Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável

Biology

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Summary

Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração.

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Tam, J. H., Pasternak, S. H. Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP. J. Vis. Exp. (104), e53153, doi:10.3791/53153 (2015).

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Abstract

Beta-amilóide (Ap) é o constituinte principal das placas senis encontradas nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer. Ap é derivado da clivagem sequencial da Proteína Precursora Amilóide (APP) por β e y-secretases. Apesar da importância de Ap a patologia da DA, a localização subcelular destas clivagens não está bem estabelecida. Trabalhar em nosso laboratório e outros implicam o sistema endossomal / lisossomal no processamento de APP após a internalização da superfície da célula. No entanto, o tráfego intracelular da APP é relativamente pouco estudada.

Embora as proteínas da superfície celular são alteráveis ​​a muitas técnicas de marcação, não existem métodos simples para seguir o tráfico de proteínas de membrana a partir do Golgi. Para este fim, criada construções de APP que foram marcados com foto-activável GFP (paGFP) na extremidade C-terminal. Após a síntese, paGFP tem baixa fluorescência basal, mas pode ser estimulado com luz de 413 nm, to produzir uma fluorescência verde forte, estável. Ao utilizar o marcador de Golgi galactosiltransferase acoplados à proteína fluorescente ciano (GalT-PCP) como um alvo, que são capazes de APP com precisão fotoactivar na rede trans-Golgi. Photo-ativado APP-paGFP pode então ser seguido, uma vez que trafica para compartimentos jusante identificados com fluorescente etiquetado proteínas marcadoras compartimento para o endossomo precoce (Rab5), o falecido endosome (Rab9) e do lisossoma (LAMP1). Além disso, o uso de inibidores do processamento de APP, incluindo o inibidor de cloroquina ou L685 γ-secretase, 458, que são capazes de realizar experiências pulse-chase para examinar o processamento de APP em células individuais.

Descobrimos que uma grande fracção da APP move-se rapidamente para o lisossoma sem aparecer na superfície da célula, e é então eliminado do lisossoma por clivagens-secretase semelhantes. Esta técnica demonstra a utilidade de paGFP para seguir o tráfico e processamento de proteínas intracelulares from o Golgi para compartimentos a jusante.

Introduction

A característica da doença de Alzheimer (DA) é a presença de placas senis e emaranhados neurofibrilares (NFTs) no cérebro. O constituinte principal das placas senis é β-amilóide (Ap). Ap é derivado de seu precursor; proteína precursora de amilóide (APP) 1. A clivagem de APP amiloidog�ica começa com a remoção do ectodomínio de APP pela secretase β-2. O fragmento do terminal carboxilo de 99-resíduo remanescente (CTF) pode ser clivado pela secretase γ para produzir Ap 3-7. Enquanto muitas experiências documentaram a clivagem de APP na superfície celular após a internalização a partir da superfície da célula para o sistema endossomal / lisossomal, uma série de estudos recentes têm sugerido que o tráfico intracelular da APP também é importante na regulação da sua transformação 8-11.

Tem havido uma série de tentativas de modular os níveis de Ap com inibidores y-secretase e Ap Immunotherapies. No entanto, os ensaios clínicos recentes com essas terapias não mostrou nenhum benefício, e, em alguns casos, causaram danos 12. Uma estratégia inexplorada de modular a produção de Ap é alterar a localização sub-celular de APP e interacção γ-secretase. Os Golgi, membrana de plasma, e endosomes / lisossomos têm sido sugeridos como possíveis locais para γ-clivagem de APP. Pesquisas no nosso laboratório sugerem que a APP eo γ-secretase são proteínas residentes da membrana lisossomal 13. Além disso, verificou-se que o lisossomais γ-secretase tem um pH óptimo ácido 13. Além disso, a alcalinização do sistema endossomal / lisossomal com cloroquina ou NH4Cl, foi demonstrado para diminuir a produção de Ap 14. y-secretase inibição ou nocaute ou Presenilin leva ao acúmulo APP-CTFs no lisossoma 15-17. Além disso, interrompendo APP endocitose reduz a produção de Ap 18-20.

Apesar da importância do Golgi como uma estação de triagem para as proteínas e as proteínas reciclados a partir do sistema endossomal / lisossomal nascentes, o tráfico intracelular de APP não tem sido estudada em pormenor 21. Um trabalho recente demonstrou que a APP pode ser reciclado para a rede trans-Golgi (TGN), através de interacção com o complexo retromer. Regulação para baixo do complexo retromer diminui a produção de Ap 8,22-24. No entanto, a saída de APP a partir do Golgi, não tem sido bem estudada.

Ao seguir a endocitose de proteínas de superfície celular, tais como o receptor de transferrina, são facilmente identificados e seguidos, após o tráfico de proteínas intracelulares é mais difícil. Na verdade, poucas proteínas tiveram seu tráfego intracelular trabalhada. O advento das marcas de proteínas fluorescentes, tais como foto-activável-GFP (paGFP), tem proporcionado novas ferramentas para examinar o tráfico intracelular. Photo-activatable-GFP é uma forma de GFP que é quase invisível após a síntese, mas desenvolve verde forte (GFP) de fluorescência depois de ser ativado por 413 nm de luz laser e este sinal é estável durante dias 25,26. Constructos usando paGFP têm sido utilizados para demonstrar o tráfico intralisossomal da proteína lisossómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, a entrega da superfície da célula do vírus da estomatite vesicular glicoproteína (VSVG, um marcador da via secretora) 27, e o volume de peroxissomas 28 e 29 autofagossomas.

A fim de visualizar a triagem de APP do TGN em células vivas, que concebido plasmídeo expressando os últimos 112 aminoácidos da APP acoplados a foto-activável (paGFP) no terminal C (referida como pAPP-paGFP) 30. Também realizamos esses experimentos com APP de comprimento total e alcançou resultados semelhantes; a construção pAPP é usado aqui porque fornece imagens mais brilhantes. Em seguida, foto-activate &# 946; APP-paGFP apenas no TGN, como demarcada pela TGN marcador Galactosiltransferase (GalT). Embora APP foi marcado com paGFP para visualizar o transporte axonal rápido da APP e autorização da região perinuclear, esta é a primeira demonstração de tráfico de APP de um compartimento cuidadosamente definidos para outro 11,31,32. Aqui, nós demonstramos foto-ativação exata dentro do TGN ea saída de APP em compartimentos jusante e subsequente clivagem e apuramento de lisossomos 30. A foto-activação preciso dentro do Golgi é amplamente aplicável a outros sistemas de proteínas.

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Protocol

1. celular Galvanização e Transfecção

  1. Num capuz de cultura de células, a placa de ~ 300.000 a ~ 500.000 SN56 células (uma gentil oferta do Dr. Jane Rylett) sobre uma 35 mm prato confocal com fundo de vidro e cobrem com meio de pré-transfecção (Dulbecco Modified Eagle Médium, DMEM, suplementado com 10% de FBS).
  2. Incubar as células durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 a proliferar.
    Nota: As células devem ser de aproximadamente 50% -70% confluentes antes da transfecção.
  3. Num capuz de cultura de células, as células transfectar com os plasmídeos que expressam uma proteína fluorescente etiquetado marcador TGN (galactosiltransferase acoplados à proteína ciano fluorescente, GalT-PCP), uma proteína fluorescente etiquetado marcador compartimento (aqui, lisossoma proteína associada à membrana 1, LAMP1, marcado com MRFP), e a proteína de interesse marcado com paGFP (pAPP-paGFP). (Estas construções foram previamente descritas 30)
  4. Incubar as células com o reagente de transfecção de ADN e o plasmídeo Fou 24 h a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Usar uma proporção de ~ 2 ug de ADN de 5 ul de agente de transfecção (por exemplo, Lipofectamine 2000) para melhor equilíbrio citotoxicidade e eficácia de transfecção. Concentrações reais podem precisar de ser otimizado para diferentes plasmídeos. Nas experiências aqui descritas, usar 1 ug / prato confocal de pAPP-paGFP, 0,3 ug / prato confocal de LAMP1-MRFP, e 0,2 ug / prato confocal de GalT-PCP.
    Nota: A quantidade de plasmídeo utilizado dependerá da eficiência de transfecção.
  5. Para linhas de células neuronais: Após o passo 1.4, em um capuz de cultura de células, remove meios de pré-transfecção e diferenciar células SN56 em 2 ml de DMEM suplementado com 0,1% de penicilina / estreptomicina, com 1 mM de dibutiril-AMP cíclico (dbcAMP) durante 24 h.

2. Microscópio fase de preparação

  1. Pré-quente solução salina tamponada com fosfato (PBS) e Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) a 37 ° C. Warm-up palco microscópio antes imaging a 37 ° C.
  2. Lavar as células duas vezes com PBS, para remover e substituir meios de diferenciação com 2 ml de HBSS a 37 ° C. Células colocar no palco microscópio aquecida a 37 ° C.
    Nota: As células são viáveis ​​para aproximadamente 1,5-2 hr em HBSS.
  3. Permitir 5-10 minutos para a temperatura da placa confocal para equilibrar com a platina do microscópio.

3. Photo-ativação do ROI sobre o Golgi

  1. Com a ocular do microscópio, encontrar células transfectadas com GalT-PCP, LAMP1-MRFP, e PAPP-paGFP.
    1. Use uma lente de imersão em óleo com alta ampliação (ou seja, 63X ou 100X). Para conformação visual de fluorescência, use um conjunto de filtros capaz de visualizar FITC (para PCP e fluorescência da GFP) e rodamina (para MRFP fluorescência).
  2. Defina a fatia confocal para cada canal de 1 um. Pegue uma imagem de baixa resolução.
  3. Cortar a imagem apenas a célula de interesse.
  4. Usando o botão de ajuste, defina manualmenteo plano focal para o meio da célula. Esta é normalmente a parte da célula, onde o núcleo é a maior.
  5. Empate 3-5 Regiões circulares de Interesses (ROI) dentro do TGN (GalT-PCP fluorescência).
    1. Para desenhar ROIs (ou seja, no programa Zeiss LSM), selecione o botão "Editar ROI 'no console de comando.
    2. Selecione o botão de ROI circular.
    3. Clique e arraste sobre GalT-PCP regiões positivos da célula.
      Nota: Os pacotes de foto-branqueamento de muitos microscópios têm esta capacidade.
  6. Pegue uma imagem do celular com o ROIs sobreposta. Salvar uma cópia dos ROIs para consulta posterior.
    1. Para salvar o ROI com a imagem, selecione o botão "Macro".
    2. Pressione o botão 'Load' para iniciar o 'CopyRoisToOverlay' (caminho do arquivo: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
      Nota: Um microscópio confocal equipado com 475-525 nm (PCP) passa banda (BP), um 500-530 nm BP (GFP),e um 560 nm passe (LP) conjuntos de filtros são obrigatórios. Também é necessário um laser de árgon de 458 nm e 488 nm de emissão de laser de HeNe e uma emissão de 540 nm.
  7. Set-up do microscópio por um curso de tempo lixívia.
    1. Defina o diodo laser (laser de 25 mW 405 nm) para potência máxima.
      Cuidado: foto-ativação excessiva poderia conduzir a foto-toxicidade ou dano às membranas celulares. Use proteção para os olhos, para evitar danos na retina.
    2. Set-up do microscópio por 120 ciclos de imagem.
      Nota: Um ciclo de imagem consiste de branqueamento dentro do ROI e imagem de toda a célula. Este é um curso de tempo de branqueamento.
    3. Defina o microscópio para branquear (foto-ativar) apenas o ROI por 20-30 iterações após cada imagem. O tempo para a imagem e lixívia uma imagem variará. Defina um atraso de tempo entre imagens para cada ciclo é de aproximadamente 30 segundos.
      Nota: A parte de imagem de cada ciclo demora cerca de 15-30 segundos, dependendo do tamanho da imagem. O branqueamento para cada ROEu é de cerca de 50 mseg. Branqueamento de todos os 4 ROIs para 20 iterações terá 4 segundos no final de cada ciclo de lixívia / imagem.
  8. Inicie o curso de tempo de branqueamento.
  9. Desligue o branqueamento depois de 15 min (30 ciclos de imagiologia e de branqueamento), mas continuar a capturar imagens da célula.
    Nota: Tempo de 0 a 15 min é o período de 'pulso'.
  10. Continuar a capturar imagens durante 45 minutos (sem clareamento), a seguir o apuramento de PAPP-paGFP.
    Nota: Tempo 15 a 45 minutos é o período de 'perseguição'.
  11. Utilizando o método descrito no passo 6, a co-localizar a proteína de interesse (aqui, pAPP-paGFP) com o compartimento de interesse (aqui, LAMP1-MRFP), tornando as superfícies de cada canal.

4. Determine o compartimento Downstream

  1. Para determinar se os lisossomas (nestas experiências) são o compartimento final, adicionar inibidores da protease a membranas permeáveis ​​para causar proteínas que se acumulam no lisossoma.
    1. Para pAPP, usar 0,5 uM L685, 458 (inibidor específico γ-secretase) durante a noite ou 100 uM de cloroquina (deacidifies lisossomas) durante 30 min antes de imagem.
  2. Encontre células e fotoactivar como no passo 3,1-3,8.
  3. Imagem do celular para um 45 min (sem foto-ativação) para determinar onde PAPP-paGFP se acumula na ausência de clivagem.
  4. Analisar a entrega de proteína para os lisossomas (ou outro compartimento a jusante) e subsequente depuração de acordo com o método descrito no passo 6.

5. garantir a precisão de Photo-ativação dentro do Golgi

  1. Warm-up HBSS a 37 ° C.
  2. Prepara-se uma solução de 2 ml, para cada placa confocal a ser trabalhada, de 66 uM de nocodazole (tratamento) ou DMSO (controlo) em HBSS.
    1. Para uma placa confocal, pipeta de 2 ml de 37 ° C e adicionar 7,96 HBSS ul de nocodazol a partir de um estoque de nocodazole 16.60 mM.
    2. Como um controlo tãolução, pipeta de 2 ml de 37 ° C HBSS para um tubo de 2 mL e adicionar 7,96 mL de DMSO.
  3. Incubar as células em HBSS com nocodazol ou DMSO durante 5 min antes de imagem.
  4. Encontrar células como no passo 3.1.
  5. Antes de fotoativação, preparar o microscópio para tomar uma pilha de Z após o período de foto-ativação.
    1. Clique no botão 'Z Stack'. Inicie a digitalização usando XY rápido.
    2. Ajustar o plano focal com o botão de ajuste do microscópio para a parte superior da célula. Prima 'Mark Primeira' para definir a primeira posição na pilha.
    3. Ajustar o plano focal com o botão de ajuste do microscópio para a parte inferior (mais próxima do vidro) da célula. Pressione "Mark Última 'para definir a última posição na pilha.
    4. No painel pilha a Z, pressione o botão 'Z seccionamento'. Defina o 'Intervalo' para 1 mícron.
      Nota: Para uma maior resolução espacial empilhar um intervalo de pilha menor, mas mais fotos precisaráser feita alongar o período de formação de imagens para a pilha.
  6. Descorar as células, tal como descrito no passo 3,7-3,8. Photo-activate e imagem de 0 min a 15 min (30 quadros).
  7. Pare de imagem depois de 30 frames. Salve imediatamente uma imagem do vídeo.
    Atenção: Alguns microscópios pode substituir primeiro vídeo se ele não é salvo antes de iniciar uma segunda sequência de imagem.
  8. Depois de gravar o vídeo, adquire imediatamente uma pilha de Z, utilizando os parâmetros do passo 5.5.
  9. Co-localizam-pAPP paGFP com GalT-PCP (ou outro marcador de Golgi), tal como descrito no passo 6.
    Nota: PCP fotobranqueadores rapidamente e pode não ser visível no final do período de imagem. Co-localização pode não ser possível com GalT-PCP. Se co-localização é necessária, use a tag GalT MRFP.

6. Vesicle Filtragem e co-localização

  1. Utilizar um programa de análise (por exemplo Imaris) para tornar as superfícies do compartimento (por exemplo LAMP1-MRFP) e uma proteína óf interesse (por exemplo, PAPP-paGFP).
  2. Entre na seção "Superar 'do programa de análise clicando no botão Ultrapasse na barra de menu superior.
  3. Selecione o botão do assistente de superfície na parte superior do painel à esquerda a maioria (5 th botão a partir da esquerda).
  4. Selecione um canal para filtrar vesículas (ou seja, PAPP-paGFP fluorescência, proteína de interesse).
  5. Realizar a subtração de fundo, apresentando o diâmetro do maior vesícula no campo para o assistente e pressione próximo. O programa de análise selecciona automaticamente - com base num limiar deriva da maior vesícula no campo - uma área no canal de interesse.
    1. Ajustar manualmente o fundo limiar para refinar a seleção, se necessário.
  6. Na parte inferior da tela de seleção de Threshold, verificar a opção 'objetos' tocar Dividir para separar as superfícies combinadas.
    Nota: Se muitas vesículas estão estreitamente agrupadas paraGether, a vontade grupo programa de análise desses objetos em uma superfície.
    1. Escolha 10-15 vesículas representativos e calcular o diâmetro médio de vesícula e digite o resultado para o assistente.
  7. Limitar os pontos de sementes seleccionadas, aumentando ou diminuindo o limiar de "Qualidade" (intensidade do canal no meio de cada ponto).
    Nota: As superfícies do canal de juros será criado. Outro refinamento das superfícies seleccionados pode ser realizada neste ponto. Vesículas limite baseado no número de pixels de cada vesícula.
  8. Mascarar o canal original com esta superfície. Para mascarar, selecione a guia 4 a partir da esquerda no assistente de criação de superfície (lápis).
  9. Selecione 'Máscara All'. Um novo canal com as vesículas de interesse será criado.
    Nota: Durante o processo de máscara, uma opção para duplicar o canal original é oferecido. Selecione essa opção se os dados originais precisa ser salvo.
  10. Repita sPTE 6.1 através de 6.7 para o canal não filtrada (ou seja LAMP1 MRFP, compartimento).
  11. Na barra de ferramentas superior, selecione a ferramenta co-localização.
    1. No painel superior, como os histogramas dos canais a serem colocalized aparecer, selecione os canais mascarados recentemente criadas.
    2. Selecione todos os dados disponíveis. Existem pixels escuros que às vezes estão presentes após a análise. Não selecionar esses pixels no histograma, eles vão distorcer os resultados.
    3. No painel da direita, selecione "Criar Coloc Canal '. Isso cria um novo canal contendo apenas os pixels colocalized. Os dados estarão no mesmo painel sob o botão "Canal Estatísticas '. Os dados podem ser exportados como um arquivo .csv.
    4. Use o "Percentual de material colocalized 'estatística. Esta opção tem em conta a intensidade dos pixels e tamanho do objecto.

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Representative Results

Os resultados típicos mostram pAPP deixar o TGN e parece tráfego rapidamente para LAMP1 (Figura 1a e b). Durante o período de foto-activação, as vesículas podem ser vistos com partida no Golgi destinado para os lisossomas (Figura 1b). Sem tratamento inibidor, paGFP fluorescência será visível nos lisossomos enquanto houver foto-ativação no TGN. Depois de parar fotoativação, a PAPP-paGFP é rapidamente eliminado do lisossoma (comparar Figura 1a a 1b). O tratamento com nocodazol leva à acumulação de APP dentro do GalT-PCP marcado compartimentos e impede o tráfico para os lisossomas (Figura 1C).

A mutação Sueca de APP (APPsw) aumenta a taxa de clivagem pela β-10-de dobragem 34. Com a clivagem rápida de βAPPsw-paGFP, a fluorescência paGFP aparece como um sinal de fluorescência difusa no citoplasma. Presumivelmente, isso is o resultado da clivagem de pAPP pela rápida γ-secretase libertando o paGFP C-terminal para o citoplasma (Figura 2). Na presença de inibidor γ-secretase, a pAPP se acumula dentro dos lisossomos.

Após a entrega do PAPP para o lisossoma, a fluorescência paGFP é rapidamente eliminado. O tempo de residência curto pode ser o resultado de tráfico a partir do lisossoma para o outro compartimento. Por outro lado, a clivagem de pAPP pela γ-secretase seria esperado para levar a difusão de paGFP fluorescência da membrana lisossomal (Figura 3a). A fluorescência difusa é mais difícil de detectar por microscopia confocal. Para determinar se a pAPP é entregue a outro compartimento ou eliminado, as células foram tratadas com SN56 um inibidor específico contra γ-secretase (L685, 458) ou um agente de alcalinização (cloroquina). A adição quer de L685, 458 ou cloroquina resultou na acumulação de APP no lisossoma ( rong> Figura 3b e c).

É comummente aceite que a APP é entregue à superfície celular antes de ser endocitado e processadas nos endossomas e lisossomas 35. No entanto, nas nossas células não tratadas, da superfície celular pAPP não poderia ser detectado por microscopia confocal. Foto-activado pAPP não podem ser concentrados numa região específica da membrana plasmática. Em vez disso, pode haver uma fluorescência difusa através da grande área de superfície da membrana de plasma. Curiosamente, o tratamento com inibidor da γ-secretase conduz à pAPP-paGFP detectáveis ​​na superfície da célula (Figura 3b). γ-secretase tratamento inibidor pode rota mais pAPP para a superfície celular, além de inibir a função da enzima. Portanto, a grande área de superfície da membrana plasmática paGFP se espalha sobre uma área maior e torna difícil a detecção, apesar de a proteína é de tráfico para o compartimento.

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Figura 1. Imaging o tráfico de APP para os lisossomas. SN56 células foram transfectadas com LAMP1-MRFP, GalT-PCP, e pAPP-paGFP. A) A célula foi exacta foto-activado dentro de ROIs colocado sobre o Golgi (ROIs indicado por círculos brancos ). A cela era alternativamente e fotografada por 15 min para determinar tráfico PAPP-paGFP ativada por foto. O encarte mostra o tráfico dentro da área perinuclear de Golgi para os lisossomas. Co-localizada pixels aparecem amarelo. B) O tráfico de uma vesícula contendo PAPP-paGFP para o lisossoma. Pixels amarelos denotar LAMP1 e pAPP-paGFP colocalização. C) SN56 células foram tratadas com nocodazole antes de imagem para evitar pAPP-paGFP egresso da TGN. Uma imagem representativa colhida a partir do final do período de foto-activação. No painel da direita, uma pilha de Z de uma mesma célula tomado imediatamente após a foto-activação. º e GalT-PCP tem sido de cor vermelha falsa para melhorar a visualização de colocalized GalT-PCP e PAPP-paGFP. Pixels amarelas denotam co-localização entre GalT-PCP e PAPP-paGFP. Barras de escala representam 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Tráfico de βAPPsw-paGFP. Células SN56 foram transfectadas com LAMP1-MRFP, GalT-PCP e βAPPsw-paGFP (PAPP com a mutação sueca familiar). A mutação sueca aumenta a taxa de APP que é clivada. As células foram alternativamente dentro do e fotografada activado foto-Golgi. A fluorescência difusa pode ser visto depois paGFP é separada da membrana do lisossoma para difundir para dentro do citoplasma. A barra de escala representa 5 um.53 / "target =" _ blank "53153fig2large.jpg> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Determinar a organela terminal. SN56 células foram transfectadas com LAMP1-MRFP, GalT-PCP e PAPP-paGFP. Após a foto-activação, as células foram seguidos durante mais 45 minutos adicionais. Os dois mais à esquerda painéis mostram as células antes de fotoativação (mais à esquerda) e 15 minutos após a fotoativação (meio). O painel do lado direito, mostra APP fluorescência após 45 min de imagem total a) sem tratamento, b) inibidor γ-secretase tratada, ou c) cloroquina tratada. Pontas de flechas apontam para APP com LAMP1 após 45 min de imaging-localizada co. Barras de escala representam 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.

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Discussion

Esta técnica descreve a foto-ativação precisa de proteínas de membrana marcados com paGFP no TGN para visualizar tráfico e subsequente clivagem. Enquanto paGFP foi criada mais de uma década de 25, este é o primeiro exemplo de foto-ativação precisa de seguir o tráfico de proteínas nascentes para compartimentos jusante. Estudos anteriores utilizando APP-paGFP constrói uma região peri-nuclear da célula, a qual foi considerada o Golgi-11 activado foto. No entanto, como é evidente nas nossas micrografias, lisossomas, endossomas precoces, e endossomas tardios também pode ser encontrada nesta região (Figura 1 e a referência 30). Estes experimentos foram executados com sucesso em células HEK293, células COS7, células SN56 neuronais, células SH-SY5Y, e neurônios de rato, embora a eficiência de transfecção de neurônios de rato é baixa. Experiências semelhantes foram realizadas usando construções de APP de comprimento completo e as construções encurtadas, que incluem o último amino 112ácidos de APP, com os locais de p- e γ-clivagem, fundido com paGFP. As construções encurtadas são mais fáceis de transfectar e fornecer um sinal de fluorescência mais elevado, e estas são mostradas nas figuras anexas. As nossas construções encurtadas também não têm o ectodomínio N-terminal, que tem clivagens indefinidas e sinais 38 de triagem. Apesar destes sinais e clivagens N-terminais, descobrimos que nossa construção encurtado tem localização semelhante e tráfico como um full-length APP-paGFP 30, 33.

Por causa das muitas organelas na área peri-nuclear da célula, todo esforço foi feito para garantir a precisão da foto-activação. Durante o período de imagem, a célula e o Golgi irá mover. Portanto, os ROIs foto-activação devem ser cuidadosamente monitorizados durante o período de foto-activação e ajustado para se manter no topo do aparelho de Golgi. Microscópios confocais são sensíveis a pequenas mudanças na temperatura. Por exemplo, AC ou aquecimento aberturas sobre o microscoPE pode resultar numa mudança do plano de imagem.

A fim de manter a coerência entre as experiências, definir um intervalo de tempo entre cada ciclo / imagens foto-ativação. É necessário tempo para branquear os ROIs e imagem da célula. Dependendo do tamanho da célula e o número de ROIs, o tempo para branquear e tomar uma imagem variará. A fim de manter a consistência de imagem para imagem, definir um tempo de atraso entre imagens para cada imagem, incluindo branqueamento, requer aproximadamente 30 segundos. O aumento da resolução temporal pode ser conseguido através da utilização de sistemas de detecção que emprega um formador de feixe (por exemplo, detector de LSM5 vivo). Estes microscópios pode imagem em 120 frames / segundo sem perda de resolução.

Para confirmar a precisão de foto-ativação, é imperativo para realizar um controle nocodazole. Ao bloquear o transporte para fora do Golgi durante a foto-activação, isso garante que paGFP não está sendo ativada significativamente nos outros compartimentos.PCP foto-branqueadores rapidamente com repetidas de imagem e de branqueamento e pode fazer co-localização com GalT-PCP difícil. Se o volume de paGFP fluorescência permanece na área de Golgi, este também pode indicar foto-activação precisa. Alternativamente, GalT podem ser marcados com MRFP, que é mais estável do que o foto-PCP nestas experiências.

Activação melhorada dentro do Golgi, também pode ser alcançado com um microscópio multi-fotão. Embora o plano de imagem confocal nestas experiências é tipicamente uma fatia de 1 uM, o laser para imagiologia e foto-activação irá passar através de toda a célula. Um laser multi-fotão pode ser usado para estas experiências, e pode melhorar a precisão em todas as três dimensões 35. No entanto, como demonstrado aqui, um tradicional 405 nm diodo laser é suficiente para activar exacta foto-pAPP-paGFP dentro da TGN.

Como controle, realizamos experimentos semelhantes para VSVG-paGFP fluorescência. VSVG-paGFP, que éconstitutivamente entregue à superfície da célula 27,37, foi visualizado a ser entregue para as sub-regiões específicas da membrana plasmática 30. Isto assegura que o transporte de compartimentos intracelulares não é activado por sobre-expressão ou a presença do marcador de paGFP.

Difuso fluorescência paGFP pode ser difícil de localizar por microscopia confocal. Na nossa experiência, a APP é rapidamente clivado e parece ter um tempo de vida curto, como uma proteína de comprimento completo na membrana lisossomal. Este problema é exacerbado pela mutação sueca FAD que acelera a taxa de clivagem de APP 34. Para empregar a técnica de proteínas rapidamente clivadas, um inibidor é crucial para determinar o compartimento a jusante final. A inibição da γ-secretase por L685, 458 ou cloroquina levar a uma acumulação significativa de APP em lisossomas; mesmo com a mutação sueca.

Se demasiado inibidor é usado, isto pode levar a AC intracelularcumulação de PAPP-paGFP, e pode levar a inclusões proteicas. Acumulada paGFP em inclusões resultados em inclusões paGFP fluorescentes na célula antes do experimento foi iniciado (nossas observações não publicadas, ou seja, o tratamento durante a noite com 40 mM de cloroquina). Uma concentração de inibidor que evita a clivagem da proteína de interesse, mas não conduz à formação de inclusão deve ser usado. Sobre-transfecção de células com paGFP também pode causar óbvias inclusões de paGFP, que fica fluorescente sem a foto-activação. Recém-paGFP ativada por foto será preferencialmente o tráfego para estas inclusões e interferir com a interpretação dos resultados. Ao olhar para as células a imagem, evite células com inclusões paGFP óbvias. Em nossa experiência com PAPP-paGFP, há uma fluorescência verde muito fraco nas células que expressam a pAPP-paGFP ao nível adequado. Esta ligeira fluorescência normalmente não pode ser trabalhada e só pode ser visto através da ocular.

(isto é, membrana do plasma) pode ser difícil de detectar. Isto pode ser porque o sinal de fluorescência, sendo espalhado sobre uma grande área, ou é diluído por o perfil de membrana em secção transversal é inferior à resolução do microscópio confocal. Pode ser possível para ultrapassar este problema por imagem usando um microscópio de epifluorescência. No entanto, isso irá reduzir significativamente a resolução espacial da técnica.

Uma vantagem desta técnica é a sua aplicabilidade a outras proteínas de membrana. Embora esta técnica depende da sobre-expressão de várias proteínas, parece que o tráfico de proteína não é abertamente interrompido, como foi demonstrado com VSVG-paGFP e pAPP-paGFP 30. Além disso para o lisossoma, outros marcadores de o sistema de direccionamento endossomal / lisossomal, também têm sido utilizados com sucesso. Estes incluem Rab5-MRFP para o fim precoceosome e rab9-mchFP (proteína fluorescente cereja) para o final de endosome. Esta poderosa técnica de microscopia pode ser estendido a seguir o tráfico de outras proteínas a partir da TGN. Pode igualmente ser aplicada a seguir tráfico entre os compartimentos discretos fornecidos marcadores compartimentos bem definidos estão disponíveis.

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Disclosures

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros ou conflitos de interesse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dishes  Matek P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
Hanks Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-092
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11995-092
Penicilin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
dibutyrl cyclic AMP Sigma  D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum Life Technologies 10082147
Heated Microscopy stage insert P PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope  Carl Zeiss with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens Carl Zeiss
L685, 458  EMD Millipore 565771 dissolved in DMSO
cholorquine  Sigma C6628  dissolved in water
Nocodazole Sigma M1404 dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide  Sigma 472301
Imaris  Bitplane with colocalization package 

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