Confocal विश्लेषण का उपयोग करना

Developmental Biology

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Summary

पांडुलिपि यहाँ Xenopus में fluorescently टैग ligands के स्राव और प्रसार का विश्लेषण करने के लिए तरीके का एक सरल सेट प्रदान करता है। इस ligand वितरण को संशोधित करने के लिए अन्य प्रोटीन की क्षमता का परीक्षण और morphogen ढ़ाल के विनियमन तंत्र में जानकारी दे सकता है कि प्रयोगों की अनुमति के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।

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Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O'Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं की एक क्षेत्र भर में वितरित ligands कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन है। एक साथ जल्दी भ्रूण में उनकी कोशिकाओं के बड़े आकार के साथ, बहिर्जात प्रोटीन व्यक्त करने में आसानी, Xenopus GFP टैग ligands दृश्यमान करने के लिए एक उपयोगी मॉडल laevis बनाते हैं। सिंथेटिक mRNAs कुशलता से प्रारंभिक चरण Xenopus भ्रूण में इंजेक्शन के बाद अनुवाद कर रहे हैं, और इंजेक्शन के लिए एक एकल कोशिका को निशाना बनाया जा सकता है। ऐसी झिल्ली सीमित आरएफपी के रूप में एक वंश दरियाफ्त के साथ संयुक्त, overexpressed प्रोटीन पैदा कर रहे हैं कि इंजेक्शन सेल (और उसके वंश) आसानी से पीछा किया जा सकता। इस प्रोटोकॉल के उत्पादन के लिए एक विधि के fluorescently इंजेक्ट mRNA से Wnt और श्श्श ligands टैग किया वर्णन करता है। तरीकों मील शामिलबहिर्जनस्तरीय explants (पशु टोपी) और कई नमूने में ligand प्रसार के विश्लेषण के सीआरओ विच्छेदन। Confocal इमेजिंग का उपयोग करके, कोशिकाओं की एक क्षेत्र से अधिक ligand के स्राव और प्रसार के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सकती है। Confocal छवियों के सांख्यिकीय विश्लेषण ligand ढ़ाल के आकार पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करते हैं। इन विधियों morphogen ढ़ाल के आकार को नियंत्रित कर सकते हैं कि कारकों के प्रभाव का परीक्षण करना चाहते हैं, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है।

Introduction

जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान कोशिकाओं उत्तरोत्तर भेदभाव की विशिष्ट प्रजातियों का पालन करने के लिए प्रतिबद्ध हैं: इस totipotent (या pluripotent) एक प्रकार की कोशिका को जन्म देने के लिए चुना गया पूर्वज कोशिकाओं की आबादी की स्थापना के लिए धीरे-धीरे ही सीमित हो जाते हैं कोशिकाओं का एक समूह होता है। सेल सेल संकेतन भ्रूण के विकास के दौरान वंश विनिर्देश के नियमन के लिए केंद्रीय है। इन संकेतों के हेरफेर उपन्यास चिकित्सा उपचार का समर्थन करने के लिए विशेष रूप से भाग्य की ओर स्टेम कोशिकाओं को निर्देशित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।

रास्ते संकेतन की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या TGF superfamily (nodals और BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnts 4, और hedgehogs 5 का जवाब रास्ते सहित विकास के दौरान इस बात को दोहराया जाता है। ये स्रावित प्रोटीन जिससे जीन अभिव्यक्ति और / या सेल व्यवहार में फेरबदल संकेत पारगमन को सक्रिय करने की कोशिका झिल्ली पर उपस्थित रिसेप्टर्स बाँध। सेल साइन की तंग विनियमनAlling सेल वंश विनिर्देश और सामान्य विकास के लिए आवश्यक है। इन रास्ते के बीच परस्पर बात सेल भाग्य का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, एक भी ligand खुद को अलग सांद्रता में अलग प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना कर सकते हैं। Morphogen ढ़ाल प्रकार की कोशिकाओं कोशिकाओं 6 के एक क्षेत्र से प्राप्त कर सकते हैं कि किस तरह अलग समझाने के लिए एक सिद्धांत के रूप में 100 से अधिक साल पहले वर्णित किया गया। कोशिकाओं के एक समूह द्वारा उत्पादित अणुओं सिग्नलिंग स्रोत से अधिक दूरी के साथ एकाग्रता में कमी, एक निश्चित सीमा से अधिक फैलाना सकता है। संकेत करने के लिए संपर्क में कोशिकाओं अलग पदों पर कोशिकाओं संकेत के विभिन्न स्तरों के लिए अलग जवाब के साथ कोशिकाओं के क्षेत्र में अपनी स्थिति पर स्थानीय एकाग्रता का जवाब देंगे। Morphogens के अस्तित्व के लिए साक्ष्य जल्दी ड्रोसोफिला भ्रूण 7 और पंख डिस्क 8, साथ ही कशेरुकी अंग 9 और न्यूरल ट्यूब 10 के अध्ययन से आता है।

के तरीके में करने की जरूरत हैस्थापित कर रहे हैं कि कैसे morphogen ढ़ाल vestigate और इन ढ़ाल को विनियमित करने में महत्वपूर्ण अन्य अणुओं की पहचान करने के लिए। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संदर्भ में इन विवो में अंतर्जात प्रोटीन कल्पना करने immunohistochemistry का उपयोग सुरुचिपूर्ण प्रयोगों morphogen ढ़ाल 11-12 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लेकिन, अच्छी एंटीबॉडी और विशिष्ट म्यूटेंट हमेशा उपलब्ध नहीं हैं, इसलिए हम एक वैकल्पिक, exogenous जीन उत्पादों की कोशिकाओं के एक क्षेत्र भर में ligands के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे काटना करने के लिए सरल तरीका प्रदान करने के लिए, Xenopus में फ्लोरोसेंट ligands की overexpression प्रयोग कर के एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। Xenopus laevis वे शुरुआती दौर में पहुंच रहे हैं तो उनके भ्रूण बाह्य विकास के रूप में प्रयोगों के इन प्रकार के कार्य करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है। वे (अभी भी लगभग 20 अपेक्षाकृत बड़े हैं के रूप में अपने बड़े आकार (व्यास में 1-1.5mm) microinjection और शल्य चिकित्सा हेरफेर को सरल और ब्लासटुला चरणों द्वारा कोशिकाओं की छवि के लिए आसान कर रहे हैं81;) भर में हूँ। Xenopus में overexpression पढ़ाई करने के लिए सरल कर रहे हैं: जल्दी भ्रूण में इंजेक्ट mRNA के विशेष कोशिकाओं को निशाना बनाया जा सकता है और कुशलता से अनुवाद किया है।

fluorescently टैग किया Wnt8a / Wnt11b-हा-EGFP निर्माणों pCS2 Wnt8a हा 13, pCS2 Wnt11b हा 14 और EGFP का उपयोग कर उत्पन्न किया गया। हा पेप्टाइड यह जीन उत्पादों दोनों कार्य करने की अनुमति Wnt और EGFP प्रोटीन को अलग करने के लिए एक स्पेसर के रूप में कार्य करने के लिए सोचा है, क्योंकि एक अतिरिक्त आणविक टैग प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी करने के लिए ही नहीं है, को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। श्श्श के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है का निर्माण पहले से एक श्श्श-EGFP संलयन प्रोटीन 15 व्यक्त एक ट्रांसजेनिक माउस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; इस कृपया एंडी मैकमोहन द्वारा प्रदान किया गया। महत्वपूर्ण बात है, सभी निर्माणों के लिए GFP टैग यह प्रसंस्करण के बाद बनाए रखा है कि इस तरह के संकेत अनुक्रम करने के लिए '3 क्लोन है। यह अंतिम प्रोटीन संशोधन के लिए आवश्यक दृश्यों, ऐसे additio भी शामिल है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी जरूरी हैके रूप में लिपिड के एन सिंथेटिक mRNA का prodution के लिए अनुकूलित है जो pCS2 + अभिव्यक्ति वेक्टर में subcloned थे श्श्श और Wnt ligands.The cDNAs के लिए मामला है; यह एक SP6 प्रमोटर और polyadenylation संकेत (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors) भी शामिल है।

यहाँ वर्णित काम स्राव और fluorescently के प्रसार की तुलना के लिए एक सरल प्रोटोकॉल Wnt और श्श्श ligands टैग किया टैग किया है। सिंथेटिक mRNA का परिभाषित मात्रा में इंजेक्शन के द्वारा, प्रोटोकॉल अलग प्रमोटरों का उपयोग कर विभिन्न वैक्टर से चर अभिव्यक्ति के साथ जुड़े किसी भी समस्याओं circumnavigates। इन तरीकों में हाल ही में श्श्श-EGFP और Wnt8a / Xenopus 16-17 में Wnt11b-हा-EGFP स्राव और प्रसार पर heparan सल्फेट endosulfatase Sulf1 के प्रभाव की जांच करने के लिए लागू किया गया है।

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Protocol

आचार बयान: पशु प्रयोगों एमईपी को एक ब्रिटेन के गृह मंत्रालय लाइसेंस के तहत किया गया था और बाहर ले गए प्रयोगों आने के अनुपालन में विश्वविद्यालय न्यूयॉर्क की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था: दिशानिर्देशों (पशु अनुसंधान vivo प्रयोगों की रिपोर्टिंग)। (Https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines)।

Fluorescently गईं ligands उत्पन्न करने के लिए 1. रणनीति

नीचे फ्रेम संलयन में Wnta-हा-EGFP निर्माण निर्माण करने के क्रम में, pCS2 में Wnt8a-हा और EGFP subcloning के लिए एक उदाहरण प्रोटोकॉल है:

  1. Wnt8a-हा और EGFP के लिए स्थापित करने और चलाने पीसीआर प्रतिक्रियाओं। तालिका 2 नोट में प्रदर्शित Table1 और उदाहरण पीसीआर प्रतिक्रिया और उदाहरण पीसीआर की स्थिति में दिखाया प्राइमर जानकारी का उपयोग करें: खाका डीएनए का निर्माण के आधार पर इस उदाहरण में, Wnt8a हा टेम्पलेट डीएनए के रूप में प्रयोग किया जाता है, का उत्पादन किया जा रहा है अलग अलग होंगे।
  2. एक जेल निकालना किट का उपयोग पीसीआर प्रतिक्रियाओं को साफ 3 में अंतिम क्षालन प्रदर्शनआणविक ग्रेड पानी की 0μl।
  3. TAE में तैयार एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 2 μl की जाँच करें।
  4. उचित प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर डाइजेस्ट Wnt8a-हा और EGFP पीसीआर उत्पादों और pCS2 तालिका 2 (उदाहरण पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट) में वर्णित के रूप में प्रतिक्रियाओं सेट, (1 टेबल देखें)।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं सेते हैं और फिर बर्फ पर Wnt8a हा और GFP पीसीआर उत्पादों की दुकान।
  6. PCS2 डाइजेस्ट करने के लिए बछड़ा क्षारीय आंतों फॉस्फेट (CAIP) की 1μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. गर्मी 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए incubating द्वारा CAIP निष्क्रिय।
  8. भागो pCS2 और पीसीआर TAE में तैयार एक 1% ultrapure agarose जेल पर हज़म।
  9. जेल निकालने और एक जेल निकालना किट का उपयोग कर pCS2 और पीसीआर उत्पादों को साफ, आणविक ग्रेड पानी की 30μl में अंतिम क्षालन प्रदर्शन करते हैं।
  10. तालिका 2 (उदाहरण टी -4 बंधाव) में वर्णित है और 16 घंटे के लिए 12 डिग्री सेल्सियस पर सेते रूप बंधाव सेट करें।

2. mRNA संश्लेषण: टी सृजनemplate

  1. झिल्ली-आसमानी (memCerulean), झिल्ली आरएफपी (memRFP), श्श्श GFP, Wnt8a / Wnt11b-हा-EGFP: निम्नलिखित plasmids के प्रतिबंध एंजाइम पाचन (अभिव्यक्ति वेक्टर pCS2 में सब) का उपयोग टेम्पलेट्स निर्माण।
    1. (उदाहरण टेम्पलेट पचाने) तालिका 2 में वर्णित के रूप में स्थापित प्रतिबंध हज़म।
    2. धीरे मिक्स और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
  2. प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए कटौती की है कि जांच करने के लिए एक 1% agarose जेल (TAE) पर पचा प्लाज्मिड के 2.5 μl चलाएँ।
  3. एक जेल निकालना किट का उपयोग हज़म को साफ, आणविक ग्रेड पानी के 50 μl में अंतिम क्षालन प्रदर्शन करते हैं।

3. mRNA संश्लेषण: इन विट्रो प्रतिलेखन में

  1. SP6 mRNA प्रतिलेखन किट का उपयोग कर कार्यात्मक mRNA synthesize। 1.5 मिलीलीटर DNase / RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूबों में प्रतिक्रियाओं इकट्ठे।
  2. तालिका 2 (उदाहरण mRNA संश्लेषण) में वर्णित के रूप में mRNA प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं सेट।
  3. मिश्रणप्रतिक्रियाओं धीरे एक विंदुक के साथ और फिर 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. एक 2% agarose जेल (TAE) पर प्रतिक्रिया के 1 μl की जाँच करें।
  5. प्रतिक्रिया के लिए DNase की 1 μl जोड़ें एक P20 के साथ धीरे मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं।
  6. आणविक ग्रेड पानी के 340 μl, अमोनियम एसीटेट के 40 μl और प्रतिक्रिया के लिए फिनोल के क्लोरोफॉर्म के 400 μl जोड़ें। 30 सेकंड के लिए प्रतिक्रियाओं भंवर।
  7. 5 मिनट, 14,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए mRNA स्पिन।
  8. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर यह चलती प्रत्येक प्रतिक्रिया से शीर्ष (जलीय) परत पिपेट टोपी microcentrifuge ट्यूब पेंच।
  9. निथर प्रतिक्रियाओं से प्रत्येक के लिए क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा में जोड़ें। 30 सेकंड के लिए नमूने भंवर।
  10. 5 मिनट, 14,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए mRNA स्पिन
  11. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर पेंच टोपी microcentrifuge ट्यूब यह चलती प्रत्येक प्रतिक्रिया से शीर्ष जलीय परत पिपेट।
  12. प्रतिक्रियाओं से प्रत्येक के लिए isopropanol के एक बराबर मात्रा जोड़ने और श्री वेगएनए 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।
  13. MRNA गोली, 14,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं का प्रत्येक स्पिन
  14. Pelleted mRNA के परेशान करने के लिए नहीं सतह पर तैरनेवाला ख्याल रख रही हटाये
  15. प्रतिक्रियाओं से प्रत्येक के लिए 70% इथेनॉल के 200 μl जोड़ें प्रतिक्रियाओं मिश्रण है और फिर 14,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए स्पिन।
  16. , MRNA परेशान एक निर्वात desiccator या गति-VAC का उपयोग कर कमरे के तापमान पर गोली सुखाने के लिए नहीं इथेनॉल ख्याल रख रही निकालें।
  17. आणविक ग्रेड पानी की 10-20 μl में mRNA फिर से निलंबित। संक्षेप में स्पिन और बर्फ पर नमूने रखें। नोट: 1 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना हीटिंग इसे भंग कर सकते हैं।
  18. एक 2% agarose जेल (TAE) पर mRNA के 1μl चलाने के लिए और एकाग्रता का सही readout पाने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 1.2 μl का विश्लेषण।
    महत्वपूर्ण कदम: सिंथेटिक mRNA के 400 एनजी / μl के एक एकाग्रता निम्नलिखित प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए आवश्यक है।

    महत्वपूर्ण कदम: 260/280 अनुपात है2.00-2.20 की सीमा, या mRNA की कुल राशि के बाहर एक लिथियम क्लोराइड तेज़ी से बाहर ले जाने के लिए, 12 ग्राम से अधिक है।
  19. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 μl aliquots में स्टोर mRNA। Aliquots का उपयोग करें और फिर दूर फेंक; mRNA जमाना फिर से नहीं है।

4. जनरेटिंग Xenopus laevis भ्रूण

  1. (; Chorulon एचसीजी) प्रयोग से पहले एक सप्ताह प्रधानमंत्री Xenopus मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन हार्मोन की 50 इकाइयों के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा महिलाओं laevis।
  2. Xenopus एचसीजी की 250 इकाइयों इंजेक्शन लगाने और 19 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे हे / एन में उन्हें incubating द्वारा प्रयोग से पहले रात महिलाओं laevis प्रेरित।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1xNAM में euthanised नर मेंढक और दुकान से वृषण काटना। नोट: नर मेंढक पशु की अनुसूची 1 के अनुसार टर्मिनल संज्ञाहरण द्वारा euthanised है (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia)।
  4. मालिश महिला Xenopus ला जमा है, ovulation के लिए प्रेरित करने के laevisएक 55 मिमी व्यास दौर पेट्री डिश में आईडी अंडे।
  5. Deionised पानी के 1 मिलीलीटर में एक Xenopus laevis वृषण की ¼ कुचल द्वारा एक शुक्राणु निलंबन का उत्पादन।
  6. ब्रश Xenopus एक पाश्चर विंदुक और पिपेट बल्ब का उपयोग कर कुचल शुक्राणु निलंबन के साथ oocytes महत्वपूर्ण कदम:। प्रयोग के दिन पर लगभग 4:30 पर निषेचन प्रतिक्रियाओं को पूरा करें।
  7. गुटनिरपेक्ष आंदोलन / 10 में 21 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति भ्रूण पानी (पानी) में पतला 1% agarose के साथ लेपित 55 मिमी पेट्री डिश में (समाधान के लिए 3 टेबल देखें)।
  8. सिस्टीन / एचसीएल (3 टेबल) का उपयोग कर 45 मिनट के बाद डी-जेली भ्रूण। नोट: 21 डिग्री सेल्सियस, भ्रूण 90 मिनट के बाद 2 सेल चरण तक पहुंच जाएगा और उसके बाद हर 20 मिनट फोड़ना।

5. Microinjecting Xenopus भ्रूण

  1. 1 x 90mm गिलास केशिकाओं और एक Narishige पीसी -10 दोहरे स्तर कांच micropipette खींचने का उपयोग करना, इंजेक्शन के लिए micropipettes खींच। एक अच्छी टिप को प्राप्त करने के अनुभव से सेटिंग्स समायोजित (कम से कम एक माइक्रोन diameआतंकवाद)।
  2. (उदाहरण के लिए, हार्वर्ड Appartaus पीएलआई 100 पिको-सुई लगानेवाला) बार-बार समय की एक डिजिटल रूप में निर्धारित अवधि के लिए एक विनियमित दबाव लागू करने से तरल की सटीक मात्रा में वितरित करने के लिए एक गैस microinjector करने के लिए एक micropipette (सुई) संलग्न। एक लजीला व्यक्ति या अंशांकन स्लाइड का उपयोग कर के रूप में निर्धारित 1.25-10 nanolitres की मात्रा देने के लिए साँस का दबाव समायोजित करें।
  3. कोट 1% agarose (पानी) के 5 मिलीलीटर के साथ एक 55 मिमी पेट्री डिश। डिश के बाहर agarose की एक 35-35 मिमी स्क्वायर कट, इस भ्रूण microinject करने के लिए एक स्थिर सतह प्रदान करेगा।
  4. गुटनिरपेक्ष आंदोलन में स्थानांतरण भ्रूण / 3 + Ficoll (3 टेबल) और इंजेक्शन पकवान के लिए कदम।
  5. वे प्रयोग के लिए आवश्यक चरण तक पहुंचने के लिए एक बार पशु गोलार्द्ध में भ्रूण इंजेक्षन।
    1. , कोशिका की सतह पर GFP टैग किया ligands के वितरण का विश्लेषण सेल प्रति दो सेल मंच, 10nl में द्वि-laterally भ्रूण इंजेक्षन। Wnt8a-हा-EGFP के लिए नीचे दिखाए गए उदाहरण mRNA dilutions। महत्वपूर्ण कदम: सभी mRNA सेंट सांद्रता सुनिश्चित करें कि400 एनजी / μl में कला।
      नोट: mRNA की राशि इंजेक्शन जा सांद्रता का परीक्षण और फ्लोरोसेंट ligand कल्पना करने के लिए आवश्यक न्यूनतम राशि खोजने के द्वारा अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। एक विरोधी हा एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता mRNAs दो अलग fluorescently टैग किया ligands की तुलना अनुमति देने के क्रम में समान स्तर के लिए अनुवाद कर रहे हैं कि यह निर्धारित करने के लिए एक आवश्यक कदम है; हम Fellgett एट अल।, 2015 में Wnt8a-हा-EGFP और Wnt11b-हा-EGFP के लिए यह किया है।
      नोट: (एक उम्मीदवार नियामक के लिए इस तरह के रूप में एक कोडिंग) एक इंजेक्शन mRNA के प्रभाव का आकलन करते हैं, एक ठेठ नियंत्रण अतिरिक्त के किसी भी प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के क्रम में भाई भ्रूण में, इस तरह के lacZ के रूप में एक गैर सक्रिय शाही सेना, इंजेक्षन है भ्रूण में टेप।
      1. 100 एनजी / μl करने के लिए एकाग्रता कम करने के लिए आणविक ग्रेड पानी के साथ 4 (1μl + 3μl DH 2 ओ) में memRFP mRNA के एक पतला।
      2. 4 (1μl + 3μl DH में Wnt8a-हा-EGFP mRNA के एक पतलाआणविक ग्रेड पानी के साथ 2 ओ) 100 एनजी / μl करने के लिए एकाग्रता कम करने के लिए।
      3. Wnt8a-हा-EGFP mRNA के साथ: 1 के अनुपात में एक 1 में memRFP mRNA मिलाएं।
      4. नियंत्रण mRNA lacZ या ऐसे Sulf1 के रूप में एक न्यूनाधिक के साथ या तो: 1 के अनुपात में एक 1 में 5.5.1.3 से mRNA मिलाएं।
      5. सेल प्रति mRNA का 10nl (20nl की कुल) के साथ 2 सेल स्तर पर द्विपक्षीय रूप से भ्रूण इंजेक्षन। नोट: यह मीटर उन्हें आरएफपी के 250 पीजी, Wnt8a-हा GFP के 250 पीजी, प्रत्येक कोशिका में इंजेक्शन जा रहा GFP और lacZ या Sulf1 mRNA के 2 एनजी Wnt11b-हा की 500 पीजी में यह परिणाम है।
    2. GFP के प्रसार ligands टैग किया विश्लेषण करने के लिए, mRNA, 16-32 सेल स्तर पर इस तरह के memRFP के रूप में एक वंश मार्कर के साथ मिलकर ligand-GFP के लिए सेल प्रति 1.25 nl कोडिंग इंजेक्षन।
    3. Ligand के प्रसार के किसी भी संभावित न्यूनाधिक के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, mRNA ligand और वंश अनुरेखक के साथ एक साथ न्यूनाधिक के लिए कोडिंग सह इंजेक्षन। वैकल्पिक रूप से, पड़ोसी कोशिकाओं इंजेक्षन: GFP टैग ligan के लिए कोडिंग mRNAs के साथ एकडी और एक वंश दरियाफ्त (memRFP) और न्यूनाधिक और एक अलग वंश दरियाफ्त (memCerulean) के लिए कोडिंग mRNAs के साथ अन्य।
  6. अगले दिन जब तक एक 12.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और संस्कृति के लिए स्थानांतरण भ्रूण Nieuwkoop और फैबर (एनएफ) चरण 8।

6. excising पशु कैप Explants

  1. 1% agarose (पानी) के 5 मिलीलीटर के साथ लेपित एक 55 मिमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण भ्रूण। गुटनिरपेक्ष आंदोलन / 2 (3 टेबल) के साथ पकवान भरें।
  2. महत्वपूर्ण कदम टंगस्टन सुइयों का उपयोग परिपत्र पशु टोपियां लें: इन बेहतर चंगा और छवि के लिए आसान हो जाएगा के रूप में इस स्तर पर बड़ी टोपी ले लो, कोई अभिसरण विस्तार होता है सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण टोपियां रखना।
  3. 4 घंटे के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर 55 मिमी के लिए 1% agarose (जल) और संस्कृति भ्रूण के साथ लेपित पेट्री डिश पशु explants स्थानांतरण महत्वपूर्ण कदम:। 4 घंटा ऊष्मायन फ्लोरोसेंट प्रोटीन परिपक्व करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है।
  4. पीवीसी insulatio की दो परतों के नीचे चिपका द्वारा राहत स्लाइड उत्पन्नखुर्दबीन स्लाइड पर एन टेप। । जानवर टोपियां बढ़ते के लिए एक कक्ष छोड़ने के लिए टेप से बाहर 10 मिमी आयत द्वारा महत्वपूर्ण कदम के लिए एक 14 मिमी कट: आयत काटने से पहले अच्छी तरह से स्लाइड पर टेप के दोनों परतों समतल।
  5. पिपेट राहत स्लाइड में गुटनिरपेक्ष आंदोलन के 2 अलग बूंदों / 2 (3 टेबल), ड्रॉप के अनुसार लगभग 30 μl।
  6. एक काट P20 टिप का उपयोग कर राहत स्लाइड करने के लिए पशु explants स्थानांतरण और शिखर की ओर ऊपर की तरफ का सामना कर रहा है, ताकि बोध। नोट: प्रत्येक स्लाइड 10-15 पशु टोपियां पकड़ कर सकते हैं महत्वपूर्ण कदम:। पशु टोपियां आंशिक रूप से चंगा किया जाना चाहिए था इस स्तर पर, यह है कि वे कम नाजुक होते हैं और संदंश का उपयोग केंद्रित किया जा सकता है।
  7. धीरे राहत स्लाइड पर एक गिलास को कवर पर्ची कम और कवर पर्ची 20 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति महत्वपूर्ण कदम: पशु टोपी के आकार महत्वपूर्ण है;। टोपी गिलास coverslip राहत स्लाइड पर उतारा है जब यह जनसंपर्क करने के लिए पर्याप्त जानवर टोपी कोशिकाओं के शिखर परत compresses कि काफी बड़ा है सुनिश्चितछवि के लिए एक फ्लैट सतह oduce। पशु टोपियां बहुत छोटे हैं तो अभी भी एक परत करने के लिए पीवीसी टेप को कम।
  8. नेल वार्निश का उपयोग स्लाइड सील महत्वपूर्ण कदम:। पीवीसी टेप हो जाता है, तो भी इसे बढ़ाने और स्लाइड को बर्बाद कर देगा नम क्योंकि राहत स्लाइड सील करने के लिए बहुत ज्यादा नेल वार्निश का प्रयोग न करें।
  9. 20 अंधेरे में मिनट और वे छवि के लिए तैयार कर रहे हैं के लिए सूखी राहत स्लाइड, आम तौर पर पशु टोपी एक बार स्लाइड में बंद 4-6 घंटे के लिए स्वस्थ रहेगा।

7. इमेजिंग

नोट: इमेजिंग एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग किया जाता था। इस प्रयोग की जाने वाली हस्ताक्षर ओवरलैपिंग के साथ कई fluorophores की अनुमति दी है, और स्कैन के बीच संभावित नमूना आंदोलन की समस्या को हटा दिया के रूप में लैम्ब्डा मोड इमेजिंग के लिए चुना गया था।

  1. एक कम बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग explants तो उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए 63x / 1.4 तेल उद्देश्य के लिए स्विच का पता लगाएं।
  2. अपेक्षित लेज़रों पर स्विच; इस उदाहरण 405 के लिएलेजर memCerulean उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, 488 लेजर GFP उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और 561 लेजर 405 और 488/561 dichroic दर्पण का उपयोग memRFP उत्तेजित करने के लिए।
  3. (ज़ेन 2011, चुनिंदा लैम्ब्डा मोड में - 32 डिब्बे) का प्रयोग करें लैम्ब्डा मोड।
  4. देखने का एक व्यापक क्षेत्र परमिट (0.6x करने के लिए) छवि बाहर ज़ूम lasers.To 405nm, 488nm और 561nm का चयन करें।
  5. वांछित छवि का आकार (220nm के पिक्सेल आकार के साथ 1024 x 1024 इस डेटा सेट के लिए इस्तेमाल किया गया था) के लिए फ्रेम का आकार निर्धारित करें।
  6. शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ाने के लिए करने के लिए आम तौर पर 4-8 औसत सेट करें।
  7. (इस डेटा सेट के लिए इस्तेमाल किया गया था 561nm लेजर के अनुसार 1 हवादार इकाई) पिनहोल अधिकतम।
  8. महत्वपूर्ण कदम लेजर शक्तियों अनुकूलित करें: सभी fluorophores आवश्यक वोल्टेज और लाभ की राशि को कम करने, whilst 32 डिटेक्टर सरणी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है कि इस तरह 405nm, 488nm और 561nm लेज़रों संतुलन।
  9. MemCerulean, GFP और memRFP से प्रकाश उत्सर्जित किया जा रहा लीजिए। इस काम प्रकाश ~ हर एकत्र किया गया था415-720nm से 10nm, बड़ा संग्रह अंतराल भी संभव हो रहे हैं, हालांकि (जैसे।, हर ~ 20 एनएम)।

8. छवि विश्लेषण

  1. GFP टैग ligands की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति पर माड्युलेटर्स के प्रभाव की जांच
    नोट: निम्न कदम विश्लेषण हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया था कि कैसे एक विस्तृत मार्गदर्शन कर रहे हैं। अंत उपयोगकर्ता पुस्तिका कदम से कुछ को हटाने के लिए एक ImageJ या फिजी स्क्रिप्ट लिख कर इस प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए चाहते हो सकता है।
    महत्वपूर्ण कदम: यह अंत उपयोगकर्ता के नमूने अंतिम प्रयोग अंतिम प्रयोग में इस्तेमाल कई fluorophores के ORM प्रभावी वर्णक्रमीय unmixing perf करने के लिए किया जाता है कि एक ही स्थिति में इस्तेमाल किसी भी fluorophores के स्पेक्ट्रा महत्वपूर्ण है।
    विश्लेषण के दो मुख्य प्रकार इस खंड में प्रदर्शन कर रहे हैं:
    1. कोशिका झिल्ली के साथ Wnt-हा-EGFP पिक्सल सह स्थानीयकरण की कुल संख्या की गणना।
      1. , हरी Unmixज़ेन सॉफ्टवेयर में इन fluorophores के एक इंजेक्शन से जांचा स्पेक्ट्रा का उपयोग कर लाल और आसमानी चैनल। अलग एल एस एम दस्तावेजों निम्नलिखित कदम के सभी में उपयोग करने के रूप में इन छवियों को बचाओ।
      2. ओपन एल एस एम छवि संपादन सॉफ्टवेयर में सीधे फाइल। नोट: निम्न निर्देश फिजी छवि जे के लिए कर रहे हैं
      3. यह स्वचालित रूप से अलग-अलग चैनलों में छवियों को विभाजित होगा, छवि अनुक्रम दस्तावेज के रूप में एल एस एम छवियों को बचाओ।
      4. डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि स्क्रिप्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए स्क्रिप्ट (वास्तविक स्क्रिप्ट के लिए पूरक कोड फ़ाइलों देखें) के रूप में एक ही फ़ोल्डर में छवि अनुक्रम को बचाओ। नोट: निम्न निर्देश matlab के लिए कर रहे हैं।
      5. स्क्रिप्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलो और लिपियों में लिखा जाता है, जिसमें निर्देशिका खुला।
      6. स्थान विश्लेषण के तहत फ़ाइल नाम दर्ज करें, सॉफ्टवेयर फ़ाइल नाम लेने के लिए और विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे।
        नोट: इस फाइल के नाम प्रत्येक भारतीय सैन्य अकादमी के लिए ImageA0000 और ImageA0001 पढ़ा होगाजीई। छवि का उपयोग करेगा स्क्रिप्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर मुखौटा के रूप में 0001 के रूप में चिह्नित और सह स्थानीय बनाना है कि यह मुखौटा के साथ छवि 0000 में पिक्सल के प्रतिशत का विश्लेषण।
      7. (आबादी कोशिका झिल्ली के रूप में एनोटेट) प्रतिशत सह स्थानीयकरण नंबर ले लो और एक स्प्रेडशीट के लिए इस कॉपी। नोट: निम्न निर्देश Excel के लिए कर रहे हैं।
      8. एक निरपेक्ष या रिश्तेदार मूल्य के रूप में या तो एक बार चार्ट पर प्रतिशत सह स्थानीयकरण नंबर प्लॉट।
    2. Wnt-हा-EGFP puncta की संख्या, आकार और आकार का विश्लेषण।
      1. ओपन अमिश्रित एल एस एम छवि संपादन सॉफ्टवेयर में सीधे फाइल। नोट: निम्न निर्देश फिजी छवि जे के लिए कर रहे हैं
      2. अपनी अलग चैनल (छवि> रंग> विभाजित चैनल) में प्रत्येक छवि को विभाजित।
      3. थ्रेसहोल्ड दोनों Wnt-हा-EGFP और झिल्ली मार्कर चैनल (छवि> ऑटो दहलीज> समायोजित) महत्वपूर्ण कदम:। Overexposing बिना, एक एक प्रतिनिधि छवि पैदा करता है जो देखने के लिए थ्रेसहोल्ड की एक नंबर की कोशिशचैनल।
      4. (मुखौटा बनाओ> प्रक्रिया> बाइनरी) एक मुखौटा करने के लिए झिल्ली मार्कर चैनल कन्वर्ट।
      5. यह मुखौटा (संपादित करें> पलटना) उलटें।
      6. ऊपर के रूप में एक मुखौटा करने के लिए Wnt-हा-EGFP puncta कन्वर्ट।
      7. (टॉप बॉक्स, नीचे बॉक्स में झिल्ली नकाब में प्रक्रिया> छवि कैलकुलेटर> Wnt मुखौटा) ligand-GFP नकाब से झिल्ली मार्कर मुखौटा घटाना।
      8. कण समारोह का विश्लेषण का प्रयोग करें। यहाँ से, आवश्यक मापदंडों का चयन करें और डेटा (विश्लेषण> विश्लेषण कण) का विश्लेषण।
      9. एक स्प्रेडशीट में कणों, औसत कण आकार और घेरा डेटा की संख्या को कॉपी और फिर इन आंकड़ों से रेखांकन साजिश है। नोट: इस विश्लेषण के लिए, केवल 0.1-10μm 2 आकार का विश्लेषण किया गया के बीच, कोई प्रतिबंध कण घेरा पर रखा गया था कणों। यह निर्देश Excel के लिए है।
  2. Ligand के प्रसार की सीमा का विश्लेषण
    1. कोंफोकल im में सभी अमिश्रित छवियों खोलोसॉफ्टवेयर उम्र बढ़ने और उसके बाद कच्चे डेटा के रूप में और एक आरजीबी छवि के रूप में, एक TIF स्वरूप में फ़ाइलों को निर्यात नोट:।। यह निर्देश ज़ेन लाइट 2011 के लिए है महत्वपूर्ण कदम: दूरी है कि हो सकता है तो छवियों के कम से कम एक पर एक पैमाने बार शामिल विश्लेषण के दौरान गणना की थी।
    2. खुले छवियों छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में विश्लेषण किया जाना है। नोट:। निम्नलिखित निर्देशों सही छवि की पृष्ठभूमि पर क्लिक करें और एक नई परत बनाने के लिए, 'पृष्ठभूमि से परत' का चयन) फ़ोटोशॉप 8.2.3 के लिए कर रहे हैं।
    3. । केवल ligand-GFP चैनल दृश्यमान (परत> नई समायोजन परत> चैनल मिश्रक) महत्वपूर्ण कदम है, इसलिए है कि 0 पर झिल्ली मार्कर चैनल सेट: विश्लेषण किया जा रहा छवि को नया समायोजन परत क्लिप, विकल्प नई परत क्लिप करने के लिए इस छवि के लिए चैनल मिक्सर विकल्प पर क्लिक करने के बाद एक टिक बॉक्स के रूप में उपलब्ध है।
    4. एक नया कार्यक्षेत्र खोलें। आरजीबी रंग करने के लिए इंच प्रति 300 पिक्सल के संकल्प और रंग मोड (फ़ाइल सेट>नई> क्लिपबोर्ड)।
    5. छवियों के सभी एकल कार्यक्षेत्र में विश्लेषण किया जा रहा कॉपी (छवि पर क्लिक करें और यह तो नियंत्रण और Alt पकड़ और कार्यक्षेत्र में छवि को खींचें नियंत्रण धारण करके चैनल मिक्सर काटा गया है)।
    6. प्रत्येक छवि के लिए प्रसार की अधिकतम लंबाई Wnt-हा-EGFP बाईं ओर केंद्रित व्यक्त कोशिकाओं के साथ क्षैतिज अक्ष के साथ मापा जा सकता है, ताकि छवियों के सभी बोध।
    7. एक TIF के रूप में काम करने की जगह बचाने के लिए और फिर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में यह खुला। नोट: निम्न निर्देश फिजी छवि जे के लिए कर रहे हैं
    8. रॉय के प्रबंधक विंडो (विश्लेषण> उपकरण> आरओआई प्रबंधक) को खोलें।
    9. पहली छवि पर एक आयत आकर्षित, आयत का सही आकार निर्दिष्ट (चयन आयत उपकरण और> संपादित करें> चयन> निर्दिष्ट किसी भी आयत आकर्षित) किया जा सकता है। नोट: 650 x 100 पिक्सल लंबाई x चौड़ाई का एक आकार इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था।
    10. Wn व्यक्त डोमेन के बहुत किनारे पर आयत की स्थितिT-हा-EGFP। Wnt-हा-EGFP प्रसार की अधिकतम दूरी के साथ क्षेत्र पर आयत रखें। महत्वपूर्ण कदम: यहां तक कि झिल्ली मार्कर के बिना Wnt-हा ई GFP व्यक्त क्षेत्रों कारण पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को दिखाई जानी चाहिए; अगर नहीं तो कच्चे छवियों से परामर्श करें।
    11. सही करने के लिए बॉक्स को 10 माइक्रोन Shift। चित्रों में से एक में शामिल पैमाने पर पट्टी की लंबाई मापने के द्वारा माइक्रोमीटर की संख्या का निर्धारण (पैमाने पर पट्टी> विश्लेषण> सेट पैमाने ट्रेसिंग एक लाइन ड्रा)। नोट: यह पिक्सल में 10 उम के लिए एक मूल्य प्रदान करता है।
    12. रॉय के प्रबंधक विंडो में जोड़ें बटन दबाकर आरओआई प्रबंधक को बॉक्स जोड़ें।
    13. अगली छवि के लिए ले जाएँ आयत आयत को स्थानांतरित करने की आयत उपकरण पर वापस क्लिक करके मापा जाएगा। दोहराएँ 8.2.10-11 कदम।
    14. एक बार जब पैनल के सभी मापा गया है, रॉय प्रबंधक मेनू (आरओआई प्रबंधक> अधिक> Multiplot> सूची) से चुनिंदा multiplot।
      नोट: डेटा Wnt पिक्सेल बौद्धिक अत्याधुनिक का प्रतिनिधित्व करता है(पिक्सेल में मापा एक्स,) क्षैतिज अक्ष के साथ दूरी बढ़ाने के साथ nsity (वाई)। Y के लिए मूल्य बिंदु एक्स पर ligand-GFP के औसत संकेत तीव्रता है और औसत प्रत्येक एक्स मूल्य के लिए वाई अक्ष में पिक्सल के सब से गणना की है। नतीजतन बॉक्स लम्बे, अधिक पिक्सल इस औसत उत्पादन करने के लिए विश्लेषण किया जाएगा। (वाई अक्ष में) एक छोटे से बॉक्स noisier हो जाएगा; एक लंबा बॉक्स बहुत कम औसत पिक्सेल तीव्रता होगा।
    15. एक स्प्रेडशीट और तदनुसार फिर से लेबल में multiplot बॉक्स से डेटा कॉपी करें। नोट: निम्न निर्देश Excel के लिए कर रहे हैं।
    16. इस ligand-GFP व्यक्त कोशिकाओं से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है और रेखांकन को विकृत रूप में प्रत्येक विश्लेषण से डेटा की पहली 10-20μm त्यागें।
    17. वैज्ञानिक विश्लेषण और रेखांकन सॉफ्टवेयर खुला और एक नया नोटबुक बनाने। नोट: निम्न निर्देश Sigmaplot 13 के लिए कर रहे हैं।
    18. ओ क्षैतिज नंबरों पर डबल क्लिक करके डेटा के लिए कॉलम के लिए आवश्यक संख्या लेबलएन वर्कशीट और माइक्रोन में उन्हें दूरी लेबलिंग, Wnt8a-हा-EGFP और Wnt11b-हा-EGFP।
    19. वैज्ञानिक विश्लेषण और रेखांकन सॉफ्टवेयर में प्रासंगिक कॉलम में स्प्रेडशीट से डेटा कॉपी करें।
    20. एक तितर बितर ग्राफ बनाएँ (ग्राफ बनाएं> तितर बितर> अनेक बिखराव> का चयन एक्स कई Y> वाई मूल्यों के लिए एक्स> का चयन Wnt8a-हा-EGFP और Wnt11b-हा-EGFP> खत्म करने के लिए दूरी स्तंभ का चयन करें)।
    21. तितर बितर ग्राफ पर एक Wnt8a-हा-EGFP बिंदु पर क्लिक छोड़ दिया द्वारा Wnt8a-हा-EGFP वक्र पर प्रतिगमन विश्लेषण करते हैं। अंक की सभी को उजागर करना चाहिए। विश्लेषण> प्रतिगमन जादूगर पर क्लिक करें।
    22. वक्र समीकरण श्रेणी (घातीय क्षय) और समीकरण का नाम (सिंगल, 3 पैरामीटर) तो अगले प्रेस का चयन करें।
    23. वक्र तो अगले प्रेस (डेटा पहले से डाला गया था, तो यह स्वचालित रूप से किया जाना चाहिए) लगाया जाना चाहिए, जो करने के लिए एक्स और वाई मूल्यों का चयन करें।
    24. संख्यात्मक आउटपुट विकल्प जब तक जादूगर के माध्यम से जारी रखेंपेज, तो ticked अगले दबाएँ 'रिपोर्ट बनाएं' किया जाता है। नोट: फिट वक्र के लिए मानकों रिपोर्ट 1 में दिखाया जाएगा *।
    25. ग्राफ़ विकल्प पृष्ठ पर तो ticked खत्म प्रेस है 'शीर्षक ग्राफ के समीकरण जोड़ने' किया जाता है। नोट: जादूगर रिपोर्ट 1 * और ग्राफ़ 1 * नोट बुक के शीर्ष पर टैब बनाया जाएगा। इसके अलावा वक्र (8.2.20) में उत्पादित ग्राफ में जोड़ा गया है जाएगा।
    26. दोहराएँ Wnt11b-हा-EGFP के लिए एक वक्र फिट करने के लिए 8.2.21-8.2.25 कदम महत्वपूर्ण कदम:। आंकड़ों के फिटिंग कई समीकरण श्रेणियों और समीकरण के नाम का प्रयास करें। नोट: सबसे अच्छा फिट के साथ वक्र चौकों की सबसे कम अवशिष्ट राशि के साथ उच्चतम आर 2 मूल्य का उत्पादन करना चाहिए।

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Representative Results

Fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त पशु टोपी explants की confocal विश्लेषण विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत ligand के वितरण दृश्यमान करने के लिए एक प्रभावी प्रणाली प्रदान करता है। एक उदाहरण में, GFP के वितरण श्श्श (चित्रा 1) में दिखाया गया है चिह्नित। 2-सेल स्तर पर, Xenopus भ्रूण एक नियंत्रण mRNA के साथ या mRNA Sulf1, कोशिका की सतह heparan सल्फेट को संशोधित और श्श्श morphogen ढाल 16 प्रभावित करती है कि एक एंजाइम के लिए कोडिंग के साथ साथ या तो दोनों कक्षों में इंजेक्ट कर रहे हैं। ये भ्रूण 32 सेल चरण तक संवर्धित कर रहे हैं और एक एकल कोशिका सह इंजेक्शन mRNAs (एक वंश अनुरेखक के रूप में) श्श्श GFP और memRFP के लिए कोडिंग के साथ है। यह कोशिका झिल्ली सीमित आरएफपी के साथ चिह्नित है कि श्श्श-GFP व्यक्त कोशिकाओं की एक क्लोन पैदा करता है। ब्लासटुला स्तर पर, पशु टोपी explants confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए लिया जाता है। चित्रा 1 नियंत्रण की शर्तों के तहत, श्श्श-GFP स्रावित होता है कि पता चलता है और फिर से बाहर diffusesइलाके इंजेक्ट mRNAs व्यक्त। हालांकि, Sulf1 की उपस्थिति में, श्श्श GFP के इस नमूने में, यह उत्पादक कोशिकाओं का क्लोन बाहर का पता नहीं है, इसके वितरण में अधिक प्रतिबंधित है और। श्श्श GFP के वितरण पर Sulf1 के प्रभाव को पूरी तरह से अधिक 16 विश्लेषण किया गया है।

Xenopus भ्रूण में व्यक्त करते हैं, fluorescently कोशिका झिल्ली पर जमा है, और कोशिकाओं के क्षेत्र भर में फैलाना, Wnt ligands स्रावित होते हैं चिह्नित। चित्रा 2 में, हम fluorecently इंजेक्शन कोशिकाओं में Wnt ligands के टैग और प्रोटीन व्यक्त दो अलग अलग की quantitaive और गुणात्मक गुण विशेषताएँ। चित्रा 2A-एच Wnt8a और Wnt11b-हा-EGFP जानवर टोपी कोशिकाओं की झिल्ली पर जमा के उदाहरण से पता चलता है । पैनलों 2 बी और 2 एफ की तुलना करके यह Wnt8a-हा-EGFP Wnt11b-हा-EGFP से कोशिका झिल्ली पर अधिक कुशलता से जम जाता है कि स्पष्ट है। मात्रात्मक जानकारी एक कॉम का उपयोग कर confocal छवियों से निकाला गया हैछवि और स्क्रिप्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर (पूरक कोड फाइल) की bination। चित्रा 2I Wnt11b-हा-EGFP की तुलना में कोशिका झिल्ली पर Wnt8a-हा-EGFP के रिश्तेदार संचय से पता चलता है। डेटा प्रत्येक छवि में कोशिका झिल्ली पिक्सल के साथ Wnt-हा-EGFP पिक्सल सह स्थानीयकरण की कुल संख्या निर्धारित करता है कि एक कंप्यूटर स्क्रिप्ट का उपयोग कर प्राप्त किया गया था। एक और दृष्टिकोण में, कोशिका झिल्ली के साथ-स्थानीय बनाना कि सह Wnt-हा-EGFP puncta की कुल संख्या छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 2J) का उपयोग गिने जाते हैं। आकार और व्यक्तिगत puncta के आकार के बारे में गुणात्मक जानकारी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा से निकाला जा सकता है। Wnt11b-हा-EGFP puncta कोशिका झिल्ली (चित्रा 2J) इन puncta के साथ सह-स्थानीयकरण कम करने के अलावा भी Wnt8a-हा-EGFP puncta (चित्रा 2K) की तुलना में एक छोटे औसत आकार है। इसके अलावा, Wnt11b-हा-EGFP puncta Wnt8a-हा-EGFP puncta (चित्रा 2L) की तुलना में एक कम घेरा है। Circularity एक वस्तु 1 एक पूर्ण चक्र और 0.1 एक लम्बी गैर गोल आकार का प्रतिनिधित्व करने के साथ एक पूर्ण चक्र जैसा दिखता है बारीकी से कैसे का एक उपाय है। यह दृष्टिकोण Wnt ligand के प्रसार के किसी भी उम्मीदवार नियामक परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, नियंत्रण कक्षों एक नियंत्रण mRNA के उम्मीदवार नियामक के एक निष्क्रिय फार्म या ऐसे बीटा galactosidase (lacZ) के रूप में एक अप्रासंगिक प्रोटीन के लिए कोडिंग के साथ इंजेक्शन होना चाहिए; इस बस नियामक इंजेक्शन लगाने नहीं की तुलना में एक अधिक मान्य नियंत्रण प्रदान करता है। इन उदाहरणों में डेटा गैर पैरामीट्रिक परीक्षण मान व्हिटनी यू 18-19 का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। एक सांख्यिकीय विश्लेषण कार्यक्रम परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

चित्रा 3 में, हम Wnt ligand के प्रसार की जांच। एक एकल ब्लास्टोमीयर पशु टोपी explants केवल कुछ कोशिकाओं Wnt8a-हा-EGFP या Wnt11b-हा-EGFP या तो व्यक्त जिसमें कोशिकाओं की एक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं कि इस तरह के 4 सेल चरण में इंजेक्ट किया गया था। एक सेल वंश दरियाफ्त शामिल करके, हम Expre पहचान कर सकते हैंगैर व्यक्त कोशिकाओं बनाम ssing और इस (चित्रा 3 बी और 3 सी) विश्लेषण किया जाना Wnt8a-हा-EGFP और Wnt11b-हा-EGFP ligand के प्रसार की सीमा से दूर स्रोत कोशिकाओं से अनुमति देता है। कारण पशु टोपी explants की वक्रता के लिए, मज़बूती से इस परख का उपयोग करके मापा जा सकता है कि अधिक से अधिक दूरी ligand के प्रसार के निरपेक्ष दूरी को मापने के लिए पर्याप्त नहीं था जो 160μm था। हालांकि, सॉफ्टवेयर कोंफोकल विश्लेषण, छवि विश्लेषण और वैज्ञानिक विश्लेषण के संयोजन का उपयोग और रेखांकन द्वारा Wnt-हा-EGFP morphogen ढाल के समग्र आकार (चित्रा 3 डी) का विश्लेषण किया जा सकता है। इस डाटा को एक ही कोशिकाओं में टैग ligands के साथ एक साथ एक और प्रोटीन overexpressing Wnt स्राव या प्रसार को प्रभावित कर सकते हैं कि क्या जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रयोग की एक और प्रकार में (चित्रा 3E-3J सेल) प्राप्त करने में एक संभावित नियामक के प्रभाव कोशिकाओं पूर्व से सटे कोशिकाओं के क्लोन में उम्मीदवार प्रोटीन overexpressing से मापा जा सकता हैWnt8a या Wnt11b-हा-EGFP दबाने। इस Wnt-हा-EGFP ligand के प्रसार पर नियामक की किसी भी गैर-सेल स्वायत्त प्रभाव की जांच की जा करने की अनुमति देता है। चित्रा 2 के अनुरूप, अधिक Wnt8a-हा-EGFP दोनों प्रसार प्रयोगों में Wnt11b-हा-EGFP से कोशिकाओं से दूर diffusing पता लगाया जा सकता है।

इस पत्र में वर्णित प्रयोगों के प्रकार श्श्श और Wnt 16,17 संकेत पर Sulf1 के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

आकृति 1
श्श्श GFP के वितरण की चित्रा 1. मॉड्यूलेशन Xenopus पशु टोपियां के confocal विश्लेषण से पता लगाया जा सकता है। (ए) भ्रूण पहले mRNA Sulf1 या एक नियंत्रण mRNA के लिए कोडिंग के साथ इंजेक्शन रहे हैं, जहां प्रयोगात्मक परख को दर्शाने वाला एक कार्टून, एक ही भ्रूण बाद में mRNA के लिए एक एकल कोशिका में श्श्श-GFP के लिए कोडिंग के साथ 32-सेल चरण में इंजेक्ट कर रहे हैं। (बीसी) पशु टोपी explantचरण 8 पर ले लिया है और 4 घंटे के बाद imaged थे। छवियाँ कोशिकाओं की एक श्श्श-+ GFP memRFP व्यक्त क्लोन के किनारे पर दिखाए जाते हैं। नियंत्रण भ्रूण (बी) में, श्श्श-GFP दूर संकेत उत्पादक कोशिकाओं की memRFP चिह्नित क्लोन से वितरित किया जाता है। Sulf1 (सी) व्यक्त भ्रूण में, श्श्श-GFP अधिक इसके वितरण में प्रतिबंधित है, 16 देखें। memRFP मैजेंटा में दिखाया गया है और हरे रंग में श्श्श-GFP है। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मात्रात्मक और कोशिका झिल्ली पर Wnt8a और Wnt11b-हा-EGFP puncta के गुणात्मक विश्लेषण। (एएच) भ्रूण mRNA के दो सेल स्तर पर पशु गोलार्द्ध में memRFP (500 पीजी) एन्कोडिंग के साथ द्विपक्षीय पहलू के बल microinjected थे। इसके अलावा भ्रूण श्री इंजेक्शन के साथ थे एनए एन्कोडिंग (एडी) Wnt8a-हा-EGFP (500 पीजी) या [एह] Wnt11b-हा-EGFP (1ng)। किसी भी संभावित नियामक के प्रभाव का विश्लेषण करते समय lacZ अतिरिक्त mRNA / प्रोटीन के लिए एक नियंत्रण प्रदान करने के लिए भ्रूण भी mRNA कोडिंग के साथ इंजेक्शन थे। (सी) और (छ) में सफेद बक्से क्रमशः पैनल (डी) में बढ़े हुए क्षेत्रों और (ज) के निशान। Wnt-हा-EGFP प्रतिदीप्ति कोशिका झिल्ली के साथ सह-स्थानीयकरण कुल राशि छवि और स्क्रिप्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर और फिर सामान्यीकृत (मैं) का उपयोग कर की गणना की गई। गुणात्मक जानकारी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निकाला गया था। Wnt8a और Wnt11b-हा-EGFP punctae कण संख्या (जे), कण आकार (कश्मीर) और कण घेरा (एल) के लिए विश्लेषण किया गया। मान व्हिटनी यू (** पी <0.01), एन = भ्रूण की संख्या। memRFP मैजेंटा में दिखाया गया है, और Wnt8a / 11b-हा-GFP हरे रंग में दिखाया गया है, स्केल सलाखों 20μm प्रतिनिधित्व करते हैं।ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Fluorescently के प्रसार की सीमा को मापने चित्रा 3. Wnt ligands चिह्नित। (ए) आरेख दूर व्यक्त कोशिकाओं से Wnt8a और Wnt11b-हा-EGFP स्राव और प्रसार को मापने के लिए इस्तेमाल किया परख चित्रण। (बीसी) mRNA एन्कोडिंग (बी) memCerulean (600 पीजी), lacZ (4ng) और Wnt8a-हा-EGFP (2ng) या (सी) memCerulean (600 पीजी), lacZ (4ng) और Wnt11b-हा-EGFP (2 एनजी परख का चित्रण) चार सेल मंच पर एक ब्लास्टोमीयर के पशु गोलार्द्ध में इंजेक्ट किया गया था। (डी) Wnt8a-हा-EGFP और Wnt11b-हा-EGFP के प्रसार की सीमा एक नियंत्रण पृष्ठभूमि के माध्यम से मापा गया था। (ई) आरेख इस्तेमाल किया lacZ व्यक्त एक पृष्ठभूमि के माध्यम से Wnt8a और Wnt11b-हा-EGFP प्रसार को मापने के लिए, Det के लिए विधि देखें बीमारी (FG) mRNA Wnt11b-हा-EGFP चार बजे एक ब्लास्टोमीयर के पशु गोलार्द्ध में इंजेक्ट किया गया था memCerulean (600 पीजी) और (एफ और एच) Wnt8a-हा-EGFP (2 एनजी) या (जी और मैं) एन्कोडिंग। सेल मंच। एक बगल ब्लास्टोमीयर एक पृष्ठभूमि व्यक्त lacZ के माध्यम से मापा गया था memRFP (600 पीजी) और lacZ (4 एनजी) जानकारी के लिए कुंजी देखते हैं। (जे) Wnt8a-हा-EGFP और Wnt11b-हा-EGFP प्रसार की सीमा एन्कोडिंग mRNA के साथ इंजेक्ट किया गया था। डेटा की मात्रा निर्धारित की और confocal विश्लेषण, छवि विश्लेषण और वैज्ञानिक विश्लेषण और रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर साजिश रची गई थी। memCerulean (नीला (सीडी) और पीला (एफ और एच)), Wnt-हा-EGFP (हरा), memRFP (मैजेंटा), स्केल सलाखों 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस फ़ाइल का एक बड़ा संस्करण डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फ़ाइलें / ftp_upload / 53,162 / 53162table1.jpg "/>

तालिका 1 प्राइमर pCS2 में Wnt8a / Wnt11b-हा-EGFP और श्श्श-GFP subclone करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

प्रतिक्रिया अवयव
उदाहरण CS2 + डाइजेस्ट 1.5 pCS2 की माइक्रोग्राम +
प्रतिबंध एंजाइम 1 से 2 μl
प्रतिबंध एंजाइम 2 के 2 μl
प्रतिबंध एंजाइम बफर के 5 μl (10X)
आणविक ग्रेड पानी के साथ 50 μl अप करने के लिए बनाया गया था
उदाहरण mRNA संश्लेषण 2 μl linearised टेम्पलेट
2 μl 10x MEGAscript TRX मिश्रण
2 μl 50mm एटीपी
2 μl 50mm सीटीपी
2 μl 50mm UTP
2 μl 5 मिमी जीटीपी
2.5 μl 40mm कैप एनालॉग (m7G (5)
2 μl SP6 एंजाइम मिश्रण
3.5 μl आण्विक ग्रेड पानी
उदाहरण पीसीआर प्रतिक्रिया 0.5 μl उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ (2,000 इकाइयों / एमएल)
2 एनजी टेम्पलेट डीएनए
2.5 आगे की μl और रिवर्स प्राइमरों (10μM)
0.5dNTPs की μl
डीएनए ploymerase बफर के 5 μl (10X)
आणविक ग्रेड पानी के साथ 50 μl अप करने के लिए बनाया गया था
उदाहरण पीसीआर की स्थिति 98 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण 2 मिनट
15 सेकंड के 98 डिग्री सेल्सियस
15 सेकंड के 65 डिग्री सेल्सियस 30 चक्रों
40 सेकंड 72 डिग्री सेल्सियस
72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार 10 मिनट
उदाहरण पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट पीसीआर उत्पाद के 28 μl
प्रतिबंध ई के 2 μlnzyme 1
प्रतिबंध एंजाइम 2 के 2 μl
प्रतिबंध एंजाइम बफर के 5 μl (10X)
13 μl आण्विक ग्रेड पानी
उदाहरण टी -4 बंधाव 1 μl कट CS2 +
3 μl कट पीसीआर उत्पाद 1
3 μl कट पीसीआर उत्पाद 2
टी -4 डीएनए ligase की 1 μl
1 μl टी -4 डीएनए ligase बफर (10X)
1 μl आण्विक ग्रेड पानी
उदाहरण टेम्पलेट पचाने 5 स्नातकीय प्लास्मिड डीएनए
10 μl प्रतिबंध एंजाइम बफर (10X)
3 μl Not1 (श्श्श-GFP छोड़कर Kpn1 प्रयोग किया जाता है)
आणविक ग्रेड पानी के साथ 100 μl अप करने के लिए बनाया गया था

Subcloning और Wnt8a-हा-EGFP के लिए सिंथेटिक mRNA के उत्पादन के लिए इस्तेमाल तालिका 2 उदाहरण प्रतिक्रिया की स्थिति।

<टीडी>
समाधान अवयव
सिस्टीन एचसीएल 0.1X गुटनिरपेक्ष आंदोलन
2.5% एल सिस्टीन हाइड्रोक्लोराइड monohydrate (pH7.8)
गुटनिरपेक्ष आंदोलन लवण 110 मिमी NaCl
2 मिमी KCl
1 मिमी सीए (NO3) 2
0.1 मिमी EDTA
गुटनिरपेक्ष आंदोलन / 2 0.5X गुटनिरपेक्ष आंदोलन लवण
5 मिमी HEPES pH7.4
0.25 मिमी बिकारबोनिट
25 स्नातकीय / एमएल Gentamycin
गुटनिरपेक्ष आंदोलन / 3 + Ficoll 0.33X गुटनिरपेक्ष आंदोलन लवण
5 मिमी HEPES pH7.4
0.25 मिमी बिकारबोनिट
2 5ug / एमएल Gentamycin
5% Ficoll
गुटनिरपेक्ष आंदोलन / 10 0.1X गुटनिरपेक्ष आंदोलन लवण
5 मिमी HEPES pH7.4
25 स्नातकीय / एमएल Gentamycin

तालिका 3. समाधान Xeno के उत्पादन और microinjection के दौरान इस्तेमाल कियामवाद भ्रूण laevis।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का एक अनिवार्य हिस्सा आम तौर पर, संसाधित स्रावित, और संलग्न एक फ्लोरोसेंट आधा भाग होने के बावजूद प्राप्त सेल में एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने में सक्षम हैं कि जैविक रूप से सक्रिय ligands पैदा कर रहा है। यह fluorescently टैग जीन उत्पाद के लिए एक उपयुक्त परख का उपयोग जैविक रूप से सक्रिय है कि स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। श्श्श-GFP के लिए, ptc1 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने की क्षमता 16 की पुष्टि की थी। Wnt8a एक भी उदर ब्लास्टोमीयर 20-21 में व्यक्त की, और Wnt8a-हा-EGFP इस जैविक गतिविधि को बनाए रखने दिखाया गया था जब एक माध्यमिक अक्ष प्रेरित करने के लिए एक उल्लेखनीय शक्तिशाली क्षमता है। Wnt11b संसृत विस्तार 21-22 के दौर से गुजर से activin इलाज किया बहिर्जनस्तरीय explants रोकता है, और Wnt11b-हा-EGFP भी अपने जैविक गतिविधि 17 बरकरार रखती है। untagged प्रोटीन के बराबर प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए टैग ligands की क्षमता निष्कर्ष ख होगा फ्लोरोसेंट ligands का उपयोग कर प्रयोगों के आधार पर पता चलता है किसामान्य प्रोटीन के लिए प्रासंगिक ई। ligand और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच हा मिलान के अलावा Wnt सक्रिय और फ्लोरोसेंट दोनों हो निर्माणों की अनुमति देता है कि एक स्पेसर क्षेत्र प्रदान की है।

विश्लेषण के इस प्रकार के प्रमुख सीमा है कि यह सीधे अंतर्जात morphogen ढ़ाल पर सूचित नहीं करता है। उदाहरण के लिए, पशु टोपी में कोशिकाओं के क्षेत्र भर में श्श्श के प्रसार तरीका भ्रूण में स्तंभ तंत्रिका उपकला के माध्यम से अंतर्जात श्श्श चाल प्रतिबिंबित नहीं कर सकते। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की सादगी ligands के वितरण पर बहिर्जात नियामकों के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है जहां प्रयोगों की अनुमति देता है। इन तरीकों से परिणाम परिकल्पना के आधार विवो विश्लेषण में अधिक मांग का उपयोग कर परीक्षण किया जा करने के लिए बना सकते हैं। उदाहरण के लिए, इस पत्र में वर्णित विधियों का उपयोग कर श्श्श-GFP के वितरण को प्रतिबंधित करने के लिए अधिक व्यक्त Sulf1 की क्षमता श्श्श morphogen ग्रैड नियमन में Sulf1 के लिए क्षमता की ओर इशारा कियाient। यह सीधे परीक्षण किया और morpholino Sulf1 की दस्तक से नीचे और न्यूरल ट्यूब 16 में अंतर्जात श्श्श कल्पना करने के लिए immunocytochemistry antisense का उपयोग कर मान्य किया गया था। हमारा करने के लिए इसी तरह की पद्धति ligand के प्रसार को विनियमित कर सकता है कि विशिष्ट तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। स्मिथ और उनके सहयोगियों ने एक GFP टैग नोडल (Xnr2) सरल प्रसार के लिए इस्तेमाल किया, और एक ढाल 23 फार्म के लिए एक्सटेंशन (cytonemes) या transcytosis (पुटिकाओं का उपयोग करते हुए) सेल नहीं कि प्रदर्शन किया।

विशेष रूप से रास्ते को ब्लॉक कि अन्य प्रोटीन संकेत अणु के लिए एक प्रतिक्रिया दूसरे के लिए एक सेल से संकेत रिले करने के लिए एक मध्यस्थ के रूप में जरूरत है कि क्या जांच करने के लिए लक्षित कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है, जहां इन तरीकों के आगे विस्तारण संभव हो रहे हैं। उदाहरण के लिए, activin के स्रोत और जवाब कोशिकाओं के बीच एक प्रमुख नकारात्मक activin रिसेप्टर व्यक्त सरल ligand के प्रसार स्रोत ई से दूर एक प्रतिक्रिया कई सेल व्यास बटोर सकता है कि पता चला24 के बीच में गैर जिम्मेदार कोशिकाओं के साथ उपक्रम। जंगली प्रकार की कोशिकाओं नोडल 25 के लिए एक आवश्यक सह रिसेप्टर कमी गैर जिम्मेदार उत्परिवर्ती कोशिकाओं से घिरे होने के बावजूद, नोडल का एक स्रोत का जवाब कर सकते हैं, जहां यह निष्कर्ष zebrafish में काम के द्वारा समर्थित किया गया। अन्य अध्ययनों fluorescently टैग ligands 28,29 के प्रसार की जांच करने के लिए zebrafish का इस्तेमाल किया है। कुछ अध्ययनों से यह संभवतः क्योंकि प्रोटीन रचना में योगदान देने वाले अत्यधिक संरक्षित cysteines की, संकेत गतिविधि पर प्रभाव कर सकते हैं Wnt प्रोटीन की सी टर्मिनस टैगिंग मिलान कि देखा गया है। हमारे पिछले काम (जैसे हा टैग के रूप में) एक स्पेसर सहित 17 जैविक रूप से सक्रिय हैं कि टैग किया Wnt ligands में यह परिणाम है कि दिखाया गया है। स्पेसर Wnt-Frz 30 बंधन के अंगूठे तर्जनी मॉडल के रूप में ligand -receptor बातचीत के लिए लचीलेपन की जरूरत है, इस तरह प्रदान करता है क्योंकि यह संभावना है।

हमारे अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए अगले कदम एक विज़ शामिल करने के लिए हैसंकेतन मार्ग के क्रियान्वयन के लिए यौन readout। उदाहरण के लिए, GFP टैग Wnt11b संकेत करने की क्षमता है, जो भर रेंज की अनुमति देगा ligand के स्रोत से दूर कोशिकाओं में Dvl 26 मापा जा व्यक्त। Wnt8a संकेतन गतिविधि की सीमा के स्रोत से थोड़ी दूरी पर कोशिकाओं 27 में बी-catenin के परमाणु स्थानीयकरण को मापने के लिए एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग कर दिखाया जा सकता है। प्रयोगों के इन प्रकार के इस पत्र में वर्णित तकनीकों का उपयोग संभव हो रहे हैं। एक एक morphogen की दहलीज सीमा का निर्धारण एक ligand के वितरण लेकिन संकेत दे रास्ते का भी उत्पादन मापने के लिए, और इस तरह से न केवल जहां विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन या fluorophores की एक किस्म का काम करके, जानकारी का एक अतिरिक्त स्तर प्रदान किया जाएगा ।

Xenopus laevis खरीद भ्रूण, mRNA संश्लेषण, microinjection और काटना के लिए तरीकों पर GFP टैग ligands और अधिक जानकारी के visualizing के लिए एक उपयोगी मॉडल हैआयन 31 उपलब्ध हैं।

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Acknowledgments

एक बीबीएसआरसी द्वारा वित्त पोषित किया गया यह काम (बी बी / H010297 / 1), खोज एवं बचाव के लिए एक बीबीएसआरसी कोटा छात्रवृत्ति, और swf करने के लिए एक एमआरसी छात्रवृत्ति एमईपी को अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles homemade
Zen lite software Carl Zeiss Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

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References

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