16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ciddi enfeksiyonlara neden bildirilmiştir nedenle, yetersiz tarif, nadir ve bakteriyel patojenler bir dizi vardır. Çoğunlukla olgu sunumları olarak yayınlanan çoğu durumda sadece birkaç veri, içinde, bir enfeksiyöz ajan gibi patojenlerin rolünü araştırmak hangi mevcuttur. Bu nedenle, bu tür mikroorganizmaların patojenik karakterini açıklamak için, bakterilerin büyük sayılardan epidemiyolojik çalışmalar yapmak gerekmektedir. suşlarının tanımlanması, bunlar rutin tanı, (sağlamlık) işlemek için kolay, ekonomik olmalıdır geçerli terminolojisine göre doğru olmalı ve onlar karşılaştırılabilir üretmek zorunda: Böyle bir sürveyans çalışmasında kullanılan yöntemler aşağıdaki kriterleri karşılamak için var laboratuvarlar arası sonuçları. Genellikle rutin bir ortamda bakteri suşları tanımlamak için üç strateji vardır: Bıochemıca karakterize 1) fenotipik tanımlamaBakterilerin l ve metabolik özellikleri, 2) bu tür yeni bir proteom göre bir yaklaşım olarak 16S rRNA gen dizilimi ve 3) kütle spektrometrisi gibi moleküler teknikler. kütle spektrometrisi ve moleküler yaklaşımların bakteriyel türlerinin büyük bir çeşitlilik belirlemek için en umut verici olduğu için, bu iki yöntem tarif edilmiştir. Bu teknikler kullanılarak Gelişmeler, sınırlamalar ve potansiyel problemler tartışılmıştır.

Introduction

Rutin teşhis nadir patojenlerin güvenli kimlik klasik kültürel ve biyokimyasal yöntemler hantal ve bazen tartışmalı olduğu gerçeği ile engellenmektedir. Bundan başka, bir teşhis mikrobiyoloji laboratuar otomatik sistemlerin kullanılmasını gerektirir günlük olarak birkaç bin birkaç yüz kadar patojenlerin çok sayıda, işleme alır. Bir günlük yüksek verim yönetiminde ek olarak, bakteri türleri kesin tanımlanması gereklidir. Onların antibiyotik duyarlılık paterni farklı ve bu nedenle doğru tanımlama, uygun antibiyotik seçmek için gerekli bilgileri (örneğin, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43 ile klinisyene sağlar çünkü bu garanti edilir.

Otomatik mikrobiyal tanıma sistemleri (Amis) bakteriyel izolatların metabolik özelliklerini karakterize etmek için enzimatik reaksiyonların standart setleri uygulamak örneğin, bu çalışmada 52 kullanılan Amis GN kartı 47, sadece bakterilerin sınırlı kümesi için bu strateji izin güvenli kimlik kullanmak rağmen. Ayrıca, veritabanı, gelişmiş bir uzman sistem, açıkça tıbbi önemi 13,15,16,36 ilgili ve son derece alakalı bakterilerin saptanması üzerine odaklanmıştır. yaygın laboratuarlarda kullanılan iki başka sistemler de bakteriyel tanımlama için biyokimyasal bir yaklaşım geçerlidir. Türler 35 level üzerinde 3. Amis sadece% 82.4 bir kimlik doğruluğunu sahipken Son çalışmalar, bu çalışmada kullanılan Amis ve rakiplerinden biri (% 93.7 ve sırasıyla% 93.0) arasında bir mukayese kimlik doğruluğunu göstermektedir. Bu tür farklılıklar altta yatan kimlik verileri referanslar, kitler ve yazılım METABO farklılıklar versiyonları kalitesi ile açıklanabilirtutumların ve teknik personel 35,36 yeterlilik.

İki otomatik -TOF MS sistemleri (-TOF mikrobik tanımlama sistemi, MMIS) çoğunlukla kullanılır. Bu sistemler, protein, parmak izi kütle spektrumları göre bakteri türlerinin çok sayıda tespiti için verir. Örneğin, kullanılan MMİS veritabanı 6000, referans spektrumları içerir. Kütle spektrometresi dayalı tanımlama sistemleri nadir patojenler 11,48,51 dahil mikroorganizmaların büyük bir çeşitlilik hızlı ve güvenilir şekilde algılanmasını sunuyoruz. Bugüne kadar sadece bir kaç doğrudan karşılaştırmalar bu çalışmada kullanılan MMIS ve rakiplerinin 19,33 arasında mevcuttur. Dæk göre ve ark., Her iki sistem de tanımlama doğruluğu benzer yüksek oranda sağlar, ancak bu çalışmada kullanılan MMİS türlerin belirlenmesi 19 daha güvenilir olduğu görülmektedir.

Benzer bir şekilde, moleküler teknikler de, aynı zamanda korunmuş ama adresleme ayrı genler ( rpoB) berrak tür kimlik 3,22,61 izin verir. Bunlar arasında, 16S rDNA çünkü tüm bakteriler 34 varlığını en yaygın olarak kullanılan temizlik gendir. Bunun işlevi, biyo-bilişim 14,34 için müsait olması için yeterince uzun olan, yaklaşık 1500 bp ile değişmeden ve son olarak kalır. Birçok araştırmacı bakteri tanımlama 21 "altın standart" olarak 16S rRNA gen analizi görüyoruz. Bu az laboratuar az ya da yeni bakteri 14,34 tanımlanması için bugüne kadar DNA-DNA hibridizasyon teknikleri kullanmak olmasından kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, daha fazla veri tabanı 16S rRNA gen analizinde 50 için kullanılabilir temin edilebilmektedir. Bununla birlikte, 16S rDNA bazlı algılama sistemleri, standart PCR protokollerine göre sınırlı bir duyarlılığa sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Dahası, moleküler yaklaşım zaman alıcı, sofistike ve yüksek eğitimli personel yanı sıra gerektirirözel laboratuvar olanakları ve, bu nedenle, kolayca rutin teşhis 55 içine uygulanmadı. Bundan başka, bakteri kimlik, en az iki farklı yöntem kombinasyonu son derece hassas soy tanımlanmasına neden olduğu gösterilmiştir. MALDI-TOF MS ile 16S rDNA sekanslama kombinasyonu, yüksek hassasiyetle farklı bakteri türlerinin çok sayıda tanımlanmasına izin verir. Son zamanlarda -TOF MS ve 16S rRNA gen analizinin kombinasyonu epidemiyolojik soruları ve nadir patojenler 56 okuyan bakteri tanımlama için sunuldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bakteriyel DNA 1. Ekstraksiyon

  1. PBS çözeltisi hazırlanması
    1. 1.65 g bir şişede 2 HPO 4 x 2H 2, O, 0.22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O ve 8.80 g NaCI Na tartılır ve 1000 ml'lik bir son hacme kadar damıtılmış su ile doldurun. PH 7.4 ayarlayın. son kullanım için bakteri geçirmez (0.22 um) aracılığıyla filtre çözelti süzülür.
  2. DNA ekstraksiyonu Gram-negatif bakteriler
    1. Streak uygun kültür ortamı (örneğin, Columbia kan ağar) hasta malzeme belirlemek ve potansiyel patojenleri izole.
    2. Saf kültür hazırlayın ve sipariş Morfotip belirlemek ve saflığını teyit etmek ve kültür 49 Gram-boyama gerçekleştirin.
    3. tek bir bakteriyel koloniden almak ve 1 ml PBS çözeltisi ihtiva eden bir steril 2.0 ml'lik tepkime tüp içine 1 ul tek kullanımlık aşılama döngü ile aktarın.
    4. Bir Thermomix'in bu süspansiyon inkübe10 dakika boyunca 95 ° C 'de er. İnkübasyondan sonra, oda sıcaklığına soğutun, bakteriyel ekstresi (çözünmüş DNA içeren) izin ve ya daha fazla kullanım (Şekil 1A) -20 ° C'de amplifikasyonu veya saklamak için doğrudan kullanımı.
  3. DNA Ekstraksiyon Gram-pozitif bakteriler
    1. Streak uygun kültür ortamı (örneğin, Columbia kan ağar) hasta malzeme belirlemek ve potansiyel patojenleri izole. kültür Morfotip doğrulamak için Gram boyama gerçekleştirin.
    2. Saf kültür hazırlayın ve sipariş Morfotip belirlemek ve kültür saflığını teyit etmek Gram-boyama gerçekleştirin.
    3. steril 1 ul inokülasyon döngü ile tek bir bakteriyel koloniden almak ve 2.0 ml bir reaksiyon tüpünde 500 ul PBS çözeltisi içinde askıya.
    4. 500 ul cam boncuk ilave edilir ve 5 dakika boyunca, yüksek frekans ve genlik (50 Hz) çalıştırılan bir salınım homojenleştirici, tüp aktarın. 1.0 mm çapında cam boncuklar kullanınbakteriyel hücre duvarlarının bozabilir.
    5. 95 ° C de 10 dakika boyunca, bu tüp inkübe ve oda sıcaklığına soğutun. Daha fazla kullanım için -20 ° C 'de, PCR reaksiyonu veya deposu için özü doğrudan kullanın.

2. 16S rDNA PCR

  1. Yükseltme primerlerinin hazırlanması
    1. primerler TPU1 kullanarak (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) ters primer olarak ileri primer ve RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAD TCC TGT T-3') halinde 25. , DNAz, ve RNaz içermeyen su ile bir primer stok çözelti hazırlayın 100 pmol / ul (100 uM) bir konsantrasyona sahiptir ve 10 pmol / ul bir çalışma çözeltisine daha da seyreltilmesi. -20 ° C'de astar stok ve çalışma çözümü saklayın veya doğrudan kullanın.
  2. PCR reaksiyon karışımı hazırlanması
    1. Pipet 1 her bir primerden ul, 1 ul dNTP karışım (100 mM), DNA özü 2.5 uL, 25 mM Mg ihtiva eden 5 ul 10x PCR tamponu (Steril bir 200 ul reaksiyon tüpüne Cl 2), Taq-polimeraz ul 0.25 (5 adet / ul) ve 39.25 ul DNAse- ve RNAse ücretsiz PCR su.
  3. PCR Protokolü
    1. şu şekilde inşa PCR programı: İlk olarak, Taq polimerazı aktive etmek için gerekli olan 5 dakika boyunca 95 ° C 'de bir başlangıç ​​inkubasyon adımı. İkinci olarak, 35 amplifikasyon döngüsü, 1 dk ihtiva etmektedir. 95 ° C, 1 dakika denatürasyon adımı. 50 ° C 'de primer tavlama aşamasından ve 72 ° C'de 1.5 dakika primer uzatma adımı. Üçüncü olarak, 72 ° C'de 10 dakika boyunca son bir uzatmadan oluşmuştur. Son olarak, PCR reaksiyonu, 4 ° C'ye kadar soğutulur.
      Not: Staphylococcus aureus ve H2O pozitif ve negatif kontrol görevi (Şekil 1b).
    2. PCR PCR reaksiyon karışımı içeren tüp yerleştirin ve programı başlatın.
  4. PCR ürünün saflaştırılması
    Not: PCR ürünü saflaştırmak için çeşitli protokoller olarak daEnzim bazlı ya da bir silika yüzerme matris ile birlikte kullanılabilir. Burada kullanılan tek aşamalı PCR temizleme iki hidrolitik enzim reaksiyonları kullanır. Ekzonükleaz I (Exo I) tek sarmallı DNA kaldırır iken, karides alkalin fosfataz (SAP) tüzel kişiliği olmayan dNTP hidrolize. yıkayın - - düşük tuz yıkama döngüsü ikinci prosedür yüksek tuz hızlı bağlama ile bir silika membran adsorpsiyon tekniği dayanmaktadır.
    1. 25 ul PCR ürününe Exo ve Sap her ikisini de içeren bir enzimatik karışımı 1.5 ul ekleyin, iyice karıştırın ve 80 ° C'de 15 dakika, ardından 37 ° C'de, ilk 15 dakika içinde basit bir protokol uygulanarak bir PCR transfer. -20 ° C'de saflaştınlmış PCR ürünü, ya saklayın veya PCR etiketlenmesi için hedef olarak doğrudan kullanımı.

