Mittels konfokaler Analyse

Developmental Biology

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Summary

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

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Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O'Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

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Abstract

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Liganden über ein Feld von Zellen verteilt visualisieren. Die Leichtigkeit der exprimieren exogene Proteine, zusammen mit der Größe ihrer Zellen in frühen Embryonen, stellen Xenopus laevis ein nützliches Modell für die Visualisierung von GFP-markierten Liganden. Synthetischer mRNAs effizient nach der Injektion in die übersetzte frühzeitig Xenopus-Embryonen und Injektionen können auf eine einzelne Zelle gezielt werden. Wenn sie mit einer Linie Tracer wie Membranbunden RFP kombiniert werden, kann der eingespritzte Zelle (und ihre Nachkommen), die Herstellung des überexprimierten Proteins leicht verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh Liganden aus injizierten mRNA. Die Verfahren die micro Dissektion der ektodermalen Explantate (animal caps) und der Analyse der Liganden Diffusion in mehreren Proben. Durch konfokale Bildgebung können Informationen über Ligand Sekretion und Diffusion über ein Feld von Zellen erhalten werden. Statistische Analysen der konfokalen Bilder liefern quantitative Daten über die Form des Liganden Steigungen. Diese Methoden können nützlich für Forscher, um die Auswirkungen der Faktoren, die die Form der Morphogen Gradienten regulieren kann testen wollen.

Introduction

Während der frühen embryonalen Entwicklung werden die Zellen schrittweise verpflichtet, bestimmte Abstammungslinien der Differenzierung zu folgen: dies bedeutet eine Gruppe von totipotenten (oder pluripotenten Zellen) werden auf die Schaffung Populationen von Vorläuferzellen bestimmt Anlass zu einem Zelltyp geben allmählich beschränkt. Zell-Zell-Signalisierung ist von zentraler Bedeutung für die Regulierung der Linienspezifikation während der embryonalen Entwicklung. Manipulation dieser Signale wird benötigt, um Stammzellen in Richtung besonderen Schicksale lenken, neue medizinische Behandlungen zu unterstützen.

Eine relativ kleine Anzahl von Signalwegen, werden während der Entwicklung wiederholt, einschließlich Wegen als Antwort auf die TGF-Superfamilie (nodals und BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnt 4 und 5 Igel. Diese sekretierten Proteine ​​binden an der Zellmembran, die Signaltransduktion wodurch Genexpression und / oder das Verhalten der Zelle ändern aktivieren Rezeptoren. Die enge Regulation von ZellzeichenAlling ist essentiell für Zelllinie Spezifikation und eine normale Entwicklung. Während das Übersprechen zwischen diesen Bahnen ist bei der Bestimmung des Zellschicksals wichtig ist, kann ein einzelner Ligand selbst hervorrufen unterschiedliche Reaktionen in unterschiedlichen Konzentrationen. Morphogen Gradienten wurden vor über 100 Jahren als eine Theorie zu erklären, wie verschiedene Zelltypen können aus einem Feld von Zellen 6 abzuleiten beschrieben. Signalmoleküle durch eine Gruppe von Zellen hergestellt werden, können über einen gewissen Bereich zu diffundieren, Abnahme in der Konzentration mit einem größeren Abstand von der Quelle. Zellen auf das Signal ausgesetzt wird, um die lokale Konzentration an ihrer Position in dem Bereich der Zellen entsprechen, die sich Zellen an verschiedenen Positionen unterschiedlich reagieren auf verschiedenen Ebenen des Signals. Beweise für die Existenz von Morphogenen ergeben sich aus Studien der frühen Drosophila-Embryo 7 und der Flügelscheibe 8 sowie des Vertebraten Schenkel 9 und Neuralrohr 10.

Verfahren sind in benötigtenvestigate wie Morphogen Gradienten etabliert sind und an andere Moleküle bei der Regulierung dieser Gradienten wichtig zu identifizieren. Elegante Experimente mittels Immunhistochemie auf endogenen Proteinen in vivo im Kontext von verschiedenen genetischen Hinter visualisiert wurden zur Morphogengradienten 11-12 untersuchen. , Gute Antikörpern und spezifischen Mutanten sind jedoch nicht immer zur Verfügung, so dass wir mit Überexpression von fluoreszierenden Liganden in Xenopus, um eine alternative, einfache Methode, um zu zerlegen, wie exogene Genprodukte Verteilung von Liganden, die über ein Feld von Zellen beeinflussen, bereitzustellen beschreiben hier eine Protokoll. Xenopus laevis bietet ein ausgezeichnetes System, um diese Arten von Experimenten durchzuführen, wie ihre Embryonen entwickeln, von außen, so dass sie in den frühesten Stadien zugänglich sind. Ihre Größe (1-1.5mm Durchmesser) vereinfacht die Mikroinjektion und chirurgischen Manipulation und durch Blastula Stufen die Zellen leicht zu Bild, da sie immer noch relativ groß ist (etwa 2081; m Durchmesser). Die Überexpression Studien in Xenopus sind einfach zu tun: mRNA in den frühen Embryo injiziert werden, um bestimmte Zellen gezielt und effizient umgerechnet.

Die fluoreszenzmarkierten Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Konstrukte wurden mit pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 und eGFP generiert. Der HA-Peptid ist wichtig, umfassen nicht nur eine zusätzliche molekulare Markierung zu schaffen, sondern auch, weil es wird angenommen, dass als Abstandshalter trennt die Wnt und eGFP-Proteinen so dass sowohl Genprodukte zu funktionieren handeln. Das zur Visualisierung von Shh verwendet Konstrukt wurde zuvor verwendet, um eine transgene Maus eine Shh-eGFP-Fusionsproteins 15 exprimieren, zu erzeugen; Dies wurde freundlicherweise von Andy McMahon zur Verfügung gestellt. Wichtig ist, dass das GFP-Tag für alle Konstrukte kloniert 3 'zur Signalsequenz, so daß sie nach der Bearbeitung beibehalten. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die endgültige Protein enthält Sequenzen, die für Änderungen erforderlich sind, wie die addition von Lipiden, wie es der Fall für Shh und Wnt ligands.The cDNAs wurden in den pCS2 + Expressionsvektor, der für die prodution synthetischer mRNA optimiert ist subkloniert; es enthält einen SP6-Promotor und Polyadenylierungssignal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Die hier beschriebene Arbeit bietet ein einfaches Protokoll für den Vergleich der Sekretion und Verbreitung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh getaggt Liganden. Durch Einspritzen von definierten Mengen synthetischer mRNA, umrundet das Protokoll keine Probleme mit variabler Expression aus verschiedenen Vektoren mit verschiedenen Promotoren verbunden. Diese Methoden wurden kürzlich angewendet, um die Wirkungen von Heparansulfat endosulfatase Sulf1 auf Shh-eGFP und Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Sekretion und Diffusion in Xenopus 16-17 untersuchen.

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Protocol

Ethics Statement: Tierversuche wurden unter einem britischen Innenministeriums Lizenz durchgeführt, um Europaabgeordnete und den durchgeführten Versuchen wurde von der University of York Ethik-Kommission in Übereinstimmung mit dem ANKOMMEN zugelassen (Tierforschung: Meldung von In-vivo-Experimente) Richtlinien. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Strategie zur fluoreszenzmarkierten Liganden Gene

Unten ist ein Beispiel-Protokoll zur Subklonierung Wnt8a-HA und eGFP in pCS2, um zu produzieren das im Rahmen Fusionskonstrukt Wnta-HA-eGFP:

  1. Einrichten und Ausführen von PCR-Reaktionen zur Wnt8a-HA und eGFP. Verwenden des Primers Informationen in Tabelle 1 und das Beispiel PCR-Reaktion und Beispiel PCR-Bedingungen in Tabelle 2 angezeigt Hinweis angezeigt: Template DNA variiert in Abhängigkeit von dem Konstrukt produziert wird, in diesem Beispiel wird Wnt8a-HA als Matrizen-DNA verwendet.
  2. Clean up PCR-Reaktionen unter Verwendung eines Gelextraktionskit, führen abschließende Elution in 30μl Wasser molekularen Klasse.
  3. Check 2 ul des PCR-Produkts auf einem 1% Agarosegel in TAE hergestellt.
  4. Digest Wnt8a-HA und eGFP PCR-Produkte und pCS2 mit den geeigneten Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 1), bis Reaktionen wie in Tabelle 2 (Beispiel PCR-Produkt-Digest) beschrieben.
  5. Reaktionen Inkubieren für 3 Stunden bei 37 ° C und dann Wnt8a-HA und GFP PCR-Produkte zu speichern auf Eis.
  6. Fügen Sie 1 ul alkalische Kälberdarm-Phosphatase (CAIP) bis pCS2 Digest und Inkubation für 6 min bei 37 ° C.
  7. Wärme inaktivieren CAIP durch Inkubation für 15 min bei 65 ° C.
  8. Run pCS2 und PCR verdaut auf einem 1% hochreinem Agarosegel in TAE vorbereitet.
  9. Gel-Extrakt und aufräumen pCS2 und PCR-Produkte unter Verwendung eines Gelextraktionskit, führen abschließende Elution in 30 ul Wasser molekularen Klasse.
  10. Up-Ligation wie in Tabelle 2 (Beispiel T4-Ligation) beschrieben und Inkubation bei 12 ° C für 16 Stunden.

2. mRNA-Synthese: Die Erzeugung des Template

  1. Produzieren Sie Vorlagen mit Restriktionsenzymverdau der folgenden Plasmide (alle in den Expressionsvektor pCS2): Membran-Cerulean (memCerulean), Membran-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Richten Sie Restriktionsverdaue wie in Tabelle 2 beschrieben (Beispiel Template zu verdauen).
    2. Vorsichtig mischen und inkubieren Sie die Reaktionen für 2 Stunden bei 37 ° C.
  2. Ausgeführt 2,5 ul verdauten Plasmid auf einem 1% Agarosegel (TAE), um zu überprüfen, dass die Reaktion vollständig geschnitten.
  3. Bereinigen Sie die Übersichten mit Hilfe eines Gelextraktionskit, führen abschließende Elution in 50 ul Wasser molekularen Klasse.

3. mRNA-Synthese: in vitro-Transkription

  1. Synthetisieren funktionelle mRNA unter Verwendung des SP6 mRNA-Transkription-Kit. Montieren Sie die Reaktionen in 1,5 ml DNAse / RNAse freien Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Up-mRNA-Transkriptionsreaktionen auf, wie in Tabelle 2 (Beispiel mRNA-Synthese) beschrieben.
  3. Mischen Sie dieReaktionen vorsichtig mit einer Pipette und dann bei 37 ° C für 4 Stunden.
  4. Kontrolle 1 ul der Reaktion auf einem 2% igen Agarosegel (TAE).
  5. 1 & mgr; l DNAse zur Reaktion vorsichtig mischen mit einem P20 und Inkubieren der Reaktion für weitere 15 min bei 37 ° C.
  6. Add 340 ul Wasser UPW 40 ul Ammoniumacetat und 400 ul Phenol-Chloroform zur Reaktions. Mischen Sie den Reaktionen für 30 Sekunden.
  7. Spin der mRNA für 5 min, 14.000 x g, 4 ° C.
  8. Pipettieren Sie die obere (wässrige) Schicht von jedem Reaktions Verschieben in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.
  9. Ein gleiches Volumen Chloroform zu jedem der abdekantiert Reaktionen. Mischen Sie den Proben für 30 Sekunden.
  10. Spin der mRNA für 5 min, 14.000 x g, 4 ° C
  11. Pipettieren Sie die obere wässrige Schicht von jeder Reaktion der Verbringung an einen frischen 1,5 ml Schraubkappe Mikrozentrifugenröhrchen.
  12. Ein gleiches Volumen Isopropanol zu jeder der Reaktionen und auszufällen mRNA bei -80 ° C für 30 min.
  13. Spin jeder der Reaktionen für 15 Minuten bei 14.000 × g, 4 ° C, um die mRNA zu pelletisieren
  14. Entfernen Sie den Überstand kümmert sich nicht um die pelle mRNA stören
  15. Nach Zugabe von 200 ul 70% igem Ethanol zu jeder der Reaktionen, die Reaktionen zu mischen und dann zu drehen für 10 min bei 14.000 × g, 4 ° C.
  16. Entfernen Sie das Ethanol kümmert sich nicht um die mRNA zu stören, trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur mit Hilfe eines Vakuumtrockenschrank oder Speed-Vac.
  17. Re-Aussetzung der mRNA in 10-20 ul Wasser molekularen Klasse. Spin kurz und halten Sie die Proben auf Eis. Anmerkung: Erwärmen der Probe auf 80 ° C für 1 min können helfen, es aufzulösen.
  18. Laufen 1 ul mRNA auf einem 2% Agarosegel (TAE) und Analyse 1,2 ul auf einem Spektrophotometer, um eine genaue Auslesung der Konzentration zu erhalten.
    Entscheidender Schritt: Eine Konzentration von 400 ng / ul synthetischer mRNA ist erforderlich, um die Durchführung der folgenden Experimente.

    Entscheidender Schritt: Wenn der 260/280-Verhältnisaußerhalb des Bereichs von 2,00 bis 2,20, oder die Gesamtmenge der mRNA als 12 & mgr; g, die Durchführung einer Lithiumchloridniederschlag.
  19. Speicher mRNA in 1 & mgr; l-Aliquots bei -80 ° C. Verwenden Aliquots und dann wegwerfen; nicht wieder eingefroren mRNA.

4. Generieren von Xenopus laevis Embryonen

  1. Prime Xenopus laevis Weibchen durch subkutane Injektion mit 50 Einheiten von menschlichem Choriongonadotropin Hormon (HCG; Chorulon) eine Woche vor dem Experiment.
  2. Induzieren Xenopus laevis-Weibchen in der Nacht vor dem Experiment durch die Injektion von 250 Einheiten HCG und Inkubation im Dunkeln, O / N bei 19 ° C.
  3. Sezieren Hoden aus euthanasiert männlichen Frosch und lagern in 1xNAM bei 4 ° C. Hinweis: Männlich Frosch wird von Terminalanästhesie in Übereinstimmung mit Anhang 1 der Tiere euthanasiert (Scientific Procedures) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Massage weiblichen Xenopus laevis, um Ovulation zu induzieren, zur Erhebung der laid Eier in eine runde Petrischale von 55 mm Durchmesser.
  5. Produzieren eine Spermiensuspension durch Zerkleinern ¼ Xenopus laevis Hoden in 1 ml VE-Wasser.
  6. Pinsel Xenopus-Oozyten mit dem zerkleinerten Spermiensuspension mit einer Pasteurpipette und Pipetten Glühlampe entscheidender Schritt:. Führen Befruchtung Reaktionen bei ca. 04.30 am Tag des Experiments.
  7. Kultur Embryonen bei 21 ° C in NAM / 10 (siehe Tabelle 3 für Lösungen) in 55 mm Petrischalen mit 1% Agarose in Wasser (Wasser) verdünnt aufgetragen.
  8. De-Gelee Embryonen nach 45 min unter Verwendung von Cystein / HCl (Tabelle 3). Anmerkung: Bei 21 ° C werden die Embryos 2-Zellen-Stadium nach 90 min erreicht und spaltet alle 20 Minuten danach.

5. Mikroinjektion von Xenopus Embryonen

  1. Unter Verwendung von 1 X 90mm Glaskapillaren und Narishige PC-10 Dual-Stage Glas-Mikropipette Puller, Mikropipetten für Injektionszwecke zu ziehen. Passen Sie die Einstellungen empirisch zu einer feinen Spitze zu erreichen (weniger als ein Mikrometer Durchter).
  2. Befestigen einer Mikropipette (Nadel) zu einem Gas Mikroinjektor (beispielsweise die Harvard Appartaus PLI-100 PICO-Injektor), wiederholt präzise Flüssigkeitsmengen zu liefern, indem eine geregelte Druck für eine digital eingestellt Zeitraum. Einstellen des pneumatischen Druck auf ein Volumen von 1,25 bis 10 Nanolitern zu liefern, wie unter Verwendung eines Retikels oder Kalibrierungsdia bestimmt.
  3. Beschichten einer 55 mm Petrischale mit 5 ml 1% Agarose (Wasser). Schneiden Sie ein 35 bis 35 mm im Quadrat aus Agarose aus dem Gericht, wird dies eine stabile Oberfläche, um Embryonen microinject.
  4. Transfer Embryonen in NAM / 3 + Ficoll (Tabelle 3) und an die Einspritz Gericht.
  5. Injizieren Embryonen im Tier Hemisphäre, sobald sie die erforderlichen Voraussetzungen für das Experiment zu erreichen.
    1. Für die Analyse der Verteilung der GFP-markierten Liganden an der Zelloberfläche, injizieren die Embryonen bilateral an den beiden Zell-Stadium 10NL pro Zelle. Beispiel mRNA Verdünnungen unten Wnt8a-HA-eGFP gezeigt. Entscheidender Schritt: Stellen Sie sicher, dass alle mRNA-Konzentrationen stTechnik bei 400 ng / ul.
      Anmerkung: Die Menge an mRNA, die injiziert werden muss, um empirisch durch Testen von Konzentrationen und Auffinden der Mindestmenge benötigt, um den fluoreszierenden Liganden visualisieren bestimmt werden. Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-HA-Antikörper ist ein wesentlicher Schritt, um zu bestimmen, dass die mRNAs auf das Niveau, um den Vergleich von zwei verschiedenen fluoreszenzmarkierten Liganden zu ermöglichen übersetzt; Wir haben dies für Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP in Fellgett et al., 2015 gemacht.
      Anmerkung: Bei der Beurteilung der Auswirkung eines injizierten mRNA (wie eine Codierung für einen Kandidaten-Regler) ist ein typischer Steuer um eine nicht-aktive RNA, wie beispielsweise LacZ, um auf die Auswirkungen der zusätzlichen Steuer einzuspritzen, in Geschwister Embryonen Transkripte in den Embryo.
      1. Verdünnen Sie memRFP mRNA 1: 4 (1 & mgr; + 3 ul dH 2 O) mit Wasser molekularen Grad um die Konzentration auf 100 ng / & mgr; l zu reduzieren.
      2. Verdünnen Sie Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1: 4 (1 & mgr; + 3 ul dH2 O) mit Wasser molekularen Grad um die Konzentration auf 100 ng / & mgr; l zu reduzieren.
      3. Mischen Sie memRFP mRNA in einem Verhältnis 1: 1 mit Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
      4. Mischungs mRNA aus 5.5.1.3 in einem Verhältnis 1: 1 entweder mit der Kontroll-mRNA LacZ oder einem Modulator, wie Sulf1.
      5. Injizieren Embryonen bilateral an der 2-Zellstadium mit 10NL von mRNA pro Zelle (insgesamt 20NL). Hinweis: Dies führt zu 250 pg m em RFP, 250 pg Wnt8a-HA- e GFP, 500 pg der Wnt11b-HA- e GFP und 2 ng LacZ oder Sulf1 mRNA, die in jede Zelle eingespritzt.
    2. Um zu analysieren, die Diffusion von GFP-markierten Liganden, zu injizieren mRNA für Ligand-GFP kodierenden zusammen mit einem Linienmarker wie memRFP am 16-32 Zell-Stadium, 1,25 nl pro Zelle.
    3. Um die Auswirkungen eines möglichen Modulators der Ligand Diffusion zu analysieren, Co-injizieren mRNA für den Modulator Codierung zusammen mit dem Liganden und Abstammung Tracer. Alternativ zu injizieren Nachbarzellen: eine mit mRNAs für die GFP-markierten ligan Codierungd und eine Linie Tracer (memRFP) und das andere mit mRNAs für den Modulator und einer anderen Linie Tracer (memCerulean) Codierung.
  6. Transfer-Embryonen zu einer 12,5 ° C-Inkubator und Kultur bis zum nächsten Tag, Nieuwkoop und Faber (NF) Stufe 8.

6. Ausschneiden Tier Kappe Explantate

  1. Transferembryonen in einer 55 mm-Petrischalen mit 5 ml 1% Agarose (Wasser) beschichtet. Füllen Sie die Schale mit NAM / 2 (Tabelle 3).
  2. Nehmen Kreis animal caps mit Tungsten Nadeln kritischer Schritt:. Nehmen Large Caps in dieser Phase, da diese zu heilen besser und leichter sein Bild, behalten die Kontrolle Kappen, um sicherzustellen, keine konvergente Extension auftritt.
  3. Übertragen Tier Explantate auf 55 mm-Petrischalen mit 1% Agarose (Wasser) und Kultur Embryos aufgetragen und bei 21 ° C für 4 Stunden kritischer Schritt. Das 4-stündiger Inkubation erforderlich ist, damit fluoreszierenden Proteinen zu reifen.
  4. Generieren Erleichterung Folien durch Kleben hinunter zwei Lagen PVC insulation Band auf Objektträgern. Schneiden Sie ein 14 mm mal 10 mm Rechteck aus der Band um eine Kammer für die Montage animal caps verlassen entscheidender Schritt:. Glätten Sie die beiden Schichten des Bandes sorgfältig auf den Objektträger vor dem Schneiden Sie das Rechteck.
  5. Pipette 2 separate Tröpfchen NAM / 2 (Tabelle 3) in den Entlastungsschieber, etwa 30 ul pro Tropfen.
  6. Bringen Tier Explantate auf den Relief Dias mit einem abgeschnitten P20 Spitze und zu orientieren, so dass der apikalen Seite nach oben zeigt. Hinweis: Jede Folie kann 10-15 animal caps halten kritischer Schritt. In diesem Stadium die animal caps sollte teilweise geheilt haben, bedeutet dies, sie sind weniger empfindlich und kann mit einer Pinzette orientieren.
  7. Senken Sie ein Deckglas auf die Entlastung Rutsche und lassen Sie das Deckglas, um für 20 Minuten trocknen entscheidender Schritt: Die Größe des Tieres Kappe ist von entscheidender Bedeutung;. sicherzustellen, die Kappe ist groß genug, dass, wenn das Deckglas wird auf die Entlastungsschieber senkte sie die apikale Schicht aus Tierkappe Zellen genug, um pr komprimiertoduce eine flache Oberfläche, die dem Bild. Wenn das Tier Kappen sind zu klein, noch dann reduzieren Sie die PVC-Band, um eine Schicht.
  8. Verschließen Sie die Folie mit Nagellack entscheidender Schritt:. Verwenden Sie nicht zu viel Nagellack, um die Entlastung Folien zu versiegeln, denn wenn die PVC-Band wird zu dämpfen, wird es wieder aufrichten und ruinieren die Rutsche.
  9. Dry Erleichterung Folien für 20 Minuten in der Dunkelheit und sie sind bereit, die dem Bild sind, in der Regel animal caps gesund für 4-6 Stunden einmal in der Folie verschlossen bleiben.

7. Imaging

Anmerkung: Bilderzeugung wurde unter Verwendung eines invertierten Konfokalmikroskop ausgeführt. Lambda-Modus wurde für die Bildgebung ausgewählt zulässig, da es mehrere Fluorophore mit überlappenden Signaturen verwendet werden, und entfernt das Problem möglicher Probenbewegung zwischen den Scans.

  1. Finden Explantate mit einer geringen Vergrößerung Ziel dann zu 63x / 1.4 Öl-Objektiv zu wechseln für höhere Auflösung Bildgebung.
  2. Schalten Sie erforderliche Laser; für dieses Beispiel die 405Laser wurde verwendet, um memCerulean anzuregen, wurde die 488-Laser verwendet werden, um GFP zu erregen und die 561 Laser memRFP mit 405 und 488/561 dichroitische Spiegel zu erregen.
  3. Verwenden Lambda-Modus (Im Zen 2011 wählen Lambda-Modus - 32 Fächer).
  4. Wählen Sie das 405nm, 488nm und 561nm lasers.To ein breiteres Sichtfeld zu ermöglichen, Verkleinern des Bildes (bis 0.6x).
  5. Stellen Sie die Bildgröße auf die gewünschte Bildgröße (1024 x 1024 mit Pixelgrößen von 220 nm wurde für diesen Datensatz verwendet wird).
  6. Set Durchschnitt typischerweise 4 bis 8, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
  7. Optimieren Sie die Lochblende (1 luftigen Einheit gemäß der 561nm-Laser wurde für diesen Datensatz verwendet wird).
  8. Optimierung der Laserleistung kritischer Schritt. Balance der 405nm, 488nm und 561nm-Laser, so daß alle Fluorophore mit der Detektoranordnung 32 bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Spannung und Verstärkung benötigt detektiert werden.
  9. Sammeln Sie das Licht aus memCerulean, GFP und memRFP emittiert. Aus diesem Arbeitslicht wurde jeden gesammelten ~10 nm von 415-720nm, obwohl größere Erfassungsintervalle sind möglich (z. B. jede ~ 20 nm).

8. Bildanalyse

  1. Untersuchung der Wirkungen von Modulatoren auf die Zelloberflächenexpression von GFP-markierten Liganden,
    HINWEIS: Die folgenden Schritte sind eine detaillierte Anleitung, wie die Analyse in unserem Labor durchgeführt. Der Endanwender wünschen können, um den Prozess, indem er ein ImageJ oder FIJI-Skript, um einige der manuellen Schritte zu entfernen straffen.
    Kritischer Schritt: Es ist wichtig, die Endbenutzer-Proben werden die Spektren einer Fluorophore unter den gleichen Bedingungen, dass die endgültige Experiment um ORM wirksame Entmischung der mehreren Fluorophoren in dem letzten Experiment verwendet perf geführt eingesetzt.
    Zwei Arten der Analyse sind in diesem Abschnitt durchgeführt:
    1. Berechnung der Gesamtzahl von Wnt-HA-eGFP Pixel Co-Lokalisations mit der Zellmembran.
      1. Entmischen die grüne,Rot und cerulean Kanäle mit Spektren von einzelnen Einspritzungen dieser Fluorophore in ZEN-Software abgetastet. Speichern Sie diese Bilder als separate LSM Dokumente in alle der folgenden Schritte verwenden.
      2. Offene LSM-Dateien direkt in Bildbearbeitungssoftware. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für die Fidschi J.
      3. Speichern Sie die LSM-Bilder als Bildsequenz Dokumente, dies wird automatisch geteilt die Bilder in die einzelnen Kanäle.
      4. Speichern Sie das Bild-Sequenz in dem gleichen Ordner wie die Skripte für das Skript-Analyse-Software, die verwendet wird, um die Daten zu analysieren werden (siehe Zusatzcode-Dateien für die eigentliche Skript). Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Matlab.
      5. Öffnen Sie den Script-Analyse-Software und öffnen Sie das Verzeichnis, in dem die Skripte geschrieben werden.
      6. Geben Sie den Dateinamen unter Standortanalyse, wird die Software den Dateinamen zu nehmen und führen Sie die Analyse.
        Hinweis: Die Dateinamen werden ImageA0000 und ImageA0001 für jeden ima lesenge. Das Skript-Analyse-Software wird das Bild verwenden markiert 0001 als Maske und zu analysieren, den Prozentsatz der Pixel im Bild 0000, das gemeinsam zu lokalisieren Mit dieser Maske.
      7. Nehmen Sie die Prozent Kolokalisation Nummer (als Zellmembran besiedelten annotiert) und kopieren Sie diese in eine Tabellenkalkulation. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Excel.
      8. Zeichnen Sie den Prozentsatz Kolokalisation Nummer auf einem Balkendiagramm entweder als absoluter oder relativer Wert.
    2. Analysieren Sie die Anzahl, Größe und Form der Wnt-HA-eGFP puncta.
      1. Offene ungemischten LSM-Dateien direkt in Bildbearbeitungssoftware. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Fidschi J.
      2. Split jedes Bild in seine einzelnen Kanäle (Bild> Farbe> Split-Kanäle).
      3. Threshold sowohl die Wnt-HA-eGFP und die Membranmarker Kanäle (Bild> Anpassen> Auto-Schwelle) kritischer Schritt:. Versuchen Sie, eine Reihe von Schwellenwerten zu sehen, welches ein repräsentatives Bild erzeugt, ohne eine Überbelichtungder Kanal.
      4. Konvertieren Sie die Membranmarker-Kanal zu einer Maske (Process> Binary> Make-Maske).
      5. Kehren Sie diese Maske (Bearbeiten> Invert).
      6. Konvertieren Sie die Wnt-HA-eGFP puncta zu einer Maske wie oben.
      7. Subtrahieren Sie die Membranmarker Maske vom Liganden-GFP-Maske (Process> Bild Rechner> Wnt-Maske in Top-Box, Membranmaske im unteren Kasten).
      8. Verwenden Sie die Analyse von Partikelfunktion. Von hier aus, wählen Sie die erforderlichen Parameter und die Daten (Analyse> Analyse Partikel) zu analysieren.
      9. Kopieren Sie die Anzahl der Partikel, mittlere Teilchengröße und Kreisdaten in eine Tabellenkalkulation und Diagramme zeichnen aus diesen Daten. Hinweis: Für diese Analyse werden nur Partikel zwischen 0.1-10μm 2 Größe analysiert wurden, wurden keine Einschränkungen für Kreisförmigkeit der Teilchen platziert. Diese Anleitung ist für Excel.
  2. Analyse der Palette von Liganden Diffusions
    1. Öffnen Sie alle ungemischten Bilder in konfokalen imAging-Software und exportieren Sie die Dateien in einem TIF-Format, als Rohdaten und als RGB-Bild Hinweis:.. Diese Anleitung ist für Zen lite 2011 entscheidende Schritt: Fügen Sie eine Maßstabsleiste auf mindestens eines der Bilder, so dass Entfernung kann während der Analyse berechnet.
    2. Die Bilder zu öffnen, um in der Bildanalyse-Software analysiert werden. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Photoshop 8.2.3) mit der rechten Maustaste auf den Hintergrund des Bildes und wählen Sie "Schicht von Hintergrund ', um eine neue Ebene zu erstellen..
    3. Setzen Sie die Membranmarker Kanäle auf 0, so dass nur die Liganden-GFP-Kanal sichtbar ist (Ebene> Neue Einstellungsebene> Kanalmischer) kritischer Schritt. Clip der neue Einstellungsebene, um das Bild, die analysiert, um die Option die neue Ebene Clip zu diesem Bild ist als Kontrollkästchen nach dem Klicken auf die Option Kanal-Mixer zur Verfügung.
    4. Öffnen Sie einen neuen Arbeitsbereich. Stellen Sie die Auflösung auf 300 Pixel pro Zoll und den Farbmodus auf RGB-Farbe (Datei>New> Zwischenablage).
    5. Kopieren Sie alle Bilder in die einzelnen Arbeitsbereich analysiert (Klicken Sie auf das Bild, und es ist Kanal-Mixer, indem Steuer dann halten Sie Steuerung und Alt und ziehen Sie das Bild in den Arbeitsbereich abgeschnitten).
    6. Orientieren alle der Bilder, so dass die maximale Länge der Diffusion für jedes Bild entlang der horizontalen Achse gemessen werden, wobei die Zellen, die Wnt-HA-eGFP nach links orientiert.
    7. Speichern Sie die Arbeitsfläche als TIF und öffnen Sie diese in der Bildanalyse-Software. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für die Fidschi J.
    8. Öffnen Sie den ROI-Manager-Fenster (Analyse> Tools> ROI-Manager).
    9. Zeichnen Sie ein Rechteck auf das erste Bild, kann die genaue Größe des Rechtecks ​​festgelegt werden (Wählen Sie Rechteck-Werkzeug und ziehen Sie jede Rechteck> Bearbeiten> Auswahl> angeben). Anmerkung: Eine Größe von 650 x 100 Pixel Länge × Breite wurde in dieser Studie verwendet.
    10. Positionieren Sie das Rechteck auf dem Rand des Domain-exprimierenden Wnt-HA-eGFP. Legen Sie das Rechteck über den Bereich mit der maximalen Entfernung von Wnt-HA-eGFP Diffusion. Entscheidender Schritt: Auch ohne die Membranmarker die Regionen Wnt-HA- e GFP-exprimierenden sichtbar sein soll aufgrund der Hintergrundfluoreszenz; wenn nicht, dann wenden Sie RAW-Bilder.
    11. Verschieben das Feld 10 & mgr; M auf der rechten Seite. Bestimmen Sie die Anzahl der Mikrometer durch Messung der Länge der Maßstabsleiste in einem der Bilder enthalten (Zeichnen Sie eine Linie Rückverfolgung der Maßstabsleiste> Analyse> gesetzt Skala). Hinweis: Diese stellt einen Wert für 10 uM in Pixel.
    12. Fügen Sie die Box auf der ROI-Manager, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen in ROI-Manager-Fenster.
    13. Verschieben Rechteck zum nächsten Bild, indem Sie wieder auf dem Rechteck-Werkzeug, um das Rechteck bewegen, gemessen werden. Wiederholen Sie die Schritte 8.2.10-11.
    14. Sobald alle Platten gemessen worden sind, wählen Sie Multiplot aus dem ROI-Manager-Menü (ROI-Manager> Mehr> Multiplot> Liste).
      Hinweis: Die Daten repräsentieren Wnt Pixel intensity (Y) mit zunehmendem Abstand entlang der horizontalen Achse (X, gemessen in Pixel). Der Wert für Y ist die mittlere Signalintensität eines Liganden-GFP am Punkt X und der Mittelwert wird aus allen der Pixel in der Y-Achse für jeden X-Wert berechnet. Folglich ist die größere der Kasten, desto mehr Pixel werden analysiert, um diesen Mittelwert zu erzeugen. Ein kleines Feld (in der Y-Achse) wird verrauschter; ein großer Kasten werden sehr niedrige Durchschnittspixelintensität haben.
    15. Kopieren Sie die Daten vom Multidiagrammfeld in eine Tabellenkalkulation und re-Label entsprechend. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Excel.
    16. Entsorgen Sie die ersten 10-20 um von Daten von jeder Analyse wie dies stellt Hintergrundfluoreszenz von Ligand-GFP-exprimierenden Zellen und verzerrt die Graphen.
    17. Öffnen Sie die wissenschaftliche Analyse und Grafik-Software und erstellen Sie ein neues Notebook. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Sigmaplot 13.
    18. Beschriften Sie die erforderliche Anzahl der Spalten für die Daten durch einen Doppelklick auf den horizontalen Nummern on das Arbeitsblatt und Kennzeichnung ihnen Abstand in um, Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Kopieren Sie Daten aus der Tabellenkalkulation in die entsprechenden Spalten in der wissenschaftlichen Analyse und Grafik-Software.
    20. Erstellen Sie ein Streudiagramm (Create Graph> Scatter> Multiple Streu> Wählen X viele Y> Wählen Sie den Abstand Spalte für X> Select Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP für die Y-Werte> Finish).
    21. Führen Regressionsanalyse auf Wnt8a-HA-eGFP-Kurve mit der linken Maustaste auf eine Wnt8a-HA-eGFP Punkt auf dem Streudiagramm. Alle Punkte sind hervorzuheben. Klicken Sie auf Analyse> Regression Assistenten.
    22. Wählen Sie die Kurvengleichung Kategorie (exponentiellen Abfall) und die Gleichung Name (Einzel, 3 Parameter) und drücken Sie dann auf Weiter.
    23. Wählen Sie die X- und Y-Werte in dem die Kurve sollte montiert werden (wenn die Daten zuvor hervorgehoben, sollte dies automatisch durchgeführt werden) und drücken Sie dann auf Weiter.
    24. Fahren Sie mit dem Assistenten, bis die numerische Ausgabe-OptionSeite, sicherzustellen, "Bericht erstellen" wird dann angekreuzt Sie auf Weiter. Hinweis: Die Parameter für die angepasste Kurve wird im Report 1 angezeigt *.
    25. Auf der Graph-Optionen Seite zu gewährleisten 'hinzuzufügen Gleichung Titel grafisch' wird dann angekreuzt drücken Abgang. Hinweis: Der Assistent Report 1 * und Grafik 1 * Registerkarten am oberen Rand des Notizbuch erstellt haben. Zusätzlich wird die Kurve zu der in (8.2.20) erzeugten Graphen hinzugefügt wurden.
    26. Wiederholen Sie die Schritte 8.2.21-8.2.25, um eine Kurve für Wnt11b-HA-eGFP passen entscheidender Schritt:. Versuchen, mehrere Pass Gleichung Kategorien und Gleichung Namen auf die Daten. Hinweis: Die Kurve mit der besten Passform sollte den höchsten R 2 Wert mit der geringsten Restquadratsumme zu erzeugen.

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Representative Results

Konfokale Analyse animal cap Explantate exprimieren fluoreszent markierte Proteine ​​bietet ein wirksames System zur Visualisierung Ligand Verteilung unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen. In einem Beispiel kann die Verteilung von GFP-markierte Shh dargestellt (Abbildung 1). In 2-Zellen-Stadium werden Xenopus-Embryonen in die beiden Zellen, die entweder mit einem Kontroll-mRNA oder mRNA, die für Sulf1, ein Enzym, das die Zelloberflächen Heparansulfat verändert und beeinflusst die Shh Morphogen Gradienten 16 kodierende injiziert. Diese Embryonen werden kultiviert, bis die 32-Zellen-Stadium und eine einzelne Zelle koinjiziert mit mRNAs für Shh-GFP und memRFP Codierung (als Linie Tracer). Dies schafft ein Klon von Zellen Shh-GFP, das mit der Zellmembran gebunden RFP markiert exprimieren. Im Blastula-Stadium werden animal cap Explantate für die Analyse durch konfokale Mikroskopie entnommen. 1 zeigt, dass unter Kontrollbedingungen, Shh-GFP sekretiert und diffundiert außerhalb des Wiedergion Expression der mRNAs injiziert. Jedoch in Gegenwart Sulf1 ist Shh-GFP eingeschränkteren in seiner Verteilung und in diesem Beispiel wird nicht außerhalb der Klon von Zellen festgestellt. Die Auswirkungen der Sulf1 auf Shh-GFP-Verteilung wurde vollständiger 16 analysiert.

Wenn sie in Xenopus-Embryonen exprimiert wird, fluoreszenzmarkierten Liganden Wnt sezerniert werden, sammeln sich an der Zellmembran und diffundieren über das Feld von Zellen. In Figur 2 kennzeichnen wir die quantitaive und qualitativen Eigenschaften der zwei verschiedenen fluorecently tagged Wnt-Liganden in Zellen injiziert und die Proteine ​​exprimieren. 2A-H sind Beispiele für Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP sammeln sich auf der Membran der animal cap Zellen . Durch Vergleichen Platten 2B und 2F ist klar, dass Wnt8a-HA-eGFP akkumuliert effizienter auf der Zellmembran als Wnt11b-HA-eGFP. Quantitative Informationen aus den konfokalen Bildern mit einem com extrahiertKombination von Bild und Schrift-Analyse-Software (Zusatzcode-Datei). 2I zeigt die relative Anreicherung von Wnt8a-HA-eGFP auf der Zellmembran im Vergleich zu Wnt11b-HA-eGFP. Die Daten wurden mit einem Computer-Skript, das die Gesamtzahl der Wnt-HA-eGFP Pixel Co-Lokalisations mit Zellmembran Pixel in jedem Bild bestimmt, erhalten. In einem anderen Ansatz, die Gesamtzahl der Wnt-HA-eGFP puncta, dass die Zusammenarbeit lokalisieren, mit der Zellmembran gezählt unter Verwendung von Bildanalyse-Software (2J). Qualitative Informationen über die Größe und Form der einzelnen puncta können auch aus den Daten unter Verwendung der Bildanalyse-Software extrahiert werden. Zusätzlich zu weniger Wnt11b-HA-eGFP puncta Co-Lokalisierung mit der Zellmembran (2J) diese puncta haben auch eine kleinere mittlere Größe als Wnt8a-HA-eGFP puncta (2k). Darüber hinaus haben Wnt11b-HA-eGFP puncta eine reduzierte Kreis Vergleich zu Wnt8a-HA-eGFP puncta (Abbildung 2 l). Circrität ist ein Maß dafür, wie genau ein Objekt ähnelt einem perfekten Kreis, wobei 1 für einen perfekten Kreis und 0,1 ein länglicher nichtkreisförmiger Form auf. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um jeden Kandidaten Regulator des Wnt-Liganden-Diffusionstest. Um dies zu tun, sollten die Kontrollzellen mit einem Steuer mRNA für eine inaktive Form des Kandidaten Regler oder ein irrelevantes Protein, wie beta-Galactosidase (lacZ) kodierende injiziert werden; Dies sorgt für eine gültige Steuer als einfach nicht das Einspritzen des Reglers. Daten in diesen Beispielen wurde unter Verwendung des nicht-parametrischen Test Mann-Whitney U 18-19 analysiert. Ein statistisches Analyseprogramm wurde verwendet, um den Test durchzuführen.

In 3 untersuchen wir Wnt-Liganden Diffusion. Ein einzelner Blastomere wurde im 4-Zell-Stadium injiziert, so dass die Tier Kappe Explantate stellen einen Bereich der Zellen, in denen nur einige Zellen exprimieren entweder Wnt8a-HA-eGFP oder Wnt11b-HA-eGFP. Indem eine Zelllinie Tracer, können wir expre identifizierenssing versus nicht-exprimierenden Zellen, und dies erlaubt der Bereich der Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP Ligand Diffusion weg von der Quelle zu analysierenden Zellen (3B und 3C). Aufgrund der Krümmung der animal cap Explantate, die maximale Entfernung, die zuverlässig unter Verwendung dieses Tests gemessen werden konnte, war 160 um, was nicht genug ist, um den absoluten Abstand von Ligand Diffusion zu messen war. Jedoch kann durch Verwendung einer Kombination von konfokaler Analyse, Bildanalyse und wissenschaftliche Analyse und grafische Software die Gesamtform des Wnt-HA-eGFP Morphogen Gradienten könnte analysiert werden (Abbildung 3D). Diese Daten können verwendet werden, um zu untersuchen, ob ein anderes Protein überexprimieren, zusammen mit den markierten Liganden in den gleichen Zellen Wnt Sekretion oder Diffusion zu beeinflussen. In einer anderen Art von Experiment (3E bis 3J) die Auswirkungen eines möglichen Regler in Aufnahmezellen kann durch die Überexpression des Proteins in Kandidaten-Klone von Zellen angrenzend an Zellen ex messDrücken Wnt8a oder Wnt11b-HA-eGFP. Hierdurch kann jeder nicht-zell autonome Wirkungen des Reglers auf Wnt-HA-eGFP Ligand Diffusion untersucht werden. In Übereinstimmung mit Abbildung 2 können mehr Wnt8a-HA-eGFP erkannt Diffundieren von Zellen als Wnt11b-HA-eGFP in beiden Diffusionsexperimente werden.

Die Arten der in diesem Dokument beschriebenen Experimenten verwendet wurden, um die Wirkung von Sulf1 auf Shh und Wnt-Signal 16,17 analysieren.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Modulation der Shh-GFP Verteilung kann durch konfokale Analyse von Xenopus animal caps erkannt werden. (A) Eine Karikatur, die experimentellen Test, wo Embryonen zunächst mit mRNA für Sulf1 oder einer Kontroll mRNA kodierenden eingespritzt wird, sind die gleichen Embryonen später an der 32-Zell-Stadium mit mRNA-Codierung für die Shh-GFP in eine einzelne Zelle injiziert. (BC) Tierkappe Explantats wurden auf Stufe 8 entnommen und nach 4 h abgebildet. Bilder werden auf dem Rand eines Shh-GFP + memRFP exprimierenden Klon von Zellen gezeigt. In Kontrollembryos (B) wird Shh-GFP vom memRFP markierten Klon von Signalerzeugungszellen verteilt. In Embryonen exprimieren Sulf1 (C) wird Shh-GFP mehr in seiner Verteilung beschränkt, siehe 16. memRFP ist in magenta dargestellt und Shh-GFP in grün. Skalenbalken stellen 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2. Die quantitative und qualitative Analyse der Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP puncta auf der Zellmembran. (AH) Die Embryonen wurden bilateral mit mRNA memRFP (500 pg) in das Tier Hemisphäre an den beiden Zell-Stadium mikroinjiziert. Darüber hinaus wurden die Embryonen mit Herrn injiziert NA-Codierung (AD) Wnt8a-HA-eGFP (500 pg) oder [EH] Wnt11b-HA-eGFP (1 ng). Die Embryos wurden mit mRNA kodierenden LacZ injiziert für eine Steuerung für zusätzliche mRNA / Protein bei der Analyse der Auswirkungen jeglicher Potentialregler bereitzustellen. Die weißen Felder in (C) und (G) um die Bereiche, in Platten (D) vergrößert und (H) sind. Die Gesamtmenge Wnt-HA-eGFP-Fluoreszenz Co-Lokalisierung mit der Zellmembran wurde unter Verwendung von Bildanalysesoftware und Script und dann normiert (I) berechnet. Qualitative Informationen wurde mit Bildanalyse-Software extrahiert. Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP Pünktchen wurden für die Partikelzahl (J), Partikelgröße (K) und Kreisförmigkeit der Teilchen (L) analysiert. Mann-Whitney U (** P <0,01), N = Anzahl der Embryonen. memRFP ist in magenta dargestellt und Wnt8a / 11b-HA-GFP wird grün dargestellt, repräsentieren Maßstabsbalken 20 um.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Mess den Bereich der Verbreitung von fluoreszenzmarkierten Wnt-Liganden. (A) Diagramm, das den Test verwendet, um Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP-Sekretion und Verbreitung von exprimierenden Zellen zu messen. (BC) codierende mRNA (B) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) und Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) oder (C) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) und Wnt11b-HA-eGFP (2 ng ) wurde in den Tierhemisphäre einer Blastomere des Vier-Zellen-Stadium injiziert. (D) den Bereich der Diffusion Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP wurde durch eine Steuer Hintergrund gemessen wird. (E) Schematische Darstellung der Assay verwendet um Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP Diffusion durch eine Hintergrund messen die lacZ exprimieren, siehe Methode für det fehlt. (FG) codierende mRNA memCerulean (600 pg) und (F und H) Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) oder (G und I) Wnt11b-HA-eGFP wurde an den vier in den Tierhemisphäre einer Blastomere spritzt Zell-Stadium. Eine angrenzende Blastomere wurde mit mRNA injiziert memRFP (600 pg) und LacZ (4 ng) zu sehen Key für Details. (J) Die Palette der Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP Diffusions codiert, wurde durch einen Hintergrund Ausdruck LacZ gemessen. Die Daten wurden quantifiziert und aufgezeichnet mittels konfokaler Analyse, Bildanalyse und wissenschaftliche Analyse und grafische Software. memCerulean (blau (CD) und Gelb (F und H)), Wnt-HA-eGFP (grün), memRFP (magenta), Maßstabsbalken repräsentieren 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Datei downloaden.

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Tabelle 1. Primer verwendet, um Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP und Shh-GFP in pCS2 subklonieren.

Reaktion Components
Beispiel CS2 + Digest 1,5 ug von pCS2 +
2 ul Restriktionsenzym 1
2 ul Restriktionsenzym 2
5 ul Restriktionsenzym-Puffer (10x)
Aufgefüllt auf 50 ul mit Wasser molekularen Grad
Beispiel mRNA-Synthese 2 ul linearisiert Vorlage
2 ul 10x Megascript trx mix
2 ul 50 mM ATP
2 ul 50 mM CTP
2 ul 50 mM UTP
2 & mgr; l 5 mM GTP
2,5 ul 40 mM Cap Analog (m7G (5 ')
2 ul SP6 Enzymmix
3,5 ul Molecular-Wasser
Beispiel PCR-Reaktion 0,5 ul High Fidelity DNA-Polymerase (2.000 Einheiten / ml)
2 ng Template-DNA
2,5 ul Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 uM)
0,5ul dNTPs
5 ul der DNA ploymerase Puffer (10x)
Aufgefüllt auf 50 ul mit Wasser molekularen Grad
B. PCR-Bedingungen Anfänglichen Denaturierung 2 min bei 98 ° C
15 sec 98 ° C
15 sec 65 ° C 30 Zyklen
40 sec 72 ° C
Letzte Verlängerung 10 min bei 72 ° C
Beispiel PCR-Produkt Digest 28 ul des PCR-Produkts
2 ul Restriction enzyme 1
2 ul Restriktionsenzym 2
5 ul Restriktionsenzym-Puffer (10x)
13 & mgr; Molecular-Wasser
Beispiel T4-Ligation 1 ul Cut CS2 +
3 & mgr; l PCR-Produkt 1 Cut
3 & mgr; l PCR-Produkt 2 Cut
1 ul T4 DNA Ligase
1 ul T4 DNA-Ligase-Puffer (10x)
1 & mgr; Molecular-Wasser
Beispiel Vorlage verdauen 5 ug Plasmid-DNA
10 ul Restriktionsenzym-Puffer (10x)
3 ul Not1 (außer Shh-GFP, Kpn1 verwendet wird)
Aufgefüllt auf 100 ul mit Wasser molekularen Grad

Tabelle 2. Beispiel Reaktionsbedingungen für die Subklonierung und Herstellung synthetischer mRNA für Wnt8a-HA-eGFP verwendet.

<td>
Lösung Components
Cystein-HCl 0,1X NAM
2,5% L-Cystein-Hydrochlorid-Monohydrat (pH 7,8)
NAM Salze 110 mM NaCl
2 mM KCl
1 mM Ca (NO3) 2
0.1 mM EDTA
NAM / 2 0,5X NAM Salze
5 mM HEPES pH 7,4
0,25 mM Bicarbonat
25 ug / ml Gentamycin
NAM / 3 + Ficoll 0.33X NAM Salze
5 mM HEPES pH 7,4
0,25 mM Bicarbonat
2 5 ug / ml Gentamycin
5% Ficoll
NAM / 10 0,1X NAM Salze
5 mM HEPES pH 7,4
25 ug / ml Gentamycin

Tabelle 3. Lösungen bei der Herstellung und die Mikroinjektion von Xeno verwendetpus laevis Embryonen.

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Discussion

Ein wesentlicher Teil dieses Protokolls erzeugt biologisch aktiven Liganden, die normalerweise bearbeitet werden, ausgeschieden wird, und fähig sind, eine Antwort in der Aufnahmezelle auslösen kann, obwohl sie eine fluoreszierende Gruppe gebunden. Es kritisch ist, nachzuweisen, dass das fluoreszenzmarkierte Genprodukt ist biologisch aktiv unter Verwendung eines geeigneten Assays. Für Shh-GFP wurde die Fähigkeit, die Expression von ptc1 aktivieren 16 bestätigt. Wnt8a hat eine bemerkenswert starke Fähigkeit, eine Nebenachse zu induzieren, wenn in einem ventralen Blastomere 20-21 ausgedrückt und Wnt8a-HA-eGFP wurde gezeigt, bewahren Sie diese biologische Aktivität. Wnt11b hemmt Activin behandelten ektodermalen Explantaten aus unterziehen konvergenten Verlängerung 21-22 und Wnt11b-HA-eGFP auch seine biologische Aktivität 17 beibehält. Die Fähigkeit der markierten Liganden, um Antworten entsprechen den unmarkierten Proteine ​​rufen legt nahe, dass die Schlussfolgerungen basierend auf Experimenten unter Verwendung der fluoreszierenden Liganden wird be, die für die normale Protein. Die Zugabe des HA-Epitop zwischen Ligand und das fluoreszierende Protein ein Spacer-Region, die die Wnt-Konstrukte sowohl aktive als auch fluoreszierend sein kann.

Die Hauptbeschränkung dieser Art von Analyse ist, dass sie nicht direkt auf die endogene Morphogen Gradienten informieren. Zum Beispiel kann die Diffusion von Shh über das Feld von Zellen in Tierkappe nicht den Weg endogenen Shh bewegt sich durch den säulen neuralen Epithel im Embryo. Die Einfachheit dieses Protokoll erlaubt aber Experimente, bei denen die Wirkung von exogenen Regler auf die Verteilung von Liganden getestet werden. Die Ergebnisse dieser Ansätze bilden die Grundlage der Hypothesen unter Verwendung anspruchsvoller in vivo-Analysen überprüft werden. Zum Beispiel kann die Fähigkeit überexprimiert Sulf1 um die Verteilung der Shh-GFP unter Verwendung der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren beschränken wies auf das Potential für Sulf1 beim Modulieren der Shh Morphogen gradient. Diese wurde direkt getestet und validiert mit Antisense-Morpholino-Knockdown von Sulf1 und Immunzytochemie, um endogene Shh im Neuralrohr 16 sichtbar zu machen. Ein ähnliches Verfahren, um uns wurde genutzt, um spezifische Mechanismen, die Liganden Diffusions regulieren könnte zu untersuchen. Smith und seine Kollegen gezeigt, dass eine GFP-markierten Knoten (Xnr2) verwendet einfache Diffusion, und Erweiterungen (Cytoneme) oder Transzytose (unter Verwendung von Vesikeln), um einen Gradienten 23 bilden keine Zelle.

Weitere Ausgestaltungen dieser Verfahren sind möglich, bei denen andere Proteine, insbesondere Wege blockieren kann in Zielzellen exprimiert zu untersuchen, ob eine Antwort auf das Signalmolekül wird als Vermittler, um Signale von einer Zelle zur anderen Relais benötigt. Zum Beispiel kann eine dominant negative Activin-Rezeptor zwischen der Quelle von Activin und der antwortenden Zellen, die zeigte, dass einfache Ligand Diffusions könnte eine Antwort mehreren Zelldurchmessern weg von der Quelle E hervorrufenmit nicht-reaktiven Zellen zwischen 24 ven. Diese Schlussfolgerung wurde durch die Arbeit im Zebrafisch unterstützt, wo Wildtyp-Zellen können mit einer Quelle für Knoten obwohl sie von nicht mehr reagiert mutierten Zellen fehlt ein wesentlicher Co-Rezeptor für Knoten 25 umgeben reagieren. Andere Studien haben Zebrafisch verwendet, um die Diffusion von fluoreszenzmarkierten Liganden 28,29 untersuchen. Einige Studien wurde beobachtet, dass Tagging der C-Terminus von Wnt-Proteine ​​können auf der Signalaktivität möglicherweise wegen der hoch konservierte Cysteine, die Proteinkonformation beitragen auswirken Epitop. Die bisherige Arbeit hat gezeigt, dass auch ein Distanzstück (wie das HA-Tag) ergibt tagged Wnt-Liganden, die biologisch aktiv sind 17. Dies ist wahrscheinlich, weil der Abstandshalter liefert Flexibilität für Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung benötigt werden, wie in dem Daumen-Zeigefinger-Modell von Wnt-Frz Bindung 30.

Der nächste Schritt für die Erweiterung unserer Untersuchungen ist es, eine vis schließendet Auslesen für die Aktivierung des Signalwegs. Zum Beispiel, die GFP-markierten Dvl 26 in Zellen entfernt von der Quelle der Ligand die Reichweite, über die Wnt11b hat die Fähigkeit, das Signal messen zu können. Der Bereich der Wnt8a Signalaktivität konnte unter Verwendung von Antikörper-Färbung an Kernlokalisation von b-Catenin in den Zellen 27 in einem Abstand von der Quelle zu messen angezeigt. Derartige Experimente sind mit Hilfe der in diesem Dokument beschriebenen Techniken. Durch den Einsatz einer Vielzahl von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen oder Fluorophore, wäre eine zusätzliche Informationsebene bereitgestellt, in denen man misst nicht nur die Verteilung eines Liganden, sondern die auch den Ausgang der Signalwege, und auf diese Weise die Bestimmung der Schwellenbereich eines Morphogens .

Xenopus laevis ist ein nützliches Modell zur Visualisierung von GFP-markierten Liganden und weitere Angaben zu den Methoden für die Beschaffung von Embryonen, die mRNA-Synthese, die Mikroinjektion und sezierenIonen sind 31.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von einem BBSRC finanziert gewähren MdEP (BB / H010297 / 1), ein BBSRC Quoten studentship zu SAR und einen MRC studentship zu SWF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles homemade
Zen lite software Carl Zeiss Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

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