die Integrität der Bakterien. Ein detailliertes Protokoll zur liposomenverkapseltem Clodronat vorzubereiten zuvor 33 gemeldet.
    1. Bei 24 HPF, dechorionate die Embryonen und Übertragung auf einen "V" -förmigen Injektionsgericht mit Fisch Wasser mit Tricaine ergänzt, um die Embryonen in einem betäubten Zustand, bis zum Ende des Einspritzvorgangs zu erhalten, wie in 3.2.2 beschrieben, gefüllt. Orientierung der Rückenseite nach unten.
    2. Legen Sie eine Mikrokapillare Injektionsnadel mit liposomenverkapseltem Clodronat (Lipo-Clodronat), schließen Sie das Mikroinjektionsnadel in die Halterung der dreidimensionalen Mikromanipulator und brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer feinen Pinzette, ein Trinkgeld Öffnungsdurchmesser von 10 um zu erhalten.
    3. Um das Einspritzvolumen zu kalibrieren, stellen Sie die Mikroinjektion Druck bis 20 hPa und der Einspritzzeit auf 0,2 sec. Legen Sie die Nadelspitze in der Nähe des urogenitalen Öffnung, zur Förderung der Schwanzvene, und drücken Sie vorsichtig die Spitze der Nadel in dieEmbryo, bis sie gerade durchstößt die Schwanzvene Region und liefern das gewünschte Volumen der Lösung (2-3 nl, 3 mal).
      HINWEIS: Die Lipo-Clodronat Suspension ist sehr klebrig und sollte vor der Injektion verwirbelt werden, damit die Blockierung der Kreislauf-System und die Tötung des Embryos. Es ist entscheidend, um mehrere aufeinanderfolgende Injektionen von kleinen Volumina fortzufahren.
    4. Übertragen Sie die Embryonen in 100 mm Petrischalen mit Fischwasser und halten sie bei 28,5 ° C, bis Infektion.
    5. Kontrollieren Sie die richtige Erschöpfung der Makrophagen durch Fluoreszenzmikroskopie.
      HINWEIS: Vollständige Makrophagen-Depletion ist für 4 Tage nach Lipo-clodoronate Verwaltung.
  2. Morpholino-basierte Verfahren
    1. Am Tag vor dem Laichen Rasse erwachsenen Zebrafisch, indem 2 Rüden und 1 Hündin von einer Barriere aus Kunststoff in einem Brutraum getrennt.
    2. Am nächsten Tag ≈ 30 min nach, dass das Licht schaltet sich im Zebrafisch-Anlage, entfernen Sie die Barriere zwischenMännchen und Weibchen. Warten für etwa 20 min nach Beginn der Laich um die Befruchtungsrate zu optimieren. Ernten Sie die Eier und ihre Entwicklung zu verlangsamen, indem sie in einer 100 mm Petrischale mit kaltem blauer Fisch Wasser (4 ° C) gefüllt.
      HINWEIS: Die Steuerung des Laich ist von entscheidender Bedeutung für die Morpholinos basierten Experimenten. Morpholino nur bis zu vier Zellen Stufe in die Eier injiziert werden.
    3. Sammeln Sie die Eier mit einer Pipette und hinterlegen Sie die Eier, die in der "U" -förmigen Einspritzkammer mit kaltem blauer Fisch Wasser gefüllt und blockieren Sie die Eier in den Kanälen mit einem hausgemachten Microloader tool.
    4. Vorbereitung der PU.1 Morpholino Lösung, die 10% der roten Phenol, wie zuvor beschrieben 19. Legen Sie eine Mikrokapillare Injektionsnadel mit dem Morpholino Vorbereitung und schließen Sie das Mikroinjektionsnadel in die Halterung der dreidimensionalen Mikromanipulator, dann brechen Sie die Spitze der Nadel mit feinen Pinzette obtaina Spitzenöffnung Durchmesser von 5-10 & mgr; m.
    5. Um das Einspritzvolumen zu kalibrieren, stellen Sie die Mikroinjektion Druck auf 20-50 hPa und der Einspritzzeit auf 0,2 sec. Legen Sie die Nadelspitze in der Nähe der Eizelle und drücken Sie vorsichtig die Spitze der Nadel durch die Chorion in das Ei und liefern die gewünschte Morpholino Lösungsvolumen, typischerweise 3-5 nl.
    6. Nach der Mikroinjektion, übertragen Sie die Eier in eine 100 mm Petrischale in Fisch Wasser und Inkubation bei 28,5 ° C, bis die Infektion Prozedur beginnt.
    7. Analysieren Sie den richtigen (komplett) Erschöpfung der Makrophagen in PU.1 morphants durch Fluoreszenzmikroskopie bei 30-48 HPF..
      HINWEIS: Je nach der injizierten Konzentration kann p u.1 Morpholinos auch die Zahl der frühen Neutrophilen beeinflussen. Um die richtige Erschöpfung der Makrophagen, ohne die Zahl der Neutrophilen zu bestätigen, ist es empfehlenswert, eine doppelt transgenen Zebrafisch-Linie mit fluoreszierenden Makrophagen und Neutrophile mit GFP verwenden (Ausdruck spezifisch durch die MPX-Promotor angetrieben) 19.

6. Bakterienlast Quantifizierung

  1. Bestimmung von CFU-Enumeration
    1. Bei dem gewünschten Zeitpunkt, zu sammeln Gruppen von infizierten Embryo (5 pro Bedingungen) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (1 Embryo / Röhrchen), Kryo-betäuben die Embryonen durch Inkubation auf Eis für 10 min und einschläfern mit einer Überdosis Tricaine (300- 500 mg / l)
    2. Zweimal waschen die Embryonen mit sterilem Wasser und verzichten sie in ein neues Röhrchen, lyse jeder Embryo mit 2% Triton X-100 in 1 X PBST mit einer 26-G-Nadel und homogenisieren die Aussetzung bis zur vollständigen Lyse verdünnt. Zentrifugieren Sie die Suspension und das Pellet in 1 X PBST mit 0,05% Tween 80 Serielle Verdünnungen der Homogenate werden auf Middlebrook 7H10 OADC plattiert und ergänzt mit BBL MGIT PANTA, wie vom Hersteller empfohlen.
      HINWEIS: M. abscessus als anfälliger für NaOH treatment als M. marinum, Dekontamination von Fisch Lysaten ohne Beeinträchtigung M. abscessus Wachstum erfolgreich mit der BBL MGIT PANTA antibiotischen Cocktail erreicht werden.
    3. Die Platten für 4 Tage Inkubation bei 30 ° C und die Zählung Kolonien.
  2. Bestimmung durch Fluoreszenz Pixel Count (FPC) Messungen in lebenden Embryonen
    HINWEIS: Um die bakterielle Belastungen über Fluoreszenzemission zu bestimmen, werden Serienbilder von infizierten Embryonen erworben und Fluoreszenzintensität von FPC (Identifizierung von Bakterien durch Partikelanalyse) gemessen mit einem hausgemachten Makro für die ImageJ Freeware entwickelt. Ein Partikelanalyse erfordert eine binäre Schwarzweißbild, das auf einem Grenzbereich, die Unterscheidung des Fluoreszenzsignals von Interesse aus dem Hintergrund ermöglicht beruht.
    1. Bei dem gewünschten Zeitpunkt, tricain-betäuben infizierten Embryonen (5-10 pro Bedingung) in 35 mm Petrischalen, wie in 3.2.2 beschrieben.
    2. Entfernen Sie Wasser und submerge die Embryonen und die gesamte Geschirroberfläche mit 1% niedrigschmelzender Agarose in Fisch Wasser, dann seitlich richten Sie die Embryonen. Decken Sie die erstarrte Agarose mit Fisch Wasser mit Tricaine.
    3. Erwerben Fluoreszenzbilder des gesamten Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer 10 X Ziel.
      HINWEIS: Die Fluoreszenz Bildaufnahme ist ein kritischer Schritt des FPC Messverfahren. Es ist wichtig, um einen kalibrierten Monitor mit einer Farbkalibrierung Sonde verwenden. Einstellen der optimale Zeitpunkt der Belichtung einen minimalen Hintergrund zu erhalten, während der Erfassung verhindert eine Sättigung des Signals. Bilder müssen in einem 8-Bit-TIFF-Format vorliegen. Identische Einstellungen werden während des gesamten Experiments für quantitative Zwecke gehalten.
    4. Vorsichtig die Agarose aus den Embryos mit einem hausgemachten Microloader tool. Diese Embryonen können für nachfolgende Analysen verwendet werden, falls erforderlich. Vor der Quantifizierung der bakteriellen Belastung, jedes Bild wird Qualität gesteuert werden. EinAlysieren Sie die Bilder und die Fluoreszenzintensität zu konvertieren in FPC pro Fisch, öffnen Sie die ImageJ Freeware.
      HINWEIS: Die FPC-Wert spiegelt die Bakterienlast wie zuvor mit M. gezeigt marinum 34.
    5. Bestimmung der erforderlichen Schwelle für Bildanalyse unter Verwendung eines Bildes eines nicht-infizierten Embryo (mehrere Steuer Embryonen können verwendet werden, um einen mittleren Schwellenwert erhalten wird). Zum Bild → Stellen → Schwellwert und bewegen Sie den Schieberegler unten im Schwellenfenster nach rechts, bis der Hintergrund komplett schwarz (dh, um einen Hintergrund zu erhalten, sollte bei Null sein). Nehmen Sie den entsprechenden Wert.
    6. Im Bild J, öffnen Sie die FPC-Makro (Zusatz-Datei) und folgen Sie den Anweisungen: Suchen Sie den Ordner mit Bildern gemessen werden soll und geben Sie dann die Schwelle wie zuvor festgelegt und klicken Sie auf "OK".
      HINWEIS: Das Makro subtrahiert automatisch den Hintergrund. Eine Schwelle wird dann angewandt. Floureszierendes Signale identifiziertim Anschluss an die Partikelanalyse Fied.
    7. Kopieren und fügen Sie die Daten aus dem Übersichtsfenster auf die gewünschte Software für die Datenanalyse.
      Anmerkung: Im Gegensatz zu den CFU-Bestimmungsverfahren ist die FPC-Methode nicht-invasiv und ermöglicht Wiederverwendung der Embryonen für die nachfolgende Analyse und, was wichtig ist, die Überwachung der Dynamik / Kinetik der bakteriellen Belastung auf einer individuellen Basis. Es ermöglicht daher, die Zahl der Tiere deutlich reduziert, in Übereinstimmung mit ethischen Regeln.

7. Imaging M. abscessus- infizierten Embryonen

  1. Live-Bildgebung von M. abscessus Infektion
    1. Halterung Tricaine narkotisiert Embryonen (siehe 3.2.2) in 1% niedrig schmelzender Agarose in einer 35 mm Petrischale vor Epifluoreszenzmikroskopie Beobachtungen. Verwenden Sie eine Bodenschale Glas für invertierten konfokalen Mikroskopie oder in einem Hohlraum Depressionen Rutsche für aufrechte konfokale Mikroskopie. Orientieren den Embryo in die gewünschte Position und Deckeldie erstarrte Agarose mit Fisch Wasser mit Tricaine.
    2. Verwenden ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer 10 X Ziel für sequentielle Fluoreszenzerfassung und Transmissionsbilder des gesamten Embryos. Als Alternative kann ein konfokales Mikroskop mit 40-facher oder 63X Ziele, um die Aktivität von Immunzellen nach einer Infektion zu visualisieren.
  2. Imaging festen M. abscessus infizierten Embryonen
    1. Euthanize die Embryonen wie in 6.1.1 beschrieben und sie auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fixieren Sie die Embryonen in 4% Paraformaldehyd in 1 X PBST für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. Paraformaldehyd zu entfernen durch Waschen der Embryos zweimal mit 1 X PBST 10 min.
      WICHTIG: Um Fluoreszenz zu erhalten, muss festgelegt Embryonen vor Licht geschützt werden.
    2. Um die Integrität der Gewebe und der Fluoreszenz zu erhalten, werden die Embryos nacheinander in steigender Glycerinkonzentration Lösungen (10, 20, 30, 40 und 50% in 1 X PBST verdünnt) inkubiert, für10 min pro Bedingung.
      HINWEIS: Fest Embryonen können für mehrere Monate in 50% Glyzerin bei 4 ° C gelagert werden.
    3. Lag der Embryo in 50% Glycerin in einer Sichtkammer (1B) 31 eingebettet.
    4. Bild mit 40X oder 63X Ziele auf einem konfokalen Mikroskop.

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Representative Results

Obwohl verschiedene anatomische Stellen injiziert 32 werden, sind Schwanzvene Injektionen oft verwendet, um eine systemische Infektion für spätere Analysen einschließlich Überlebensexperimente, bakterielle Belastung Bestimmung Phagozytoseaktivität oder Schnur Bildung zu erzeugen. Injektionen in die Schwanzmuskeln werden verwendet, um die Rekrutierung von Makrophagen an der Stelle der Injektion (3A) zu beurteilen. Zu untersuchen und zu vergleichen, die Virulenz von R- und S-Varianten von M. abscessus, fluoreszierende Bakteriensuspensionen werden in die Schwanzvene von 30 HPF Embryonen (3A) 19 eingespritzt. Im Gegensatz zu dem S-Variante induziert der R Morphotyp eine robustere und tödliche Infektion in Zebrafischembryos (3B) innerhalb des zentralen Nervensystems (CNS) (3C), gekennzeichnet durch die rasche Entwicklung von bakteriellen Abszessen. Systemische Injektionen sowohl mit dem R- und S-Varianten führen zu ZNS-Infektionen und UnterschiedPathologie und Virulenz Phänotypen können entweder durch Fluoreszenzmikroskopie Beobachtung (3C), durch Auflisten der CFU pro Fisch (3D) oder durch Bestimmung der FPC von akquirierten Bildern (3E) quantifiziert werden. Wichtig ist, CFU und FPC Bestimmung korreliert und darauf hin zu größeren bakterielle Belastungen für die R-Stamm als die S-Stamm bei 3 und 5 dpi. Insgesamt sind diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich Zebrafisch als relevant und nicht-invasiven Infektionsmodell, um die Chronologie der Infektionsprozess zu studieren.

Vielleicht ist einer der spektakulärsten Features wurde von Videomikroskopie ermöglicht die Visualisierung von Serpentinenkabel innerhalb des ZNS von Embryonen mit dem R-Variante infiziert (Abbildung 4) offenbart. Dank der optischen Transparenz der Embryos könnte die Kinetik der R-Schnur Bildung überwacht und abgebildet werden in einer nicht-invasiven Weise, welche die hohe Neigung des R Variante ext replizierenracellularly. Diese unkontrollierte Replikationsrate in Verbindung mit Mobil / Gewebezerstörung führt schnell zu der Entwicklung von Abszessen und letztlich zum Tod der Larve.

Makrophagen sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der Mykobakterien und insbesondere durch Antreiben der Granulombildung 35 zu spielen. Zwei komplementäre Strategien können verwendet werden, um M. studieren abscessus Wachstum / Virulenz in Makrophagen verarmten Embryonen: Die Lipo-clodronate- und Morpholino-gestützten Verfahren (5A). Die Infektion von Makrophagen-abgereichertem Embryonen mit dem R-Variante führt zu einem massiven Anstieg der bakteriellen Belastungen und Schnüren, wie durch Videomikroskopie (5B) offenbart, was zu einer extrem schnellen Todes (100% toten Embryonen bei 3 dpi; 5C) . Dies zeigt deutlich, dass Makrophagen sind erforderlich, um zu kontrollieren M. abscessus Infektion.

Zur weiteren Untersuchung der Rolle von Makrophagenwährend der Infektion, spezifischen transgenen Embryos beherbergen rot fluoreszierende Makrophagen (mpeg1: mCherry) verwendet 19 werden. Die Injektion von M. abscessus exprimieren Wasabi in die Schwanzvene Muskel oder in die Schwanzvene induziert eine deutliche Rekrutierung von myeloiden Zellen, hauptsächlich Makrophagen an der Stelle der Infektion. Diese Einstellung führt zu einer effizienten Phagozytose von einzelnen Bakterien (6A-6B). Trotz der Anwesenheit von Makrophagen zeigt Konfokalmikroskopie das Aussehen von großen Bakterien Schnüre, die Makrophagen nicht phagozytieren (6C). Zusammen genommen verdeutlichen auch diese Ergebnisse einen neuen Mechanismus der Immunumgehung, basierend auf der Rolle der Kordiermaschine bei der Verhinderung mykobakteriellen Phagozytose.

Figur 3
Abbildung 3. M. abscessus Infektion in Zebrafischembryonen. (A) (oben) Die intravenöse Infektion durch Injektion von fluoreszierenden M. durchgeführt abscessus in die Schwanzvene (weiß dargestellt) (Pfeil 1), hinter dem urogenitalen Öffnung in 30 hpf Embryonen. (Unteres Feld) Intramuskuläre Infektionen durch die Injektion von fluoreszierenden Mykobakterien geführt im Schwanzmuskel (weiß dargestellt) über einen Somiten (Pfeil 2), in 48 hpf Embryonen. (BE) 30 hpf Embryonen intravenös tdTomato- M. infiziert abscessus (R und S Varianten). (B) Die Überlebenskurven von Embryonen mit ≈ 300 CFU entweder R oder S infiziert Varianten oder PBS injiziert Kontrollen (n = 20). Repräsentative Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. (C) Spatiotemporal Visualisierung von entweder der R- oder der S-Variante exprimieren tdTomato (weiß) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durch Fluoreszenz die Bildgebung durchgeführt wird. Für jeden Stamm, ist ein repräsentatives Fluoreszenz und Transmission Lagerung der gesamten infizierten Embryos sho wn. Die gleichen Embryos wurden nach 3 und 5 dpi bebildert. (DE) Bakterielle Belastungen innerhalb Embryonen entweder R oder S-Varianten (≈ 200 CFU) von CFU Zählen (D) oder FPC-Messungen (E) bestimmt infiziert. (D) CFU von Lysat der einzelnen Embryonen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durch Ausplattieren auf Middlebrook 7H10 OADC BBL MGIT PANTA ergänzt bestimmt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung log (horizontaler Balken) KBE pro Embryo aus drei unabhängigen Experimenten (n = 5). (E) FPC Messungen an einzelnen lebenden Embryonen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion basierend auf Partikelanalyse mit ImageJ. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung log (horizontaler Balken) FPC pro Embryo aus drei unabhängigen Experimenten (n = 5). Alle Bilder wurden mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet erhalten. t = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. In vivo Aufzeichnung des R-Variante. 30 HPF Embryonen intravenös mit dem R-Variante von M. infiziert abscessus und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der abgebildeten Infektion die Progression der Schnurbildung sichtbar zu machen. Der rote Pfeil wird als fester Referenzpunkt, um die raumzeitliche Entwicklung der Schnur folgendermaßen verwendet. Die DIC Bilder der Teil des Schwanzes, die die wachsende Serpentinenkabel sind eingerahmt (Mikroskop mit einer Farbkamera ausgestattet ist). Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Depletion von Makrophagen führt zu einer erhöhten Proliferation Kabel. (A) Die Embryonen werden mit dem Lipo-Clodronat-basierten Verfahren oder der Morpholino-basierte Verfahren erschöpft. Embryonen: (oben) Clodronat-verkapselten Liposomen (Lipo-Clodronat) intravenös in 24 HPF Tg (mCherry mpeg1) injiziert. Im Kreislauf, wird Lipo-Clodronat schnell durch Makrophagen, die anschließende Apoptose verschlungen. Zebrafisch-Eier: (linke untere Tafel) Injektion der Morpholino-Vorbereitung bis in befruchtete Tg (mCherry mpeg1) Knock-down der Expression des Gens PU.1. (Rechts-Down-Feld) Die richtige Erschöpfung der Makrophagen in Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie überprüft (BC) 30 HPF-Makrophagen-haltigen (+) oder Makrophagen-erschöpft. (-) Embryos (nach Lipo-Clodronat Behandlung) mit M. infiziert abscessus R exprimieren tdTomato (weiß dargestellt). (B) (C) Überlebenskurven der Makrophagen haltigen oder Makrophagen-abgereichertem Embryonen mit ≈300 CFU M. infiziert abscessus R (n = 20). Repräsentative Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. Alle Bilder wurden mit einem Mikroskop, um eine Farbkamera verbunden erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Verhalten der Makrophagen in Embryonen entweder lokal oder systemisch mit M. infiziert abscessus (A) 48 HPF Tg (mpeg1: mCherry). Zebrafischembryonen sind intramuskulär mit Wasabi-exprimierenden M. infiziert abscessus R. Live-Imaging mit einem konfokalen Mikroskop sichtbar zu machen rekrutierte Makrophagen phagozytierenden einzelnen Mykobakterien (in Minuten nach der Infektion, MPI). Maximum Intensity Projection, die eine intensive Rekrutierung von Makrophagen (rot) an der Injektionsstelle (konfokales Mikroskop mit 40-facher APO Wasser 0,8 NA-Objektiv). Maßstab: 20 & mgr; m (BC) 48 HPF Tg (mpeg1: mCherry). Embryonen intravenös mit M. infiziert abscessus R exprimieren Wasabi wurden fixiert und durch konfokale Mikroskopie (40X) bei 4 hpi (B) und 3 dpi (C) abgebildet. (B) Die maximale Intensitätsprojektion von Makrophagen (rot) oder anderen myeloiden Zellen, vermutlich Neutrophilen (Pfeile), enthaltend isolierten Mykobakterien (grün) in der Nähe der Injektionsstelle (konfokales Mikroskop mit 63X APO Öl 1,33 NA-Objektiv). Maßstab: 10 & mgr; m (C) Maximum Intensity Projection, die ein Makrophage (rot) nicht in der Lage, um ein Kabel (grün) (konfokales Mikroskop mit 63X APO Öl 1,33 NA-Objektiv) phagozytieren..Maßstab:. 5 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Der Zebrafisch hat vor kurzem als eine ausgezeichnete Wirbeltiermodellsystem zur Untersuchung der Dynamik von bakteriellen Infektionen mit breiten Feld und konfokale Bildgebung in Echtzeit 36. Die Kombination aus verteilt mykobakteriellen Suspensionen (Protokoll 2.2) zusammen mit Mikro-Injektionsverfahren (Protokoll 4) ermöglicht reproduzierbare systemische Infektionen und eine spätere Überwachung und Visualisierung des Verlaufs der Infektion mit einem besonderen Fokus auf den bakteriellen Interaktionen mit Host-Makrophagen. Virulenz von M. abscessus in vivo kann durch die Verwendung von Wildtyp-goldenen Zebrafisch-37 untersucht werden. Um Wechselwirkungen zwischen M. studieren abscessus und Host-myeloischen Zellen können mehrere transgene Zebrafischlinien als Tg (mpeg1: mCherry) verwendet, so werden, um Makrophagen 19 sichtbar zu machen. Zusätzliche transgene Reporterlinien wie die als Tg (MPX: GFP) 38 oder Tg (lyz: DsRed) 39 With entweder Grün Rot Neutrophilen jeweils kann auch verwendet werden, um die spezifische Funktion dieser Granulozyten als Reaktion auf die Infektion zu adressieren.

M. abscessus und insbesondere die R-Variante weist eine natürliche Neigung zu einer massiven bakteriellen Aggregate 19 zu bilden, wodurch reproduzierbare Mikroinjektion. Darüber hinaus schließt die Tatsache, dass die R-Variantenformen wesentlich größere Klumpen als der S-Variante auch das Potential Vergleich der Virulenz Phänotypen für die beiden isogenen Varianten. Die in Abschnitt 2 beschriebenen Protokoll ermöglicht den Erhalt homogen und verteilt M. abscessus Suspensionen für die Mikroinjektion in Embryonen. Diese Zubereitung können zu anderen Mykobakterienarten oder Mutantenstämme Anzeige übermäßige Aggregation Eigenschaften angewendet werden. Da der Ultraschallbehandlung kann die äußerste mykobakteriellen Zellwandschicht zu ändern, sollte darauf geachtet werden, um die Auswirkungen dieser physikalischen Behandlung auf die Lebensfähigkeit der Bakterien für E beurteilenach neuen Stamm.

Bestimmung der bakteriellen Belastungen routine beruht auf CFU Zählen nach dem Ausplattieren lysiert Embryonen auf Selektiv Agarmedium zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, wie in Protokoll 6.1 beschrieben. Dieses Verfahren umfasst mehrere Einschränkungen auf: da die Tiere eingeschläfert, kann jedes Embryos (oder Gruppe von Embryonen) für die Bestimmung eines einzigen Zeitpunkt verwendet werden. Darüber hinaus bleibt diese Methode ungenau infolge eines großen Anteils von Bakterien, die während der Lyse abgetötet werden und / oder verloren gehen, anschließende serielle Verdünnungen oder überwiegend durch Verklumpung. Zählen der CFU ist auch eine mühsame Aufgabe. Als Alternative wird das Protokoll 6.2 beschreibt ein effizientes Verfahren, um die M. quantifizieren abscessus Last, die begrenzte Handhabungsschritte umfasst, basierend auf der Analyse von Fluoreszenzbildern von infizierten Embryos mit Pixel Quantifizierung, wie ursprünglich entwickelt von M. marinum 40,41. Das FPC-Methode, basierend auf Partikelanalyse, zeigt eine gute Korrelation with der CFU Zählungen. In ähnlicher Weise durch die Kombination von Mikroskopie und Fluoreszenz Quantifizierung relativen Veränderungen angeborenen Immunzellzahlen pro Embryo kann durch Bildanalyse unter Verwendung angemessener transgenen Linien quantifiziert werden.

Zebrafischembryos verwendet werden, um die Rolle von Immunzellen während der Infektion und Makrophagen Verarmungs auszuwerten wurde gefunden, daß in Abhängigkeit von M. beeinträchtigen Wirt überleben abscessus Infektion. Spezifische Makrophagen Verarmung effizient mit dem Lipo-Clodronat-basierte Verfahren (Protokoll 5.1) oder der Morpholino-basierende Verfahren (Protokoll 5.2) erzeugt werden. Dennoch, da die Anwesenheit von Makrophagen, die für die Etablierung und die Erhaltung des vaskulären Systems und für die korrekte Embryonalentwicklung ist, ist es empfehlenswert, Makrophagen-Produktion bei 24 hpf mit Lipo-Clodronat abzutragen.

Die Zebrafischembryo erscheint als ein einzigartiges Modell zu studieren M. abscessus Infektionen und die Rolle der extradere Cording als Immunsystem subversion Strategie. Wenn Determinanten Steuerung Aufzeichnung in M. abscessus identifiziert werden können, könnten sie auf die Entwicklung innovativer Therapieoptionen führen. Die Verknüpfung der Verwendung von Zebrafisch zusammen mit innovativen Hochdurchsatz-Technologien 42 öffnet sich auch das Feld, um Wirkstoffforschung und neue pharmakologische Ansätze gegen diese Arzneimittel-resistente Erreger.

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Acknowledgments

Die Autoren danken K. Kissa für hilfreiche Diskussionen und für die Bereitstellung von Lipo-Clodronat und L. Ramakrishnan für die großzügige Gabe der pTEC27 und pTEC15, die die Expression tdTomato und Wasabi zu ermöglichen sind. Diese Arbeiten sind Teil der Projekte des Französisch National Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 und DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) und Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7-PEOPLE-2011-ITN) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. PITN-GA-2011-289209 für die Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma. Wir möchten auch die Vereinigung von Gregory Lemarchal und Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) für die Finanzierung CM Dupont danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

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References

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