Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

Immunology and Infection

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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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Abstract

Il y a un certain nombre d'agents pathogènes bactériens rares et, par conséquent, décrit insuffisamment qui sont signalés à causer des infections graves en particulier chez les patients immunodéprimés. Dans la plupart des cas, seules quelques données, pour la plupart publiées sous forme de rapports de cas, sont disponibles qui enquête sur le rôle de ces agents pathogènes comme un agent infectieux. Par conséquent, afin de clarifier le caractère pathogène de ces micro-organismes, il est nécessaire de mener des études épidémiologiques qui comprennent un grand nombre de ces bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude de surveillance doivent répondre aux critères suivants: l'identification des souches doit être précise selon la nomenclature en cours de validité, ils devraient être faciles à manipuler (robustesse), économique dans le diagnostic de routine et ils doivent générer comparables les résultats entre les différents laboratoires. En général, il existe trois stratégies pour identifier des souches bactériennes dans un cadre de routine: 1) l'identification phénotypique caractérisant le Biochemical et métaboliques propriétés des bactéries, 2) les techniques moléculaires telles que le séquençage du gène ARNr 16S et 3) la spectrométrie de masse comme une approche basée roman protéome. Etant donné que la spectrométrie de masse et les approches moléculaires sont les outils les plus prometteurs pour l'identification d'une grande variété d'espèces bactériennes, ces deux méthodes sont décrites. Les progrès, les limites et les problèmes potentiels lors de l'utilisation de ces techniques sont discutées.

Introduction

Identification sécurisée des agents pathogènes rares dans le diagnostic de routine est entravée par le fait que les méthodes culturales et biochimiques classiques sont encombrants et parfois discutable. En outre, un laboratoire de microbiologie diagnostique doit traiter un grand nombre d'agents pathogènes, allant de quelques centaines à plusieurs milliers par jour, ce qui nécessite l'utilisation de systèmes automatisés. En plus de la gestion d'un débit journalier élevé, l'identification précise des espèces bactériennes est nécessaire. Cela est justifié car ils diffèrent dans leur modèle de sensibilité aux antimicrobiens et l' identification correcte fournit donc le clinicien des informations essentielles pour choisir les antibiotiques appropriés (par exemple, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

systèmes d'identification microbienne automatisée (MUAS) appliquent un ensemble normalisé de réactions enzymatiques pour caractériser les propriétés métaboliques des isolats bactériens par exemple, 47 dans la carte GN du MUAS utilisé dans cette étude 52, ce permis de stratégie identification sécurisée seulement pour un ensemble limité de bactéries. En outre, la base de données, un système expert avancé, est clairement axé sur la détection de bactéries pertinentes et hautement pertinentes d'importance médicale 13,15,16,36. Deux autres systèmes, largement utilisés dans les laboratoires, appliquent également cette approche biochimique pour l'identification bactérienne. Des études récentes démontrent une précision d'identification comparable entre les MUAS utilisés dans cette étude et l' un des concurrents (93,7% et 93,0% respectivement), tandis que le 3 ème MUAS a une précision d'identification de seulement 82,4% sur les espèces de niveau 35. Ces écarts peuvent être expliqués par la qualité des références de données d'identification sous-jacentes, les versions de kits et de logiciels, les différences de metabolisme et la compétence du personnel technique 35,36.

Deux systèmes automatisés MALDI-TOF MS (MALDI-TOF système d'identification microbienne, IHMs) sont principalement utilisés. Ces systèmes permettent la détection d'un grand nombre d'espèces bactériennes en fonction de leurs spectres de masse des protéines d'empreintes digitales. Par exemple, la base de données des IHMs utilisées contient des spectres de référence 6000. Les systèmes d'identification basés sur la spectrométrie de masse offrent une détection rapide et fiable d'une grande variété de micro - organismes , y compris les agents pathogènes rares 11,48,51. À ce jour , seulement quelques comparaisons directes sont disponibles entre les IHMs utilisés dans cette étude et son concurrent 19,33. Selon Daek et al. Les deux systèmes offrent un taux de précision de l' identification similaire élevé, mais les IHMs utilisés dans cette étude semble être plus fiable dans l' identification des espèces 19.

gènes distincts De même, les techniques moléculaires adressage bien conservées mais aussi ( rpoB) permettent une identification claire des espèces 3,22,61. Parmi ceux - ci, l'ADNr 16S est le gène le plus largement utilisé de ménage en raison de sa présence dans toutes les bactéries 34. Sa fonction reste inchangée et , finalement, avec environ 1 500 pb, il est assez long pour être adapté à la bio-informatique 14,34. De nombreux chercheurs considèrent ARNr 16S analyse génétique comme «étalon-or» pour l' identification bactérienne 21. Cela est dû au fait que quelques laboratoires utilisent des techniques d'hybridation ADN-ADN à ce jour pour l' identification des rares ou nouvelles bactéries 14,34. En outre, de plus en plus des bases de données sont disponibles qui peuvent être utilisés pour l' analyse de l' ARNr 16S des gènes 50. Cependant, il doit être pris en compte que les systèmes de détection basés sur l'ADNr 16S ont une sensibilité limitée par rapport aux protocoles de PCR standard. En outre, l'approche moléculaire est sophistiquée, du temps et nécessite un personnel hautement qualifié, ainsi queinstallations de laboratoire dédiées et est, par conséquent, pas facilement mis en œuvre dans le diagnostic de routine 55. En outre, il a été montré que la combinaison d'au moins deux procédés différents d'identification des bactéries conduit à l'identification des souches très précis. La combinaison de séquençage MALDI-TOF MS et ADNr 16S permet d'identifier un grand nombre de différentes espèces bactériennes avec une grande précision. Récemment , la combinaison de l' analyse du gène MALDI-TOF MS et ARNr 16S a été présenté pour l' identification bactérienne étudier les questions épidémiologiques et des agents pathogènes rares 56.

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Protocol

1. Extraction de l'ADN bactérien

  1. Préparation de la solution PBS
    1. Peser 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O et 8,80 g de NaCl dans un flacon et remplir avec de l' eau distillée jusqu'à un volume final de 1000 ml. Ajuster le pH à 7,4. Pour utilisation finale filtrer la solution à travers une bactérie résistant (0,22 um) filtre.
  2. Les bactéries d'extraction d'ADN de bactéries à Gram négatif
    1. Streak le matériel du patient sur ​​les milieux de culture approprié (par exemple, Columbia gélose au sang), d' identifier et d' isoler les agents pathogènes potentiels.
    2. Préparer une culture pure et effectuer la coloration de Gram, afin de déterminer morphotype et pour confirmer la pureté et de la culture 49.
    3. Choisissez une seule colonie bactérienne et le transférer avec un usage unique boucle d'inoculation 1 pi dans un tube de réaction de 2,0 ml stérile qui contient 1 ml de solution PBS.
    4. Incuber cette suspension dans un thermomixer à 95 ° C pendant 10 min. Après incubation, laisser l'extrait bactérien (contenant l'ADN dissous) refroidir à la température ambiante et soit l' utiliser directement pour l' amplification ou conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure (figure 1a).
  3. Les bactéries d'extraction d'ADN de bactéries à Gram positif
    1. Streak le matériel du patient sur ​​les milieux de culture approprié (par exemple, Columbia gélose au sang), d' identifier et d' isoler les agents pathogènes potentiels. Effectuer la coloration de Gram pour confirmer morphotype de la culture.
    2. Préparer une culture pure et effectuer la coloration de Gram afin de déterminer morphotype et de confirmer la pureté de la culture.
    3. Choisir une seule colonie bactérienne avec un mélange 1 ul de boucle d'inoculation stérile et en suspension dans 500 ul de solution PBS dans un tube réactionnel de 2,0 ml.
    4. Ajouter 500 ul de perles de verre et le transfert du tube vers un homogénéisateur oscillant, fonctionnant à une fréquence et une amplitude maximale (50 Hz), pendant 5 min. Utilisez perles de verre de 1,0 mm de diamètrepour perturber les parois cellulaires bactériennes.
    5. Incuber ce tube pendant 10 min à 95 ° C et laisser refroidir à température ambiante. Utilisez l'extrait soit directement pour la réaction PCR ou conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.

2. ADNr 16S PCR

  1. Préparation de Amorces d'amplification
    1. Utilisez les amorces TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) comme amorce avant et RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') comme amorce inverse 25. Préparer une solution d'amorce d'actions avec DNAse et RNAse eau libre, ayant une concentration de 100 pmol / pl (100 uM) et diluer davantage à une solution de travail à 10 pmol / ul. Stocker l'amorce stock et la solution de travail à -20 ° C ou utiliser directement.
  2. Préparation du mélange de PCR
    1. 1 ul de chaque amorce, 1 ul de dNTP mix (100 mM), 2,5 ul de l'extrait d'ADN, 5 pi de tampon de PCR 10x (contenant 25 mM de MgL' eau libre PCR Cl 2), 0,25 ul Taq polymérase (5 unités / ul) et 39.25 ul DNase et RNase dans un 200 tube de réaction ul stérile.
  3. Protocole de PCR
    1. Démarrer le programme de PCR construit de la manière suivante: Tout d'abord, une étape d'incubation initiale à 95 ° C pendant 5 min, ce qui est nécessaire pour activer la Taq-polymérase. En second lieu, 35 cycles d'amplification contenant une 1 min. étape de dénaturation à 95 ° C, à 1 min. l'étape d'hybridation d'amorce à 50 ° C, et une étape d'extension d'amorce de 1,5 min à 72 ° C. Troisièmement, une extension finale de 10 min à 72 ° C. Enfin, la réaction PCR est refroidie à 4 ° C.
      NOTE: Staphylococcus aureus et H 2 O servent de contrôle positif et négatif (figure 1b).
    2. Placer le tube contenant le mélange de réaction PCR dans le thermocycleur et démarrer le programme.
  4. La purification du produit PCR
    NOTE: Afin de purifier le produit de PCR, plusieurs protocoles soitou à base d'enzymes avec une matrice d'adsorption de silice peuvent être utilisées. Le nettoyage PCR en une seule étape utilisée ici utilise deux réactions enzymatiques hydrolytiques. Alors que exonucléase I (Exo I) supprime l'ADN simple brin, de la phosphatase alcaline de crevette (SAP) hydrolyse dNTP non constituées en société. La deuxième procédure est basée sur une technique d'adsorption sur membrane de silice avec un sel élevé de liaison rapide - lavage - cycle d'élution faible teneur en sel.
    1. Ajouter 1,5 ul d'un mélange enzymatique contenant à la fois Exo I et SAP au produit PCR de 25 ul, mélanger soigneusement et transférer à un thermocycleur l'application d'un protocole simple de 15 premières minutes à 37 ° C puis 15 min à 80 ° C. Stocker le produit PCR purifié soit à -20 ° C ou l'utiliser directement comme cible pour l'étiquetage de PCR.

3. ADN Agarose Gel Electrophoresis

  1. Préparation du tampon d'électrophorèse (TBE-tampon)
    1. Titrer 54,0 g (445 mM) de base TRIS 27,5 g (445 mM) d'acide borique et 20 ml d'une EDTA 0,5 M (10mM) solution à pH 8,0 avec NaOH dans un flacon et de le remplir avec de l'eau distillée à un volume total de 1000 ml. Ensuite diluer ce tampon 5x 1:10 avec de l'eau distillée (0,5x TBE) pour l'électrophorèse.
  2. Préparation du tampon de chargement
    1. Mélanger 250 mg de bleu de bromophénol, 250 mg de xylène - cyanol FF et 15 g de polysaccharose (Matériaux de table) dans un flacon. Ensuite, remplissez-le avec du tampon 0,5x TBE à un volume total de 100 ml. Aliquoter le colorant de charge à 1 ml portions et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
  3. Coulée du gel Agarose
    1. Peser électrophorèse standard de 6 g d'agarose à 300 ml de tampon 0,5x TBE (voir section 3.1.1) dans un ballon, pour préparer un 2% (p / v) gel d'agarose. Ensuite, mettre le mélange d'agarose dans un four à micro-ondes, chauffer point près d'ébullition jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous et la solution semble claire.
    2. Laissez-les refroidir suffisamment agarose fondu et ajouter 10 ul d'un 1% (p / v) de bromure d'éthidium actions solution. Verser la solution dans un moule et placer un peigne de gel (permettant 30 puits) dans le casting. Retirer le peigne lorsque le gel est complètement solidifié et mettre le gel dans la chambre d'électrophorèse contenant un tampon 0,5x TBE.
      NOTE: Le bromure d'éthidium est toxique et mutagène. Par conséquent, il doit être manipulé avec précaution. Il est conseillé d'utiliser des gants en nitrile. Il y a des taches de l'acide nucléique intercalant d'autres qui peuvent être utilisés comme une alternative non toxique.
  4. Electrophorèse sur gel d'agarose des produits de PCR
    NOTE: Afin de vérifier la bonne taille des amplicons PCR et pour estimer la concentration d'ADN du produit PCR purifié est séparé dans un gel d'agarose.
    1. Introduire à la pipette 2 pi de tampon de charge dans un tube de réaction PCR et ajouter 8 ul du produit de PCR. Ce mélange pipeter dans les puits du gel. Ajouter 8 ul d'un marqueur de taille moléculaire en poids (échelle d'ADN) dans un puits séparé pour estimer la taille du produit de PCR.
    2. Appliquerune tension constante à 10 V / cm et arrêter l'électrophorèse, dès que le marqueur de bleu de bromophénol ait atteint environ les ¾ de la longueur totale du gel. Visualisez les fragments PCR séparés en utilisant un transilluminateur UV (longueur d'onde 302 nm) et les documenter à l'aide d'un système de gel documentation. Estimer la quantité d'ADN par comparaison visuelle avec l'échelle de l'ADN. Consommerait environ 10 ng comme cible pour le marquage par PCR.

4. Sanger séquençage

  1. Cycle Sequencing PCR
    REMARQUE: Effectuer l'étiquetage PCR dans une réaction de 10 ul en utilisant un kit commercial (tableau Matériaux).
    1. Ajouter 2 ul de mélange maître de réaction 5x, 2 ul de la préparation d'ADN, 1,5 pi de solution ou TPU1 RTU4 de travail (10 pmol / pl) et 4,5 pi de DNAse et de RNAse eau libre.
    2. Mettez ce mélange réactionnel de séquençage dans un thermocycleur et exécuter un autre PCR. Au total, ce procédé 25 cycles consistant en une étape de dénaturation (96 ° C,10 sec), une étape de recuit (45 à 60 ° C, 5 secondes) et une étape d'extension (60 ° C, 2 min). Enfin, refroidir la réaction à 4 ° C.
  2. Purification de la réaction de séquençage
    1. Purifier le mélange de réaction de marquage en utilisant des colonnes de spin commerciales pour la purification PCR (Tableau Matériaux).
    2. Charge 10 pi de la réaction de séquençage à la matrice de filtration sur gel pré-hydraté et d'effectuer une étape de centrifugation à 750 g pendant 3 min.
      REMARQUE: Par l'utilisation de cette procédure terminateurs de colorant non incorporés sont retenus dans la matrice de gel.
    3. Sécher ensuite l'éluat aqueux dans un concentrateur sous vide. Centrifuger à 2500 g pendant 20 à 30 min à 40 ° C pour achever la sécheresse.
    4. Ajouter 10 ul de formamide fortement désionisée puis dénaturent à 90 ° C pendant 2 minutes et refroidir le mélange sur la glace. Pipette 10 pi des échantillons dénaturés sur une plaque de 96 pi. Stocker le produit PCR séché et nettoyé à -20 ° C si l'analyse està effectuer à un moment ultérieur.
  3. Le séquençage de l'ARNr 16S génique et analyse de la séquence d'ADN
    REMARQUE: Effectuer une analyse de séquence sur un séquenceur automatisé (tableau des matériaux). Le séquenceur utilisé ici est un système d'électrophorèse capillaire à base de fluorescence automatisé qui analyse les 4 échantillons en même temps (tableau 50 cm 4-capillaire) avec un polymère liquide 67 (figure 1c).
    1. Placer la plaque de microtitrage dans le séquenceur. Ecrire une feuille d'échantillon (enregistrement de plaque) comme prévu dans 2, l' enregistrer et démarrer le séquençage run / analyse qui suit les étapes indiquées en 1.
      NOTE: Durée d'une course de séquence est 2 heures et fournit des données de 800 à 1000 pb.
    2. Ouvrir le logiciel d'analyse de séquence (tableau Materials). Les données de séquence sont données sous forme de fichier texte (.seq) et un fichier contenant l'électrophorégramme y compris les valeurs de qualité (QV) (.ab1).
      REMARQUE: Base de l'appel est automatiquement parformé par le logiciel d'analyse de séquence et l'électrophorégramme sous - jacent est contrôlé visuellement (par exemple, la hauteur du pic, la séparation des pics) avant que la séquence soit utilisée pour d' autres applications.
    3. Comparer le fichier de séquence d'ADN conservé à l'algorithme BLAST base de données NCBI nr en utilisant (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. SM MALDI-TOF

NOTE: Le spectromètre de masse utilise un 337 nm N 2 laser et est exploité par un logiciel de commande spécifique (tableau des matériaux). Les spectres sont enregistrés en mode linéaire et une gamme de masse entre 2.000 à 20.000 Da est couvert. L' interprétation des données et la répartition des scores aux échantillons est effectuée en temps réel par un logiciel d'analyse (tableau des matériaux) (Figure 1d).

  1. Préparation des bactéries pour MALDI-TOF MS
    1. Cultiver les bactéries d'intérêt (par exemple, Myroides odoratimimus) sur Columbia gélose au sang contenant 5% de sang de cheval à 37 ° C pendant 18 à 24 heures, en fonction de la souche bactérienne (figure 2a). Effectuer la coloration de Gram pour vérifier l'morphotype de l'organisme sous enquête, ainsi que la pureté de la culture.
    2. Utilisez un cure - dent en bois pour le transfert d' une seule colonie bactérienne à un puits de 96 puits cible en acier (Figure 2b et 2c). Spot 1 pi d'acide formique à 70% au-dessus de l'organisme séché à l'air sur la cible en acier et laisser sécher pendant environ 2-3 min.
    3. Ensuite, recouvrir la tache avec une solution de matrice 1 ul, contenant 50 mg / ml CHCA (acide α-cyano-4-hydroxycinnamique) dans un solvant organique (50% d'acétonitrile, l' acide trifluoroacétique à 2,5%, 47,5% de H 2 O).
      NOTE: La méthode de superposition acide (sur la méthode de préparation des plaques) peut être utilisé pour améliorer la qualité des spectres de masse. Il a été démontré que les bactéries Gram-positives comme une «attaque acide» va augmenter le scoreLues des spectres mesurés 45.
      NOTE: En variante , un système de préparation automatisée d'échantillons (tableau des matériaux) peut être utilisé dans lequel un contact libre des taches de 1 ul de 70% d' une solution d'acide formique et, après un premier cycle de séchage, la solution de matrice 1 ul sont appliqués sur le frottis bactérien. Les échantillons sont ensuite séchés dans des conditions normalisées à 60% d'humidité relative et sont prêts à l'emploi pour l'analyse.
    4. Laissez le frottis avec la matrice recouverte d'air sec à nouveau pendant environ 5 min dans une hotte. Ce frottis bactérien avec la matrice appliquée est maintenant stable pendant de nombreuses heures.
      NOTE: frottis bactériens sans matrice peuvent ne pas être stable en raison de la dégradation des protéines.
  2. Exécution de la MS Analyse MALDI-TOF
    1. Introduction d'échantillons
      1. Ouvrez le logiciel de contrôle de nos MMIS (tableau Matériaux).
      2. Aérer le port de chargement d'échantillon du spectromètre de masse en appuyant sur la touche IN / OUT de l'instrument.
      3. Ouvrez le port de chargement après un clic et insérer la plaque cible MALDI-TOF MS avec le frottis bactérien séché ainsi que la matrice.
      4. Fermez le port et évacuer à nouveau. Observez vide et quand il atteint 4,5 x 10 -6 mbar démarrer la mesure.
    2. Analyse des échantillons
      1. Ouvrez le logiciel d'analyse de nos MMIS (Matériaux Table) et cliquez sur le menu "Fichier". Sélectionnez "Nouvelle classification" et un nouveau "assistant de classification en temps réel MALDI Biotyper" fenêtre ouvre. Tapez le nom du projet, par exemple les "mesure de Myroides projet_1, dans le champ" Nom du projet "et appuyez sur le bouton" Nouveau ". Dans le cadre de la nouvelle boîte de dialogue nommé" Nouveau projet "vérification du nom du projet et procéder en appuyant sur le bouton" OK ".
      2. Dans le «Assistant de classification Biotyper MALDI en temps réel" observer la fenêtre "placement Analyte" ouvert. Sélectionnez les positions cibles (par exemple, A1, A2, A3 ...), droit-click toute position sélectionnée (indiquée par un carré bleu) et sélectionnez "Ajouter des échantillons". Dans le tableau ouvert automatiquement le type d'affichage de nom échantillon, ID d'échantillon et éventuellement un commentaire. Cliquez sur le bouton "Suivant" pour continuer.
      3. Dans le «Assistant de classification Biotyper MALDI en temps réel" observer la "Sélection de MALDI méthodes de Biotyper" fenêtre ouverte. Sélectionnez "Bruker Taxonomie" de "MSPs des arbres taxonomiques" et cliquez sur "Suivant" pour continuer.
      4. Dans le «Assistant de classification Biotyper MALDI en temps réel" observer la fenêtre "Résumé du projet" ouvert. Vérifiez les entrées insérées données ci-dessus pour le projet de classification réelle. Lancer la classification exécuter en appuyant sur ​​le bouton "Terminer" (Figure 2d - f). La mesure commence automatiquement lorsque le vide approprié est atteint.
      5. Suivez la course de classement jusqu'à ce que la mesure est terminée avec succès. Voir le tableau des résultats en til «MALDI Biotyper Realtime Myroides Classification projet de mesure projet_1" ouvrir le menu "Affichage" et cliquez sur "Résultats".
      6. Voir les "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classification Résultats" en tant que fichier HTML dans le navigateur web par défaut. Imprimer et enregistrer les résultats.
    3. Mesurer une norme quotidienne avant de test pour l'analyse échantillonner pour calibrer l'instrument et effectuer instrument validation hebdomadaire (instrument d'auto-test).
      NOTE: Pendant les spectres MALDI-TOF mesure sont analysés en temps réel par le logiciel d'analyse (tableau des matériaux). Une liste des dix espèces avec leurs scores respectifs est donné et est introduit dans le système d'information de laboratoire (LIS) pour le reporting.
    4. Évaluer de façon critique les résultats MALDI-TOF MS (voir des résultats représentatifs) et, le cas échéant, inclure d'autres tests, tels que les profils biochemical- et antibiotiques susceptibilité ou le séquençage des gènes ARNr 16S et, si nécessaire, coloration de Gram pourattribuant une espèce bactérienne au rapport microbiologique.

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Representative Results

MALDI-TOF MS est une nouvelle méthode rapide et peu coûteuse pour le diagnostic de routine microbiologiques. Bactérienne identification des espèces par MALDI-TOF MS produit des spectres principalement composé de protéines ribosomiques , mais aussi d' autres "protéines très conservées avec des fonctions internes de maintien affectés dans une mesure minimale par les conditions environnementales" 17 base de données .La de cette MMIS contient un grand nombre de spectres de référence et même les bactéries qui sont rarement trouvés dans les isolats cliniques peuvent être solidement identifiés 7,56,57. Les valeurs Score montrent la fiabilité des espèces identifiées. Les scores supérieurs à 2.300 représentent une identification des espèces hautement probable, un score compris entre 2,000 et 2,300 indique une identification des espèces sécurisé, un score compris entre 1.700 et 2.000 peuplements pour une identification des espèces probables et un score inférieur à 1.700 est non fiable. Dans le cas de plus d'une espèce étant identifié avec un score supérieur à 2.000, tes supplémentairests doivent être appliquées, ce qui est la raison pour laquelle nous avons combiné différentes méthodes telles que le séquençage de l' ADNr 16S, API et techniques traitant de la morpho et / ou phénotype bactérien tel que la coloration de Gram, la motilité , etc. Dans le cas où le score est inférieur à 1.700 les essais mentionnés ci-dessus doivent être utilisées pour obtenir l'identification des espèces fiables. Une combinaison de MALDI-TOF MS et de séquençage de l' ADNr 16S a été démontré récemment 56-58. Il convient de souligner que les lignes directrices claires pour la détermination des espèces sur la base des homologies de séquence d' ADNr 16S font encore défaut 22,61. Pour l' interprétation pratique, homologies de ≥97%, tel que proposé par Stackebrandt et Göbel 61, sont utilisés 56. Les progrès réalisés dans le séquençage d'ADN permettent la détermination des génomes bactériens entiers positifs en suivant les techniques de production à coût relativement faible et, par conséquent, en principe l'identification de bactéries en fonction de leur séquence génomique. Cette technique a déjà été utilisée dansgénome gestion des épidémies en fonction ou en épidémiologie 9,29. Cependant, la limitation la plus forte aujourd'hui est le manque de facile à utiliser des logiciels pour l'utilisateur final 65.

Sept exemples de bactéries produisant rares, isolées à partir d' échantillons de patients au cours des diagnostics de routine et analysées à la fois par MALDI-TOF séquençage du gène SM et ARNr 16S sont indiquées dans le tableau 1. Les spectres MALDI-TOF de la souche n ° 1 à n ° 6 sont représentées sur la figure 3 et un spectre de la souche n ° 7, Sphingobacterium spiritivorum, est représenté sur la figure 1E. Tous les isolats montrent des scores élevés dans l'analyse MALDI-TOF MS et 99 à 100% ADNr 16S homologies de séquence. Ainsi, les deux techniques conduisent à sécuriser le genre et l'identification des espèces. Cependant, comme l' a souligné dans une publication récente sur la comparaison des méthodes de Myroides sp d'identification., La combinaison de séquençage du gène MALDI-TOF MS et 16S ARNr a conduit à r plus fiableésultats 56. Ces données illustrent qu'une seule méthode utilisée ne peut pas toujours être suffisante pour obtenir un résultat fiable d'identification. La combinaison de deux méthodes indépendantes conduit à une plus grande précision et élargit la base de données MALDI-TOF MS commercial avec en interne entrées ont abouti à une identification des espèces sans équivoque 56.

La souche n ° 1 a été identifié comme Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF Le score 2,490, une homologie de séquence de 99%). Chryseobacteria sont Gram-négatives, des tiges non-fermentation et liés à Myroides spp. Chryseobacterium spp. sont considérés comme des agents pathogènes émergents, associés à la septicémie, la pneumonie et les infections des voies urinaires. Le genre Chryseobacterium comprend un grand nombre d'espèces et les espèces les mieux étudiés est indologenes Chryseobacterium. Comme pour les infections causées par Myroides sp., La plupart du temps les patients immunodéprimés sont touchés6,10,60. Souche n ° 2 a été identifié comme Myroides odoratimimus (MALDI-TOF Le score 2,436, une homologie de séquence de 99%) et de la souche N ° 3 comme Myroides odoratus (MALDI-TOF Le score 2,237, une homologie de séquence de 99%) Myroides sp. sont des bâtonnets à Gram négatif fermentent qui sont associés à des maladies graves telles que la septicémie, la pneumonie ou la cellulite. La plupart du temps les patients immunodéprimés atteints de maladies hématologiques ou oncologiques sous - jacents sont affectés 8,18,42. La souche n ° 4 a été identifiée comme étant de 32,71 Sphingobacterium (MALDI-TOF marquer 2,092, une homologie de séquence de 99%).

Les bactéries sont des tiges non-fermentation Gram-négatives, qui peuvent causer une septicémie chez les patients immunodéprimés 5,24,44,53. En outre, un cas de méningo - encéphalites mortelles a été rapporté 70. Les taches # 5 (MALDI-TOF MS score de 2.282, une homologie de séquence 100%) et n ° 6 (MALDI-TOF MS score de 2.289, séquence homologuey 100%) ont été identifiés comme Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Ces bactéries sont courtes, non motile, bacilles Gram-négatives qui ont d' abord été isolées à partir de larves de la mouche parasite Wohlfahrtia magnifica et décrits en 2008 66. Ces bactéries zoonotiques sont considérés comme des agents pathogènes émergents et les agents responsables de la bactériémie, la septicémie ou une infection des tissus mous 4,40,64. Fait intéressant, la plupart des patients rapportés étaient sans abri et / ou souffert de l' alcoolisme et, par conséquent, la présence de ces agents pathogènes rares peut être expliqué par le taux plus élevé de ectoparasites dans la population sans - abri 4,54. Souche n ° 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS score de 2,269, une homologie de séquence de 100%), est un agent pathogène rare. Il peut causer des infections chez les patients immunodéprimés et les premiers isolats humains ont été décrits en 1982 31,71. Un récent rapport identifie comme agent causal de Sphingobacterium pour un cas mortel de bacTeremia et la septicémie chez un patient souffrant de leucémie aiguë myéloïde 38.

Figure 1
Figure 1:. Workflow pour l' acide nucléique et / ou spectrométrie de détection de masse à base de bactéries cliniquement pertinentes dans le laboratoire de microbiologie médicale A partir d'une culture pure (a), l' ADN cible est amplifié dans un thermocycleur (b). Amplicons PCR sont séquences dans un séquenceur quatre capillaire en utilisant la technologie de Sanger (c). Les résultats de séquençage sont déterminés en pourcentage homologies de séquences de requête à des entrées de base de données par comparaison assistée par ordinateur. Une seconde, la protéomique méthode basée, utilise la spectrométrie de masse (d) et au centre un résultat de spectroscopie de masse de la souche n ° 1 dans le tableau 1, Sphingobacterium spiritivorum, y compris son score MALDI-TOF MS, est donné (e </ Strong>). Une combinaison de spectrométrie de masse et séquençage du gène ARNr 16S peut être nécessaire, afin de parvenir à une identification des espèces plus fiables et précises. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Procédure d'analyse MALDI-TOF MS pour l' identification de bactéries cliniquement pertinentes Un opérateur prend la matière bactérienne de cellules entières (a) avec un cure - dent à partir d' une culture pure (b) et place des frottis bactériens sur une cible en acier (c). La cible d'acier est inséré dans le port de chargement du spectromètre de masse. Quand le bon vide de 5 x 10 -6 mbar est atteinte, la cible sera déplacé vers la chambre d'ionisation. À l' aide d' un N 2 à l' allongementr, les ions sont créés par désorption doux qui sont ensuite accélérés dans un champ électrostatique (d) et séparé dans le tube de vol (e). Le temps de vol (TOF) nécessaire pour les ions pour atteindre le détecteur du tube de vol (f) est directement liée à leur masse et constitue la base de calculs ultérieurs de pics de masse. Logiciel d'identification spécifique (tableau Matériaux) affecte ensuite les valeurs de pointage à l'empreinte de spectre de masse de protéines bactériennes ionisés. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: MALDI-TOF spectres et assignés scores d'agents pathogènes rares Dans cette figure, les spectres MALDI-TOF représentant des six premiers pathogènes rares lis.ted dans le tableau 1 sont présentées. Nom de l' espèce et le score MALDI-TOF MS correspondant sont notés dans chaque spectre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

N ° 3
Souche identification MALDI Le score MALDI Résultat ADNr 16S BLAST homologie
#1 Chryseobacterium gleum 2.211 Chryseobacterium gleum 99% d'identité
n ° 2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99% d'identité
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99% d'identité
N ° 4 Sphingobacterium multivorum 2.093 Sphingobacterium multivorum 99% d'identité
N ° 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% d'identité
n ° 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% d'identité
#7 Sphingobacterium spiritivorum 2.269 Sphingobacterium spiritivorum

Tableau 1: Résultats représentatif MALDI-Tofs des bactéries présentes rares par rapport à l' ARNr 16S séquençage du gène.

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Discussion

Deux MALDI-TOF et le séquençage du gène de l'ARNr 16S offrent la possibilité d'identifier un grand nombre de bactéries différentes. MALDI-TOF MS est une méthode rapide et peu coûteuse, qui est facile à manipuler et de grandes bases de données de spectres de masse bactérienne sont disponibles. Pour cette raison, MALDI-TOF MS est un coût moyen rapide, efficace et fiable pour mener des études de dépistage axés sur les bactéries pathogènes rares 17,20,39,51. Dans une étude prospective comparant MALDI-TOF MS avec d' autres méthodes d'identification phénotypiques, Seng et al. Coût - efficacité démontrée et la vitesse de MALDI-TOF MS 59 et Tan et al. Ont rapporté une réduction des réactifs et le coût du travail pour l' identification bactérienne dans leur environnement de laboratoire de 56,9% par an 62. Ces réductions de coûts sont pris en charge par une note de Gaillot et al 28.

D'autre part, le séquençage de l'ADNr 16S est plus consommatrice de temps, laborieux et bons de souscription p spécialiséeERSONNEL pour effectuer l'analyse 34. Néanmoins, les deux approches sont appropriées pour le diagnostic de routine et il pourrait être démontré que la combinaison de ces deux méthodes conduit à une plus grande fiabilité et une précision d'identification plus sûre, ce qui est particulièrement bénéfique en cas de résultats douteux 56. Par conséquent, nous proposons la combinaison des deux méthodes que la meilleure approche pour vérifier l'identification des bactéries présentes rares dans le diagnostic de routine. Pour l'identification des espèces fiables, il est absolument impératif d'utiliser des cultures bactériennes pures parce que les cultures mixtes empêchent la détermination des espèces. Comme un contrôle de plausibilité, l' identification des espèces obtenue soit avec MALDI TOF MS ou le séquençage de l' ADNr 16S doit être en conformité avec les résultats de la coloration de Gram, la caractérisation biochimique et la présentation clinique 49.

La spectrométrie de masse comme outil d'analyse pour l'identification bactérienne a été proposé en 197551. Cependant, il a fallu attendre la fin des années 1980 pour établir une approche possible pour l' analyse des protéines. La technologie "soft d'ionisation de désorption" a été introduit par Koichi Tanaka en 1985 63, qui a reçu le prix Nobel de chimie en 2002, permettant l' analyse des protéines intactes. Dans le même temps le temps d'ionisation assistée par matrice de spectrométrie de masse de vol a été introduit par Hillenkamp et Karas comme ils ont été les premiers à utiliser un acide organique pour analyser des biomolécules 37 et ceci est la méthode qui est encore utilisé aujourd'hui. Bien que la technologie MALDI a été utilisé sporadiquement 23,30,41, il a fallu attendre 2004 , lorsque Bruker Daltonics introduit son microflex système MALDI Biotyper (Conférence Pittcon & Expo 2004, communiqué de presse), que l' identification microbienne à base de MALDI-TOF MS est devenu une routine technique de diagnostic 46. Les approches récentes dans les techniques MALDI-TOF MS ont donné l'occasion d'identifier les levures, les bactéries multirésistantes détecteret d' effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens 17,51. En outre, certaines procédures offrent la possibilité d'analyser directement les bactéries à partir d' échantillons primaires, tels que l' urine ou le sang des cultures 17,51.

Bien que l'utilisation de ce système est principalement facile, il y a quelques pièges qui peuvent influencer les résultats. L'âge des micro-organismes, par exemple affecte l'expression des protéines bactériennes et par conséquent la reproductibilité des résultats. Tout d'abord, les conditions de croissance peuvent être un problème. A titre d'exemple, des entérobactéries telles que Escherichia coli , une croissance plus rapide que les bactéries ne fermentant pas (par exemple Pseudomonas aeruginos a) et doivent par conséquent être analysé précédemment 17. D'autre part, la matrice utilisée pour la SM MALDI-TOF est constitué de petites molécules d'acides organiques qui ont une absorption optique à laser solide pour la longueur d'onde du laser utilisé. Avant l'analyse de la matrice est ajoutée à l'échantillon et les deux composants subissent une crystallization processus de formation d'une solution solide.

Cela explique pourquoi les changements dans la matrice peuvent affecter la précision de l'identification bactérienne 17. Par conséquent, les solutions fraîchement préparées de matrice, pas plus de 7 jours, doit être utilisé. Troisièmement, le support à partir duquel les bactéries sont récoltées peuvent influer sur l'identification résulte 17,68. Par exemple, le violet cristallisé, qui est un composant d'agar - agar de MacConkey, interfère avec les spectres de masse 17. En outre, trop de bactéries appliquées sur la cible en acier conduira à des scores plus faibles et donc affecter la précision de l'identification. Par conséquent, il est souhaitable de définir des critères précis quant à la façon dont l'analyse est effectuée. Cependant, des résultats trompeurs effectués par MALDI-TOF MS sont principalement causés par des spectres de référence insuffisante contenue dans la base de données. (Actuellement , la base de données contient> 6.000 entrées.) Cela est particulièrement encore le cas pour l'identification des bactéries anaérobies 17. Cependant, unLes spectres supplémen taires peuvent être ajoutés par l'utilisateur. Bibliothèque MALDI-TOF MS , par exemple , contient 98 des spectres de référence supplémentaire des isolats qui ne sont pas traités de manière adéquate par la base de données d' origine, tels que Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. Et Chryseobacterium sp. Par conséquent, les spectres de référence supplémentaire entraînera une précision de l' identification ultérieure 59,69. Enfin, dans certains cas, les spectres des différentes espèces sont très similaires. Cela peut conduire à une erreur d' identification dans des cas tels que la discrimination d'Escherichia coli et Shigella spp. ou Streptococcus pneumoniae et Streptococcus mitis 17,51.

Le séquençage de l' ADNr 16S et des gènes supplémentaires tels que rpoB ont simplifié l'identification moléculaire des bactéries rares ou inconnues. Ces gènes sont communs dans la plupart des bactéries et leur fonction individuelle estidentique. Toutefois, étant donné qu'ils possèdent suffisamment de variabilité génétique pour produire des résultats qui permettent une différenciation sur le genre et niveau des espèces, elles peuvent être utilisées pour l' identification des bactéries 34. Selon Stackebrandt et Göbel, homologies <97% représentent les différentes espèces 61. Cependant, homologies> 97% ne conduisent pas nécessairement à une identification des espèces sécurisé 34,47. Ces incertitudes ont plusieurs raisons.

La qualité des bases de données qui sont utilisées pour calculer les homologies est parfois douteuse 34. Dans les cas où il existe des homologies élevées au niveau ADNr 16S, les incertitudes peuvent entraîner l'identification des espèces. Une combinaison de différentes régions génétiques peut donc conduire à des résultats plus sûrs. De plus, il n'y a pas de lignes directrices générales pour l'interprétation de l' ADNr 16S des données de séquençage 22,34,61. Cependant, l'augmentation de la fiabilité des bases de données existantes conduira à une plus Accuracé pour l' identification bactérienne en utilisant cette approche moléculaire 34. En ce qui concerne la réaction de séquençage, nous devons mentionner que la précision des résultats de séquençage repose principalement sur la qualité de la PCR sous-jacente. En outre, étant donné que les résultats sont acquis en les comparant aux mentions figurant dans les bases de données publiques, la qualité des entrées de séquence et la maintenance des données est d'une importance cruciale.

En général, bien que les deux approches, MALDI-TOF MS et 16S séquençage du gène ARNr, présentent des avantages qu'ils ont aussi des faiblesses. La combinaison des deux méthodes, cependant, conduit à une très grande précision pour l'identification des bactéries. Par exemple, dans une étude précédente , nous avons pu démontrer que MALDI-TOF MS est capable de distinguer entre Myroides odoratimimus et Myroides odoratus 56. Dans quelques cas, le score MALDI a suggéré l'identification des espèces peu fiables, alors que les résultats obtenus par séquençage de l'ADNr 16S pourrait confirmer l'espèceidentité. empreintes spectrales de masse de ces isolats ont ensuite été créés et introduits dans notre base de données de spectres de référence de MALDI. Les recherches futures se concentrant sur d'autres bactéries rares peut démontrer l'applicabilité de la stratégie proposée.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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