3. DNA Agaroz Jel Elektroforezi

  1. Elektroforez tamponu (TBE tampon) hazırlanması
    1. (10 54.0 g (445 mM) Tris baz, 27.5 g (445 mM), borik asit ve 0.5 M EDTA 20 ml titremM) bir şişe içinde NaOH ile pH 8.0 çözeltisi ve 1.000 ml'lik toplam hacme kadar damıtılmış su ile doldurun. Sonra elektroforez için distile su (0.5x TBE) ile bu 5x tampon 01:10 sulandırmak.
  2. Yükleme Tamponu hazırlanması
    1. 250 mavi mg bromofenol, 250 mg ksilen cyanol FF ve bir balona polisükroz (Malzeme Tablosu) 15 g karıştırın. Daha sonra, 100 ml'lik toplam hacme kadar 0.5x TBE tamponu ile doldurun. Daha fazla kullanım için -20 ° C 'de yükleme 1 ml'lik kısımlar boyayı ve mağaza kısım.
  3. Agaroz Jel Döküm
    1. (Ağırlık / hacim) agaroz jel,% 2 hazırlamak için, agaroz bir şişede 300 mL 0.5x TBE tamponu (bkz 3.1.1) 6 g, standart elektroforezi tartılır. Daha sonra agaroz tamamen eriyene kadar ısıtın, bir mikro dalga fırın içinde yakın kaynama noktalı agaroz karışımı koymak ve çözelti berrak görünür.
    2. Erimiş agaroz yeterince soğumasını bekleyin ve% 1 10 ul ekleyin etidyum bromür stok Solu (w / v)yon. bir döküm haline çözüm dökün ve döküm (30 kuyular için izin) bir jel tarağı yerleştirin. Jel tamamen katılaşmış olduğunda tarağı çıkarın ve 0.5x TBE tamponu içeren elektroforez odasına jel koydu.
      NOT: Etidyum bromür toksik ve mutajenik olduğunu. Bu nedenle dikkatli ele alınmalıdır. Nitril eldiven kullanılması tavsiye edilir. toksik olmayan bir alternatif olarak kullanılabilecek alternatif interkalasyon nükleik asit lekeler bulunmaktadır.
  4. PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi
    Not: PCR amplikonlarının doğru boyutu doğrulamak ve saflaştınlmış PCR ürünü, agaroz jeli içinde ayrılmış DNA konsantrasyonu tahmin etmek için.
    1. Pipet 2, bir PCR reaksiyon tüpüne yükleme tamponu ul PCR ürününün 8 ul ilave edin. jel kuyulara bu karışımı pipetle. PCR ürününün boyutunu tahmin etmek için, ayrı bir biçimde düzenlenmiş bir moleküler boyut işaretleyici (DNA merdiveni) 8 ul ekle.
    2. Uygulamaksabit 10 V / cm voltaj ve Bromophenol Mavi işaretleyici yaklaşık ¾ jel toplam uzunluğunun ulaşmıştır en kısa sürede elektroforez durdurun. UV-transilluminator (dalga boyu 302 nm) kullanılarak ayrılır PCR parçaları görselleştirmek ve bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak belge. DNA merdiveni ile karşılaştırma yapılarak DNA miktarını tahmin edin. etiketleme PCR için hedef olarak yaklaşık 10 ng kullanın.

4. Sanger dizileme

  1. Cycle Sequencing PCR
    NOT: ticari bir kit (Malzeme Tablosu) kullanarak 10 ul reaksiyon PCR etiketleme gerçekleştirin.
    1. 5x Reaksiyon master 2 ul DNA hazırlama 2 ul, TPU1 ya RTU4 çalışma çözeltisi (10 pmol / ul) ve DNAaz 4.5 ul, ve RNaz içermeyen su 1.5 ul ekle.
    2. Bir termalcycler bu sıralama reaksiyon karışımı koyun ve başka PCR çalıştırın. Toplam olarak, 25 ile devir (96 ° C, bir sunileştirme aşamasından,10 saniye), bir tavlama aşaması (45-60 ° C, 5 saniye) ve bir uzatma aşamasından (60 ° C, 2 dakika). Son olarak, 4 ° C'ye kadar reaksiyon soğutulur.
  2. Sekanslama reaksiyonu saflaştırılması
    1. PCR saflaştırma (Malzeme Tablosu) ticari dönüş sütunlarını kullanarak etiketleme reaksiyon karışımı arındırın.
    2. Önceden hidratlanmış jel filtrasyon matris üzerine sıralama reaksiyonunun 10 ul yükleme ve 3 dakika boyunca 750 x g'de bir santrifüjleme adımı gerçekleştirmek.
      Not: Birleşmemiş boya terminatörler jel matris içinde muhafaza edilir, bu prosedürün kullanımı ile.
    3. Daha sonra, bir vakum yoğunlaştırıcısı sulu eluat kurutun. 40 ° C'de 20 ila 30 dakika için 2500 x g'de santrifüjleyin kurumanın tamamlanması.
    4. yüksek deiyonize formamid 10 ul, daha sonra 2 dakika süre ile, 90 ° C'de denatüre etmek ve buz karışımı soğumaya ekleyin. Pipet 96 oyuklu bir plaka üzerinde ul denatüre numunelerin 10 ul. Analiz ise -20 ° C de kurutulur ve temizlenmiş PCR ürünü Mağazadaha sonra yapılacak.
  3. 16S rRNA gen sıralamada ve DNA Sekans Analizi
    NOT: Otomatik bir sequencer (Malzeme Tablosu) üzerine dizi analizi yapın. Burada kullanılan Sequencer sıvı polimer 67 (Şekil 1 c) (50 cm 4-kapiller dizi) eş zamanlı olarak 4 örnekleri analiz otomatik bir flüoresan bazlı kapiler elektroforez sistemidir.
    1. sequencer mikrotiter plaka koyun. 2'de düzenlendiği şekilde bir örnek levha (plaka kaydı) yaz, kaydetmek ve 1 de verilen adımları izleyerek sıralama çalıştırma / analiz başlar.
      NOT: Bir dizi çalışma süresi 2 saat ve 800 1000 bp veri sağlar.
    2. Dizilim analizi yazılımı (Malzeme Tablosu) açın. Dizi verileri bir metin dosyasına (.seq) ve kalite değerleri (QV) de dahil olmak üzere Elektroferogram içeren bir dosya olarak verilmektedir (.ab1).
      NOT: Baz arama başına otomatik olarakdizi analizi yazılımı ile oluşturulur ve altta yatan elektroferogramıdır görsel olarak kontrol edilir (örneğin, pik yüksekliği, tepe ayrılması) sırayla önce daha fazla uygulamalar için kullanılır.
    3. NCBI nr veritabanı kullanılarak BLAST algoritması (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) saklanan DNA dizisi dosyasını karşılaştırın.

5. MALDI-TOF MS

NOT: kütle spektrometresi bir 337 nm N2 lazer kullanan ve belirli bir kontrol yazılımı (Malzeme Tablosu) tarafından işletilmektedir. Spektrumlar, doğrusal modda 2.000 ila 20.000 Da kaplıdır arasında bir kütle aralığı kaydedilir. Örnekler puanları veri yorumlama ve tahsisi bir analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) (Şekil 1d) tarafından gerçek zamanlı olarak yürütülmektedir.

  1. MALDI-TOF MS analizi için Bakteri hazırlanması
    1. Col (örn, Myroides odoratimimus) ilgi bakterileri büyürbakteri suşu (Şekil 2a) bağlı olarak, 18 ila 24 saat boyunca 37 ° C'de% 5 at kanı içeren Umbia Kan agar. kültür soruşturma altında organizmanın Morfotip yanı sıra saflığını doğrulamak için Gram boyama gerçekleştirin.
    2. 96 oyuklu bir çelik, hedef bir kuyucuğuna tek bir bakteriyel koloniden aktarmak için bir kürdan (Resim 2b ve 2c). Noktası 1 çelik hedef hava ile kurutulmuş organizma üzerine% 70 formik asit ul, yaklaşık 2-3 dakika boyunca kurumaya bırakın.
    3. Daha sonra, bir organik çözücü (% 50 asetonitril,% 2.5 trifloroasetik asit,% 47.5 H2O) 'de 50 mg / mL CHCA (α-siyano-4-hidroksisinamik asit) ihtiva eden, 1 ul matrisi çözeltisi ile yer kaplaması.
      Not: (kalıp hazırlama yöntemi ile) asit bindirme yöntemi kütle spektrumları kalitesini artırmak için kullanılabilir. Gram-pozitif bakteriler için gösterilmiştir böyle bir "asit saldırısı" skor va artırırÖlçülen spektrumları 45 frengi.
      Not: Alternatif olarak, bir otomatik örnek hazırlama sistemi (Malzeme Tablosu) olan bir birinci kurutma döngüsünden sonra 1 | il% 70 formik asit solüsyonu ve temas bilgilerini lekeler, 1 ul matrisi çözeltisi bakteriyel yayma uygulanır kullanılabilmektedir. Örnekler daha sonra% 60 nispi nemde standart koşullar altında kurutuldu ve analiz için kullanılacak hazırdır.
    4. matrisi ile smear bir kaputu yaklaşık 5 dakika süreyle tekrar hava kuru üst üste edelim. uygulanan matris ile bu bakteri yayma artık birçok saat boyunca stabildir.
      NOT: matris olmadan Bakteriyel smear nedeniyle protein yıkımı stabil olmayabilir.
  2. -TOF MS Analizi Sahne
    1. numune tanıtımı
      1. Bizim MMIS (Malzeme Tablo) kontrol yazılımı açın.
      2. enstrümanın IN / OUT düğmesine basarak kütle spektrometresi örnek yükleme noktasını havalandırınız.
      3. Bir tıklama sonra yükleme noktasını açın ve kurutulmuş bakteriyel smear artı matris ile MALDI-TOF MS hedef plakası yerleştirin.
      4. port kapatın ve tekrar tahliye. Vakum gözlemleyin ve ulaştığında 4.5 x 10 -6 mbar ölçümü başlatın.
    2. numune Analizi
      1. Bizim MMIS (Malzeme Tablo) analiz yazılımı açın ve "Dosya" menüsünü tıklatın. "Yeni sınıflandırma" ve yeni bir pencere "MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı" Seç açılır. Proje adı "alanına, Myroides ölçüm project_1" örnek için, proje adını yazın "ve düğmesine basın," Yeni bir proje "olarak adlandırılan yeni bir diyalog kutusu altında." Yeni "onay proje adı ve düğmesine basarak devam" Tamam ".
      2. "MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı" açık "analit yerleştirme" penceresini gözlemlemek. Hedef seç pozisyonları (örneğin, A1, A2, A3 ...), sağ-click seçilen herhangi bir (mavi kare ile gösterilir) pozisyonu ve "örnekleri Ekle" seçeneğini seçin. Örnek adı, örnek kimliği ve isteğe bağlı olarak bir yorumda otomatik olarak açılır tablo görünümü türü. Devam etmek için lütfen "Next" tıklayın.
      3. "MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı" açık "Seçim MALDI ve biotyper yöntemleri" penceresini gözlemlemek. dan "Bruker Taksonomisi" "sınıflandırma ağaçlarından MSP'ler" ı seçin ve devam etmek için "İleri" düğmesine tıklayın.
      4. "MALDI biotyper gerçek zamanlı sınıflandırma sihirbazı" açık "Proje özeti" penceresini gözlemlemek. Gerçek sınıflandırma projesi için yukarıda verilen eklenen girişleri kontrol edin. Lütfen "Finish" tuşuna basarak çalıştırın sınıflandırma başlatın (Şekil 2d - f). Uygun vakum ulaşıldığında Ölçüm otomatik olarak başlar.
      5. Ölçüm başarıyla tamamlanana kadar sınıflandırma çalışmasını izleyin. t sonuçlar tablo görüntüleO "MALDI Biotyper Gerçek Zamanlı Sınıflandırma Projesi Myroides ölçüm project_1" menüsü "Görünüm" açın ve "Sonuçlar" butonuna tıklayınız.
      6. varsayılan web tarayıcısında HTML dosyası olarak "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Sınıflandırma Sonuçları" görüntüleyin. Yazdırın ve sonuçları kaydedin.
    3. Cihazı kalibre ve enstrüman doğrulama haftalık (enstrüman kendi kendini sınama) gerçekleştirmek için analiz örnek günlük öncesinde bir test standardı ölçün.
      NOT: Ölçüm MALDI-TOF spektrumları sırasında analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) tarafından gerçek zamanlı olarak analiz edilmektedir. kendi puanlarıyla on türlerinin listesi verilmiştir ve raporlama için laboratuvar bilgi sistemi (LIS) beslenir.
    4. Kritik MALDI-TOF MS sonuçları (Örnek sonuçlara bakınız) ve, uygun olduğunda, bu için gerekli olan Gram boyama durumunda biochemical- ve antibiyotik duyarlılık profilleri veya 16S rRNA gen dizilimi ve diğer testler arasında, değerlendirilmesimikrobiyolojik raporuna bakteri türlerini atama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

-TOF MS bir roman, mikrobiyolojik rutin teşhis için hızlı ve ucuz bir yöntemdir. MALDI-TOF MS tarafından bakteri türleri tanımlama özellikle ribozomal proteinler, aynı zamanda diğer "çevre koşullarından en az bir ölçüde etkilenen ev tutma işlevleri ile çok korunmuş protein" oluşan spektrumları üreten bu MMİS 17 .bir veritabanı başvurusu spektrumları büyük bir kümesini içerir ve genelde klinik izolatlarda bulunan bile bakteri güvenli 7,56,57 tespit edilebilir. Skor değerlerinin tespit türlerin güvenilirliğini göstermektedir. 2.300 yukarıdaki puanları kuvvetle muhtemel türler kimlik temsil 2.000 ve 2.300 arasında bir skor güvenli bir tür kimlik gösterir olası bir tür tanımlaması için 1.700 ile 2.000 standları arasında bir skor ile 1.700 altında bir skor olmayan güvenilirdir. Birden fazla türün halinde 2.000 ek TES üzerinde bir skor ile belirlenmektedir,ts uygulanmak zorundadır ve bu skor altında olduğu böyle bir durumda vb Gram boyası, hareketliliği gibi bakteriyel morfolojik ve / veya fenotip adresleme farklı tür 16S rDNA sıralama, API olarak yöntem ve teknikleri bir araya getirmiştir sebebi budur 1.700 söz konusu testler güvenilir bir tür kimlik elde etmek için kullanılması gerekmektedir. MALDI-TOF MS ile 16S rDNA sekanslama bir kombinasyon en son 56-58 gösterilmiştir. 16S rDNA sekans benzerliklerinden dayalı türler tespiti için net kurallar hala 22,61 eksik olduğunu işaret edilmelidir. Stackebrandt ve Göbel 61 tarafından önerilen pratik yorumlanması için, ≥97% ait homolojiler, 56 kullanılır. DNA dizilimi gelişmeler genom sekansı göre bakterilerin prensibi tanımlanması, bu nedenle, nispeten düşük maliyetle nesil tekniklerle tam bakteriyel genom belirlenmesini sağlar ve. Bu teknik, daha önce kullanılmış olantabanlı salgın yönetimi ya da epidemiyoloji 9,29 olarak genom. Ancak, en güçlü sınırlama bugün son kullanıcı için 65 yazılım paketleri kullanımı kolay olmaması.

Rutin tanı sırasında hasta numunelerinden izole edilmiş ve her iki MALDI-TOF MS ile 16S rRNA gen dizilemesi ile analiz nadir olarak oluşan bakteriler verilen örnekler, Tablo l'de listelenen 1. # 6 streyn 1. MALDI-TOF spektrumu, Şekil 3 'de gösterilmiştir ve suşu # 7, Sphingobacterium spiritivorum, bir spektrum Şekil 1e gösterilmiştir. Tüm izolatlar, yüksek MALDI-TOF MS analizi puanları 99 ila% 100 16S rDNA sekansına homoloji göstermektedir. Böylece, her iki teknik cins ve tür kimlik güvenli yol. Myroides sp kimlik yöntemlerinin karşılaştırılması üzerine bir son yayında işaret Ancak,., MALDI-TOF MS ve 16S rRNA gen dizilimi kombinasyonu daha güvenilir r yol açtısonuçları · Borçlar 56. Bu veriler, kullanılan tek yöntem her zaman, güvenilir bir tanım sonucu elde etmek için yeterli olmayabilir göstermektedir. İki bağımsız yöntemlerin kombinasyonu daha yüksek bir doğruluk yol açar ve in-house girişleri net bir tür tanımlama 56 sonuçlanmıştır ticari MALDI-TOF MS veritabanı genişletir.

Gerilme 1. Chryseobacterium gleum olarak tespit edilmiştir (MALDI-TOF MS 2.490, dizi homolojisi% 99 puan). Chryseobacteria Gram-negatif, fermente edici olmayan çubuklar ve Myroides spp. Chryseobacterium spp ilgilidir. septisemi, pnömoni ve idrar yolu enfeksiyonu ile ilişkili ortaya çıkan patojenler olarak kabul edilmektedir. Cinsi Chryseobacterium tür çok sayıda içerir ve en iyi incelenen türlerin Chryseobacterium indologenes olup. Myroides sp neden olduğu enfeksiyonlara benzer., Daha çok bağışıklık yetersizliği olan hastalar etkilenmektedir6,10,60. Gerilme 2. Myroides odoratimimus olarak tespit edilmiştir ve Myroides odoratus olarak suş 3. (MALDI-TOF MS 2.436, dizi benzerliği% 99 puan) Myroides sp (MALDI-TOF MS 2,237, dizi benzerliği% 99 puan). sepsis, selülit ve pnömoni gibi ciddi hastalıklara ilişkili Gram-negatif, fermente çubukları bulunmaktadır. Çoğunlukla altta yatan hematolojik veya onkolojik hastalıkları olan bağışıklığı baskılanmış hastalarda 8,18,42 etkilenir. (2.092, dizi homolojisi% 99 puan, MALDI-TOF MS) Gerilme 4. Sphingobacterium multivorum 32,71 olarak tespit edilmiştir.

Bakteriler bağışıklığı baskılanmış hastalarda 5,24,44,53 yılında septisemi neden olabilir Gram-negatif fermente edici olmayan çubuklar vardır. Buna ek olarak, önemli meningoensefalit bir durumda 70 bildirilmiştir. lekeleri 5. (MALDI-TOF MS 2.282 puan, dizi homolojisi% 100) ve # 6 (MALDI-TOF MS 2.289 sekans homologunu skory% 100) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica olarak tespit edildi. Bu bakteriler ilk kez 2008 yılında parazit sinek Wohlfahrtia magnifica larvaları izole ve tarif edilmiş Gram-negatif çubuklar, non-motil, kısa 66. Bunlar zoonotik bakteriler ortaya çıkan patojenler olarak kabul edilir ve bakteriyemi, septisemi ve yumuşak doku enfeksiyonları 4,40,64 için etkenler. İlginçtir, bildirilen hastaların çoğu evsiz ve / veya alkolizm muzdarip ve bu nedenle, bu nadir patojenlerin oluşumu evsiz nüfusun 4,54 yılında ektoparazit yüksek oranda açıklanabilir ya idi. Gerilme 7., Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS 2.269 puan, dizi homolojisi% 100), nadir görülen bir patojendir. Bu immün sistemi baskılanmış hastalarda ve ilk insan izolatlarında enfeksiyonları 1982 31,71 tarif edildi neden olabilir. Yeni bir rapor bac bir ölümcül vaka için Sphingobacterium spiritivorum olarak nedensel ajanı tanımlarakut miyeloid lösemi 38 olan bir hastada teremia ve sepsis.

Şekil 1
Şekil 1:., Nükleik asit ve / veya Tıbbi Mikrobiyoloji laboratuarda klinik olarak bakterilerin kütle spektrometresi tabanlı algılama için iş akışı, (a), hedef DNA bir saf kültür başlayarak bir PCR amplifiye edilir, (b). PCR amplikonlarının Sanger teknolojisi (c) kullanarak dört kılcal sequencer sıralanır. Diziliş analizi sonuçlarından, bilgisayar destekli olarak karşılaştırılması, veritabanı girişlere sorgulama sekansları yüzde homolojiler olarak tespit edilir. Bir ikinci, proteomik göre yöntem olup, bunun MALDI-TOF MS skoru içeren Sphingobacterium spiritivorum, verilen kütle spektrometrisi (d) ve Tablo 1 'de streyn 1. merkezinde kütle spektroskopik sonucu (e <kullanır/ Strong> '). Kütle spektrometresi ve 16S rRNA gen dizilimi kombinasyonu daha güvenilir ve doğru tür kimlik elde etmek için gerekli olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Klinik olarak ilgili bakterilerin tanımlanması için MALDI-TOF MS ile analiz prosedürü bir operatör bütün hücreli bakteriyel madde alır: (a) saf kültürden bir kürdan ile (b) ve çelik hedefin (c) ile ilgili bakteriyel smear yerleştirir. Çelik hedef kütle spektrometresi yükleme ağzının içine sokulur. 5 x 10 -6 mbar'lık uygun elektrikli ulaşıldığında, hedef iyonizasyon bölmesinde taşınacaktır. Bir N2 -lase kullanılmasıR, iyonları bir elektrostatik alan (d) 'de hızlandırılmış ve uçuş borusu (e)' de ayrılmış olan yumuşak bir desorpsiyon tarafından oluşturulur. Iyonları için gerekli uçuş (TOF) zaman doğrudan kütleye ilgili uçuş tüp (f) ve detektörü ulaşmak ve kitle doruklarına sonraki hesaplamalar temelini oluşturuyor. Belirli kimlik yazılımı (Malzeme Tablosu) sonra iyonize bakteriyel proteinlerin kütle spektrumu parmak izi için puan değerleri atar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Nadir patojenlerin MALDI-TOF spektrumu ve atanan puanlar Bu şekilde, ilk altı nadir patojenler lis temsilcisi MALDI-TOF spektrumu.Tablo 1'de ted gösterilmiştir. Türler adı ve ilgili MALDI-TOF MS puanı her spektrum belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3.
Gerilme MALDI kimlik MALDI puan 16'lar rDNA sonucu BLAST homoloji
1. Chryseobacterium gleum 2,211 Chryseobacterium gleum % 99 oranında özdeş
2. Myroides odoratimimus 2,397 Myroides odoratimimus % 99 oranında özdeş
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus % 99 oranında özdeş
4. Sphingobacterium multivorum 2.093 Sphingobacterium multivorum % 99 oranında özdeş
5. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica % 100 identik olan
6. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica % 100 identik olan
7. Sphingobacterium spiritivorum 2,269 Sphingobacterium spiritivorum

Tablo 1: 16S rRNA dizilemesi göre nadir olarak oluşan bakteriler Örnek MALDI-TOFs sonuçlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

-TOF MS ve 16S rRNA gen sıralama Hem farklı bakteri çok sayıda tespit imkanı sunuyoruz. MALDI-TOF MS kolu ve bakteriyel kütle spektrumları büyük veri tabanları kullanılabilir kolay, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Bu nedenle, MALDI-TOF MS nadir bakteriyel patojenler 17,20,39,51 odaklanmış tarama çalışmaları yapmak için hızlı, uygun maliyetli ve güvenilir bir yöntemdir. Diğer fenotipik tanımlama yöntemleri, Seng ve ark. Göstermiştir maliyet etkinliği ve MALDI-TOF MS 59 ve Tan hızı ile MALDI-TOF MS karşılaştıran prospektif çalışmada ark. Laboratuar ortamında bakteri tanımlama için reaktif ve işgücü maliyetlerinin bir azalma rapor yılda 62% 56.9 ile. Böyle bir maliyet düşürme Gaillot ark bir not ile desteklenmektedir. 28

Öte yandan, 16S rDNA dizi daha zaman alıcı, zahmetlidir ve garanti s uzmananalizi 34 gerçekleştirmek için ersonnel. Bununla birlikte, her iki yaklaşım rutin teşhis için uygundur ve iki yöntem kombinasyonu şüpheli sonuçların 56 durumunda özellikle yararlıdır daha yüksek bir güvenilirlik ve daha güvenli kimlik doğruluğu, neden olduğunu göstermektedir olabilir. Bu nedenle, biz rutin teşhis nadir görülen bakteri kimlik doğrulamak için en iyi yaklaşım olarak her iki yöntemin birleşimini öneriyoruz. Güvenilir tür tanımlaması için, karışık kültürler türlerin belirlenmesi önlemek için saf bakteri kültürleri kullanmak kesinlikle şarttır. Bir olasılık kontrolü olarak, tür tayini, MALDI TOF MS veya 16S rDNA sıralama biriyle elde edilen Gram boyaması, biyokimyasal karakterizasyonu ve klinik sunum 49 sonuçlarına göre olmak zorundadır.

Bakteriyel tanımlama için analitik bir araç olarak kütle spektrometresi ilk olarak 1975 yılında önerilmiştir51. Ancak, bu protein analizi için uygulanabilir bir yaklaşım oluşturmak için 1980'lerin sonuna kadar sürdü. "Yumuşak desorpsiyon iyonizasyon" teknolojisi sağlam proteinlerin analizi sağlayan 2002 yılında Nobel kimya ödülünü aldı 1985 63 içinde Koichi Tanaka tarafından tanıtıldı. Aynı zamanda biyomoleküllerin 37 analiz etmek bir organik asit kullanan ilk olduğu gibi uçuş kütle spektrometresi matris destekli iyonizasyon süresi Hillenkamp ve Karas tarafından tanıtıldı ve bu hala günümüzde kullanılan yöntemdir. MALDI teknoloji tük 23,30,41 kullanılmasına rağmen, bu Bruker Daltonics -TOF MS tabanlı mikrobiyal tanıma rutin haline geldiğini onun microflex MALDI Biotyper sistemi (Pittcon Conference & Expo, 2004, basın açıklaması) tanıttı 2004 yılına kadar sürdü tanı tekniği 46. -TOF MS tekniklerindeki son yaklaşımlar çoğul dirençli bakteri tespit, mayalar tanımlamak için fırsat verdive antimikrobiyal duyarlılık testleri 17,51 gerçekleştirin. Dahası, bazı prosedürler doğrudan idrar ya da kan kültürleri 17,51 olarak birincil numunelerin, bakteriler analiz imkanı sunuyoruz.

Bu sistemin kullanılması esas kolay olmasına rağmen, sonuçlarını etkileyebilecek bazı tuzaklar vardır. Örneğin mikroorganizma yaşı bakteriyel protein ekspresyonu ve bu nedenle sonuç tekrarlanabilirliği etkiler. İlk olarak, büyüme koşulları bir sorun olabilir. Bir örnek olarak, Escherichia coli gibi Enterobakteriler fermente edici olmayan bakteriler daha hızlı büyür (örneğin Pseudomonas aeruginosa a) ve bunun sonucu olarak daha önce 17 analiz edilmesi gerekir. İkinci olarak, MALDI-TOF MS için kullanılan matris kullanılabilir lazer dalga boyu için güçlü bir lazer optik emme sahip küçük organik asit molekülünden oluşur. Analizden önce matris numuneye eklenir ve her iki bileşen, bir crystallizatio geçmesikatı bir eriyik oluşturduğu N işlemi.

Matris içinde değişiklikler bakteri tanımlama 17 doğruluğunu etkileyebilir açıklıyor. Bu nedenle, taze 7 gün daha eski Matrisi hazırlanabilir, kullanılmalıdır. Üçüncü olarak, bakteri kimlik etkileyebilir toplanır olan ortamı 17,68 sonuçlanır. Örneğin, MacConkey ağarı bir bileşenidir kristal mor, kütle spektrumları 17 engeller. Ayrıca, çelik hedefine uygulanan çok sayıda bakteri düşük puan sağlayacaktır ve bu nedenle kimlik doğruluğunu etkiler. Nedenle, bir analiz yapılmaktadır olarak nasıl anlaşılır kriterleri tanımlamak için tavsiye edilir. Bununla birlikte, MALDI-TOF MS tarafından gerçekleştirilen yanlış sonuçlar çok veri tabanında yer alan yeterli bir referans spektrumları kaynaklanır. (Şu veri tabanı> 6000 girdileri içerir.) Bu, özellikle hala anaerobik bakteri 17 tanımlanması için geçerlidir. Bununla birlikte,size ilave spektrumları kullanıcı tarafından eklenebilir. Örneğin -TOF MS kütüphane gibi Mycoplasma sp yeterince özgün veritabanı tarafından ele alınmayan izolatların, 98 ek referans spektrumları mevcuttur., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. Ve Chryseobacterium sp. Sonuç olarak, ek bir referans spektrumları bir yüksek tanımlama doğruluğu 59,69 yol açacaktır. Son olarak, bazı durumlarda, farklı türlerin spektrumu çok benzer. Bu Escherichia coli ve Shigella spp ayrımcılık olarak durumlarda hatalı tanımlama yol açabilir. veya Streptococcus pneumoniae ve Streptococcus 17,51 mitis.

16S rDNA ve rpoB gibi ek genlerin Ardışık nadir veya bilinmeyen bakterilerin moleküler kimlik basitleştirilmiş var. Bu genler çok bakteri yaygındır ve bireysel fonksiyonuduraynıdır. Bu cins ve türler düzeyde ayırt edilmesine olanak verecek sonuçlar için yeterli genetik değişkenlik sahip olduklarından, ancak, bunlar, bakteriyel tanımlama 34 için kullanılabilir. Stackebrandt ve Göbel göre, homolojiler <% 97 farklı türler 61 temsil etmektedir. Ancak,>% 97 kökendeşliklerin mutlaka güvenli bir tür kimlik 34,47 yol açmaz. Bu belirsizlikler çeşitli nedenleri vardır.

Homoloji hesaplamak için kullanılan veritabanlarının kalite 34 bazen tartışmalı olduğunu. 16S rDNA düzeyinde yüksek homolojiler mevcut durumlarda, belirsizlikler türlerin belirlenmesi neden olabilir. farklı genetik bölgelerin bir arada, bu nedenle daha güvenli sonuçlara yol açabilir. Ayrıca, 16S rDNA dizi veri 22,34,61 yorumlanması için genel kurallar vardır. Ancak, mevcut veritabanlarının güvenilirliğini artırarak daha yüksek bir Accu yol açacaktırBu molekül bir yaklaşım 34 kullanılarak bakteriyel tanımlama için ateşli. Biz sıralama sonuçlarının doğruluğu çoğunlukla altta yatan PCR kalitesine güvenmektedir bahsetmek gerekir sıralama reaksiyonu ile ilgili olarak. Sonuçlar, kamu veritabanlarında listelenen girdileri bunları karşılaştırarak elde ediliyor çünkü Ayrıca, dizi girişleri ve veri bakım kalitesi büyük önem taşımaktadır.

Her iki yaklaşım, MALDI-TOF MS ve 16S rRNA gen sıralama, avantajlara sahip olmasına rağmen genel olarak, onlar da zayıflıkları vardır. her iki metodunun kombinasyonu Bununla birlikte, bakteriyel tanımlanması için yüksek bir kesinlik sağlamaktadır. Örneğin, bir önceki çalışmada biz -TOF MS Myroides odoratimimus ve Myroides odoratus 56 ayırt etmek mümkün olduğunu göstermek olabilir. Sonuçlar türler onaylamak olabilir 16S rDNA sıralanması ile elde ederken birkaç durumda MALDI skor, güvenilmez tür kimlik önerdiKimlik. Bu izolatların kütle spektral parmak daha sonra oluşturulan ve bizim MALDI referans spektrumları veritabanına girmiştir. diğer nadir bakteriler odaklanan gelecekteki araştırma önerilen stratejinin uygulanabilirliğini göstermek olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17, (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49, (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79, (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70, (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39, (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19, (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30, (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27, (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8, (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49, (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17, (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95, (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95, (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36, (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42, (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81, (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33, (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6, (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42, (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20, (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25, (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42, (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42, (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43, (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49, (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28, (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10, (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32, (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31, (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14, (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45, (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70, (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18, (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60, (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33, (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45, (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10, (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80, (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45, (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288, (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51, (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46, (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67, (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21, (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6, (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19, (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15, (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79, (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49, (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50, (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42, (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52, (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67, (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78, (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16, (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48, (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2, (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33, (3), 580-598 (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics