광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University
Published 10/17/2015
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Biology

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Summary

세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다.

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Tam, J. H., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

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Abstract

베타 아밀로이드 (Aβ)는 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 발견 노인반의 주요 구성 성분이다. Aβ는 β 및 γ - 세 크레타에 의해 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적 분열에서 파생됩니다. AD 병리에 Aβ의 중요성에도 불구하고, 이러한 분열의 세포 내 현지화가 잘 확립되어 있지 않습니다. 우리 실험실에서 직장 및 다른 세포 표면에서 내재화 후 APP 처리에 엔도 솜 / 리소좀 시스템 연루. 그러나, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 상대적으로 파악 하였다입니다.

세포 표면 단백질은 많은 라벨링 기술에 수정할 수있는 반면, 골지체에서 막 단백질의 거래를위한 다음의 간단한 방법은 없다. 이를 위해, 우리는 C- 말단에서 사진 기동 GFP (paGFP)로 태그 한 응용 프로그램 구조를 만들었습니다. 합성 후 paGFP 낮은 기저 형광을​​ 가지고 있지만 413 nm의 빛을 t로 자극 될 수있다O 강한, 안정적인 녹색 형광을 생산하고 있습니다. 사용하여 골지 마커 락토 트랜스퍼 대상 시안 형광 단백질 (GALT-CFP)에 결합 된, 우리는 트랜스 골지 네트워크 APP photoactivate 정확하게 할 수있다. 이 형광 식별 하류 구획 (트래픽) 초기 엔도 좀 (Rab5), 후반 엔도 좀 (Rab9)와 리소좀 (램프 1)에 대한 구획 마커 단백질 태그로 사진 활성화 APP-paGFP은 다음에 할 수 있습니다. 또한, 클로로퀸 또는 γ 세 크레타 제 억제제 인 L685, 458을 포함 APP 처리에 억제제를 사용하여, 우리는 단일 세포에서 APP의 프로세싱을 조사 펄스 추적 실험을 수행 할 수있다.

우리는 APP의 많은 부분이 세포 표면에 나타나는없이 리소좀에 빠른 속도로 이동 한 다음 세 크레타 같은 분열에 의해 리소좀에서 삭제되는 것을 찾을 수 있습니다. 이 기술은 이리저리 세포 내 단백질의 인신 매매 및 처리를 다음과 같은 사항에 대해 paGFP의 유틸리티를 보여줍니다하류 구획 골지을 해요.

Introduction

알츠하이머 병 (AD)의 특징은 노인성 플라크와 뇌의 신경 섬유 엉킴 (NFTS)의 존재이다. 노인성 플라크의 주성분은 β - 아밀로이드 (Aβ)입니다. Aβ는 그 전구체에서 파생 된; 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 1. 응용 프로그램의 아밀로이드 분열은 β-크레타 제 2에 의해 APP에서 ectodomain의 제거를 시작합니다. 남은 잔류 물을 99 카복실 말단 단편 (CTF)는 Aβ 3-7을 생산하는 γ 세 크레타 제에 의해 절단 될 수있다. 많은 실험 엔도 솜 / 리소좀 시스템으로 세포 표면에서 내재화 후 세포 표면 APP의 분열을 설명하고 있지만, 최근 다수의 연구는 APP의 세포 트래 피킹 또한 그 처리 8-11을 조절하는데 중요하다는 것을 제안 하였다.

γ 크레타 제 저해제 및 아밀로이드 베타 immun으로 Aβ의 수준을 조절에서 시도의 숫자가 있었다otherapies. 그러나, 이들 치료법에 대한 최근의 임상 시험은 경우에 피해를 야기 12, 더 유익 없었다하고. 아밀로이드 베타의 생산을 조절하는 개발되지 않은 전략은 APP의 하위 세포 현지화 및 γ-크레타 제의 상호 작용을 변경하는 것입니다. 골지, 세포막, 그리고 엔도 좀 / 리소좀은 모든 APP의 γ-절단 가능한 로케일로 제안되었다. 우리의 실험실에서 연구 APP 및 γ-크레타 제는 리소좀 막 (13)의 거주자 단백질이 있음을 시사한다. 또한, 우리는 리소좀 γ 크레타 제는 산성 최적의 pH (13)를 가지고 있음을 발견했다. 또한, 클로로퀸 또는 NH 4 CL와 엔도 솜 / 리소좀 시스템의 알칼리화, Aβ (14)의 생성을 감소하는 것으로 나타났다. -γ 크레타 제 억제 또는 녹아웃 또는 프레는 리소좀 15-17에서 APP-CTFs 축적으로 이어집니다. 또한, 응용 프로그램 엔도 시토 시스를 방해하는 Aβ 생산 18 ~ 20을 낮 춥니 다.

초기 단백질과 엔도 솜 / 리소좀 시스템에서 재활용 단백질 정렬 역으로 골지의 중요성에도 불구하고, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 세부 (21)에 연구되지 않았다. 최근 작품은 앱이 retromer 단지와의 상호 작용을 통해 트랜스 골지 네트워크 (TGN)로 재순환 될 수 있음을 보여 주었다. retromer 단지의 다운 규제는 Aβ 생산 8,22-24을 감소시킨다. 그러나, 골지에서 응용 프로그램의 출구는 잘 연구되지 ​​않았다.

이러한 트랜스페린 수용체로 세포 표면 단백질의 세포 내 이입을 다음 있지만, 쉽게 표시 및 준수, 세포 내 단백질의 인신 매매를 따라하는 것은 더 어렵습니다. 사실, 몇 가지 단백질은 세포 내 인신 매매는 몇 군데 있었다. 이러한 사진 기동-GFP (paGFP), 형광 단백질 태그의 출현은 세포 내 인신 매매를 조사하기위한 새로운 도구를 제공하고 있습니다. 사진 - 기동-GFP는 GF의 한 형태이다합성 후 거의 보이지이지만, 413 nm의 레이저 광에 의해 활성화 된 후에 강한 녹색 (GFP)의 형광을 개발하고이 신호 (25, 26) 일 동안 안정하다 P. paGFP를 사용 제물 리소좀 단백질 intralysosomal 매매를 입증하는 데 사용 된 막 단백질 1 (LAMP1) (25), 소낭 구내염 바이러스 당 단백질 (VSVG, 분비 경로의 마커) (27)의 세포 표면에 전달하고, 퍼 옥시 솜의 회전율 2829 autophagosomes.

생균에 TGN에서 APP의 정렬을 가시화하기 위해, 우리는 C 말단에 광 활성화 가능한 (paGFP)에 결합 APP의 마지막 112 아미노산을 발현하는 플라스미드를 설계 (30) (βAPP-paGFP라고 함). 우리는 또한 전체 길이 응용 프로그램과 함께 이러한 실험을 수행하고 비슷한 결과를 달성했다; 그것은 밝은 이미지를 제공하기 때문에 ΒAPP 구조가 여기에 사용됩니다. 우리는 다음 사진을 활성화 &# 946;에만 TGN에서 APP-paGFP, TGN 마커 갈 락토 (GALT)에 의해 경계가있다. 앱이 핵 주변 지역에서 빠른 축삭 앱의 운송 및 통관을 시각화 paGFP 태그되었지만,이 하나 신중하게 정의 함에서 다른 11,31,32에 응용 프로그램 매매의 첫 번째 데모입니다. 여기서 우리는 정확한 TGN 내 사진 활성화 및 다운 스트림 구획과 리소좀 (30) 후속 절단 및 통관에 응용 프로그램의 출구를 보여줍니다. 골지 내의 정확한 광 - 활성화 단백질은 다른 시스템에 널리 적용 할 수있다.

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Protocol

1. 전지 도금 및 형질

  1. 세포 배양 후드에서, 플레이트 ~ 300,000 ~ 500,000 SN56 세포 (박사 제인 Rylett의 일종 선물) 35mm의 유리 바닥 공 초점 접시에와 (둘 베코의 수정 이글 배지, DMEM는, 보충 사전 형질 미디어 커버 10 % FBS).
  2. 증식 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 배양한다.
    참고 : 세포가 약 50 %의 형질 전환 이전에 70 %의 합류해야한다.
  3. 세포 배양 후드에서, 형광 단백질을 발현하는 플라스미드 트랜 세포는 형광 단백질 여기 구획 표식 (태그 리소좀 관련 막 단백질 1 LAMP1를 태그 TGN 마커 (GALT-CFP 시안 형광 단백질에 결합 갈 락토 실 전이 효소)를 태그 MRFP), 및 paGFP (βAPP-paGFP 태그 관심의 단백질). (이러한 구조는 이전 30 기재되어있다)
  4. 형질 전환 시약 및 플라스미드 DNA의 F와 세포를 품어또는 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간. 최적의 균형 세포 독성 및 형질 전환 효율을 형질 에이전트의 5 μL (예를 들어, 리포 펙 타민 2000)에 DNA의 ~ 2 μg의 비율을 사용합니다. 실제 농도는 다른 플라스미드에 최적화 될 필요가있다. 여기에 설명 된 실험에서, 1 μg의 βAPP-paGFP의 / 공 초점 접시, 램프 1-MRFP 0.3 μg의 / 공 초점 요리 및 GALT-CFP의 0.2 μg의 / 공 초점 접시를 사용합니다.
    주 : 사용 된 플라스미드의 양은 형질 전환 효율에 의존 할 것이다.
  5. 신경 세포주 : 단계 1.4 후, 세포 배양 후드에서 미리 형질 매체를 제거하고 1 mM의 24 시간 동안 환상 AMP (dbcAMP)를 dibutyryl 0.1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 ML의 DMEM에 SN56 세포 분화.

2. 현미경 무대 준비

  1. 사전 따뜻한 인산염 완충 식염수 (PBS)와 37 ° C에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS). imagi 전에 워밍업 현미경 단계37 ° C에 NG.
  2. 두 번 PBS로 세척 세포는 분화 미디어를 제거하고 37 ℃에서 HBSS 2 ㎖로 교체합니다. 현미경 스테이지에 배치 세포를 37 ℃로 가온.
    참고 : 세포가 HBSS 약 1.5 시간 동안 실행 가능한 있습니다.
  3. 공 초점 판 온도가 현미경 단계와 평형을 5 ~ 10 분을 허용합니다.

골지을 통해 ROI를 3. 사진 활성화

  1. 현미경의 접안 렌즈로, GALT-CFP, 램프 1-MRFP 및 βAPP-paGFP로 형질 세포를 찾을 수 있습니다.
    1. 높은 배율 (즉, 63X 또는 100X)와 오일 침지 렌즈를 사용합니다. 형광의 시각적 형태를 들어, 및 로다 민 (MRFP 형광 용) (CFP 및 GFP의 형광을위한) FITC를 시각화 할 수있는 설정 필터를 사용합니다.
  2. 1 μm의 각 채널에 대한 공 촛점 슬라이스를 설정합니다. 저해상도 이미지를 촬영.
  3. 이미지 작물 관심의 세포.
  4. 조정 손잡이를 사용하여 수동으로 설정할셀의 중앙에 초점면. 이것은 일반적으로 핵이 가장 큰 셀의 일부분이다.
  5. TGN (GALT - CFP 형광) 내 (로아) 관심의 3-5 원형 영역을 그립니다.
    1. (즉, 자이스 혈구 LSM 프로그램)의 ROI를 그리려면 명령 콘솔에서 '편집 투자 수익 (ROI)'버튼을 선택합니다.
    2. 원형 투자 수익 (ROI) 버튼을 선택합니다.
    3. 클릭 GALT - CFP에게 셀의 긍정적 인 영역을 통해 드래그합니다.
      참고 : 많은 현미경 사진 표백 패키지는이 기능을 가지고있다.
  6. 중첩 로아와 셀의 이미지를 가져 가라. 나중에 참조 로아의 사본을 저장합니다.
    1. 이미지에 ROI를 저장하려면, '매크로'버튼을 선택합니다.
    2. 'CopyRoisToOverlay'(C : /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb 파일 경로)를 시작하는 '로드'버튼을 누릅니다.
      참고 : 475-525 나노 미터 (CFP) 대역 통과 (BP), 500-530 nm의 BP (GFP)가 장착 된 공 초점 현미경을,및 560 nm의 긴 패스 (LP) 필터 세트가 필요합니다. 458 nm에서 488 nm의 방출 및 540 nm의 방출에 대한 헬륨 네온 레이저를위한 아르곤 레이저도 필요합니다.
  7. 설정 표백제 시간 코스에 대한 현미경을.
    1. 최대 전력 레이저 다이오드 (25 mW의 405 nm의 레이저)를 설정합니다.
      주의 : 과도한 사진 활성화가 세포막에 사진 독성 또는 손상이 발생할 수 있습니다. 망막 손상을 방지하기 위해 보안경을 사용하십시오.
    2. 설정 이미징의 120주기에 대한 현미경을.
      주 : 촬상 한 사이클 내에서 ROI를 표백 셀 전체의 촬상 이루어져있다. 이 표백제 시간 코스입니다.
    3. 모든 이미지 후 20-30 반복 만의 ROI (사진 활성화)을 표백하기 위해 현미경을 설정합니다. 이미지가 달라질 이미지와 표백제까지의 시간. 각주기는 약 30 초, 그래서 이미지 사이의 시간 지연을 설정합니다.
      주 : 각 사이클의 촬상 부는 화상의 크기에 따라 약 15 ~ 30 초 걸린다. 각 소유주의 표백나는 약 50 밀리 초입니다. 20 반복에 대한 모든 4 로아의 표백 각 표백제 / 이미지 사이클의 끝에서 4 초를 취할 것입니다.
  8. 표백제 시간 코스를 시작합니다.
  9. 15 분 (이미징 및 표백의 30주기) 후 표백을 끄고 있지만, 셀의 이미지를 캡처 계속합니다.
    참고 : 분 '펄스'기간 인 0-15 시간.
  10. βAPP-paGFP의 틈새를 따라, (표백)없이 45 분 동안 이미지를 캡처 계속합니다.
    참고 : 분 '추적'기간 인 15-45 시간.
  11. 단계 6에 기재된 분석 방법을 사용하여, 각 채널에 표면함으로써 (여기서, LAMP1-MRFP) 관심 구획이자 (여기서, βAPP-paGFP)의 단백질을 공동 - 지역화.

4. 다운 스트림 구획을 결정

  1. (이 실험에서) 리소좀 최종 구획되어 있는지 확인하려면 단백질이 리소좀에 축적하는 원인이 막 투과성 단백질 분해 효소 억제제를 추가합니다.
    1. βAPP를 들어, 0.5 μm의 L685, 458 (특정 γ 크레타 제 억제제) 하룻밤 또는 이미징 전에 30 분 동안 100 μM의 클로로퀸 (deacidifies의 리소좀)를 사용합니다.
  2. 3.8 - 3.1 단계에서와 같이 세포와 photoactivate를 찾을 수 있습니다.
  3. βAPP-paGFP는 분열의 부재에 축적 경우 이미지 (사진 활성화 제외) 추가 45 분 동안 세포 확인합니다.
  4. 단계 6에 기재된 방법에 따라 리소좀 (혹은 다른 하류 구획실)로 단백질의 전달 및 후속 간극을 분석한다.

5. 골지 내 사진 활성화의 정확성을 보장

  1. 37 ° C로 예열 HBSS.
  2. 모든 공 초점 판 HBSS에 66 μm의 nocodazole (처리) 또는 DMSO (제어)으로, 이미징 될 수 있도록, 2 ml의 솔루션을 준비합니다.
    1. 하나의 공 초점 판, 피펫 (2) 37 ° C HBSS ml의 16.60 mM의 nocodazole 재고에서 nocodazole의 7.96 μl를 추가하십시오.
    2. 제어 그래서lution, 피펫 2 2 ML 튜브에 37 ° C HBSS ㎖의 DMSO의 7.96 μl를 추가합니다.
  3. 촬영하기 전에 5 분 동안 nocodazole 또는 DMSO와 HBSS에 세포를 품어.
  4. 단계 3.1에서와 같이 세포를 찾아보십시오.
  5. photoactivati​​on 전에 사진 정품 인증 기간 후 Z - 스택을하기 위해 현미경을 준비합니다.
    1. 'Z 스택'버튼을 클릭합니다. 빠른 XY를 사용하여 스캔을 시작합니다.
    2. 셀의 상단에 현미경 조절 노브와 초점면을 조정합니다. 눌러 '마크 먼저'스택의 제 1 위치에 설정한다.
    3. 셀의 하단 현미경 조정 노브 (유리에 가장 가까운)과 초점 평면을 조정한다. 를 눌러 '마크 최근'스택의 마지막 위치를 설정합니다.
    4. Z 스택 패널에서 'Z 절편'버튼을 누릅니다. 1 μm의 '간격'을 설정합니다.
      높은 공간 해상도가 작은 스택 간격을 스택,하지만 더 많은 이미지가 필요합니다 참고 :스택 촬상 기간을 길게 취할.
  6. 단계 3.7에서 3.8 사이에 기술 된 바와 같이, 셀을 표백. 15 분 (30 프레임)로 0 분에서 사진 활성화 및 이미지.
  7. 30 프레임 후에 영상을 중지합니다. 즉시 비디오의 이미지를 저장합니다.
    주의 :이 제 2 이미징 시퀀스를 시작하기 전에 저장되지 않는 경우에는 일부 현미경 먼저 영상을 겹쳐있다.
  8. 동영상을 저장 한 후, 즉시 단계 5.5에서 매개 변수를 사용하여, Z - 스택을 획득.
  9. 단계 6에 기재된 바와 같이, CFP-GALT (또는 다른 골지 마커)로 βAPP-paGFP 동시 - 지역화.
    CFP 빠르게 photobleaches 및 이미징 기간 말까지 표시되지 않을 수 있습니다 참고. colocalization을가 GALT - CFP 가능하지 않을 수 있습니다. colocalization을해야하는 경우, 걸트에 태그를 MRFP를 사용합니다.

6. 소포 필터링 및 colocalization을

  1. 구획의 표면 (예 : 램프 1-MRFP)과 단백질 (을)를 만들기 위해 분석 프로그램 (예를 들어 Imaris)를 사용하여F의 관심 (예 βAPP-paGFP).
  2. 상단 메뉴 표시 줄에서 능가 버튼을 클릭하여 분석 프로그램의 '능가'​​섹션을 입력합니다.
  3. 가장 왼쪽 패널 (왼쪽에서 5 번째 버튼)의 상단 표면의 마법사 버튼을 선택합니다.
  4. 소포 (즉 βAPP-paGFP 형광, 관심의 단백질)를 필터링 할 채널을 선택합니다.
  5. 다음 마법사와 언론 분야에서 가장 큰 소포의 직경을 제출하여 배경 빼기를 수행합니다. 분석 프로그램이 자동으로 선택 - 관심의 채널 영역 - 필드의 최대 소포로부터 유도 된 임계 값에 기초하여.
    1. 수동으로 필요한 경우 선택을 구체화하는 임계 배경을 조정합니다.
  6. 임계 값 선택 화면의 아래쪽에 결합 된 표면을 분리하는 '분할 감동 객체의 옵션을 선택합니다.
    참고 : 많은 소포가 밀접로 그룹화하는 경우게델, 한면에서 이러한 개체 분석 프로그램 의지 그룹.
    1. 10 ~ 15 대표 소포를 선택하고 평균 소포 직경을 계산하고 마법사에 결과를 입력합니다.
  7. 증가 또는 '품질'(각 스폿의 중앙에 채널의 강도)에 임계 값을 감소시킴으로써 선택된 시드 포인트를 구체화.
    주 : 관심있는 채널의 표면이 생성됩니다. 선택면의 추가적인 정련이 시점에서 수행 될 수있다. 각 소포의 화소 수에 기초하여 임계 소체.
  8. 이 표면과 원래 채널 마스크. 마스크, 표면 생성 마법사 (연필)의 왼쪽에서 4 번째 탭을 선택합니다.
  9. '모두 마스크'를 선택합니다. 관심있는 소포와 새로운 채널이 생성됩니다.
    주 : 마스크 프로세스 동안 원래 채널을 복제하는 옵션이 제공된다. 원래의 데이터가 저장해야하는 경우이 옵션을 선택합니다.
  10. 반복의필터링되지 않은 채널 (예 : 램프 1 MRFP, 구획) 6.7을 통해 TEPS 6.1.
  11. 상단 도구 모음에서, colocalization을 도구를 선택합니다.
    1. 상단 패널에서 colocalized 할 수있는 채널의 히스토그램 표시로, 최근에 만들어진 마스크​​ 채널을 선택합니다.
    2. 가능한 모든 데이터를 선택합니다. 때로는 분석 후 존재하는 어두운 픽셀이 있습니다. 히스토그램에서 이러한 픽셀을 선택하지 마십시오, 그들은 결과를 왜곡합니다.
    3. 오른쪽 패널에서 'Coloc 채널 구축'을 선택합니다. 이것은 단지 colocalized 픽셀을 포함하는 새로운 채널을 생성합니다. 데이터는 '채널 통계'버튼 아래에있는 동일 패널 (Panel)에있을 것입니다. 데이터를 .csv 파일로 내보낼 수 있습니다.
    4. '재료의 비율이 colocalized'통계를 사용합니다. 이 옵션은 계정에 개체의 픽셀 크기의 강도를합니다.

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Representative Results

일반적인 결과는 βAPP (그리고 그림 1a b)는 TGN를 떠나 빠르게 램프 1 트래픽에 나타납니다 보여줍니다. 광 활성화 기간 동안에, 소체는 리소좀 (도 1B)로 향하는 골지체를 벗어남을 알 수있다. TGN에서 사진 활성화가 동안 억제제 치료를하지 않으면, paGFP 형광은 리소좀에서 볼 수 있습니다. photoactivation을 중지 한 후, βAPP-paGFP 빠르게 (1B에 그림 1a 비교) 리소좀에서 지워집니다. nocodazole과 치료는 구획을 표시 GALT - CFP 내에서 응용 프로그램의 축적에 이르게와 리소좀 (그림 1C)에 인신 매매를 방지 할 수 있습니다.

APP 스웨덴 변이 (APPsw)은 10 배 (34)에 의해 β-분열의 속도를 증가시킨다. βAPPsw-paGFP의 급속한 분열로, paGFP 형광은 세포질에서 확산 형광 신호로 나타납니다. 아마도이 나는의 세포질로의 C- 말단 paGFP를 해방 γ - 세 크레타 (그림 2)에 의한 빠른 βAPP 절단의 결과. γ 세 크레타 제 억제제의 존재하에 βAPP는 리소좀 내에 축적한다.

리소좀에 βAPP 전달 후, paGFP 형광 빠르게 지워집니다. 짧은 체류 시간은 다른 구획에 리소좀에서 인신 매매의 결과 일 수있다. 반대로, γ 세 크레타 제에 의한 절단은 βAPP의 리소좀 막 (도 3a)로부터 paGFP 형광의 확산을 초래할 것으로 예상된다. 확산 형광 공 초점 현미경으로 감지하기 어렵습니다. βAPP 다른 구획에 전달 또는 해제 여부를 확인하려면, SN56 세포는 γ - 세 크레타 (L685, 458) 또는 및 알칼리 에이전트 (클로로퀸)에 대한 특정 억제제로 치료했다. 하나 L685, 458 또는 클로로퀸의 추가는 리소좀에서 APP 축적의 결과 ( 룽> 그림 3b 및 c).

그것은 일반적으로 응용 프로그램은 endocytosed되기 전에 세포 표면에 전달 엔도 좀 처리하고 35 리소좀 것이 허용됩니다. 그러나, 우리의 치료 세포, 세포 표면 βAPP은 공 초점 현미경으로 감지 할 수 없습니다. 광 활성화 βAPP은 세포막의 특정 영역에 집중되지 않을 수있다. 대신, 세포막의 넓은 표면적에 걸쳐 확산 형광이있을 수있다. 흥미롭게도, γ 세 크레타 제 억제제 처리는 세포 표면에서 βAPP-paGFP를 발견하는 고무하는 리드 (도 3B). γ 세 크레타 제 억제제 처리는 효소를 억제하는 기능에 부가하여, 세포 표면에 더 βAPP를 행 할 수있다. 단백질 구획 인신되지만 따라서, 세포막의 큰 표면적은보다 큰 영역에 걸쳐 확산과 paGFP 검출을 어렵게 만든다.

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리소좀에 응용 프로그램의 인신 매매 이미징 그림 1. SN56 세포. 램프 1-MRFP, GALT - CFP 및 βAPP-paGFP로 형질했다) 셀은 정확하게 흰색 동그라미로 표시 골지 (ROI를 위에 배치 ROI를 내 사진 활성화 ). 세포는 다른 방법으로 사진을 활성화하고 βAPP-paGFP 거래를 결정하기 위해 15 분 동안 몇 군데 있었다. 삽입 된 골지에서 리소좀에 핵 주변 지역에서 인신 매매를 보여줍니다. 공동 지역화 된 픽셀은 노란색. B) 리소좀에 βAPP - paGFP를 포함하는 소포의 인신 매매를 나타납니다. 노란색 픽셀은 램프 1을 표시하고 βAPP-paGFP colocalization을. C는) SN56 세포 TGN에서 βAPP-paGFP 출구를 방지하기 위해 촬영 전에 nocodazole 처리 하였다. 대표 화상은 광 활성화 기간의 끝에서 찍은. 오른쪽 패널에서, 동일한 셀의 Z - 스택은 사진을 활성화 직후 촬영. 목 전자 GALT - CFP는 colocalized GALT - CFP 및 βAPP-paGFP의 시각화를 개선하기 위해 거짓 컬러 레드를하고있다. 노란색 픽셀 GALT - CFP 및 βAPP-paGFP 사이 colocalization을을 나타낸다. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
βAPPsw-paGFP. SN56 세포의 그림 2. 인신 매매는 램프 1-MRFP, GALT - CFP 및 βAPPsw-paGFP (가족 스웨덴어 돌연변이와 βAPP)로 형질 감염시켰다. 스웨덴 돌연변이는 APP가 절단되는 속도를 증가시킨다. 세포는 골지체 광 활성화 묘화 내에 대안 적이었다. paGFP이 세포질 내로 확산하는 리소좀 막으로부터 분리 된 후 확산 형광을 알 수있다. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다.53 / 53153fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 터미널 세포 기관을 결정. SN56 세포 램프 1-MRFP, GALT - CFP 및 βAPP-paGFP로 형질했다. 광 활성화 한 후, 세포를 추가로 45 분 동안 관찰 하였다. 두 개의 가장 왼쪽 패널은 세포 photoactivati​​on 전에 (가장 왼쪽)과 photoactivati​​on (가운데) 후 15 분을 보여줍니다. 에 패널은 맨 오른쪽) 치료, B) γ 크레타 제 억제제의 전체 영상의 45 분 치료, 또는 c) 클로로퀸 처리 후 앱 형광을 보여줍니다. 화살촉은 APP 공동 지역화 된 영상의 45 분 후에 램프 1로 가리 킵니다. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.

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Discussion

이러한 기술은 후속 매매 및 분열을 시각화 TGN에 paGFP 태그 막 단백질의 정확한 광 활성화를 설명한다. paGFP 25 일 전 십 년간 생성 된 반면,이 하류 구획에 초기 단백질의 인신 매매를 수행하는 정확한 사진 활성화의 첫 번째 예입니다. APP-paGFP를 사용하여 이전의 연구 사진을 활성화 골지 (11)로 간주 된 세포의 요정 핵 영역을 구성한다. 그러나, 우리의 현미경 사진, 리소좀, 초기 엔도 좀, 늦게 엔도 좀 같이 분명 또한이 지역 (그림 1 참조 30)에서 찾을 수 있습니다. 마우스 뉴런의 형질 전환 효율이 낮지 만 이들 실험은 HEK293 세포, COS7 세포, 신경 세포 SN56, SH-SY5Y 세포와 마우스 뉴런에서 성공적으로 실행되어왔다. 유사한 실험은 지난 112 아미노산을 포함 전체 길이 APP 구조 단축 구조를 사용하여 수행되었다APP의 산은, β- 및 γ-분열 사이트와, paGFP에​​ 융합. 단축 제물 형질과 높은 형광 신호를 제공하도록 용이하고, 이들은 첨부 된 도면에 도시된다. 우리의 단축 구조는 정의되지 않은 분열 및 정렬 신호 (38)이 N 말단 ectodomain을 부족합니다. 이 N- 말단 신호와 분열에도 불구하고, 우리는 우리의 단축 구조는 전체 길이 APP-paGFP (30), (33)과 비슷한 현지화 및 인신 매매를 가지고 찾을 수 있습니다.

때문에 셀의 요정 핵 영역에서 많은 소기관의 모든 노력은 사진 활성화의 정확성을 보장하기로 결정했습니다. 촬상 기간에, 셀 및 골지체 이동한다. 따라서, 광 활성화 로아 신중 광 활성화 기간 동안 모니터링 골지체 위에 유지하도록 조절되어야한다. 공 초점 현미경은 온도의 작은 변화에 민감합니다. microsco을 통해 예를 들어, AC 또는 가열 통풍구PE는 결상면의 변화를 초래할 수있다.

실험 사이의 일관성을 유지하기 위해, 우리는 각각의 광 활성화 / 이미징 사이클 사이의 시간 지연을 설정한다. 시간의 ROI와 이미지를 셀을 표백하는 데 필요합니다. 로아의 셀 개수 및 크기에 따라 시간이 표백제 하나의 이미지가 달라질 취할. 이미지 간의 일관성을 유지하기 위해, 각각의 이미지를 포함 표백, 그래서 이미지 사이의 시간 지연을 설정 약 30 초를 필요로한다. 증가 된 시간 해상도는 빔 형성기 (예 LSM5 라이브 검출기)를 이용하는 검출 시스템을 사용함으로써 달성 될 수있다. 제 2 해상도의 손실없이 120 프레임 /에서이 현미경 할 수있는 이미지입니다.

광 활성화의 정확성을 확인하기 위해, nocodazole 제어를 수행하는 것이 필수적이다. 사진을 활성화하는 동안 골지 중 전송을 차단하여,이 pa​​GFP 크게 다른 구획에서 활성화되지 않는 것을 보장한다.CFP의 사진 표백제 빠르게와 이미징 및 표백을 반복하고 어려운 GALT - CFP와 colocalization을 만들 수 있습니다. paGFP 형광 대량 골지체 영역에 남아있는 경우, 이는 또한 정확한 광 활성화를 나타낼 수있다. 또한, GALT 더 사진 안정 CFP보다이 실험에 MRFP, 태그 할 수 있습니다.

골지 내의 활성 향상은 다중 광자 현미경에 의해 달성 될 수있다. 이 실험에서 공 초점 영상면은 일반적으로 1 μm의 조각, 전체 셀을 통해 전달합니다 영상 및 사진 활성화를위한 레이저된다. 다중 광자 레이저가 실험에 사용될 수 있으며, 모든 삼차원 35의 정확도를 향상시킬 수있다. 여기에서 입증 된 바와 같이 그러나, 전통적인 405 nm의 레이저 다이오드 정확하게 TGN 내에 βAPP-paGFP 사진을 활성화하기에 충분하다.

제어, 우리는 VSVG-paGFP 형광 비슷한 실험을 수행했습니다. 이다 VSVG-paGFP,구조적 세포막 (30)의 특정 하위 영역들로 전달되는 가시화하고, 세포 표면에 전달 27,37. 이는 세포 내 구획이 전송에 의해 트리거되지 않는 것을 보장 과발현 또는 paGFP 태그의 존재.

확산 paGFP의 형광 공 초점 현미경으로 지역화하기 어려울 수 있습니다. 우리의 경험에 의하면, 응용 프로그램은 빠르게 분해와 리소좀 막에서 전체 길이 단백질 등의 짧은 수명을 가지고 나타납니다. 이 문제는 APP 절단 (34)의 속도를 가속화 스웨덴 유행 돌연변이에 의해 악화된다. 급속 절단 단백질 기법을 채용하는 것이, 억제제는 최종 하류 구획실을 결정하는 것이 중요하다. L685, 458 또는 리소좀에서 APP의 상당한 축적 클로로퀸 리드에 의한 γ-크레타 제의 억제; 심지어 스웨덴 변이.

너무 많은 억제제가 사용되는 경우, 이는 세포 내 AC 이어질 수βAPP-paGFP의 누적, 단백질 흠도 발생할 수 있습니다. 실험이 시작되기 전에 세포에 형광 paGFP 흠의 흠도 결과에 paGFP 누적 (우리의 게시되지 않은 관찰, 40 μm의 클로로퀸과 밤새 치료 IE). 관심의 단백질의 절단을 방지 할 수 있지만 개재물 형성으로 이어지지 않는 억제제 농도를 사용한다. 오버 형질 paGFP와 세포 또한 사진을 활성화하지 않고 형광 것이다 paGFP의 명백한 흠을 일으킬 수 있습니다. 새롭게 광 활성화 paGFP 우선적 이들 개재물 트래픽 및 결과의 해석을 방해 할 것이다. 이미지 세포를 찾을 때, 분명 paGFP 흠 세포를 피할 수 있습니다. βAPP-paGFP의 경험에서 적절한 수준에서 βAPP-paGFP를 발현하는 세포에 매우 희미한 녹색 형광이있다. 이 희미한 형광은 일반적 묘화 될 수없고 단지 접안 렌즈를 통해 볼 수있다.

(즉, 세포막)에 인신 매매 그 단백질을 감지하기 어려울 수있다. 이것은 형광 신호가 큰 영역에 걸쳐 확산되고 있으므로, 희석 또는 단면 프로파일은 막 공 초점 현미경의 해상도 이하로되어 있기 때문에 일 수있다. 그것은 표면 형광 현미경을 사용하여 영상화함으로써이 문제를 회피하는 것이 가능할 수있다. 그러나, 이로 인해 기술의 공간 해상도를 감소시킬 것이다.

이 기술의 장점은, 다른 세포막 단백질의 적용이다. 이 기술은 여러 단백질의 발현 이상에 달려 있지만, 그것은 VSVG-paGFP과 βAPP-paGFP (30)와 입증 된 바와 같이 단백질 인신 매매는 명백히, 중단하지 않은 것 같습니다. 리소좀 이외에, 엔도 / 리소좀 시스템의 다른 마커는 또한 성공적으로 사용되어왔다. 이들은 초기 끝 rab5-MRFP 포함osome 후반 엔도 좀에 대한 rab9-mchFP (체리 형광 단백질). 이 강력한 현미경 기법 TGN에서 다른 단백질의 거래를 수행하도록 확장 될 수있다. 이것은 동일하게 정의 함 마커를 사용할 제공된 이산 구획 사이의 거래를 수행하는 데 적용될 수있다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계 나 이해 관계의 충돌이 없습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

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References

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