تصوير الاتجار بين الخلايا من APP مع GFP Photoactivatable

1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University
Published 10/17/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

في حين يتم نقل البروتينات سطح الخلية درس بسهولة نسبيا، تصور الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر صعوبة بكثير. هنا، فإننا نستخدم بنيات دمج GFP photoactivatable ويبرهن على وجود طريقة لمتابعة بدقة بروتين اميلويد السلائف من جهاز جولجي إلى المقصورات أسفل مجرى وتابع إزالة لها.

Cite this Article

Copy Citation

Tam, J. H., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بيتا اميلويد (Aβ) هو المكون الرئيسي لويحات خرف وجدت في أدمغة مرضى الزهايمر. مشتق Aβ من انشقاق متتابعة من اميلويد السلائف البروتين (APP) من خلال β وγ-secretases. وعلى الرغم من أهمية Aβ إلى AD علم الأمراض، لا راسخة توطين التحت خلوية من هذه الانقسامات. العمل في مختبرنا وغيرها توريط النظام endosomal / الليزوزومية في معالجة APP بعد استيعاب من سطح الخلية. ومع ذلك، فإن الاتجار داخل الخلايا APP هو دراسة سلوكه نسبيا.

بينما البروتينات على سطح الخلية قابلة للتعديل إلى العديد من التقنيات وصفها، لا توجد طرق بسيطة لمتابعة الاتجار بروتينات الغشاء من جولجي. تحقيقا لهذه الغاية، أنشأنا بنيات APP التي تم الموسومة ب-صورة activatable GFP (paGFP) في محطة سي. بعد التوليف، paGFP ديها منخفضة مضان القاعدية، ولكن يمكن حفز مع 413 نانومتر ضوء رس إنتاج، مخضر قوي مستقر. باستخدام جولجي علامة Galactosyl ترانسفيراز بالإضافة إلى البروتين سماوي نيون (جالت-CFP) كهدف، ونحن قادرون على APP photoactivate بدقة في شبكة عابرة للجولجي. تنشيط الصور APP-paGFP ثم يمكن اتباعها لأنها بالاتجار إلى حجرات المصب تحديدها مع الموسومة fluorescently البروتينات علامة المقصورة لالاندوسوم في وقت مبكر (Rab5)، المرحوم الاندوسوم (Rab9) ويحلول (LAMP1). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مثبطات لمعالجة APP بما في ذلك الكلوروكين أو γ-secretase المانع L685، 458، ونحن قادرون على إجراء تجارب نبض مطاردة لدراسة تجهيز APP في الخلايا وحيدة.

نجد أن نسبة كبيرة من APP يتحرك بسرعة ليحلول دون الظهور على سطح الخلية، ومن ثم يتم مسح من يحلول من قبل الانشقاقات مثل secretase. توضح هذه التقنية فائدة paGFP لمتابعة الاتجار وتصنيع البروتينات داخل الخلايا جيئة وذهابام غولجي إلى حجرات المصب.

Introduction

السمة المميزة لمرض الزهايمر (AD) هي وجود لويحات خرف والتشابك الليفي العصبي (NFTS) في الدماغ. الرئيسية المكونة لويحات خرف هو بيتا اميلويد (Aβ). مشتق Aβ من السلائف. بروتين اميلويد السلائف (APP) 1. الانقسام amyloidogenic من APP يبدأ مع إزالة ectodomain من APP التي كتبها β-secretase 2. ما تبقى من 99 محطة بقايا الكربوكسيل جزء (CTF) يمكن المشقوق من قبل γ-secretase لإنتاج Aβ 3-7. بينما العديد من التجارب وقد وثقت الانقسام من سطح الخلية APP بعد استيعاب من سطح الخلية في نظام endosomal / الليزوزومية، وعدد من الدراسات الحديثة قد اقترح أن الاتجار داخل الخلايا APP مهم أيضا في تنظيم التجهيز لها 8-11.

كان هناك عدد من محاولات تحوير مستويات Aβ مع مثبطات-γ secretase وAβ إمانotherapies. ومع ذلك، أظهرت التجارب السريرية الأخيرة مع هذه العلاجات لا فائدة، وفي بعض الحالات تسبب الضرر 12. استراتيجية غير المستغلة لتعديل إنتاج Aβ هو تغيير التعريب شبه الخلوية من APP والتفاعل γ secretase. كلها قد اقترح جولجي، غشاء البلازما، والإندوسومات / الجسيمات الحالة كما غات الممكنة لγ-انشقاق من APP. البحث عن المختبر لدينا تشير إلى أن APP وγ-secretase هي البروتينات المقيمة للغشاء الليزوزومية 13. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن الليزوزومية γ-secretase لديه درجة الحموضة المثلى الحمضية 13. بالإضافة إلى ذلك، قلونة النظام endosomal / الليزوزومية مع الكلوروكين أو NH 4 الكلورين، وقد تبين أن ينخفض ​​إنتاج Aβ 14. جاما-secretase تثبيط أو بالضربة القاضية أو Presenilin يؤدي إلى تراكم APP-كتفس في يحلول 15-17. وعلاوة على ذلك، وتعطيل APP الإلتقام يخفض Aβ إنتاج 18-20.

وعلى الرغم من أهمية جولجي كمحطة الفرز للبروتينات الوليدة والبروتينات المعاد تدويرها من النظام endosomal / الليزوزومية، لم يدرس الاتجار داخل الخلايا APP بالتفصيل 21. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي APP يمكن إعادة تدويرها إلى الشبكة العابرة للجولجي (TGN) عن طريق التفاعل مع مجمع retromer. تنظيم الأسفل من مجمع retromer ينخفض ​​إنتاج Aβ 8،22-24. ومع ذلك، فإن الخروج من APP من جولجي لم يتم دراستها جيدا.

بينما بعد الإلتقام من البروتينات على سطح الخلية، مثل مستقبلات ترانسفيرين، وصفت بسهولة وتلت ذلك، في أعقاب الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر تحديا. في الواقع، فإن القليل من البروتينات الاتجار بهم داخل الخلايا تصوير. وقد وفرت ظهور علامات بروتين فلوري، مثل الصورة activatable-GFP (paGFP)، وأدوات جديدة لدراسة الاتجار داخل الخلايا. الصور activatable-GFP هو شكل من أشكال GFP التي هي غير مرئية تقريبا بعد التوليف، ولكن تطور قوي الأخضر (GFP) مضان بعد أن تفعيلها من خلال 413 نانومتر ضوء الليزر وهذه إشارة غير مستقرة لعدة أيام 25،26. وقد استخدمت بنيات باستخدام paGFP للتدليل على الاتجار intralysosomal من البروتين الليزوزومية بروتين الغشاء 1 (LAMP1) 25، وتسليم سطح الخلية من إلتهاب الفم التقرحي الفيروسات البروتين السكري (VSVG، علامة على مسار إفرازية) 27، ودوران peroxisomes 28 وautophagosomes 29.

من أجل تصور فرز APP من TGN في الخلايا الحية، قمنا بتصميم البلازميد معربا عن مشاركة 112 الأحماض الأمينية من APP بالإضافة إلى الصور activatable (paGFP) على C-محطة (المشار إليها باسم βAPP-paGFP) 30. لقد قمنا أيضا هذه التجارب مع كامل طول APP وحققت نتائج مماثلة؛ يتم استخدام بناء ΒAPP هنا لأنها توفر صورا أكثر إشراقا. نحن بعد ذلك الصور وتفعيل# 946؛ APP-paGFP فقط في TGN، كما رسمتها TGN علامة Galactosyltransferase (جالت). على الرغم من APP تم الموسومة ب paGFP لتصور النقل محواري السريع لAPP والتخليص من منطقة محيط بالنواة، وهذا هو اول دليل على الاتجار APP من احد المقصورة محددة بعناية ل11،31،32 آخر. هنا، علينا أن نظهر دقة الصورة التنشيط داخل TGN والخروج من APP إلى أقسام المصب والانقسام اللاحق والتخليص من الجسيمات الحالة 30. في دقيقة الصور التنشيط داخل جولجي ينطبق على نطاق واسع لأنظمة البروتين الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية الطلاء وترنسفكأيشن

  1. في غطاء ثقافة الخلية، لوحة ~ 300،000 إلى ~ 500،000 SN56 الخلايا (هدية عينية من الدكتور جين Rylett) على الزجاج السفلي 35 مم طبق متحد البؤر، وتغطي مع وسائل الإعلام قبل ترنسفكأيشن (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، DMEM، على أن تستكمل مع 10٪ FBS).
  2. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة لتتكاثر.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا ما يقرب من 50٪ -70٪ متموجة قبل ترنسفكأيشن.
  3. في غطاء ثقافة الخلية، وخلايا transfect مع البلازميدات معربا عن بروتين فلوري الموسومة TGN علامة (Galactosyl ترانسفيراز بالإضافة إلى سماوي نيون البروتين، جالت-CFP)، الموسومة بروتين فلوري مقصورة علامة (هنا، يحلول يرتبط البروتين غشاء 1، LAMP1، الموسومة ب mRFP)، والبروتين من الفائدة الموسومة ب paGFP (βAPP-paGFP). (سبق وصف هذه بنيات 30)
  4. احتضان الخلايا مع كاشف ترنسفكأيشن وDNA البلازميد وأو 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. استخدام نسبة ~ 2 ميكروغرام من الحمض النووي ل5 ميكرولتر من وكيل ترنسفكأيشن (على سبيل المثال Lipofectamine 2000) لأفضل السمية الخلوية التوازن والكفاءة ترنسفكأيشن. قد تحتاج تركيزات الفعلية ليكون الأمثل لالبلازميدات مختلفة. في التجارب الموصوفة هنا، استخدم 1 ميكروغرام / طبق متحد البؤر من βAPP-paGFP، 0.3 ميكروغرام / طبق متحد البؤر من LAMP1-mRFP، و 0.2 ميكروغرام / طبق متحد البؤر من جالت-CFP.
    ملاحظة: إن كمية البلازميد المستخدمة تعتمد على كفاءة ترنسفكأيشن.
  5. لخطوط الخلايا العصبية: بعد الخطوة 1.4، في غطاء ثقافة الخلية، وإزالة وسائل الاعلام قبل ترنسفكأيشن وتفرق خلايا SN56 في 2 مل DMEM تستكمل مع 0.1٪ البنسلين / الستربتومايسين مع 1 ملي dibutyryl AMP الحلقي (dbcAMP) لمدة 24 ساعة.

2. مجهر مرحلة الإعداد

  1. قبل الدافئة المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) ومحلول الملح المتوازن هانك (HBSS) إلى 37 درجة مئوية. الاحماء مرحلة المجهر قبل imagiنانوغرام إلى 37 درجة مئوية.
  2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، لإزالة وسائل الإعلام التمايز ويحل مع 2 مل من HBSS في 37 ° C. خلايا المكان على خشبة المسرح المجهر تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلايا قابلة للتطبيق لحوالي 1،5-2 ساعة في HBSS.
  3. السماح 5-10 دقيقة لدرجة الحرارة لوحة مبائر لكي تتوازن مع المرحلة المجهر.

3. صور-تفعيل رويس خلال جولجي

  1. مع العدسة المجهر، والعثور على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع جالت-CFP، LAMP1-mRFP، وβAPP-paGFP.
    1. استخدام عدسة النفط الغمر مع تضخم عالية (أي 63X أو 100X). لالتشكل البصري مضان، استخدام عامل تصفية مجموعة قادرة على تصور FITC (لCFP وGFP مضان) ورودامين (لmRFP مضان).
  2. تعيين شريحة مبائر لكل قناة إلى 1 ميكرون. اتخاذ المنخفض دقة وضوح الصورة.
  3. المحاصيل لصورة فقط من الخلايا في المصالح.
  4. باستخدام مقبض تعديل، تعيين يدوياطائرة الوصل إلى وسط الخلية. هذا هو عادة جزء من الخلية حيث النواة هي الأكبر.
  5. رسم 3-5 المناطق دائرية من اهتمامات (رويس) داخل TGN (جالت-CFP مضان).
    1. رسم رويس (أي في برنامج زايس LSM)، حدد زر "تحرير ROI" في وحدة القيادة.
    2. حدد زر ROI دائري.
    3. انقر واسحب على جالت-CFP المناطق إيجابية للخلية.
      ملاحظة: حزم الصور وتبييض للعديد من المجاهر لديها هذه القدرة.
  6. التقاط صورة للخلية مع رويس مضافين. حفظ نسخة من رويس كمرجع لاحق.
    1. لحفظ رويس إلى صورة، حدد زر "ماكرو".
    2. اضغط على زر 'تحميل' لبدء "CopyRoisToOverlay '(مسار الملف: ج: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
      ملاحظة: A المجهر متحد البؤر مجهزة 475-525 نانومتر (CFP) الفرقة تمرير (BP)، و500-530 نانومتر BP (GFP)،وهناك حاجة إلى 560 نانومتر تمريرة طويلة (LP) مجموعات التصفية. مطلوب أيضا ليزر الأرجون ل458 نانومتر و 488 نانومتر، وانبعاث الليزر الحنة لانبعاث 540 نانومتر.
  7. انشاء المجهر لدورة الوقت التبييض.
    1. تعيين يزر ديود (25 ميغاواط 405 نانومتر ليزر) لأقصى قدر من السلطة.
      تحذير: الإفراط في الصورة التنشيط يمكن أن يؤدي إلى الصور سمية أو أضرار في الأغشية الخلوية. استخدام حماية العين لتجنب الضرر في شبكية العين.
    2. انشاء المجهر لمدة 120 دورات التصوير.
      ملاحظة: تتكون دورة التصوير واحد من التبييض داخل رويس والتصوير من الخلية بأكملها. هذه هي دورة الوقت التبييض.
    3. تعيين المجهر لتبييض (الصورة تنشيط) فقط رويس لمدة 20-30 التكرار بعد كل صورة. الوقت للصورة والتبييض سوف تتفاوت صورة. تعيين تأخير الوقت بين الصور لذلك كل دورة حوالي 30 ثانية.
      ملاحظة: جزء من كل دورة التصوير يستغرق حوالي 15-30 ثانية اعتمادا على حجم الصورة. تبيض لكل ROI حوالي 50 مللي ثانية. سوف تبيض جميع رويس 4 لمدة 20 التكرار يأخذ 4 ثانية في نهاية كل دورة التبييض / صورة.
  8. بدء دوام التبييض.
  9. إيقاف تبيض بعد 15 دقيقة (30 دورات التصوير وتبيض)، ولكن متابعة التقاط الصور للخلية.
    ملاحظة: الوقت 0-15 دقيقة هو 'نبض' الفترة.
  10. متابعة التقاط الصور لمدة 45 دقيقة (بدون تبيض)، لمتابعة إزالة βAPP-paGFP.
    ملاحظة: الوقت 15-45 دقيقة هي الفترة "مطاردة".
  11. باستخدام أسلوب التحليل هو موضح في الخطوة 6، وشارك في توطين البروتين من الفائدة (هنا، βAPP-paGFP) مع مقصورة الفائدة (هنا، LAMP1-mRFP) بجعل أسطح لكل قناة.

4. تحديد حجرة المصب

  1. لتحديد ما إذا الجسيمات الحالة (في هذه التجارب) هي مقصورة النهائية، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني، نفاذية الغشاء لتسبب بروتينات لتتراكم في يحلول.
    1. لβAPP، استخدم 0.5 ميكرومتر L685، 458 (محدد γ-secretase المانع) بين عشية وضحاها أو 100 ميكرومتر الكلوروكين (deacidifies الجسيمات الحالة) لمدة 30 دقيقة قبل التصوير.
  2. البحث عن الخلايا وphotoactivate كما في الخطوة 3،1-3،8.
  3. صورة الخلية لعدد إضافي من 45 مين (بدون صورة التنشيط) لتحديد حيث يتراكم βAPP-paGFP في غياب الانقسام.
  4. تحليل إيصال البروتين إلى الجسيمات الحالة (أو غيرها من مقصورة المصب) وإزالة لاحقة وفقا للطريقة هو موضح في الخطوة 6.

5. ضمان دقة صور التنشيط داخل جولجي

  1. الاحماء HBSS إلى 37 درجة مئوية.
  2. إعداد محلول 2 مل، لكل لوحة مبائر للتصوير، من 66 ميكرومتر نوكودازول (العلاج) أو DMSO (مراقبة) في HBSS.
    1. لوحة واحدة مبائر، ماصة 2 مل من 37 درجة مئوية HBSS وإضافة 7.96 ميكرولتر من نوكودازول من 16.60 ملي الأسهم نوكودازول.
    2. كعنصر تحكم ذلكlution، ماصة 2 مل من 37 درجة مئوية HBSS في أنبوب 2 مل وإضافة 7.96 ميكرولتر من DMSO.
  3. احتضان الخلايا في HBSS مع نوكودازول أو DMSO لمدة 5 دقائق قبل التصوير.
  4. البحث عن الخلايا كما في الخطوة 3.1.
  5. قبل تنشيط ضوئي، وإعداد المجهر لاتخاذ Z كومة بعد فترة الصور التنشيط.
    1. انقر على زر "Z المكدس". بدء المسح الضوئي باستخدام XY سريع.
    2. ضبط البؤري مع مقبض تعديل المجهر إلى أعلى الخلية. 'مارك الأول "اضغط لتعيين المركز الأول في المكدس.
    3. ضبط البؤري مع مقبض تعديل المجهر لأسفل (الأقرب إلى الزجاج) للخلية. اضغط على "مارك آخر" لتحديد المركز الأخير في المكدس.
    4. في لوحة كومة Z، اضغط على "Z باجتزاء 'زر. تعيين "الفاصل الزمني" إلى 1 ميكرون.
      ملاحظة: للحصول على أعلى المكاني القرار كومة كومة فاصل زمني أصغر، ولكن سوف تحتاج إلى مزيد من الصورتؤخذ إطالة فترة التصوير لالمكدس.
  6. تبييض الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3،7-3،8. صور تنشيط وصورة من 0 دقيقة إلى 15 دقيقة (30 إطارات).
  7. توقف التصوير بعد 30 الإطارات. حفظ فورا صورة من شريط الفيديو.
    تحذير: بعض المجاهر قد الكتابة الفيديو الأول إذا لم يتم حفظها قبل البدء في تسلسل التصوير الثاني.
  8. بعد حفظ الفيديو، والحصول على الفور Z كومة، وذلك باستخدام المعلمات من الخطوة 5.5.
  9. شارك في توطين βAPP-paGFP مع جالت-CFP (أو غيرها من علامة جولجي)، كما هو موضح في الخطوة 6.
    ملاحظة: CFP photobleaches بسرعة وقد لا تكون واضحة قبل نهاية فترة التصوير. قد لا تكون Colocalization ممكن مع جالت-CFP. إذا كنت بحاجة colocalization، استخدم mRFP لعلامة جالت.

6. الحويصلة تصفية وColocalization

  1. استخدام برنامج تحليل (على سبيل المثال Imaris) لجعل أسطح المقصورة (على سبيل المثال LAMP1-mRFP) وبروتين سالفائدة و (على سبيل المثال βAPP-paGFP).
  2. أدخل قسم "تفوق" من برنامج تحليل بالضغط على زر تفوق على شريط القائمة العلوية.
  3. حدد زر المعالج السطح في الجزء العلوي من معظم اللوحة اليسرى (5 زر عشر من اليسار).
  4. اختيار قناة لتصفية حويصلات (أي βAPP-paGFP مضان، والبروتين من الفائدة).
  5. أداء الطرح الخلفية عن طريق تقديم قطر من أكبر حويصلة في الميدان لالمعالج واضغط التالي. برنامج تحليل تختار تلقائيا - بناء على عتبة المستمدة من أكبر حويصلة في الميدان - منطقة في القناة المثيرة للاهتمام.
    1. ضبط يدويا الخلفية عتبة لصقل التحديد إذا لزم الأمر.
  6. في الجزء السفلي من الشاشة اختيار عتبة، والتحقق من خيار "كائنات لمس تقسيم" للفصل بين السطوح مجتمعة.
    ملاحظة: إذا تم تجميع العديد من الحويصلات ارتباطا وثيقانوى، إرادة مجموعة برامج تحليل هذه الكائنات تحت سطح واحد.
    1. اختيار 10-15 الحويصلات التمثيلية وحساب متوسط ​​قطر الحويصلة وأدخل إلى المعالج.
  7. حدد النقاط البذور المختارة عن طريق زيادة أو خفض عتبة على 'الجودة' (شدة القناة في منتصف كل بقعة).
    سيتم إنشاء السطوح للقناة من الفائدة: ملاحظة. مزيد من صقل الأسطح المحدد يمكن أن يؤديها في هذه المرحلة. الحويصلات عتبة استنادا إلى عدد من وحدات البكسل في كل حويصلة.
  8. قناع القناة الأصلية مع هذا السطح. لإخفاء، حدد علامة التبويب 4TH من الناحية اليسرى في معالج إنشاء السطحية (قلم رصاص).
  9. اختر 'قناع جميع ". وسيتم إنشاء قناة جديدة مع الحويصلات من الفائدة.
    ملاحظة: أثناء عملية قناع، وتقدم خيارا لتكرار قناة الأصلي. حدد هذا الخيار إذا كان يحتاج البيانات الأصلية ليتم حفظها.
  10. كرر الصورةteps 6.1 خلال 6.7 للقناة التي لم تتم تصفيتها (أي LAMP1 mRFP، المقصورة).
  11. في شريط الأدوات العلوي، حدد أداة colocalization.
    1. في اللوحة العلوية، كما تظهر رسوم بيانية للقنوات أن colocalized، اختيار القنوات المقنعة التي أنشئت مؤخرا.
    2. تحديد كافة البيانات المتاحة. هناك بكسل السوداء التي عادة ما تكون موجودة بعد التحليل. لم تقم بتحديد هذه بكسل في الرسم البياني، وأنها سوف تؤثر على النتائج.
    3. في لوحة اليمين المتطرف، اختر 'بناء قناة Coloc. وهذا يخلق قناة جديدة تحتوي فقط بكسل colocalized. سوف تكون البيانات في نفس لوحة تحت زر "الاحصائيات القناة. البيانات يمكن تصديرها كملف CSV..
    4. استخدام الإحصائية "النسبة المئوية للمواد colocalized. يأخذ هذا الخيار في الاعتبار كثافة بكسل وحجم الكائن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتشير النتائج النموذجية βAPP ترك TGN ويبدو أن حركة المرور بسرعة لLAMP1 (الشكل 1a و ب). خلال الفترة الصور التنشيط، يمكن أن ينظر إلى الحويصلات مغادرة جولجي الموجهة للالجسيمات الحالة (الشكل 1B). بدون العلاج المانع، وpaGFP مضان تكون مرئية في الجسيمات الحالة في حين أن هناك صورة التنشيط في TGN. بعد وقف تنشيط ضوئي، أخلى βAPP-paGFP بسرعة من يحلول (قارن الشكل 1a إلى 1B). العلاج مع نوكودازول يؤدي إلى تراكم APP داخل جالت-CFP المسمى المقصورات ويمنع الاتجار في الجسيمات الحالة (الشكل 1C).

طفرة السويدية APP (APPsw) يزيد من معدل β-انشقاق بنسبة 10 أضعاف (34). مع الانقسام السريع للβAPPsw-paGFP، يظهر مضان paGFP كإشارة مضان منتشر في العصارة الخلوية. يفترض هذا أناالصورة نتيجة لانشقاق βAPP السريع من قبل γ-secretase تحرير paGFP-C محطة في لالسيتوبلازم (الشكل 2). بحضور γ-secretase المانع، βAPP يتراكم داخل الجسيمات الحالة.

بعد تسليم βAPP إلى يحلول، يتم مسح مضان paGFP بسرعة. الوقت الإقامة قصيرة يمكن أن يكون نتيجة عمليات تهريب من يحلول إلى حجرة أخرى. وفي المقابل، من المتوقع أن يؤدي إلى انتشار paGFP مضان من غشاء الليزوزومية (الشكل 3A) انشقاق من βAPP التي كتبها جاما-secretase. مضان منتشر أكثر صعوبة للكشف بواسطة المجهر متحد البؤر. لتحديد ما إذا كان يتم تسليم βAPP إلى حجرة أخرى أو تطهيرها، تم علاج الخلايا SN56 مع مثبط محدد ضد γ-secretase (L685، 458) أو وكيل alkalinizing (الكلوروكوين). أدت إضافة إما L685، 458 أو الكلوروكين في تراكم APP في يحلول ( رونغ> 3B الشكل وج).

ومن المقبول عموما أن يتم تسليم APP إلى سطح الخلية قبل endocytosed ومعالجتها في الإندوسومات والجسيمات الحالة 35. ومع ذلك، في الخلايا غير المعالجة لدينا، لا يمكن أن يتم الكشف عن سطح الخلية βAPP بواسطة المجهر متحد البؤر. قد لا تكون مركزة βAPP تنشيط الصورة في منطقة محددة من غشاء البلازما. بدلا من ذلك، قد يكون هناك مضان منتشر عبر مساحة كبيرة من غشاء البلازما. ومن المثير للاهتمام، γ-secretase العلاج المانع يؤدي إلى اكتشافها βAPP-paGFP على سطح الخلية (الشكل 3B). γ-secretase يجوز العلاج المانع الطريق أكثر βAPP إلى سطح الخلية، بالإضافة إلى تثبيط وظيفة الانزيم. ولذلك، فإن مساحة كبيرة من غشاء البلازما ينتشر paGFP على مساحة أكبر، ويجعل من الصعب الكشف، على الرغم من أن الاتجار بهم البروتين إلى المقصورة.

1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53153 / 53153fig1.jpg "/>
و transfected الشكل 1. التصوير الاتجار APP إلى الجسيمات الحالة. SN56 الخلايا مع LAMP1-mRFP، جالت-CFP، وβAPP-paGFP. أ) إن الخلية بدقة تفعيلها الصورة داخل رويس وضعت على جولجي (رويس الرمز بواسطة دوائر بيضاء ). وكانت الخلية بدلا من وتصوير لمدة 15 دقيقة لتحديد الاتجار βAPP-paGFP تنشيط صور. يظهر أقحم الاتجار داخل منطقة محيط بالنواة من جولجي إلى الجسيمات الحالة. مترجمة شارك بكسل تظهر الصفراء. ب) الاتجار حويصلة تحتوي على βAPP-paGFP إلى يحلول. بكسل الصفراء دلالة LAMP1 وβAPP-paGFP colocalization. ج) يعاملون SN56 الخلايا مع نوكودازول قبل التصوير لمنع βAPP-paGFP الخروج من TGN. صورة الممثلة المأخوذة من نهاية الفترة الصور التنشيط. في اللوحة اليمنى، وهو Z-كومة من نفس الخلية اتخذت على الفور بعد الصور التنشيط. عشر وقد جالت ه-CFP أحمر اللون كاذبة لتحسين التصور من colocalized جالت-CFP وβAPP-paGFP. بكسل الصفراء دلالة colocalization بين جالت-CFP وβAPP-paGFP. الحانات النطاق تمثل 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
و transfected الشكل 2. الاتجار βAPPsw-paGFP. الخلايا SN56 مع LAMP1-mRFP، جالت-الحراجية وβAPPsw-paGFP (βAPP مع الطفرة السويدية العائلية). طفرة السويدية يزيد من المعدل الذي هو المشقوق APP. وكانت الخلايا بدلا من داخل وتصويرها جولجي تفعيلها الصور. ويمكن الاطلاع على مضان منتشر بعد فصل paGFP من غشاء الليزوزومية لنزع فتيل إلى السيتوبلازم. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون./ 53153fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "53> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تحديد عضية النهائية. و transfected SN56 الخلايا مع LAMP1-mRFP، جالت-CFP وβAPP-paGFP. بعد الصور التنشيط، تمت متابعة الخلايا لمدة 45 دقيقة إضافية. تظهر اليسار معظم الفريقين الخلايا قبل تنشيط ضوئي (إلى أقصى اليمين) و 15 دقيقة بعد تنشيط ضوئي (وسط). لوحة يظهر على اليمين المتطرف APP مضان بعد 45 دقيقة من التصوير الكلي في) غير المعالجة، ب) المانع γ-secretase معاملة، أو ج) الكلوروكين علاجها. وتشير النصال على APP مع LAMP1 بعد 45 دقيقة من التصوير المترجمة المشترك. الحانات النطاق تمثل 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من الهو الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه التقنية على دقة الصور تفعيل بروتينات غشاء الموسومة ب paGFP في TGN لتصور الاتجار والانقسام لاحق. في حين تم إنشاء paGFP أكثر من عشر سنوات 25، وهذا هو المثال الأول من دقيق الصور تفعيل لمتابعة الاتجار البروتينات الوليدة إلى حجرات المصب. الدراسات السابقة باستخدام APP-paGFP يبني منطقة شبه النووي للخلية، والذي كان يعتبر في جولجي 11-تنشيط صور. ومع ذلك، كما يتضح في الميكروسكوب لدينا، الجسيمات الحالة، الإندوسومات في وقت مبكر، والإندوسومات أواخر يمكن أيضا أن تكون موجودة في هذه المنطقة (الشكل 1 و إشارة 30). وقد تم تشغيل هذه التجارب بنجاح في الخلايا HEK293، خلايا COS7، والخلايا العصبية SN56، والخلايا SH-SY5Y، والخلايا العصبية الماوس، على الرغم من أن كفاءة ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الماوس منخفضة. وقد أجريت تجارب مماثلة باستخدام كامل بنيات طول APP ويبني تقصير، والتي تشمل 112 الأمينية الماضيالأحماض من APP، مع مواقع β- وγ-الانقسام، تنصهر paGFP. يبني تقصير هي أسهل ل transfect وتوفير إشارة الفلورسنت أعلى، وتظهر هذه في الأرقام المرفقة. كما تفتقر يبني لدينا تقصير-N محطة ectodomain، التي لديها انشقاقات غير محددة وإشارات فرز 38. وعلى الرغم من هذه الإشارات-N محطة والانشقاقات، نجد أن لدينا بناء تقصير ديه توطين مماثل والاتجار بها على كامل طول APP-paGFP 30، 33.

بسبب العديد من العضيات في منطقة شبه النووي للخلية، وبذل كل جهد ممكن لضمان دقة من الصور التنشيط. خلال فترة التصوير، فإن الخلية وجولجي تتحرك. ولذلك، فإن رويس الصور التنشيط يجب أن تتم مراقبتها بعناية خلال الفترة الصور تفعيل وتعدل في البقاء على رأس جولجي. المجاهر مبائر حساسة للتغيرات الصغيرة في درجات الحرارة. على سبيل المثال، AC أو التدفئة الفتحات على microscoالمؤسسة العامة يمكن أن يؤدي إلى تغيير الطائرة التصوير.

من أجل الحفاظ على الاتساق بين التجارب، وضعنا فترة زمنية بين كل دورة / التصوير الضوئي التنشيط. ويتطلب وقتا لتبييض رويس وصورة الخلية. اعتمادا على حجم الخلية وعدد رويس، والوقت لتبييض وتأخذ صورة واحدة سوف تختلف. من أجل الحفاظ على الاتساق من صورة إلى صورة، تعيين تأخير الوقت بين الصور لذلك كل صورة، بما في ذلك التبييض، ويتطلب حوالي 30 ثانية. ويمكن تحقيق زيادة القرار الزماني باستخدام أنظمة الكشف عن أن توظيف المشكل شعاع (على سبيل المثال LSM5 كاشف لايف). يمكن لهذه المجاهر صورة في 120 لقطة / ثانية مع أي خسارة في القرار.

لتأكيد دقة الصور التنشيط، لا بد من إجراء الرقابة نوكودازول. من خلال منع النقل من جولجي خلال الصور التنشيط، وهذا يضمن أن paGFP لا يتم تفعيلها بشكل كبير في المقصورات الأخرى.CFP الصور التبييض بسرعة مع تكرار التصوير والتبييض ويمكن أن تجعل colocalization مع جالت-CFP الصعبة. إذا كان الجزء الأكبر من paGFP مضان يبقى في منطقة جولجي، وهذا يمكن أيضا الإشارة إلى دقة الصور التنشيط. بدلا من ذلك، جالت يمكن الموسومة ب mRFP، وهي الصورة أكثر استقرارا من CFP في هذه التجارب.

يمكن أيضا أن يتحقق تحسين التنشيط داخل جولجي مع المجهر متعدد الفوتون. في حين أن الطائرة التصوير مبائر في هذه التجارب هي عادة شريحة 1 ميكرومتر، ليزر للتصوير والصور تفعيل سيمر من خلال الخلية بأكملها. ويمكن استخدام ليزر متعدد الفوتون لهذه التجارب، ويمكن تحسين الدقة في جميع الأبعاد الثلاثة 35. ومع ذلك، كما هو موضح هنا، التقليدي ليزر ديود 405 نانومتر كافية لبدقة الصور تفعيل βAPP-paGFP داخل TGN.

كما تحكم، وقد أجرينا تجارب مماثلة لVSVG-paGFP مضان. VSVG-paGFP، وهوسلمت جوهري على سطح الخلية 27،37، وتصور يجري تسليمها إلى مناطق فرعية محددة من غشاء البلازما 30. هذا يؤكد أن النقل إلى حجرات داخل الخلايا ليست ناجمة عن الإفراط في التعبير أو وجود علامة paGFP.

قد يكون منتشر paGFP مضان الصعب حصر بواسطة المجهر متحد البؤر. في تجربتنا، هو المشقوق APP بسرعة ويبدو أن العمر قصير كما بروتين كامل طول في غشاء الليزوزومية. وتتفاقم هذه المشكلة عن طريق الطفرة FAD السويدية أن يسرع معدل APP انشقاق 34. لاستخدام هذه التقنية للبروتينات المشقوق بسرعة، كان المانع هو الحاسم لتحديد مقصورة المصب النهائي. تثبيط γ-secretase التي كتبها L685، 458 أو الرصاص الكلوروكين إلى تراكم كبير من APP في الجسيمات الحالة. حتى مع وجود طفرة السويدية.

إذا تم استخدام الكثير من المانع، وهذا يمكن أن يؤدي إلى تيار متردد بين الخلايا تراكم βAPP-paGFP، وربما يؤدي إلى شوائب البروتين. تراكمت paGFP في نتائج الادراج في الادراج paGFP الفلورية في الخلية قبل بدء التجربة (الملاحظات غير منشورة لدينا، أي علاج بين عشية وضحاها مع 40 ميكرومتر الكلوروكين). وينبغي استخدام تركيز مثبط أن يمنع انشقاق من البروتين من الفائدة، ولكن لا يؤدي إلى تشكيل إدراج. يمكن أيضا أن يسبب الإفراط في ترنسفكأيشن من الخلايا مع paGFP شوائب واضحة من paGFP، والتي سوف يتألق دون الصور التنشيط. حديثا تنشيط الصورة paGFP وحركة المرور بشكل تفضيلي لهذه الادراج وتتداخل مع تفسير النتائج. عندما تبحث عن الخلايا إلى صورة، وتجنب الخلايا مع الادراج paGFP واضحة. في تجربتنا مع βAPP-paGFP، هناك مخضر باهت جدا في الخلايا التي تعبر عن βAPP-paGFP على المستوى المناسب. هذا مضان خافت عادة لا يمكن تصويرها ويمكن فقط أن ينظر من خلال العدسة.

= "jove_content"> المحددات الأخرى لهذه التقنية هو أن البروتين الاتجار بهم لهيكل غشاء كبير (أي غشاء البلازما) قد يكون من الصعب الكشف عنها. قد يكون هذا بسبب إشارة الفلورسنت، التي تنتشر على مساحة واسعة، والمخفف أو لأن الغشاء الشخصي في المقطع العرضي هو دون قرار من المجهر متحد البؤر. قد يكون من الممكن للتحايل على هذه المشكلة عن طريق التصوير باستخدام مجهر epifluorescence. ومع ذلك، فإن هذا من شأنه أن يقلل القرار المكاني للتقنية.

ميزة هذا الأسلوب هو انطباقها على بروتينات غشاء الأخرى. في حين أن هذا الأسلوب يعتمد على مدى تعبير عن العديد من البروتينات، يبدو أن الاتجار البروتين لا تتعطل بشكل علني، كما ثبت مع VSVG-paGFP وβAPP-paGFP 30. بالإضافة إلى يحلول، قد استخدمت أيضا علامات أخرى من endosomal / نظام الليزوزومية بنجاح. وتشمل هذه rab5-mRFP لنهاية مبكرةosome وrab9-mchFP (الكرز البروتين الفلوري) لالاندوسوم في وقت متأخر. ويمكن تمديد هذه التقنية المجهر قوية لمتابعة الاتجار البروتينات الأخرى من TGN. يمكن كذلك تطبيقها لمتابعة الاتجار بين مقصورات منفصلة المقدمة هي علامات مقصورة محددة جيدا المتاحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم مصالح أو تضارب المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, (12), 4245-4249 (1985).
  2. Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286, (5440), 735-741 (1999).
  3. De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391, (6665), 387-390 (1998).
  4. Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (16), 9299-9304 (2000).
  5. Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (11), 6138-6143 (2000).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280, (41), 35069-35076 (2005).
  7. Pawar, A. P., et al. Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350, (2), 379-392 (2005).
  8. Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195, (5), 765-779 (2011).
  9. Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39, (2), 168-177 (2007).
  10. Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (38), 13461-13466 (2005).
  11. Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282, (45), 32956-32964 (2007).
  12. Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10, (1), 18 (2013).
  13. Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278, (29), 26687-26694 (2003).
  14. Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716, (1-2), 91-100 (1996).
  15. Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255, (5045), 728-730 (1992).
  16. Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14, (3), 651-659 (1995).
  17. Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275, (47), 36794-36802 (2000).
  18. Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274, (27), 18851-18856 (1999).
  19. Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58, (1), 42-51 (2008).
  20. Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
  21. Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9, (4), 527-533 (1997).
  22. Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5, (1), 40 (2010).
  23. Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43, (2), 338-3345 (2011).
  24. Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32, (4), 1467-1480 (2012).
  25. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297, (5588), 1873-1877 (2002).
  26. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32, (4), 445-450 (2004).
  27. Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143, (6), 1485-1503 (1998).
  28. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173, (4), 521-532 (2006).
  29. Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141, (4), 656-667 (2010).
  30. Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7, (1), 54 (2014).
  31. Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70, (3), 441-454 (2011).
  32. Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41, (2), 166-174 (2009).
  33. Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3, (1), 11 (2010).
  34. Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271, (16), 9390-9397 (1996).
  35. Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283, (44), 29615-29619 (2008).
  36. Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89, (2), 1346-1352 (2005).
  37. Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11, (1), 13-22 (2000).
  38. Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats