باستخدام تحليل متحد البؤر من

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

مخطوطة يوفر هنا مجموعة بسيطة من طرق لتحليل إفراز ونشر بروابط الموسومة fluorescently في القيطم. ويوفر هذا السياق لاختبار قدرة بروتينات أخرى لتعديل توزيع يجند والسماح التجارب التي قد تعطي نظرة ثاقبة آليات تنظيم التدرجات محدثة التخلق.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O'Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور بروابط توزيعها عبر حقل من الخلايا. سهولة التعبير عن البروتينات الخارجية، جنبا إلى جنب مع حجم كبير من الخلايا في الأجنة في وقت مبكر، وجعل القيطم المورق نموذجا مفيدا لتصور بروابط الموسومة GFP. يتم ترجمتها من mRNAs الاصطناعية بكفاءة بعد الحقن في مرحلة مبكرة أجنة القيطم، والحقن يمكن أن تستهدف خلية واحدة. عندما جنبا إلى جنب مع التتبع النسب مثل غشاء المربوطة طلب تقديم العروض، وحقن الخلايا (ونسله) التي تنتج البروتين overexpressed يمكن بسهولة أن يتبع. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإنتاج الموسومة من fluorescently WNT وShh على بروابط من حقن مرنا. أساليب تنطوي على ميلCRO تشريح إإكسبلنتس الأدمة (القبعات الحيوان) وتحليل يجند نشر في عينات متعددة. باستخدام التصوير متحد البؤر، معلومات عن إفراز يجند ونشر أكثر من مجال الخلايا يمكن الحصول عليها. التحليلات الإحصائية للصور مبائر توفر البيانات الكمية على شكل تدرجات يجند. قد تكون هذه الطرق مفيدة للباحثين الذين يرغبون في اختبار آثار العوامل التي يمكن أن تنظم شكل تدرجات محدثة التخلق.

Introduction

أثناء التطور الجنيني المبكر، والخلايا التي ارتكبت تدريجيا لمتابعة الأنساب محددة من التمايز: وهذا يعني مجموعة من مكتملة النمو (أو المحفزة) الخلايا تصبح مقيدة تدريجيا إلى إقامة السكان من الخلايا الاصلية العزم على أن تؤدي إلى نوع خلية واحدة. إشارات الخلية خلية مركزية لتنظيم مواصفات النسب أثناء التطور الجنيني. سوف تكون هناك حاجة التلاعب في هذه الإشارات لتوجيه الخلايا الجذعية نحو مصائر خاصة لدعم العلاجات الطبية الجديدة.

وأكد عدد صغير نسبيا من مسارات الإشارات خلال التنمية، بما في ذلك مسارات الاستجابة إلى الفصيلة TGF (nodals وأفضل الممارسات الإدارية) 1-2، عوامل النمو FGFs 3، 4 Wnts، والقنافذ 5. هذه البروتينات يفرز ربط مستقبلات موجودة على غشاء الخلية لتنشيط نقل الإشارة وبالتالي تغيير التعبير الجيني و / أو سلوك الخلية. تنظيم محكم من علامة الخليةalling أمر ضروري للمواصفات سلالة الخلايا والتطور الطبيعي. في حين أن الحديث المتبادل بين هذه الممرات مهم في تحديد مصير الخليوي، ويجند نفسه واحد يمكن أن تثير ردود متميزة في تركيزات مختلفة. وقد وصفت التدرجات محدثة التخلق منذ أكثر من 100 سنة بوصفها نظرية لشرح كيفية مختلف أنواع الخلايا يمكن أن تجنيها من حقل الخلايا 6. تشوير الجزيئات التي تنتجها مجموعة واحدة من الخلايا قد نشر على نطاق معين، وخفض التركيز في مسافة أكبر من المصدر. والخلايا المعرضة للإشارة لرد على تركيز المحلية في مركزها في مجال الخلايا، والخلايا في مواقع متميزة تستجيب بشكل مختلف لمستويات مختلفة من الإشارات. الدليل على وجود morphogens يأتي من الدراسات في وقت مبكر من ذبابة الفاكهة الجنين 7 و القرص الجناح وكذلك الأطراف الفقارية 9 و 10 الأنبوب العصبي.

وهناك حاجة إلى أساليب لفيvestigate كيف التدرجات محدثة التخلق يتم وضع وتحديد جزيئات أخرى مهمة في تنظيم هذه التدرجات. وقد استخدمت التجارب أنيقة باستخدام المناعية لتصور البروتينات الذاتية في الجسم الحي في سياق خلفيات وراثية مختلفة لتحقيق التدرجات محدثة التخلق 11-12. ومع ذلك، والأجسام المضادة جيدة والمسوخ محددة ليست متوفرة دائما، لذلك نحن هنا وصف البروتوكول باستخدام overexpression من بروابط الفلورسنت في القيطم، لتوفير بديل، طريقة بسيطة لتشريح كيفية منتجات الجين الخارجية يمكن أن تؤثر في توزيع بروابط عبر حقل من الخلايا. يوفر القيطم المورق نظام ممتاز لإجراء هذا النوع من التجارب مع تطور الأجنة من الخارج بحيث يمكن الوصول إليها في المراحل الأولى. حجمها كبير (1-1.5mm في القطر) يبسط microinjection والتلاعب الجراحية ومراحل الأريمة الخلايا هي سهلة لصورة لأنها لا تزال كبيرة نسبيا (حوالي 2081؛ م عبر). دراسات Overexpression في القيطم هي بسيطة للقيام: مرنا حقنها في الجنين في وقت مبكر يمكن أن تستهدف خلايا معينة، ويتم ترجمتها بكفاءة.

تم إنشاء الموسومة fluorescently بنيات Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP باستخدام pCS2 Wnt8a-HA 13، pCS2 Wnt11b-HA 14 و EGFP. الببتيد HA مهم لتشمل، ليس فقط لتوفير علامة الجزيئية إضافية، ولكن أيضا لأنه يعتقد أن تتصرف كفاصل فصل البروتينات WNT وEGFP يسمح كل من المنتجات الجينات لتعمل. التركيبة المستخدمة لتصور Shh على استخدمت في السابق لتوليد الماوس المعدلة وراثيا تعبر عن Shh على-EGFP الانصهار البروتين 15؛ هذا وقدمت تفضلت اندي مكماهون. الأهم من ذلك، هو استنساخ العلامة GFP لجميع بنيات 3 'إلى تسلسل إشارة بحيث يتم الاحتفاظ بها بعد المعالجة. ومن الضروري أيضا لضمان أن البروتين النهائي يتضمن تسلسل المطلوبة للتعديلات، مثل وadditioن من الدهون كما هو الحال بالنسبة لShh على وWNT ligands.The cDNAs تم subcloned في pCS2 + ناقلات التعبير الذي هو الأمثل لبرودوشن مرنا الاصطناعية. ويشمل المروج SP6 وإشارة تذييل بعديد الأدينيلات (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

العمل الموصوف هنا يوفر بروتوكول بسيط للمقارنة بين إفراز ونشر الموسومة fluorescently WNT وShh على الموسومة بروابط. عن طريق حقن كميات محددة من مرنا الاصطناعية، وبروتوكول circumnavigates أي مشاكل المرتبطة التعبير متغير من نواقل مختلفة استخدام منشطات مختلفة. وقد تم مؤخرا تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في الآثار المترتبة على سلفات endosulfatase heparan Sulf1 على Shh على-EGFP وWnt8a / إفراز Wnt11b-HA-EGFP ونشرها في القيطم 16-17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت التجارب على الحيوانات تحت رخصة مكتب المملكة المتحدة الرئيسية في الهندسة الكهربائية والميكانيكية وتمت الموافقة على التجارب التي أجريت من قبل لجنة جامعة يورك الأخلاق في الامتثال للوصول: الأخلاق بيان (الحيوان البحوث: الإبلاغ عن التجارب المجراة) المبادئ التوجيهية. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. استراتيجية لتوليد الموسومة fluorescently الليجندات

وفيما يلي مثال للبروتوكول subcloning Wnt8a-HA وEGFP إلى pCS2، من أجل إنتاج في إطار الاندماج بناء Wnta-HA-EGFP:

  1. انشاء وتشغيل ردود الفعل PCR لWnt8a-HA وEGFP. استخدام المعلومات التمهيدي عرضها في TABLE1 وردود الفعل مثال PCR ومثال PCR الشروط المعروضة في الجدول رقم 2. ملاحظة: تختلف قالب DNA اعتمادا على بناء التي يتم إنتاجها، في هذا المثال، يتم استخدام Wnt8a-HA كما DNA القالب.
  2. تنظيف ردود الفعل PCR باستخدام طقم استخراج الهلام، نفذ شطف النهائي في 30μl من الماء الصف الجزيئية.
  3. تحقق 2 ميكرولتر من الناتج PCR على هلام الاغاروز 1٪ يحضر في تاي.
  4. ملخص Wnt8a-HA والمنتجات EGFP PCR وpCS2 باستخدام أنزيمات التقييد المناسب (انظر الجدول 1)، إعداد ردود الفعل كما هو موضح في الجدول رقم 2 (المنتج مثال PCR هضم).
  5. احتضان ردود الفعل لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية ومن ثم تخزين Wnt8a-HA وGFP PCR المنتجات على الجليد.
  6. إضافة 1μl من العجل الفوسفاتيز القلوية في الأمعاء (CAIP) لpCS2 هضم واحتضان لمدة 6 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  7. الحرارة تعطيل CAIP التي يحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
  8. تشغيل pCS2 ويساعد على هضم PCR على هلام 1٪ عالى النقاء الاغاروز أعدت في تاي.
  9. استخراج جل وتنظيف pCS2 وPCR المنتجات باستخدام مجموعة استخراج الهلام، أداء شطف النهائي في 30μl من الماء الصف الجزيئية.
  10. اقامة ربط كما هو موضح في الجدول رقم 2 (مثال T4 ربط) واحتضان عند 12 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

2. مرنا التجميعي: توليد Template

  1. إنتاج قوالب باستخدام انزيم الهضم قيود من البلازميدات التالية (كل في التعبير ناقلات pCS2): غشاء أزرق (memCerulean)، غشاء RFP (memRFP)، Shh على-GFP، Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP.
    1. إعداد قيود يساعد على هضم كما هو موضح في الجدول رقم 2 (قالب مثال هضم).
    2. المزيج بلطف واحتضان ردود الفعل لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. تشغيل 2.5 ميكرولتر من البلازميد هضمها على هلام الاغاروز 1٪ (تاي) للتأكد من أن رد الفعل قد قطع على الانتهاء.
  3. تنظيف هضم باستخدام مجموعة استخراج الهلام، نفذ شطف النهائي في 50 ميكرولتر من الماء الصف الجزيئية.

3. مرنا التجميعي: النسخ في المختبر

  1. توليف مرنا الوظيفية باستخدام عدة نسخ SP6 مرنا. تجميع ردود الفعل في 1.5 مل الدناز / ريبونوكلياز أنابيب microcentrifuge مجانا.
  2. إعداد ردود الفعل مرنا النسخ كما هو موضح في الجدول رقم 2 (مثال مرنا التوليف).
  3. مزجردود الفعل بلطف مع ماصة ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  4. تحقق 1 ميكرولتر من رد الفعل على هلام الاغاروز 2٪ (تاي).
  5. إضافة 1 ميكرولتر من الدناز إلى رد فعل، المزيج بلطف مع P20 واحتضان رد فعل لمدة 15 دقيقة أخرى في 37 ° C.
  6. إضافة 340 ميكرولتر من الماء الصف الجزيئية، 40 ميكرولتر من خلات الأمونيوم و 400 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم إلى رد فعل. دوامة ردود الفعل لمدة 30 ثانية.
  7. تدور مرنا لمدة 5 دقائق، 14000 x ج، 4 ° C.
  8. ماصة للأعلى (المائية) طبقة من كل رد فعل نقله إلى الطازجة 1.5 مل المسمار أنبوب الغطاء microcentrifuge ل.
  9. إضافة حجم مساو من كلوروفورم إلى كل من ردود الفعل يصب. دوامة العينات لمدة 30 ثانية.
  10. تدور مرنا لمدة 5 دقائق، 14000 x ج، 4 ° C
  11. ماصة للطبقة المائية أعلى من كل رد فعل نقله إلى الطازجة 1.5 مل المسمار غطاء أنبوب microcentrifuge.
  12. إضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول إلى كل من ردود الفعل ويعجل السيدNA في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. تدور كل من ردود الفعل لمدة 15 دقيقة في 14000 x ج، 4 ° C لتكوير مرنا
  14. إزالة طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو مرنا مكعبات
  15. إضافة 200 ميكرولتر من الايثانول 70٪ على كل من ردود الفعل، مزيج من ردود الفعل وثم تدور لمدة 10 دقيقة في 14000 x ج، 4 ° C.
  16. إزالة الايثانول مع الحرص على عدم تعكير صفو مرنا، تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف فراغ أو السرعة بطالة.
  17. إعادة تعليق مرنا في 10-20 ميكرولتر من الماء الصف الجزيئية. تدور لفترة وجيزة والحفاظ على العينات في الثلج. ملاحظة: يمكن تسخين العينة إلى 80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة مساعدتها على حل.
  18. تشغيل 1μl مرنا على هلام الاغاروز 2٪ (تاي) وتحليل 1.2 ميكرولتر على معمل للحصول على قراءات دقيقة من التركيز.
    خطوة حاسمة: مطلوب تركيز 400 نانوغرام / ميكرولتر من مرنا الاصطناعية لتنفيذ التجارب التالية.

    خطوة حاسمة: إذا كانت نسبة 260/280 هيخارج نطاق 2،00-2،20، أو المبلغ الإجمالي للمرنا يتجاوز 12 ميكروغرام، تنفيذ هطول الأمطار كلوريد الليثيوم.
  19. متجر مرنا في 1 مكل في -80 ° C. استخدام قسامات ثم رمي بعيدا. لا إعادة تجميد مرنا.

4. توليد القيطم المورق الأجنة

  1. رئيس القيطم المورق الإناث عن طريق الحقن تحت الجلد مع 50 وحدة من البشر هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمية (HCG، Chorulon) قبل أسبوع من التجربة.
  2. حمل القيطم المورق الإناث في الليلة التي سبقت التجربة عن طريق حقن 250 وحدة من قوات حرس السواحل الهايتية وتفرخ لهم في الظلام، O / N في 19 ° C.
  3. تشريح خارج الخصيتين من الضفادع الذكور رصاصة الرحمة لها وتخزينها في 1xNAM في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يتم رصاصة الرحمة ذكر الضفدع من قبل التخدير الطرفي وفقا للجدول 1 من الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. تدليك أنثى القيطم المورق للحث على الإباضة، وجمع لاالبيض معرف في 55 مم طبق بتري المستديرة.
  5. إنتاج تعليق الحيوانات المنوية عن طريق سحق ¼ من الخصية القيطم المورق في 1 مل من الماء منزوع الأيونات.
  6. فرشاة القيطم البويضات مع الحيوانات المنوية تعليق سحق باستخدام ماصة باستير وماصة لمبة خطوة حاسمة: إجراء التفاعلات الإخصاب في حوالي الساعة 04:30 في يوم التجربة.
  7. الأجنة الثقافة في 21 درجة مئوية في حركة عدم الانحياز / 10 (انظر الجدول 3 عن حلول) في 55 ملم أطباق بتري المغلفة مع 1٪ الاغاروز المخفف في الماء (الماء).
  8. الأجنة دي هلام بعد 45 دقيقة باستخدام السيستين / HCL (الجدول 3). ملاحظة: في 21 درجة مئوية، والأجنة تصل إلى مرحلة 2 الخلية بعد 90 دقيقة ويلتصق كل 20 دقيقة بعد ذلك.

5. Microinjecting القيطم الأجنة

  1. باستخدام 1 X ضربات 90mm الزجاج الشعيرات الدموية وNarishige PC-10 مرحلة مزدوجة من الزجاج مجتذب micropipette، وسحب بال micropipettes لحقن. ضبط إعدادات تجريبيا لتحقيق تلميح على ما يرام (ميكرون أقل من واحد دياميثالثا).
  2. إرفاق micropipette (إبرة) إلى microinjector الغاز (على سبيل المثال، في جامعة هارفارد Appartaus PLI-100 PICO-INJECTOR) لتسليم مرارا كميات دقيقة من السوائل عن طريق تطبيق الضغط المنظم لفترة محددة رقميا من الزمن. ضبط ضغط هوائي لتسليم حجم 1،25-10 nanolitres كما هو محدد باستخدام الشبيكة أو المعايرة الشريحة.
  3. معطف طبق بتري 55 ملم مع 5 مل من 1٪ الاغاروز (الماء). قطع 35-35 ملم مربع من الاغاروز من الطبق، وهذا سيوفر سطح ثابت لmicroinject الأجنة.
  4. ونقل الأجنة إلى NAM / 3 + Ficoll (الجدول 3) والانتقال إلى الطبق الحقن.
  5. حقن الأجنة في نصف الكرة حيوان بمجرد وصولها إلى المرحلة المطلوبة للتجربة.
    1. لتحليل توزيع بروابط GFP الموسومة على سطح الخلية، حقن الأجنة ثنائية أفقيا على مرحلتين الخلية، 10nl لكل خلية. التخفيفات سبيل المثال مرنا هو مبين أدناه لWnt8a-HA-EGFP. خطوة حاسمة: التأكد من أن جميع مرنا تركيزات الواحدالفن في 400 نانوغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: كمية مرنا ليتم حقنه تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا عن طريق اختبار تركيزات وإيجاد الحد الأدنى من المبلغ اللازم لتصور يجند الفلورسنت. النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة HA هو خطوة أساسية لتحديد أن من mRNAs يتم ترجمتها إلى مستويات مماثلة من أجل السماح للمقارنة بين اثنين من مختلف بروابط الموسومة fluorescently. فعلنا هذا لWnt8a-HA-EGFP وWnt11b-HA-EGFP في Fellgett وآخرون، 2015.
      ملاحظة: عند تقييم تأثير حقن مرنا (مثل واحد الترميز لمنظم مرشح)، عنصر تحكم نموذجية لحقن الحمض النووي الريبي غير نشط، مثل LacZ، إلى الأجنة الأشقاء من أجل السيطرة على أي آثار إضافية محاضر في الجنين.
      1. تمييع memRFP مرنا 1 في 4 (1μl + 3μl درهم 2 O) مع الماء الصف الجزيئية للحد من تركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر.
      2. تمييع Wnt8a-HA-EGFP مرنا 1 في 4 (1μl + 3μl درهم2 O) مع الماء الصف الجزيئية للحد من تركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر.
      3. مزيج memRFP مرنا في نسبة 1: 1 مع Wnt8a-HA-EGFP مرنا.
      4. مزيج مرنا من 5.5.1.3 في نسبة 1: 1 مع أي سيطرة مرنا LacZ أو المغير مثل Sulf1.
      5. حقن الأجنة على أساس ثنائي في المرحلة 2 الخلية مع 10nl مرنا في الخلية (مجموعه 20nl). ملاحظة: هذه النتائج في 250 خريج من م م RFP، 250 خريج من البريد GFP Wnt8a-HA-، 500 خريج من Wnt11b-HA- ه GFP و 2 نانوغرام من LacZ أو Sulf1 مرنا حقنها في كل خلية.
    2. لتحليل نشر GFP الموسومة بروابط، وضخ مرنا الترميز ليجند GFP جنبا إلى جنب مع علامة النسب مثل memRFP في مرحلة 16-32 الخلية، 1.25 NL لكل خلية.
    3. لتحليل آثار أي المغير المحتمل ليجند نشرها، وشارك في حقن مرنا الترميز لالمغير جنبا إلى جنب مع يجند والنسب التتبع. بدلا من ذلك، حقن الخلايا المجاورة: واحدة مع من mRNAs الترميز لligan GFP الموسومةد والتتبع النسب (memRFP) والآخر مع من mRNAs الترميز لالمغير والتتبع نسب مختلفة (memCerulean).
  6. ونقل الأجنة إلى 12.5 درجة مئوية الحاضنة والثقافة حتى اليوم التالي، Nieuwkoop وفابر (NF) المرحلة 8.

6. استئصال الحيوان كاب إإكسبلنتس

  1. ونقل الأجنة إلى 55 ملم أطباق بتري المغلفة مع 5 مل من 1٪ الاغاروز (الماء). ملء الطبق مع NAM / 2 (الجدول 3).
  2. خذ القبعات الحيوان دائرية باستخدام الإبر التنغستن خطوة حاسمة: تأخذ الشركات الكبرى في هذه المرحلة لأن هذه سوف تلتئم أفضل ويكون من الأسهل على الصورة، والحفاظ على القبعات الرقابة لضمان حدوث أي تمديد متقاربة.
  3. نقل إإكسبلنتس الحيوان إلى 55 ملم أطباق بتري المغلفة مع 1٪ الاغاروز (الماء) والأجنة الثقافة في 21 درجة مئوية لمدة 4 ساعات خطوة حاسمة: مطلوب حضانة 4 ساعة للسماح البروتينات الفلورية إلى أن تنضج.
  4. توليد الشرائح الإغاثة عن طريق الالتزام أسفل طبقتين من insulatio PVCن الشريط على الشرائح المجهر. قطع 14 مم 10 مم مستطيل من الشريط إلى ترك الغرفة لتركيب القبعات الحيوان خطوة حاسمة: تسطيح كل من طبقات من الشريط تماما على الشريحة قبل قطع المستطيل.
  5. ماصة 2 قطرات منفصلة من NAM / 2 (الجدول 3) في الشريحة الإغاثة، ما يقرب من 30 ميكرولتر من كل قطرة ماء.
  6. نقل إإكسبلنتس الحيوان إلى الشرائح الإغاثة باستخدام قطع طرف P20 وتوجيه بحيث الجانب قمية يواجه صعودا. ملاحظة: كل شريحة يمكن أن تعقد 10-15 القبعات الحيوان خطوة حاسمة: في هذه المرحلة يجب أن تلتئم جزئيا القبعات الحيوان، وهذا يعني أنهم أقل حساسة ويمكن أن يتم توجيه باستخدام ملقط.
  7. خفض بلطف زلة غطاء زجاجي على الشريحة الإغاثة والسماح للانزلاق الغطاء لتجف لمدة 20 دقيقة خطوة حاسمة: حجم الغطاء الحيواني أمر بالغ الأهمية؛ ضمان الحد الأقصى هو كبير بما فيه الكفاية أنه عندما يتم تخفيض ساترة الزجاج على الشريحة الإغاثة يضغط طبقة قمي من خلايا حيوان قبعة كافية لالعلاقات العامةoduce لنا سطح مستو لصورة. إذا كانت القبعات الحيوان هي صغيرة جدا ثم لا يزال لحد من الشريط PVC إلى طبقة واحدة.
  8. ختم الشريحة باستخدام طلاء الأظافر خطوة حاسمة: لا تستخدم الكثير من طلاء الأظافر لختم الشرائح الإغاثة لأنه إذا يصبح الشريط PVC رطبة جدا وسوف جمع ما يصل والخراب الشريحة.
  9. الشرائح الإغاثة الجافة لمدة 20 دقيقة في الظلام، وأنهم مستعدون للصورة، وعادة القبعات الحيوان ستبقى صحي لمدة 4-6 ساعة مختومة مرة واحدة في الشريحة.

7. التصوير

ملاحظة: تم إجراء التصوير خارج باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب. وقد تم اختيار وضع امدا للتصوير لأن هذا يسمح fluorophores متعددة متداخلة مع التوقيعات لاستخدامها، وإزالة مشكلة الحركة عينة المحتملة بين بالاشعة.

  1. البحث إإكسبلنتس باستخدام الهدف تضخم منخفض ثم التبديل إلى 63X / 1.4 هدف النفط لدقة أعلى التصوير.
  2. تشغيل الليزر المطلوبة. لهذا المثال 405تم استخدام الليزر لإثارة memCerulean، وكان يستخدم ليزر 488 لإثارة GFP والليزر 561 لإثارة memRFP باستخدام 405 و 488/561 المرايا مزدوج اللون.
  3. وضع الاستخدام امدا (في زين 2011، حدد وضع امدا - 32 صناديق).
  4. حدد 405NM، 488nm 561nm وlasers.To تسمح أوسع مجال الرؤية، تصغير الصورة (ل0.6x).
  5. ضبط حجم الإطار إلى حجم الصورة المطلوبة (1024 x 1024 بكسل مع أحجام من 220nm كانت تستخدم لهذه المجموعة البيانات).
  6. تعيين المتوسط ​​إلى عادة 4-8 لزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء.
  7. Optimise (الوحدة 1 متجدد الهواء وفقا ليزر 561nm كانت تستخدم لهذه المجموعة البيانات) الثقب.
  8. Optimise القوى الليزر خطوة حاسمة: تحقيق التوازن بين 405NM، 488nm 561nm الليزر ومثل هذه أن كل fluorophores يمكن الكشف باستخدام مجموعة 32 كاشف في حين التقليل من كمية الجهد وزيادة المطلوبة.
  9. جمع الكائن الضوء المنبعث من memCerulean، GFP وmemRFP. لهذا العمل ضوء جمعت كل ~10nm من 415-720nm، على الرغم من فترات جمع اكبر من الممكن أيضا (على سبيل المثال، كل ~ 20 نانومتر).

تحليل 8. صورة

  1. التحقيق في آثار جهري على التعبير عن سطح الخلية من بروابط الموسومة GFP
    ملاحظة: الخطوات التالية هي دليل مفصل لكيفية تم إجراء التحليل في المختبر لدينا. يمكن للمستخدم نهاية يريدون تبسيط عملية عن طريق كتابة السيناريو يماغيج أو فيجي لإزالة بعض الخطوات اليدوية.
    خطوة حاسمة: من المهم العينات المستخدم النهائي أطياف أي fluorophores المستخدمة في نفس الظروف أن التجربة النهائية تتم من أجل PERF اسندت unmixing الطيفي الفعال للfluorophores متعددة استخدمت في التجربة النهائية.
    يتم إجراء نوعين رئيسيين من التحليل في هذا القسم:
    1. حساب العدد الكلي للWNT-HA-EGFP بكسل شارك في توطين مع غشاء الخلية.
      1. Unmix الأخضر،قنوات الأحمر وأزرق باستخدام أطياف عينات من الحقن واحدة من هذه fluorophores في برنامج زين. حفظ هذه الصور وثائق LSM منفصلة لاستخدامها في كافة الخطوات التالية.
      2. فتح ملفات LSM مباشرة في برنامج تحرير الصور. ملاحظة: الإرشادات التالية هي للفيجي صورة J.
      3. حفظ الصور LSM وثائق تسلسل الصور، وهذا سيؤدي إلى انقسام الصور تلقائيا في قنوات منفصلة.
      4. حفظ تسلسل الصور في نفس المجلد مثل مخطوطات لبرامج التحليل النصي الذي سيتم استخدامه لتحليل البيانات (انظر ملفات التعليمات البرمجية تكميلية لالسيناريو الفعلي). ملاحظة: الإرشادات التالية هي لمطلب.
      5. فتح برامج التحليل النصي وفتح الدليل الذي يتم كتابة البرامج النصية.
      6. أدخل اسم الملف تحت تحليل الموقع، يقوم البرنامج يأخذ اسم الملف وإجراء التحليل.
        ملاحظة: ستكون أسماء الملفات قراءة ImageA0000 وImageA0001 لكل معهد العالم العربيجنرال الكتريك. برامج التحليل النصي وسوف تستخدم الصورة وضع علامة 0001 كقناع وتحليل نسبة بكسل في صورة 0000 التي شارك في توطين مع هذا القناع.
      7. اتخاذ عدد نسبة المشاركة في توطين (المشروح في غشاء خلية بالسكان) ونسخ هذه إلى جدول بيانات. ملاحظة: التعليمات التالية لبرنامج Excel.
      8. رسم عدد نسبة المشاركة في توطين على الرسم البياني شريط إما كقيمة مطلقة أو نسبية.
    2. تحليل عدد وحجم وشكل WNT-HA-EGFP نقاط و.
      1. فتح LSM غير مخلوط الملفات مباشرة في برنامج تحرير الصور. ملاحظة: التعليمات التالية هي للفيجي صورة J.
      2. تقسيم كل صورة إلى قنوات منفصلة لها (صورة> اللون> قنوات تقسيم).
      3. عتبة كل من WNT-HA-EGFP والقنوات علامة غشاء (صورة> ضبط> السيارات عتبة) خطوة حاسمة: حاول عدد من العتبات لمعرفة أي واحد ينتج صورة تمثيلية، دون تعريضالقناة.
      4. تحويل قناة علامة الغشاء إلى قناع (عملية> ثنائي> جعل قناع).
      5. عكس هذا القناع (تحرير> عكس).
      6. تحويل نقاط وWNT-HA-EGFP إلى قناع على النحو الوارد أعلاه.
      7. طرح قناع علامة غشاء من قناع يجند GFP (عملية> صورة آلة حاسبة> قناع WNT في المربع العلوي، قناع غشاء في المربع السفلي).
      8. استخدام تحليل وظيفة الجسيمات. من هنا، حدد المعلمات المطلوبة وتحليل البيانات (جسيمات تحليل> تحليل).
      9. نسخ عدد من الجسيمات، ومتوسط ​​حجم الجسيمات والبيانات دائرية في جدول ثم رسم الرسوم البيانية من هذه البيانات. ملاحظة: للحصول على هذا التحليل، والجسيمات فقط بين حللت 0.1-10μm 2 الحجم، لم توضع أي قيود على الجسيمات دائرية. هذه التعليمات هو ل Excel.
  2. تحليل مجموعة من يجند نشر
    1. فتح جميع الصور غير مخلوطة في متحد البؤر ايمالشيخوخة البرمجيات وثم تصدير الملفات في تنسيق TIF، والبيانات الخام وكصورة RGB ملاحظة: هذه التعليمات هو زين لايت 2011 خطوة حاسمة: وتشمل شريط النطاق على واحد على الأقل من الصور بحيث يمكن أن تكون المسافة تحسب أثناء التحليل.
    2. فتح الصور ليتم تحليلها في صورة برامج التحليل. ملاحظة: الإرشادات التالية هي للفوتوشوب 8.2.3) انقر بزر الماوس الأيمن على خلفية الصورة واختر 'طبقة من الخلفية، لخلق طبقة جديدة.
    3. تعيين القنوات علامة غشاء 0، بحيث لا قناة يجند GFP مرئية (طبقة> طبقة معايرة جديدة> خلاط قناة) خطوة حاسمة: كليب طبقة جديدة للتكيف مع الصورة التي يجري تحليلها، خيار مقطع طبقة جديدة في هذه الصورة غير متوفرة على شكل مربع التجزئة بعد النقر على خيار قناة خلاط.
    4. فتح مساحة عمل جديدة. تعيين دقة إلى 300 بكسل لكل بوصة، ووضع اللون إلى اللون RGB (ملف>جديدة> الحافظة).
    5. نسخ كافة الصور التي تم تحليلها في مساحة العمل واحد (اضغط على الصورة وانها قص قناة خلاط من خلال عقد السيطرة ثم عقد السيطرة والبديل واسحب الصورة إلى مساحة العمل).
    6. توجيه كل الصور بحيث يمكن قياس الحد الأقصى لطول نشرها لكل صورة على طول المحور الأفقي، مع الخلايا معربا عن WNT-HA-EGFP الموجه إلى اليسار.
    7. حفظ مساحة العمل باعتباره TIF ثم قم بفتح هذا في صورة برامج التحليل. ملاحظة: الإرشادات التالية هي للفيجي صورة J.
    8. فتح نافذة مدير ROI (تحليل> أدوات> مدير ROI).
    9. رسم مستطيل على الصورة الأولى، يمكن تحديد على وجه الدقة حجم المستطيل (اختر أداة المستطيل واستخلاص أي المستطيل> تحرير> تحديد> تحديد). ملاحظة: تم استخدام حجم 650 × 100 بكسل الطول × العرض في هذه الدراسة.
    10. وضع مستطيل على حافة جدا من المجال معربا عن سفلتي HA-EGFP. وضع مستطيل على المنطقة مع المسافة القصوى من WNT-HA-EGFP نشرها. خطوة حاسمة: حتى بدون علامة غشاء المناطق معربا عن WNT-HA- ه GFP يجب أن يكون مرئيا بسبب مضان الخلفية؛ إذا لم يكن ثم الرجوع إلى الصور الخام.
    11. تحويل مربع 10 ميكرومتر إلى اليمين. تحديد عدد ميكرومتر عن طريق قياس طول الشريط على نطاق وتضمينها في واحدة من الصور (رسم خط تتبع شريط النطاق> تحليل> ضبط مقياس). ملاحظة: هذا يوفر قيمة 10 أم في بكسل.
    12. إضافة مربع إلى مدير ROI عن طريق الضغط على زر الإضافة في نافذة مدير ROI.
    13. الخطوة المستطيل إلى الصورة التالية التي يتم قياسها من خلال النقر مرة أخرى على أداة المستطيل لتحريك مستطيل. كرر الخطوات من 8.2.10-11.
    14. مرة واحدة وقد تم قياس كل من لوحات، وحدد multiplot من القائمة مدير العائد على الاستثمار (ROI مدير> عن> Multiplot> قائمة).
      ملاحظة: يمثل البيانات WNT بكسل الأسواق العالمية ضغطهاnsity (Y) مع زيادة المسافة على طول المحور الأفقي (X، وتقاس بالبكسل). قيمة Y هي متوسط ​​كثافة إشارة من يجند GFP عند نقطة X ويتم احتساب المتوسط ​​من كل بكسل في المحور Y لكل قيمة X. وبالتالي فإن أطول مربع، سيتم تحليل أكثر بكسل لإنتاج هذا المتوسط. وهناك مربع صغير (في المحور Y) يكون نويصر. سوف مربع طويل القامة لديهم منخفضة جدا متوسط ​​كثافة بكسل.
    15. نسخ البيانات من مربع multiplot في جدول وإعادة تسمية وفقا لذلك. ملاحظة: التعليمات التالية لبرنامج Excel.
    16. تجاهل 10-20μm أول من البيانات من كل تحليل لأن هذا يمثل مضان الخلفية من الخلايا معربا عن يجند GFP ويشوه الرسوم البيانية.
    17. فتح التحليل والرسوم البيانية العلمية البرمجيات وإنشاء جهاز كمبيوتر محمول جديد. ملاحظة: الإرشادات التالية هي للSigmaplot 13.
    18. تسمية العدد المطلوب من الأعمدة للبيانات عن طريق النقر المزدوج على الأرقام الأفقية سن ورقة العمل واصفة إياهم عن بعد في ميكرون، Wnt8a-HA-EGFP وWnt11b-HA-EGFP.
    19. نسخ البيانات من جدول البيانات في الأعمدة ذات الصلة في التحليل والرسوم البيانية البرنامج العلمي.
    20. إنشاء رسم بياني مبعثر (إنشاء الرسم البياني> مبعثر> متعددة مبعثر> اختر العديد من X Y> حدد العمود بعد لX> اختر Wnt8a-HA-EGFP وWnt11b-HA-EGFP لقيم Y> إنهاء).
    21. إجراء تحليل الانحدار على منحنى Wnt8a-HA-EGFP عن طريق النقر على اليسار نقطة Wnt8a-HA-EGFP على الرسم البياني التشرذم. جميع النقاط التي ينبغي تسليط الضوء عليها. انقر على تحليل> المعالج الانحدار.
    22. حدد الفئة معادلة منحنى (الاضمحلال الأسي) واسم المعادلة (واحد، 3 المعلمة) ثم اضغط التالي.
    23. حدد X و Y القيم التي ينبغي تركيب منحنى (إذا تم تسليط الضوء على بيانات سبق، ينبغي أن يتم ذلك تلقائيا) ثم اضغط التالي.
    24. تواصل من خلال المعالج حتى خيار إخراج رقميةالصورة صفحة، وضمان "إنشاء تقرير" تكتك ثم اضغط التالي. ملاحظة: سيتم عرض المعلمات من أجل منحنى المجهزة في 1 تقرير *.
    25. على الصفحة خيارات الرسم البياني ضمان "إضافة إلى الرسم البياني المعادلة عنوان 'تكتك ثم اضغط النهاية. ملاحظة: قد خلقت المعالج تقرير 1 * والرسم البياني 1 * علامات التبويب في الجزء العلوي من كتاب المذكرة. وبالإضافة إلى ذلك سيكون قد تم إضافة منحنى الرسم البياني المنتجة في (8.2.20).
    26. كرر الخطوات من 8.2.21-8.2.25 لتناسب منحنى لWnt11b-HA-EGFP خطوة حاسمة: محاولة تركيب المعادلة فئات متعددة وأسماء المعادلة للبيانات. ملاحظة: منحنى مع الأنسب أن تنتج أعلى R 2 قيمة بأقل مبلغ المتبقي من الساحات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يقدم تحليلا متحد البؤر من إإكسبلنتس الغطاء الحيواني معربا عن البروتينات الموسومة fluorescently نظام فعال لتصور توزيع يجند تحت ظروف تجريبية مختلفة. في مثال واحد، وتوزيع GFP الموسومة يظهر Shh على (الشكل 1). في المرحلة 2-خلية، يتم حقن أجنة القيطم في كل من الخلايا التي تحتوي إما مع مرنا التحكم أو مع مرنا الترميز لSulf1، وهو الانزيم الذي يعدل سطح الخلية heparan كبريتات ويؤثر على Shh على محدثة التخلق التدرج 16. هذه الأجنة يتم تربيتها حتى المرحلة 32 خلية وخلية واحدة هي مع من mRNAs ترميز لShh على-GFP وmemRFP (كما التتبع النسب) حقن المشترك. وهذا يخلق استنساخ الخلايا معربا عن Shh على-GFP التي تم وضع غشاء الخلية المربوطة طلب تقديم العروض. في مرحلة الأريمة، تؤخذ إإكسبلنتس الغطاء الحيواني لتحليلها بواسطة المجهر متحد البؤر الشكل 1 يدل على أنه في ظل ظروف السيطرة، ويفرز Shh على-GFP وينشر خارج إعادةجيون معربا عن من mRNAs حقن. ومع ذلك، في ظل وجود Sulf1، Shh على-GFP هو أكثر تقييدا ​​في توزيعه و، في هذه العينة، لم يتم الكشف خارج استنساخ الخلايا المنتجة له. وقد تم تحليل آثار Sulf1 على توزيع Shh على-GFP أوفى 16.

عندما أعرب في الأجنة القيطم، الموسومة fluorescently تفرز بروابط WNT، وتتراكم على غشاء الخلية، ونشر في مجال الخلايا. في الشكل ونحن تميز quantitaive والنوعية خصائص مختلفة اثنين الموسومة fluorecently بروابط WNT في حقن الخلايا والتعبير عن البروتينات. الشكل 2A-H يدل على أمثلة على كيفية Wnt8a وWnt11b-HA-EGFP تتراكم على غشاء الخلايا الغطاء الحيواني . بمقارنة وحات 2B و2F فمن الواضح أن Wnt8a-HA-EGFP يتراكم بشكل أكثر كفاءة على غشاء الخلية من Wnt11b-HA-EGFP. تم استخراج المعلومات الكمية من الصور مبائر باستخدام كومbination الصورة وبرامج التحليل النصي (ملف التعليمات البرمجية التكميلي). ويبين الشكل 2I تراكم النسبي للWnt8a-HA-EGFP على غشاء الخلية مقارنة Wnt11b-HA-EGFP. تم الحصول على البيانات باستخدام برنامج نصي الكمبيوتر التي تحدد العدد الإجمالي للWNT-HA-EGFP بكسل شارك في توطين مع بكسل غشاء الخلية في كل صورة. في مقاربة أخرى، فإن العدد الإجمالي للWNT-HA-EGFP نقاط والذي شارك في توطين مع غشاء الخلية تحسب باستخدام برمجيات تحليل الصور (الشكل 2J). كما يمكن استخراج المعلومات النوعية حول حجم وشكل نقاط والفردية من البيانات باستخدام برمجيات تحليل الصور. بالإضافة إلى أقل Wnt11b-HA-EGFP نقاط وشارك توطين مع غشاء الخلية (الشكل 2J) هذه نقاط ولها أيضا متوسط ​​حجم أصغر من Wnt8a-HA-EGFP نقاط و(الشكل 2K). وعلاوة على ذلك، نقاط وWnt11b-HA-EGFP لديها انخفاض دائرية مقارنة Wnt8a-HA-EGFP نقاط و(الشكل 2L). سيركularity هو مقياس مدى قرب كائن يشبه دائرة الكمال، مع 1 يمثل دائرة الكمال و 0.1 شكل غير دائرية ممدود. ويمكن استخدام هذا النهج لاختبار أي منظم مرشح WNT يجند نشرها. للقيام بذلك، وينبغي حقن الخلايا السيطرة مع مرنا السيطرة ترميز لشكل غير نشط من منظم مرشح أو البروتين ذي صلة مثل بيتا غالاكتوزيداز (lacZ)؛ هذا يوفر سيطرة أكثر صحة من مجرد عدم حقن منظم. تم تحليل البيانات في هذه الأمثلة باستخدام اختبار غير حدودي مان ويتني U 18-19. تم استخدام برنامج التحليل الإحصائي لأداء الاختبار.

في الشكل 3، ونحن التحقيق WNT يجند نشرها. تم حقن قسيم أرومي واحد في مرحلة 4 خلايا بحيث لل explants الغطاء الحيواني تمثل مجال الخلايا التي فقط بعض الخلايا تعبر إما Wnt8a-HA-EGFP أو Wnt11b-HA-EGFP. من قبل بما في ذلك التتبع نسب الخلية، يمكننا تحديد expressing مقابل الخلايا غير التعبير عن وهذا يسمح للمجموعة من Wnt8a-HA-EGFP وWnt11b-HA-EGFP يجند نشرها بعيدا عن الخلايا المصدر ليتم تحليلها (الشكل 3B و 3C). نظرا لانحناء لل explants الغطاء الحيواني، وكانت المسافة القصوى التي يمكن قياسها بشكل موثوق به باستخدام هذا الاختبار 160μm، الذي لم يكن كافيا لقياس المسافة المطلقة ليجند نشرها. ومع ذلك، باستخدام مزيج من التحليل متحد البؤر، تحليل الصور والرسوم البيانية والتحليل العلمي للبرمجيات في الشكل العام للمحدثة التخلق التدرج WNT-HA-EGFP يمكن تحليلها (الشكل 3D). هذه البيانات يمكن استخدامها لتحقيق في ما إذا overexpressing بروتين آخر مع بروابط الموسومة في الخلايا نفسها يمكن أن تؤثر على إفراز WNT أو نشرها. في نوع آخر من التجربة (الشكل 3E-3J) آثار منظم المحتملين في تلقي الخلايا يمكن أن يقاس overexpressing البروتين مرشح في استنساخ الخلايا المجاورة للخلايا السابقالضغط Wnt8a أو Wnt11b-HA-EGFP. وهذا يسمح أي آثار غير الخلية-المستقلة للمنظم على WNT-HA-EGFP يجند نشرها ليتم فحصها. بما يتفق مع الشكل 2، يمكن أن يتم الكشف عن المزيد من Wnt8a-HA-EGFP نشرها بعيدا عن خلايا من Wnt11b-HA-EGFP في كلا التجربتين نشرها.

وقد استخدمت أنواع من التجارب وصفها في هذه الورقة إلى تحليل أثر Sulf1 على Shh على وWNT يشير 16،17.

الشكل 1
ويمكن الكشف عن الرقم 1. تعديل التوزيع Shh على-GFP عن طريق تحليل متحد البؤر من القبعات الحيوان القيطم. (A) A الكرتون تصور الفحص التجريبي حيث يتم حقن الأجنة أولا مع مرنا الترميز لSulf1 أو مرنا السيطرة، ونفس الأجنة في وقت لاحق ضخت في المرحلة 32 خلية مع مرنا الترميز لShh على-GFP في خلية واحدة. (BC) الغطاء الحيواني يزدرعأخذت الصورة في مرحلة 8 و تصوير بعد 4 ساعات. وتظهر الصور على حافة استنساخ معربا عن Shh على-GFP + memRFP من الخلايا. في الأجنة مراقبة (B)، وتوزع Shh على-GFP بعيدا عن memRFP ملحوظ استنساخ الخلايا المنتجة للإشارة. في الأجنة معربا عن Sulf1 (C)، Shh على-GFP هو أكثر تقييدا ​​في توزيعه، انظر 16. يظهر memRFP في أرجواني وShh على-GFP باللون الأخضر. تمثل الحانات نطاق 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. التحليل الكمي والكيفي للWnt8a وWnt11b-HA-EGFP نقاط وعلى غشاء الخلية. تم microinjected (AH) الأجنة ثنائية أفقيا مع مرنا ترميز memRFP (500 خريج) في نصف الكرة الحيوانية في مرحلتين الخلية. وبالإضافة إلى ذلك تم حقن الأجنة مع السيد ترميز NA (AD) Wnt8a-HA-EGFP (500 خريج) أو [EH] Wnt11b-HA-EGFP (1NG). تم حقن الأجنة أيضا مع مرنا الترميز لLacZ لتوفير الرقابة على إضافي مرنا / البروتين عند تحليل آثار أي منظم المحتملين. المربعات البيضاء في (C) و (G) علامة المناطق الموسع في لوحات (D) و (H) على التوالي. تم احتساب المبلغ الإجمالي WNT-HA-EGFP مضان شارك توطين مع غشاء الخلية باستخدام الصور وبرامج التحليل النصي ثم تطبيع (I). تم استخراج المعلومات النوعية باستخدام برمجيات تحليل الصور. وقد تم تحليل Wnt8a وWnt11b-HA-EGFP punctae لعدد الجسيمات (J)، وحجم الجسيمات (K) ودائرية الجسيمات (L). مان ويتني U (** P <0.01)، N = عدد من الأجنة. يظهر memRFP في أرجواني، ويظهر Wnt8a / 11B-HA-GFP باللون الأخضر والحانات على نطاق وتمثل 20μm.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. قياس مدى انتشار الموسومة fluorescently بروابط WNT. (A) رسم بياني يصور الفحص المستخدمة لقياس Wnt8a وWnt11b-HA-EGFP إفراز ونشرها بعيدا عن الخلايا معربا. (BC) ترميز مرنا (B) memCerulean (600 خريج)، LacZ (4ng) وWnt8a-HA-EGFP (2ng) أو (C) memCerulean (600 خريج)، LacZ (4ng) وWnt11b-HA-EGFP (2 نانوغرام ) تم حقنها في نصف الكرة الحيوانية من قسيم أرومي واحدة في مرحلة أربع خلايا. (D) مجموعة من نشر Wnt8a-HA-EGFP وWnt11b-HA-EGFP تم قياسها من خلال خلفية السيطرة. (E) رسم بياني يصور فحص استخدام لقياس Wnt8a وWnt11b-HA-EGFP نشرها من خلال خلفية التعبير عن LacZ، انظر طريقة لديت تعانيه. (FG) مرنا ترميز memCerulean (600 خريج) و (F و H) Wnt8a-HA-EGFP (2 نانوغرام) أو (G) وانا تم حقن Wnt11b-HA-EGFP في نصف الكرة الحيوانية من قسيم أرومي واحد في أربعة مرحلة الخلية. تم حقن لقسيم أرومي المجاور مع مرنا ترميز memRFP (600 خريج) وLacZ (4 نانوغرام) انظر مفتاح لمزيد من التفاصيل. (J) مجموعة من Wnt8a-HA-EGFP وWnt11b-HA-EGFP نشر وقياسها من خلال خلفية التعبير عن LacZ. وكان كميا البيانات ورسم باستخدام تحليل متحد البؤر، تحليل الصور والتحليل العلمي والبرمجيات الرسوم البيانية. memCerulean (الأزرق (CD) والأصفر (F و H))، WNT-HA-EGFP (الأخضر)، memRFP (أرجواني) والحانات على نطاق وتمثل 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لتحميل نسخة أكبر من هذا الملف.

الملفات / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg "/>

الجدول 1. الاشعال المستخدمة لsubclone Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP وShh على-GFP إلى pCS2.

رد فعل مكونات
مثال CS2 + ملخص 1.5 ميكروغرام من pCS2 +
2 ميكرولتر من تقييد انزيم 1
2 ميكرولتر من تقييد انزيم 2
5 ميكرولتر من العازلة انزيم تقييد (10X)
تتكون ل50 ميكرولتر بالماء الصف الجزيئي
مثال مرنا التوليف 2 ميكرولتر قالب linearised
2 ميكرولتر 10X Megascript TRX مزيج
2 ميكرولتر 50MM ATP
2 ميكرولتر 50MM CTP
2 ميكرولتر 50MM UTP
2 ميكرولتر 5MM GTP
2.5 ميكرولتر 40MM كاب النظير (m7G (5 ')
2 ميكرولتر مزيج انزيم SP6
3.5 ميكرولتر المياه الصف الجزيئية
رد فعل سبيل المثال PCR 0.5 ميكرولتر البلمرة DNA عالية الدقة (2000 وحدة / مل)
DNA قالب 2 نانوغرام
2.5 ميكرولتر من الأمام وعكس الاشعال (10μM)
0.5ميكرولتر من dNTPs
5 ميكرولتر من العازلة ploymerase DNA (10X)
تتكون ل50 ميكرولتر بالماء الصف الجزيئي
شروط سبيل المثال PCR Intial تمسخ 2 دقيقة في 98 ° C
15 ثانية 98 درجة مئوية
15 ثانية 65 درجة مئوية 30 دورات
40 ثانية 72 درجة مئوية
النهائي تمديد مدة 10 دقيقة في 72 ° C
مثال PCR المنتج ملخص 28 ميكرولتر من الناتج PCR
2 ميكرولتر من تقييد هnzyme 1
2 ميكرولتر من تقييد انزيم 2
5 ميكرولتر من العازلة انزيم تقييد (10X)
13 ميكرولتر الماء الصف الجزيئية
مثال T4 ربط 1 ميكرولتر قص CS2 +
3 ميكرولتر قص PCR المنتج 1
3 ميكرولتر قص PCR المنتج 2
1 ميكرولتر من T4 DNA يغاز
1 ميكرولتر T4 DNA يغاز العازلة (10X)
1 ميكرولتر المياه الصف الجزيئية
قالب المثال هضم 5 ميكروغرام البلازميد DNA
10 ميكرولتر العازلة انزيم تقييد (10X)
3 ميكرولتر Not1 (باستثناء Shh على-GFP، ويستخدم Kpn1)
صنع ما يصل إلى 100 ميكرولتر مع الماء الصف الجزيئية

الجدول 2. مثال ظروف التفاعل تستخدم لsubcloning وإنتاج مرنا الاصطناعية لWnt8a-HA-EGFP.

<td>
حل مكونات
السيستين-HCL 0.1X حركة عدم الانحياز
2.5٪-L السيستين هيدروكلوريد مونوهيدرات (pH7.8)
أملاح حركة عدم الانحياز 110 ملي كلوريد الصوديوم
2 مم بوكل
1 ملم CA (NO3) 2
0.1 ملي EDTA
NAM / 2 أملاح 0.5X حركة عدم الانحياز
5 ملي HEPES pH7.4
0.25 ملي بيكربونات
25 ميكروغرام / مل الجنتاميسين
NAM / 3 + Ficoll أملاح 0.33X حركة عدم الانحياز
5 ملي HEPES pH7.4
0.25 ملي بيكربونات
2 5ug / مل الجنتاميسين
5٪ Ficoll
NAM / 10 أملاح 0.1X حركة عدم الانحياز
5 ملي HEPES pH7.4
25 ميكروغرام / مل الجنتاميسين

الجدول 3. حلول استخدمت أثناء إنتاج وMicroinjection من كرهالقيح المورق الأجنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

جزء أساسي من هذا البروتوكول هو توليد بروابط نشطة بيولوجيا والتي تتم معالجتها عادة، يفرز، وقادرة على استثارة رد فعل في الخلية المستقبلة، على الرغم من وجود شاردة الفلورسنت المرفقة. فمن الأهمية بمكان لإثبات أن المنتج الجينات fluorescently الموسومة نشطة بيولوجيا باستخدام الفحص المناسب. لShh على-GFP، تم تأكيد القدرة على تفعيل التعبير عن ptc1 16. Wnt8a لديه قدرة قوية بشكل ملحوظ للحث على المحور الثانوي عندما أعرب في واحد بطني قسيم أرومي 20-21، وتبين Wnt8a-HA-EGFP الإبقاء على هذا النشاط البيولوجي. Wnt11b يمنع activin تعامل إإكسبلنتس الأدمة من تمر متقاربة التمديد 21-22، ويحتفظ Wnt11b-HA-EGFP أيضا نشاطها البيولوجي 17. قدرة بروابط الموسومة الحصول على ردود تعادل البروتينات لازال تشير إلى أن استنتاجات مبنية على تجارب باستخدام بروابط الفلورسنت وبالبريد ذات الصلة بروتين طبيعي. إضافة حاتمة HA بين يجند وببروتين قدمت المنطقة هل يسمح للWNT يبني على حد سواء نشطة والفلورسنت.

القيد الرئيسي لهذا النوع من التحليل هو أنه لا إعلام مباشرة على التدرجات محدثة التخلق الداخلية. على سبيل المثال، نشر Shh على عبر الحقل من الخلايا في الغطاء الحيواني قد لا تعكس طريقة التحركات SHH الذاتية من خلال الظهارة العصبية عمودية في الجنين. ومع ذلك، بساطة هذا البروتوكول يسمح التجارب حيث تأثير منظمات خارجية على توزيع بروابط يمكن اختبارها. النتائج من هذه الطرق يمكن أن تشكل أساس الفرضيات التي سيتم اختبارها باستخدام أكثر تطلبا في يحلل الجسم الحي. على سبيل المثال، وقدرة على-أعرب Sulf1 لتقييد توزيع Shh على-GFP باستخدام الأساليب المذكورة في هذه الورقة أشارت إلى إمكانية Sulf1 في تحوير محدثة التخلق غراد Shh علىient. تم اختبار هذا مباشرة والتحقق من صحتها باستخدام العقاقير morpholino تدق إلى أسفل من Sulf1 ومناعية لتصور الذاتية Shh على في الأنبوب العصبي 16. وهناك طريقة مماثلة لبلدنا استخدمت لتحقيق آليات محددة يمكن أن يجند تنظيم نشرها. تظاهر سميث وزملاؤه أن GFP الموسومة العقدي (Xnr2) تستخدم الانتشار البسيط، وليس بخلية ملحقات (cytonemes) أو transcytosis (باستخدام الحويصلات) لتشكيل التدرج 23.

تفصيل هذه الطرق ممكنة حيث البروتينات الأخرى التي تمنع مسارات معينة يمكن التعبير عنها في الخلايا المستهدفة للتحقيق في ما إذا كانت هناك حاجة إلى الرد على جزيء إشارة كوسيط لنقل الإشارات من خلية واحدة إلى أخرى. على سبيل المثال، معربا عن السائد مستقبلات activin سلبي بين مصدر activin وخلايا الاستجابة أظهرت أن نشر يجند بسيط يمكن أن يثير رد فعل عدة أقطار الخلية بعيدا عن مصدر هفين مع الخلايا غير متجاوبة في الفترة ما بين 24. ويدعم هذا الاستنتاج العمل في الزرد حيث خلايا النوع البري يمكن أن تستجيب لمصدر العقدي، على الرغم من كونها محاطة خلايا متحولة عدم استجابة تفتقر إلى المشاركة في مستقبلات ضروري لالعقدي 25. وقد استخدمت دراسات أخرى الزرد للتحقيق نشر بروابط الموسومة fluorescently 28،29. وقد لاحظ بعض الدراسات أن حاتمة وضع علامات على C-محطة من البروتينات WNT يمكن أن تؤثر على النشاط يشير، ربما بسبب cysteines الحفظ جدا التي تساهم في البروتين التشكل. وقد أظهرت عملنا السابقة التي بما في ذلك فاصل (مثل العلامة HA) يؤدي إلى بروابط WNT الموسومة التي تنشط بيولوجيا 17. وهذا هو المرجح لأن هل يوفر المرونة اللازمة للتفاعل يجند -receptor، كما هو الحال في نموذج الإبهام السبابة من WNT-FRZ ملزمة 30.

الخطوة التالية للنهوض دراستنا لتشمل فيسالسياقية قراءات لتفعيل مسار الإشارات. على سبيل المثال، معربا عن DVL 26 في الخلايا البعيدة عن مصدر يجند سيسمح للمجموعة التي عبر Wnt11b ديه القدرة للإشارة إلى الموسومة GFP إلى أن تقاس. ويمكن أن يتبين مدى Wnt8a النشاط الإشارات باستخدام تلوين الأجسام المضادة لقياس التوطين النووي ب-catenin في خلايا 27 على مسافة من المصدر. هذه الأنواع من التجارب ممكنة باستخدام الأساليب المذكورة في هذه الورقة. من خلال توظيف مجموعة متنوعة من البروتينات أو fluorophores الفلورسنت مختلفة، سيتم تقديم مستوى إضافي من المعلومات واحد حيث يقيس ليس فقط توزيع ليجند ولكن أيضا إخراج مسارات الإشارات، وبهذه الطريقة تحديد نطاق عتبة محدثة التخلق .

القيطم المورق هو نموذجا مفيدا لتصور بروابط الموسومة GFP ومزيد من التفاصيل عن طرق لشراء الأجنة، والتوليف مرنا، microinjection وتشريحتتوفر 31 أيون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وقد تم تمويل من قبل BBSRC هذا العمل منحة الهندسة الكهربائية والميكانيكية (BB / H010297 / 1)، حصة studentship BBSRC ريال، وstudentship MRC إلى SWF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles homemade
Zen lite software Carl Zeiss Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134, (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154, (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15, (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12, (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22, (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5, (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24, (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135, (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398, (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24, (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320, (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120, (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135, (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391, (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128, (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111, (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15, (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127, (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14, (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7, (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411, (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146, (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129, (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics