Çift şeritli DNA Ministrings üretimi

1School of Pharmacy, University of Waterloo, 2Sgd Health Innovation
Published 2/29/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Wong, S., Lam, P., Nafissi, N., Denniss, S., Slavcev, R. Production of Double-stranded DNA Ministrings. J. Vis. Exp. (108), e53177, doi:10.3791/53177 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu, in vivo olarak basit bir platform ile üretilen bir non-viral gene teslim vektörü alternatif olarak lineer kovalent olarak kapalı (LCC), DNA minivectors inşa edilmiştir. DNA ministrings yükseltilmiş bir güvenlik profiline sahiptir ve aynı zamanda verimli bir şekilde hedeflenen hücrelere DNA yük sağlar. Geleneksel DNA vektörleri, antibiyotik direnç genleri, CpG motifleri ve konakçı bağışıklık yanıtlarının uyarılmasına neden olabilir bakteriyel replikasyon kökeni, aşağıdakileri içeren, istenmeyen prokaryotik sekansları taşır. Geleneksel bir DNA vektörlerinin biyoyararlanım nedeniyle daha büyük bir molekül boyutuna taviz verilmektedir. Onların dairesel doğası da sokma mutajenezi neden kromozomal entegrasyon vermek olabilir.

Bakteriyel sekansları, ilgili (GOI) ve gerekli ökariyotik sentezleme elemanları, sadece gen bırakarak, DNA minivectors eksize edilir. Bizim LCC DNA minivectors veya DNA ministrings, bağışıklık bakteriyel dizilerin yoksun olan; Bu nedenle th iyileştirilmesiEIR biyoyararlanım ve GOI ifade. kromozom içine, vektör bütünleşmesinden durumunda, LCC DNA ministring öldürücü böylece proliferasyon hücre popülasyonundan tehlikeli mutantını kaldırma konakçı kromozomuna bozacaktır. istenmeyen vektör entegrasyon olaylar için potansiyel ortadan kaldırırken Sonuç olarak, DNA ministrings 'minicircle' DNA avantajlar sunuyoruz. Geleneksel plasmidler ve izogenik dairesel kovalent olarak kapalı (CCC) meslektaşları karşılaştırıldığında DNA ministrings birçok biyolojik, transfeksiyon verimi ve sitoplazmik kinetiği göstermektedir - Dolayısıyla, hedef hücrelerin etkili transfeksiyon için katyonik yüzey aktif alt ihtiyaç duyarlar.

Biz, kullanımı basit, hızlı ve ölçeklenebilir Escherichia coli DNA ministrings üretimi için in vivo sistem olarak uyanlabilir tek-aşamalı bir inşa ettiler.

Introduction

Amacı, kovalent (LCC), DNA minivectors basit ve yüksek verim tek-aşamalı ısı ile uyarılabilir İn vivo DNA ministring üretim sistemi kullanılarak kapalı doğrusal büyütülebilir miktarlarda üretilmesidir. DNA ministrings DNA teslim etmek için güvenli ve etkili bir viral olmayan bir strateji sağlar. Bunlar DNA kangallı verimlilikle LCC vektörlerinin güvenlik kombine ve aynı zamanda transfeksiyon verimi ödün vermeden virüs türevli vektörler için daha güvenli bir alternatif sunmaktadır.

başarılı olması için bir transgen dağıtım sistemi için, DNA vektörü hedef konakçı hücrenin girerek kodlanmış transgen (ler) i eksprese gerekir. Özellikle memeli sistemlerinde, uygulamada aşılması gereken çeşitli hücresel engeller vardır. retiküloendotelyal sistem serum nükleazlar ve immün tayini ile bozulmasını önlemek için, DNA vektörü hedef sisteme sahip biyolojik ve bağışıklık-uyumlu olmalıdır. Korunmasız DNA hızla plazma nükleazlar tarafından sindirilirDNA vektörü, hızla hedef hücrelerin plazma membran geçme kabiliyetine sahip olmalıdır, böylece ve plazmid membran yoğun lipoprotein bariyerleri oluşmaktadır. hücreye bir kez, vektörler sitoplazmaya hareket olması ve transgen sentezlenmesi için çekirdeğe girmek için çekirdek membranından geçerler. Viral olmayan gen iletim sistemleri doku ve hücre hedefleme geliştireceklerdir. Bununla birlikte, bu teknikler ile geleneksel plasmidlerin kullanımı nedeniyle hızlı bir şekilde gen ekspresyonu 1,2 sessizlikler imünojenik bakteriyel dizilerin varlığında transfeksiyon verimini azaltır. Konvansiyonel plazmidler genellikle prokaryotik sistemlerde bakım için antibiyotik direnç genleri taşır. Bununla birlikte, bu, insan ana olası yan etkilere ya da doğal olarak yatay gen transfer etkileri üzerinden ana florasının oluşan karşı direnci olabilir. Konvansiyonel plazmidler de potansiyel istenmeyen immünostimulan tepkisini tetikleyebilir dinükleotid CpG motifleri 2 içerenazaltılması veya transgen ekspresyonunu susturulması.

Bunlar sadece ökaryotik ekspresyon kasetinin oluşmaktadır olarak, DNA kangallı 3 DNA minivectors, dolayı azaltılmış boyut ve immünostimülatör prokaryotik elemanlarının bulunmaması da hücre dışı ve hücre içi biyolojik ve gelişmiş bir gen ekspresyonunu sergilemiştir gen dağıtımı için daha iyi bir alternatif 4. Daha iyi bir hedef bölgeye 5 in vivo tatbikat ile ilgili kesme kuvvetlerine karşı direnç ile ilgili olarak düşük vektör boyutu bileti. Birim kütle başına vektörün yüksek kopya sayısı ve böylece toksisite azaltarak daha az transfeksiyon reaktifi gerektirir. Bununla birlikte, bir konukçu kromozomu içine entegrasyon Vektör durumunda, dairesel kovalent molekül süreklilik vermek DNA kangallı geleneksel plasmidlerin her iki dahil olmak üzere (CCC) vektörleri, kapalı ve dolayısıyla yıkıcı sonuçlara sahip olabilir girmeyle mutagenez, yol açabilir 7 önlenmesi, hücre ölümü, yollar kromozomu bozan ve başlatır. Minimalistic imünolojik tanımlanan gen ekspresyonu (Sineği) vektörleri 8 ve mikro doğrusal vektörleri 9 (MiLV), in vitro gelişen LCC DNA vektörleri bulunmaktadır. Sineği vektörleri bilinen plazmid DNA 11 vektörleri ile karşılaştırıldığında in vivo koşullarında, bir 17-kat daha iyi transgen ekspresyonu kadar sergiledi ve Vaccine 10 ve kanser 8 gen terapisinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Buna ek olarak, LCC minivector bükülme olmadan bir yapıya, daha az transfeksiyon reaktifi, böylece toksisite 7 indirgeyici CCC süper-muadili göre gereklidir.

Geliştirilmiş LCC DNA vektörleri, DNA'nın ministrings üstün sentezleme verimlilik ve bioavai göstermiştiroynaklığı 7. Ayrıca DNA ministrings tek-aşamalı bir ısı ile uyarılabilir in vivo üretim sistemi, in vitro olarak çok sayıda basamak gerektirdiğinden tatarcık ve MiLV LCC vektörleri, bir uygun ve düşük maliyetli bir alternatif üretilmektedir. Gösterilmelidir DNA ministring üretim sistemi yapma, in vivo olarak gerçekleştirilen basit bir ısı ile indüklenebilen bir işlemdir hem de düşük maliyetli ve kolay bir şekilde büyütülebilir. Bu sistem, Yersinia enterocolitica bakteriyofaj PY54 türetilmiş Tel / PAL prokaryotik plazmid omurgasından az ökaryotik ekspresyon kaseti ayırmak için rekombinasyon sistemi 12 protelomerase patlatır. Biz ısı uyarılabilir bakteriyofaj λ promotör, cl [Ts] 857 13 kontrolü altında Tel protelomerase ifade Escherichia coli hücreleri (W3NN) tasarladık. İfade üzerine, Tel protelomerase "Süper Sırası" (SS) haberci plazmid üzerinde bulunan siteler içinde mevcut dostum hedef sitelerinde hareketDNA, ministring Daha sonra (Şekil 1) saflaştırılabilir olan LCC ürünler elde edilir. DNA, ministring ön-madde plazmid SS siteleri de böylece bir ön-madde plazmidden izogenik LCC ve CCC minivectors üretimini kolaylaştırmak Cre rekombinaz (lx), TelN protelomerase (telRL) ve Flp rekombinaz (STT) dahil olmak üzere diğer rekombinaz için hedef sitesi kodlayan. Buna ek olarak, her bir SS Alanı çekirdek translokasyonunu 14 geliştirmek için hizmet SV40 güçlendirici (SV40e) dizileri tarafından her iki yandan da taarruz edilen. Biz SV40e ardışık ilaveli kademeli Transfeksiyon etkinliğindeki 7 karşılık gelen bir artış sağladığını başka göstermiştir. Ön-madde plasmidi (pDNA MiniString veya PDMS), yeşil floresan haberci (GFP) ile transkripsiyonel füzyon daki herhangi bir istenen gen sokulmasını kolaylaştırmak için bir poli-(Şekil 1) içerir.

DNA minivector teknolojisi olabilirökaryotik sistemlerde transgen ekspresyonunun etkinliğine yönelik gen transferi, haberci genlerin sentezlenmesi ve değerlendirmeler için geleneksel yöntemlerin yerine kullanılabilir. DNA ministrings biyouyumluluk ve lineer DNA vektörleri üstün güvenlik profili ile "mini" vektörlerin artan transfeksiyon verimliliği faydalarını birleştirir. Bizim sağlam bir adım üretim platformu hızla ve kolayca herhangi bir gen transfer uygulaması için DNA ministrings üreten ve daha yüksek bir güvenlik profili sunmaktadır.

Protocol

Medya ve Kültürler 1. Hazırlık

  1. LB + amp: Luria-Bertani etsuyu (LB) ve 500 mi, 30 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav ile sterilize hazırlayın. kullanılana kadar ampisilin ile Ek 4 ° C'de ampisilin ve deposunun 100 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir.
  2. TB + Amp için: büyük (500 ml veya daha fazla) üretimi ministring hacimleri hazırlanın. 30 dakika boyunca 121 ° C'de bir otoklav sterilize steril Terrific Broth (TB) 600 ml hazırlayın. kullanılana kadar ampisilin ile Ek 4 ° C'de ampisilin ve deposunun 100 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir.
  3. LB agar + amp: agar 15 g / l ile desteklenmiş LB + amp hazırlanması steril LB agar levhaları hazırlayın. Lik bir porsiyon yaklaşık 15 - ters 4 ° C'de steril petri deposunda 20 mi gerekene kadar.
  4. tarafından aseptik W3NN [pdms] çizgiler W3NN [pdms] bir çizgi tabak hazırlayın LB agar + Amp üzerinde hücreleri. plaka overni inkübe30 ° C'de GHT tek koloniler gözlenebilir kadar. protelomerase ifadesini yeniden tutmanın önlemek için bu sıcaklığın üzerinde W3NN inkübe etmeyin.
  5. Aseptik olarak transferi steril bir test tüpüne LB + Amp 5 ml. çizgi plaka tek bir koloni ile bu hacim aşılayarak W3NN [pdms] bir gecede kültür hazırlayın. 230-250 rpm'de bir çalkalayıcıda 30 ° C 'de kültür bir gece boyunca inkübe edilir.

2. Büyüme Aşaması

  1. Aseptik olarak steril 125 ml Erlenmeyer şişesi içine transferi LB + Amp 10 mi ve 1 yapma hazırlanan LB + Amp içerisine gece boyunca W3NN [PDMS] kültür, 100 ul ile inoküle: 100 seyreltme.
    1. Daha büyük miktarlar için, bunun yerine LB + Amp, 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde TBC + amp 50 ml gecelik kültürün 500 ul ekle.
    2. Alternatif olarak, aşama 2.2 ikinci "temsilci" kültür olarak kullanmak.
  2. cul kadar 30 ° C ve 250 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe inkübe600 = 0.8: Türe bir optik yoğunluk (OD) veya absorbans ile gösterilen, eski kütük fazı için orta ulaşır. 1-2 saat sonra, orta çıplak gözle bulanık görünmeye başlaması gerekir.
    1. Aseptik olarak transferi temiz bir spektrofotometre küvetine kültür 1 ml.
    2. 600 nm'ye ayarlanmış dalga boyunda bir UV-vis spektrofotometre kullanarak ışık absorbansı ölçülür. Hücreler boş (LB veya TB) ayarlamak için yetiştirilen edildiği medya 1 ml kullanın. İsteğe bağlı olarak, yerine bu adım için adım 2.1.3 temsilcisi kültür kullanın.
    3. kültür henüz uygun OD ulaşmış değilse, çalkalayıcı dönmek ve bir kez daha her yarım saatte bir kontrol edin. 600 0.8 yaklaştıkça daha sık OD edin.
  3. Kültür 600 = 0.8 ile gösterilen eski kütük fazı, ulaştığında, aseptik olarak steril bir 50 ml santrifüj tüplerine kültür aktarın.
  4. 10 dakika için 10,000 x g'de kültürü santrifüj hücreleri toplamak. pedikür için kontrol edinTüpün alt llet.
  5. uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabı içine temizlenmiş süpernatant süzün. Hücre pelet Rahatsız etmeyin.
  6. tüm hücreleri toplanıncaya kadar tekrarlayın 2,4-2,5 adımları.
  7. 100 ul LB + Amp pelet yeniden askıya. Aspire bir mikropipet kullanarak veya bir vorteks karıştırıcı kullanın. daha ministring üretimi için, taze LB + Amp eden 1 ml'lik ortam içine 50 mi TB + amp kültürünü pelet yeniden askıya.

3. Ministring Üretimi

  1. Aseptik 42 ° C'ye kadar bir 125 mL Erlenmeyer şişesi ve ısı LB + amp 20 ilave edin. daha ministring üretimi için, 42 ° C'ye kadar ön ısıtmaya tabi LB + Amp 500 ml hazırlanması.
  2. Önceden ısıtılmış ortama tabanda aktarın.
  3. 42 ° C'de inkübe edilir ve 600 = 1.0 ile gösterilen son log fazı kadar 250 rpm. 1 saat geçmiş 42 ° C'de kültür 20 ml bırakmayın.
  4. 37 ° C sıcaklığı azaltmak ve bir addin kültür bırakıntional 90 dakika. 500 ml için 90 ek indüksiyon dönemi için kültür bırakın - 120 dakika ve sıcaklığını düşürür yoktur.
  5. 30 ° C'ye düşürülür ve 2 saat arasında ek bir sıcaklık vites küçültme süreyle 200 rpm'de sallama kültüründen bırakın. 500 ml için 4 saat veya gece sıcaklık vites küçültme uzatmak.

4. Hasat Ministrings

  1. Aseptik steril bir 50 ml santrifüj tüplerine kültür aktarın. 10 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj ve pelet olup olmadığını kontrol edin.
  2. pelet rahatsız etmeden uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabına süpernatant süzün. tüm hücreleri toplanmıştır kadar tekrarlayın.
  3. Daha sonra çıkarılması için -80 ° C'de sıvı nitrojen ve mağaza herhangi bir ticari çıkarma ve endotoksin çıkarma kiti veya flash dondurma ile plazmid çıkarılması için pelet saklayın.

Representative Results

DNA ekstraksiyonu, artık habercisi plazmid, LCC prokaryotik omurga ve DNA ministring sonra telafi edilecektir. Genel olarak plazmid verim ve saflık, spektrofotometre kullanılarak değerlendirilebilir. Saflık 260 nm ve 1.9-2.0 lik bir oran optimal 280 nm'de (A260 / A280) absorbans oranı kullanılarak tahmin edilir. Tüm LCC ve CCC ürünleri, agaroz jel elektroforezi (AGE) (Şekil 2) vasıtasıyla ayrılabilir. YAŞ öncesi saflaştırma ministring için, ısı indüksiyon sonrası üretim ministring sonuçlarını görüntüler. Ministring üretim kalite değerlendirmesi ebeveyn plazmid (5.6 kb) (Şekil 2) ministring (2.4 kb) bant yoğunluğu karşılaştırarak, bu aşamada yapılabilir. Ministring DNA YAŞ aşağıdaki standart plazmid jel ekstraksiyon protokolleri üzerinden elde edilebilir. 3 taşıma sırasında oluşabilecek çeşitli koşullar altında üretim verimliliği ministring özetlemektedir Şekilprotokol dışarı ing. Ministring üretim verimliliği üreticinin analiz programı kullanılarak DNA bandı yoğunluğuna göre belirlenmiştir. Herhangi benzer dansitometrisi programı YAŞ sonuçlarını analiz etmek için kullanılabilir.

Şekil 1
Şekil 1:. Üretim ministring genel (A) ana vektör iki P sitelerinin çerçeveli bir raportör gen ile kopyalama füzyon bir poli içerir. Omurga ampisilin direnci için beta-laktamaz kodlar ve ayrıca in vitro sindirim için omurgaya özgü birçok kesim siteleri içerir. Ana protokol (B) genel bakış. Adımlar 2) Büyüme Faz ve 3) Ministring Üretim protokolünün sadeliği vurgulayarak, ilgili adımların genel bir şematik sağlamak için bir diyagram temsil edilmektedir. (C) Ministring indüksiyon. Isı indüksiyon ana plazmidler SS sitelerinde Tel etkinliği takip tel ifadesini sağlayan, sıcaklığa duyarlı bastırıcı inaktive. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: protokolden sapmalar sonra üretime Ministring. 1: Kumanda, 2: indüklenmeyen, 3: Büyümüş, 4: Overinduced, 5: Erken Kaldırma. DNA ministring LCC omurgası 3 kb, yaklaşık 2,4 kb ve pNN9 ebeveyn plazmid 5.6 kb. ministring ve LCC omurga bantların bant yoğunluğu düşük ministring verimi gösteren protokolden sapmalar ile bırakın. Soldan sağa: New England Biolabs'dan 1Kb lader; Kontrol, protokol takip edilerek Uyarılmamış, hiçbir sıcaklık vites büyütme; Büyümüş, sıcaklık Durin viteseg durağan faz; Overinduced, geniş sıcaklık vites büyütme; Erken kaldırma, hiçbir sıcaklık vites küçültme. Plazmidler Omega-Biotek EZNA Plazmid Mini Kit kullanılarak çıkarıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Üretim verimliliğini (PE) ministring protokolüne sapmaların Etkileri Sonuçları 3 çalışmaların ortalamasıdır. PE YAŞ sonrası Alphalmager'in HP kullanılarak ölçülen bağıl bant yoğunluğu tahmin edilmektedir. sapmaları aşağıdaki adımlardan meydana: Kontrol, protokolü takip; Uyarılmamış, 2. adımda hiçbir sıcaklık vites büyütme; Büyümüş, sıcaklık vites büyütme aşamasında 1.6 de sabit faz sırasında başladı; Adım 2.3 de Overinduced, genişletilmiş sıcaklık vites büyütme; Erken kaldırma, hücreler çıkarıldı ve çıkarılanAdım 2.3 sıcaklık vites küçültme olmadan. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Biz tipik bakteriyel büyüme ve manipülasyonu kullanılan bu kenara özel ekipman gerektirir tek aşamalı bir ısı ile uyarılabilir bir protokol kullanılarak LCC DNA ministrings üretimi için basit bir sistem tarif eder. DNA ministrings Prokaryotik genetik elemanların yoksun torsiyonsuz ve sabit lineer DNA ekspresyon kasetleri vardır. Ökaryotik sistemlerde transgen ekspresyonunun etkinliğine yönelik gen transferi, haberci genlerin ekspresyonu yanı sıra değerlendirmeler için geleneksel yöntemlerin yerine kullanılabilmektedir. DNA ministrings biyouyumluluk ve lineer DNA vektörleri üstün güvenlik profili ile "mini" vektörlerin artan transfeksiyon verimliliği faydalarını birleştirir. In vivo üretim platformu bizim sağlam tek aşamalı hızlı ve kolay bir çok pahalı in vitro işleme gerek olmadan herhangi bir gen transfer uygulama için DNA ministrings üretir.

birkaç kritik adımlar vardırOptimal ministring üretimini (Şekil 2 ve 3) emin olun. Isı indüksiyon üretimini ministring için en kritik adımdır. üretim ministring tam olmaması nedeniyle protelomerase ifade baskı LCC ministring haberci plazmidinin dönüşüm önleyen ısı indirgemesi (30 ° C 'de muhafaza edilmiş), eksikliği muhtemeldir. Isı indüksiyon protokolü takiben, yaklaşık% 75 bir üretim verimliliğini bekliyoruz. Hücreler log fazında ise ısı indüksiyon en uygunudur. ( "Büyümüş" Şekil 3) sabit faz hücreleri kullanırken PE ministring istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmasına rağmen, biz genel plazmid verimi neredeyse% 50'lik bir azalmaya dikkat yaptı. Verim kullanılan plazmid çıkarma protokolü bağlıdır. Hücreler log fazında iken uygun ministring üretimi için, ısı indirgemesi tetikler. Kötü ministring üretimi, büyük olasılıkla uzun süreli sıcaklık yükseltme veya insufficie bir sonucu olacaktırnt sıcaklık vites küçültme. Bu E. aktive olarak uzun süreli sıcaklık vites büyütme önerilmez protelomerase aktivitesini inhibe edebilir ve plazmid stabilitesi müdahale edebilir coli ısı şokuna cevap veren 15. Bu nedenle, sıcaklık downshift zamanlama verimli ministring üretimi için bir başka kritik bir adımdır. 30 ° C 'de ek bir inkübasyon süresi olmadan ministring üretim verimliliği çok zayıf olduğu bulundu ( "erken kaldırılması", Şekil 3). Bu Tel ifade ve aktivite için gerekli olan süreyi bağlı olabilir. Menşeli profajından PY54 şifreleyen Tel protelomerase normal optimal 30 ° C de, Tel aktivitesi için daha optimum olabileceğini göstermektedir, yaklaşık 28 ° C 12 büyür Yersinia, bozar.

DNA, minivector üretim sistemi, yüksek kaliteli bakteriyel sekansı içermeyen DNA minivectors üretmek için bir in vivo platformu kullanır. protokole Değişiklikler i mayçoğalma fazı sırasında hücre büyümesini (yerine LB TB) teşvik ya da üretim ve dönüşüm etkinliğini ministring artırmak için plasmid ve protein üretimini optimize etmek için büyüme ortamı değiştirme nclude. Daha büyük kültür hacimleri (200 ml ve üzeri), sıcaklık vites küçültme ve 30 ° C'de inkübasyon için PE ministring üzerinde ciddi olumsuz etkisi olmadan bir gecede uzatılabilir. Bu örnek olarak, 500 ml kültürler için protokol taditattan. DNA ministrings saflaştırılması prokaryotik omurgası in vitro endonükleaz sindirim yoluyla hızlandırılmış olabilir. Endonükleaz, hedef siteye vardır (örneğin, PI-SceI, Pvu, Scal) açık doğrusal ortaya çıkarmak için kesilebilir ön-madde plazmid prokaryotik omurgası üzerine prokaryotik omurgasının in vitro degradasyon sağlayan, sona erer. Diğer vektör türlerden ministrings izolasyonu da anyon değiştirmeli membran kromatografisi 16 ile elde edilebilir.

LCC DNA vektörü üretim sistemi ile ilişkili bir akım sınırlama diğer LCC ve CCC ürünleri DNA ministring saflaştırılması için ihtiyaç vardır. Kolayca standart plazmid izolasyon yöntemleri kullanılarak saflaştınldı, ancak izolasyon aşaması, yine de büyük ölçekli bir ortamda bir dezavantaj olabilir. ministring ayrılması zaman alıcı ministring ve LCC prokaryotik omurga boyutu çok benzer ise AGE kullanarak olabilir. Seçenek olarak ise, anyon değiştirmeli membran kromatografisi CCC vektörü türlerinin 16 ministrings daha iyi ayrılmasını sağlayabilir. Yüksek sıcaklıklar da E. ısı şok tepki aktive olarak sıcaklık vites büyütme başka potansiyel sınırlama olabilir olumsuz rekombinant proteini etkileyen E. coli, 17 verir ve dolayısıyla dönüşüm ministring için plazmid oranlarını azaltmak. Biz üretim platformu optimizasyonları aşmak ve / veya ısı şoku 18 gibi etkilerini azaltmak için başka bir yerde rapor. BizAyrıca, şu anda ortadan kaldırmak ya da in vivo LCC prokaryotik omurga kirlenmesini azaltmak için yöntemler optimize ediyoruz.

LCC, DNA ministring kromozomal entegrasyon konak kromozomu bozar ve apoptoz hücreyi tabi. Sadece bu tür onkogenezde ve komşu genlerin susturma, böylece onun güvenliğini iyileştirilmesi gibi girmeyle mutagenez olumsuz sonuçlarını azaltmak gelmez; öldürücü etkisi, aynı zamanda ilişkili yan etkileri ve entegrasyon zarar vermeden knock-in ve gen değiştirme çalışmaları için ideal bir yöntem olarak kullanılabilir. DNA, ministring vektörleri in vivo olarak belirli bir hedef haline Terapötik proteinlerin, RNA, antikorlar veya antijenler için genlerin transferi ve ifadesi olarak uygulanacak ya da arızalara veya çalışmayan alel yerine edilebilir. Basit tek aşamalı ısı ile uyarılabilir in vivo üretim sistemi, DNA ministring vektörleri kolaylıkla klinik veya endüstriyel uygulamalar için üretilen sağlar.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var beyan.

Acknowledgements

Yazarlar bu çalışmayı finanse Doğal Bilimler ve Kanada (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli W3NN Mediphage strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012
pDMS.IRES.GFP Mediphage parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244620
Fisher BioReagents Terrific Broth Fisher Scientific BP2468500
BD Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific 214010
Ampicilin MP Biomedicals LCC 2190147
Ultrapure Milipore Water Fisher Scientific  Z00Q0V0US Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System
Surgical Gloves VWR (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430     
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
30 ml KIMAX Test Tubes VWR 89001-448
Spectrophotometer Cuvette Sarstedt 67.74
Sterile 15 ml Falcon Tubes  BD Falcon 62406-200,
Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  FroggaBio 2930-S0
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml BD Falcon 13-675-20
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml BD Falcon 13-668-2 
Micropipettor (100-1,000 μl) FroggaBio C1000-1
Micropipettor (20-200 μl) FroggaBio C200-1
Sterile Pipette Tips (100-1,250 μl) VWR 89079-472 
Sterile Pipette Tips (1-200 μl) VWR 89079-460
Fisher Scientific Economy Burner Fisher Scientific 03-917Q
Incubator Shaker New Brunswick Scientific  M1352-00000
Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980125 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980250 Aldrich 
Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml) Pyrex (Sigma Aldrich) CLS4980500 Aldrich 
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 335901 Model: Genesys 10 Vis
Floor Centrifuge Beckman Coulter  369001 Model: Avanti J-E
Benchtop Centrifuge Beckman 362114 Model: GS-6R
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific  02-215-365
1 kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
  2. Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10, (2), 269-278 (2004).
  3. Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6, (2), 209-218 (1999).
  4. Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21, (1), 131-138 (2012).
  5. Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19, (1), 94-100 (2011).
  6. Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118, (9), 3132-3142 (2008).
  7. Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3, (April), (2014).
  8. Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3, (5 Pt 1), 793-800 (2001).
  9. Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7, (10), (2012).
  10. López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21, (3-4), 247-257 (2002).
  11. Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21, (1), 17-23 (2007).
  12. Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
  13. Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11, (1), 154 (2012).
  14. Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272, (1-2), 149-156 (2001).
  15. Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
  16. Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
  17. Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
  18. Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9, (2), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats