تقييم محيط بالغدد التناسلية حساسية والبروستات ماست تنشيط خلية في نموذج الفأر من فصل الأمهات حديثي الولادة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نحن قياس حساسية وتنشيط الخلايا البدينة الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية في البروستاتا من الذكور C57BL / 6 الفئران التي خضعت في وقت مبكر نموذج ضغوط الحياة - فصل الأمهات حديثي الولادة، وذلك للحث على نموذج ما قبل السريرية لمتلازمة آلام الحوض / المزمنة المزمنة التهاب البروستات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fuentes, I. M., Pierce, A. N., O'Neil, P. T., Christianson, J. A. Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation. J. Vis. Exp. (102), e53181, doi:10.3791/53181 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / CPPS) يحتوي على انتشار عمر 14٪ و هو التشخيص المسالك البولية الأكثر شيوعا للرجال الذين تقل أعمارهم عن 50 عاما، ومع ذلك هو اضطراب مزمن آلام الحوض لا يقل عن فهمها ودراستها. مجموعة فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض التقرير بعد أن شهدت ضغوط الحياة في وقت مبكر أو إساءة المعاملة، التي يمكن أن تؤثر بشكل ملحوظ على أداء وتنظيم الغدة النخامية، الغدة الكظرية (HPA) المحور. تنشيط الخلايا البدينة، وهو ما ثبت على أن تزاد في كل من البول وإفرازات البروستاتا أعرب من المرضى CP / الهادئ، وينظم جزئيا تفعيل المصب من محور HPA. وقد استخدم الأطفال حديثي الولادة فصل الأمهات (NMS) لأكثر من عقدين من الزمن لدراسة نتائج ضغوط الحياة في وقت مبكر من نماذج القوارض، بما في ذلك التغيرات في المحور HPA والحساسية الحشوية. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام NMS كنموذج قبل السريرية لCP / CPPS في الذكور C57BL / 6 الفئران. وصفنا منهجيةلأداء NMS، وتقييم آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية، والأدلة النسيجي للتنشيط الخلايا البدينة. ونحن نقدم أيضا أدلة على أن الإجهاد النفسي المبكر يمكن أن يكون لها تأثيرات طويلة الأمد على الجهاز البولي التناسلي الذكور في الفئران.

Introduction

آلام الحوض المزمنة ليست في حد ذاتها مرضا، بل هو مصطلح يرتبط مع الألم المستمر عفوية و / أو استحضر التي يعاني منها المرضى الذين شخصت مع متلازمة القولون العصبي (IBS)، والتهاب المثانة الخلالي / متلازمة المثانة المؤلمة (IC / PBS)، التهاب الأعضاء الأنثوية، أو التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / الهادئ). وغالبا ما المرضية هذه المتلازمات ومشاركة العديد من الخصائص في أنه ليس لديهم علم الأمراض المرتبطة بها أو تحديد المسببات الكامنة، وإن كان قد أظهرت ضعف في جهاز المناعة والجهاز العصبي المركزي، والجهاز العصبي المحيطي للمساهمة في صيانة وتطور هذه الاضطرابات 1 -3. المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض أكثر عرضة للتقديم مع أعراض إضافية، واضطرابات الألم الوظيفية واضطرابات المزاج، بما في ذلك القلق، والاكتئاب، واضطراب الهلع 4-6 والذي ارتبط مع سير تغير من hypothalamic- غير ذات صلة الحوض- pituitary-الغدة الكظرية (HPA) المحور 10/07. التعرض لضغوط الحياة في وقت مبكر أو الصدمة هو عامل خطر كبير لتطوير تشوهات HPA وما يرتبط بها من متلازمات الألم المزمن 10،11 وعلى هذا النحو، مجموعة فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات آلام الحوض وظيفية بأنهن شهدت أحداث الطفولة السلبية مثل سوء المعاملة أو الإهمال 12-14.

نماذج القوارض الفصل حديثي الولادة الأمهات (NMS)، والتي تنطوي على إزالة الجراء من السد لفترة معينة من الوقت خلال فترة preweaning، وقد استخدمت على مدى العقدين الماضيين لدراسة نتائج ضغوط الحياة في وقت مبكر. بشكل عام، وقد تبين NMS لزيادة HPA محور التنشيط، والسلوكيات مثل القلق الناتجة، التي تؤثر بشكل مباشر على التعبير الجيني داخل منطقة ما تحت المهاد، فضلا عن عرقلة تنظيم المصب من الهياكل الحوفي 15-18. وقد تبين أن تعطل سير السليم محور HPA للمساهمة في زيادة القولون والمستقيم 19-22 16 حساسية المعروضة من قبل القوارض NMS النماذج، ولكن على الرغم من توصيف واسعة من تأثير على المدى الطويل بعد الولادة التهاب المثانة 23-25، وتأثير ضغوط الحياة في وقت مبكر قد ذهب إلى حد كبير غير مدروسة في الأجهزة التناسلية. ولذلك، فإن الدراسة التالية تصف كيفية أداء NMS في الفئران وبعد ذلك تقييم حساسية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية وتسلل الخلايا البدينة / التنشيط في البروستاتا للتحقق من استخدام الفئران الذكور للمرفق كنموذج قبل السريرية لCP / الهادئ.

لجميع المزمنة اضطرابات ألم الحوض تشخيص، CP / CPPS ربما تكون متلازمة الأقل المعترف بها جيدا، وتميزت، على الرغم من وجود انتشار عمر ما يقرب من 14٪ 26 و تكاليف المريض سنوية تقدر ب 4400 $ (مرتين أن آلام أسفل الظهر أو المفاصل التهاب المفاصل 27). المرضى الذين يعانون من CP / CPPS الألم تقرير في العجان والمستقيم والبروستاتا والقضيب والخصيتين، و / أو البطن 28، تجربة مرحبايتم تشخيص درجة gher من الضغط النفسي من المرضى التحكم 29، والحاضر عادة مع أعراض أو مع الحوض المزمنة الألم أو الإضطرابات المزاجية المرضية 5،29-31. العدوى المتكررة، ظهارة تتسرب منها المياه، والتهاب الأنسجة العصبية، وأمراض المناعة الذاتية كلها قد يظن كأسباب محتملة الكامنة وراء CP / CPPS 2،32،33، فضلا عن تنشيط الخلايا البدينة وتحبب 34. وإفرازات البروستاتا وأعرب عن الرجال مع CP / CPPS زادت تريبتاز الخلايا البدينة وعامل نمو الأعصاب (NGF) مستويات 34، وأكدت دراسة لاحقة أن تريبتاز وكربوكسي ببتيداز A (CPA3)، علامة على تنشيط الخلايا البدينة، وزادت أيضا في البول للمرضى CP / CPPS 35. لقد كان دور محتمل للالخلايا البدينة في بداية وصيانة CP / الهادئ محورا رئيسيا من البحوث الحيوانية على هذه المتلازمة حتى الآن. نموذج القوارض الأكثر استخداما تستخدم لدراسة CP / الهادئ هو التهاب البروستات الذاتية التجريبية (EAP) نموذج جنرالerated عن طريق الحقن تحت الجلد من مستضد البروستاتا في مساعد كاملة فرويند، الذي ينتج في درجات مختلفة من التهاب البروستاتا حسب الأنواع والسلالة المستخدمة 34،36-39. وقد تبين تسلل الخلايا البدينة وتفعيل / تحبب لزيادة الحث التالية من EAP 34،35،40. الفئران المعدلة وراثيا نقص في أي من الخلايا البدينة 34 أو مستقبلات تريبتاز PAR2 35 لا تتطور حساسية تكتيك البروستاتا التالية EAP، على عكس الفئران wildtype EAP. في حين أن هذا النموذج قبل السريرية يعيد العديد من خصائص CP البشرية / الهادئ، وبروتوكول الاستقراء هو لا يدل على حالة الإنسان، والتي لديها مسببات متنوعة، وغالبا ما لا تنطوي على التهاب المباشر، والعدوى، او الاصابة البروستات.

تأثير ضغوط الحياة في وقت مبكر على تطوير CP / CPPS في البشر إلى حد كبير ذهب بدون تحقيق. ومع ذلك، فإن الدراسة التي هو جين تاو، وآخرون. 41، أثبتت أن لين الذين أفادوا تاريخ الجسدية في مرحلة الطفولة، والعاطفية، و / أو كان الاعتداء الجنسي بشكل ملحوظ أكثر احتمالا للتعرض لأعراض توحي CP / الهادئ. علاوة على ذلك، أظهرت أن كلا من الألم وعشرات البولية وزيادة في المرضى الذين لديهم تاريخ من الإساءة الجسدية والعاطفية. لقد أثبتنا سابقا أن نفس النموذج NMS في الإناث C57BL / 6 الفئران تنتج الحساسية عن طريق المهبل والشاذ التعبير الجيني في كل من المهبل والمثانة توحي HPA مختلة الناتج محور 16. هذه الأدلة جنبا إلى جنب مع ارتفاع معدل انتشار CP / المرضى الهادئ مع تقديم التواكب المرضي أخرى 42، بما في ذلك IC / PBS واضطرابات المزاج، والتي أكثر وضوحا ثبت أن تكون مرتبطة مع الحياة في وقت مبكر التعرض الإجهاد 12-14، ويوفر الأساس المنطقي لاستخدام نموذج NMS للتحقيق CP / CPPS في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول تتفق مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة من قبل مركز جامعة كانساس الطبية المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. حديثي الولادة الأم الفصل (NMS)

  1. مراقبة السدود الحوامل يوميا لولادة القمامة.
    ملاحظة: اليوم يعتبر القمامة ولدت P0.
  2. على P1، إزالة السد من قفص المنزل ووضع في وعاء الثانوية نظيفة.
  3. فرك حفنة من الفراش بين الأيدي النظيفة-القفاز للحفاظ على رائحة قفص المنزل.
  4. إضافة عمق 1-2 سم من الفراش قفص المنزل في نظيفة، وصفت بشكل مناسب 2 L زجاج الدورق. إضافة ما يقرب من نصف أي تخصيب المواد الفراش الإضافية التي هي موجودة في قفص المنزل، على سبيل المثال، nestlet، ورقة تغضن، إلى كوب زجاجي.
  5. بلطف وضع كافة الجراء من القمامة واحدة، كل على حدة، في نفس الكأس.
  6. المكان على الفورالكأس في حاضنة عقد في 33 درجة مئوية و 50٪ الرطوبة لمدة 180 دقيقة.
  7. إزالة السد من الحاوية الثانوية وعودتها إلى قفص المنزل. العودة قفص المنزل لموقعه سكن مناسب داخل الحظيرة.
  8. كرر هذا الإجراء لكل القمامة تمر NMS، وذلك باستخدام قفازات نظيفة والحاويات الثانوية لكل القمامة / السد.
  9. في نهاية فترة الفصل 180 دقيقة، وعودة الفضلات إلى أقفاص وطنهم في نفس الترتيب كما تم إزالتها.
  10. استرداد قفص المنزل من القمامة الأولى التي تم فصلها في وقت سابق اليوم. إزالة السد من قفص المنزل ووضع في وعاء الثانوية نظيفة.
  11. إزالة الكأس الأول من الحاضنة وفرك حفنة من الفراش بين أيدي القفاز نظيفة للحفاظ على رائحة قفص المنزل أثناء التعامل مع الجراء.
  12. بلطف نقل الجراء، بشكل فردي، من الدورق إلى قفص المنزل.
  13. عودة أي التخصيب والفراش المتبقية في الكأس لقفص المنزل.
  14. العودة السد من الحاوية الثانوية إلى قفص المنزل وإعادته إلى موقعه سكن مناسب داخل الحظيرة.
  15. شطف الكأس مع الماء وإعادته إلى الحاضنة. استخدام نفس الكأس لكل القمامة في جميع أنحاء الداخلي الانفصال.
  16. كرر هذا الإجراء لكل القمامة تمر NMS في نفس الترتيب كما تم وضعها في الحاضنة.
  17. كرر هذا الإجراء بأكمله لكل خضوعه القمامة NMS كل يوم من خلال P21.
  18. فطم الجراء للمرفق وساذجة على P22 عن طريق وضع تتزاحم من نفس الجنس معا في أقفاص نظيفة كاملة مع الغذاء والماء. يجب أن تكون ولدت الجراء ساذجة ويضم تحت نفس الشروط الفئران للمرفق، ولكن يخضع أي معالجة إضافية خارج العادية المهام تربية الحيوانات.

2. محيط بالغدد التناسلية الميكانيكية الحساسية

  1. إعداد جهاز فون فراي
    1. جعل الفئران إلى قاعة الاختبار، والسماح لهم للتأقلم لمدة 30دقيقة في حين تبقى في أقفاص وطنهم.
    2. إعداد منطقة الاختبار عن طريق وضع underpad ماصة تحت سلك شبكة قمة الجدول ارتفاع (79 سم × 28 سم) التي توفر مساحة كافية للسماح للمحقق بالاقتراب من الجانب السفلي دون مذهلة الفئران، ما يقرب من 55 سم في الطول.
    3. وضع ما يصل إلى 12 الفئران، بشكل فردي، في ظل واضحة، غرف بلاستيكية مثقبة (11 سم × 5 سم × 3.5 سم) على رأس جدول سلكية. وضع جسم ثقيل على رأس الدوائر لمنع الفئران من الهرب.
    4. تأقلم الفئران لمدة 30 دقيقة إضافية على الشاشة قبل تقييم الحد الأدنى للسحب.
  2. تقييم محيط بالغدد التناسلية الميكانيكية الحساسية
    1. تنفيذ الأسلوب من أعلى إلى أسفل باستخدام مجموعة قياسية من متدرج المجذوذه فون فراي 43. استخدام المجذوذه التالية: 1.65 جم، 2.36 جم، 2.83 جم، 3.22 جم، 3.61 جم، 4.08 جم، 4.31 جم، و4.74 غرام.
      1. عقد قاعدة ز حيدة 3.22 وفضح أحادية تراجعخيوط.
        ملاحظة: قد لا يكون بعض النماذج لتراجع حيدة.
      2. وضعه التحقيق بحيث يتم توجيه حيدة عموديا وعند الفأر هو في حالة تأهب، قادرة على الحركة، ويتم توزيع وزن الجسم بالتساوي بين الكفوف الخلفيتين تطبيقه إما إلى الجانب الأيسر أو الأيمن من كيس الصفن، وتجنب خط الوسط، حتى طفيف لوحظ منعطف في خيوط.
      3. عقد حيدة في مكان لمدة 10 ثانية أو حتى يظهر الحيوان ردا ايجابيا.
        ملاحظة: يعتبر استجابة إيجابية لتكون رعشة السريع أو القفز استجابة لطلب حيدة أو لعق أو سلوك العض الموجهة نحو حيدة. إذا تحرك الماوس أثناء تطبيق حيدة 10 ثانية دون عرض هذه السلوكيات، لا بد من إعادة اختبار حيدة بعد مدة لا تقل عن بقية 1 دقيقة طويلة. إذا كان الماوس لا يتحرك ولا يسلك أي من فوق السلوكيات المدرجة خلال تطبيق حيدة 10 ثانية، ويعتبر ردا سلبيا.
      4. تسجيل ردا على ذلك، إما سلبية أو إيجابية، في دفتر المختبر أو الكمبيوتر المحمول، وتكرار هذا الإجراء على كل من الفئران المتبقية باستخدام 3.22 ز حيدة.
      5. اختبار كل من الفئران مرة أخرى باستخدام حيدة المناسبة القادمة. ملاحظة: إذا عرضت الماوس ردا سلبيا على 3.22 غرام حيدة، تطبيق 3.61 ز حيدة بنفس الطريقة وتسجيل استجابة. إذا عرضت الماوس ردا إيجابيا على 3.22 غرام حيدة، تطبيق 2.83 ز حيدة وتسجيل استجابة.
    2. تواصل اختبار كل فأر باستخدام القادمة حيدة أكبر أو أصغر، حسب الاقتضاء، ل4 تطبيقات إضافية بعد لوحظ أول رد إيجابي.
    3. عودة الفئران لأقفاص المنزل.
    4. استخدام قيمة النهائية فون فراي حيدة تطبيقها في سلسلة محاكمة في وحدات سجل لحساب 50٪ عتبة ز الانسحاب كما هو موضح في Chaplan وآخرون. 43.
عنوان "> 3. المحمضة طولويدين الأزرق ماست تلوين الخلية

  1. تجهيز الأنسجة
    1. تشريح الأنسجة البروستاتا 44 من الفئران التي تم perfused لintracardially مع الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ 45. بوستفيكس الأنسجة في 4٪ امتصاص العرق لمدة 1 ساعة على RT ثم cryoprotect في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات CO / N.
    2. إعداد (30 مل) حمام صغير من هيبتان ووضعه على الثلج الجاف.
    3. شطف أنسجة البروستاتا في برنامج تلفزيوني 1X والجافة باستخدام واجب ضوء مسح.
    4. إدراج أنسجة البروستاتا في هيبتان الباردة حتى يتم تجميده.
    5. المكان على الفور أنسجة البروستاتا المجمدة في cryomold تحتوي على تركيب وسائل الاعلام ومكان على الثلج الجاف حتى تجمد.
    6. متجر cryomolds في -20 ° C.
    7. قطع مستعرض أنسجة البروستاتا في 7 cryosections ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد.
    8. مكان 8-12 cryosections غير التسلسلي التي تمتد على طول الأنسجة، وعلى شرائح المجهر موجبة الشحنة.
    9. متجر الانتهاء الشرائح في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  2. إعداد المحمضة طولويدين الأزرق
    1. إضافة 1 غرام من طولويدين الأزرق O إلى 100 مل 70٪ من الإيثانول ودوامة حتى في محلول لإعداد محلول المخزون 1٪. ويمكن تخزين الحل السهم عند RT لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع.
    2. إضافة 1 جم كلوريد الصوديوم إلى 100 مل من الماء في كوب وضعت على رأس لوحة ضجة.
    3. ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول كلوريد الصوديوم باستخدام 12 M حمض الهيدروكلوريك حتى مجموعة من درجة الحموضة 0.5 - 1.0 يتحقق.
    4. إعداد 0.25٪ طولويدين الأزرق الحل العمل من خلال الجمع بين 8 مل من محلول المخزون طولويدين الأزرق و 32 مل من 1٪ كلوريد الصوديوم الحل. ماصة صعودا وهبوطا لضمان الدمج الكلي للمحلول المخزون طولويدين الأزرق ومزيج باستخدام الدوامة. يجب أن يتم حل العمل الطازجة والتخلص منها بعد استخدام.
  3. تلطيخ Cryosections البروستاتا
    1. إزالة الشرائح التي سيتم تجهيزها من الفريزر والسماح لتتوازن لRT لحوالي 30 مفي.
    2. غسل أقسام الأنسجة عن طريق غمس بشكل فردي الشرائح لمدة حوالي 1 ثانية إلى 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي على كمية كافية من 1X PBS للتأكد من أن أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة سيتم مغمورة تماما. تسمح الشرائح للهواء الجاف على منشفة ورقية.
    3. مكان الشرائح في وعاء زجاجي تلطيخ تحتوي على ما يكفي 0.25٪ تعمل الحل طولويدين الأزرق للتأكد من أن أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة سوف تكون مغمورة تماما واحتضان لمدة 10 - 15 دقيقة في حين على الكرسي الهزاز منصة وضعت في 15 دورة في الدقيقة.
    4. تراجع الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لحوالي 1 ثانية لتغسل الزائدة طولويدين الأزرق.
    5. وضع الشرائح في مربع الشريحة أو رف في مثل هذه الطريقة أن الشرائح على الجانبين للسماح لتصريف المياه.
    6. تجفيف الشرائح في الفرن عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو O / N في RT.
    7. يذوى الشرائح بسرعة باستخدام الكحول، والسماح للشرائح حتى يجف تماما بين التعرض للكحول. الشرائح الجافة من خلال تجفيف على منشفة ورقية لالثاني محو ظهورهم وحواف مع واجب ضوء مسح.
      1. تزج الشرائح في 95٪ ETOH لحوالي 1 ثانية، والسماح ليجف تماما. كرر هذا الإجراء 1-10 مرات حتى يجف الأنسجة أكثر الزرقاء من الأرجواني.
      2. تزج الشرائح في 100٪ ETOH لحوالي 1 ثانية، والسماح ليجف تماما. كرر هذا الإجراء 1-10 مرات حتى الأنسجة مظلمة إلى اللون الأزرق المتوسط، ولكن ليس الأرجواني.
    8. إصلاح وصمة عار التي يحتضنها الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة 3 دقائق. السماح ليجف.
    9. ساترة الشرائح مع الجلسرين، PBS، أو وسائل الإعلام تصاعد دائم قائم على زيلين. استنزاف وسائل الإعلام الزائدة وتخزينها في RT.
  4. خلايا ماست تحديد مقدار
    1. تصور طولويدين أقسام الأنسجة الأزرق الملون في 20X التكبير باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 2).
    2. عد عدد من الخلايا البدينة الحالية داخل منطقة تصور والتفريق بين الخلايا البدينة غير degranulated وdegranulated. 40X تعظمايون قد يكون من الضروري لتأكيد الوضع التحبيب في بعض الخلايا البدينة.
      ملاحظة: الخلايا البدينة غير degranulated يحمل metachromasia كثيفة مع عدم وجود أو خافت مخطط النووي و / أو أي قذف الحبيبية حول الخلية. الخلايا البدينة Degranulated يحمل metachromasia أقل كثافة ولديها مخطط واضح واضح للنواة و / أو حبيبات الحرة داخل السيتوبلازم وخارج الحدود الخلية.
    3. تواصل تقييم عدد من الخلايا البدينة غير degranulated وdegranulated في مجملها من قسم الأنسجة الحالي. كرر هذا الإجراء على لا يقل عن 7 أقسام منفصلة إضافية، والتي تمتد على طول كل الأنسجة.
    4. حساب النسبة المئوية للdegranulated (DG) إلى إجمالي الخلايا البدينة لكل الأنسجة / الماوس وفقا للمعادلة التالية: (DG الخلايا البدينة / مجموع الخلايا البدينة) × 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأظهرت الفئران التي خضعت NMS الأدلة السلوكية يدل على CP / الهادئ. عند اختباره مع سلسلة متدرجة من المجذوذه فون فراي، الفئران للمرفق القديمة أسابيع 8 (ن = 4) ظهور آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية بالمقارنة مع نظرائهم ساذجة (ن = 5، الشكل 2). ويتضح هذا الأمر انخفاضا كبيرا (P <0.01؛ ر الطالب اختبار) في العتبة انسحاب الميكانيكية التي أثارت استجابة سلوكية إيجابية، كما هو مسجل رعشة السريع أو القفز استجابة لطلب حيدة أو لعق أو سلوك العض الموجهة نحو حيدة .

كما عرض الفئران التي تعرضت للNMS دليل النسيجي للCP / الهادئ. كانت ملطخة المقاطع ناظم البرد من أنسجة البروستات مع س طولويدين المحمض الأزرق لمراقبة حبيبات تريبتاز مقرها داخل الخلايا البدينة (الشكل 3A-D). نسبة الخلايا البدينة التي أظهرت أدلة على التنشيط، على سبيل المثال، metachroma منتشرسيا، حبيبات خارج الحالي للحدود الخلية (الشكل 3D)، وزيادة كبيرة في أنسجة البروستاتا من الفئران للمرفق القديمة أسابيع 8، مقارنة ساذجة (P <0.0001، تي الطالب اختبار، الشكل 3E). إجمالي عدد الخلايا البدينة تسلل، بغض النظر عن حالة التحبيب، لم يكن يختلف كثيرا بين السذاجة (99.5 ± 15.2 خلية / قسم) والفئران للمرفق (108.2 ± 22.5 خلية / قسم).

الشكل 1
الشكل 1. خط الزمن الإجرائي. ويبين التخطيطي خط الوقت الموصى به لأداء منهجية وصفها. يتم تنفيذ الفصل الأمهات حديثي الولادة (NMS) يوميا من يوم بعد الولادة (P) 1 حتى مفطوم P21 والفئران في P22. تبقى الفئران دون عائق خارج تربية الحيوانات العادية حتى 8 أسابيع من العمر عندما يتم اختبارها للالسيناتور الميكانيكية محيط بالغدد التناسليةitivity. إذا كان نفس الفئران تسير على أن يقسم لتلطيخ الخلايا البدينة، ينبغي السماح أسبوع واحد لتنقضي بعد اختبار السلوكي للسماح لأي آثار الإجهاد المتبقية لحلها.

الرقم 2
وقد تم قياس الرقم 2. محيط بالغدد التناسلية حساسية الميكانيكية. محيط بالغدد التناسلية حساسية الميكانيكية باستخدام فون فراي تطبيق حيدة. ذكور الفئران التي خضعت فصل الأمهات حديثي الولادة (NMS) اظهرت انخفاض كبير في العتبة الانسحاب، مقارنة مع الفئران ساذجة، مما يدل على آلام جلدية الميكانيكية. تمثل البيانات يعني SEM، ن = 4 لكل مجموعة. * P <0.05، تي الطالب اختبار.

الشكل (3)
الشكل 3. تنشيط الخلايا البدينة. طولويدين المحمضة الأزرق تم استخدامها لتصور حبيبات تريبتاز وحساب النسبة المئوية للتنشيط / الخلايا البدينة degranulated في أقسام ناظم البرد من أنسجة البروستات. وترد photomicrographs تمثيلية من طولويدين أقسام الزرقاء الملطخة من السذاجة (A) وNMS (B) البروستاتا مع السهام تشير سليمة (غير degranulated) ورؤوس سهام تشير المنشط (degranulated) الخلايا البدينة. وتظهر الصور التكبير أعلى من السذاجة (C) وNMS (D) المثانة لتوضيح الاختلافات النسيجية من غير degranulated (C) وdegranulated (D) الخلايا البدينة. وقد لوحظت نسبة أعلى بكثير من الخلايا البدينة degranulated في أقسام البروستاتا من الفئران NMS بالمقارنة مع الفئران السذاجة (E). تمثل البيانات يعني SEM، ن = 4 لكل مجموعة. **** ف <0.0001، تي الطالب اختبار.= "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول منهجية لاستخدام الضغط حديثي الولادة، في شكل NMS، للحث على symptomology يدل على CP / CPPS في الفئران الذكور البالغين. كما الكبار، وتعرض الفئران للمرفق آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية كبير، وكذلك دليل على تحبب الخلايا البدينة في أنسجة البروستاتا. استخدام NMS هو نهج جديد لتطوير نموذج ما قبل السريرية لCP / الهادئ في أنه يعيد ضغوط الحياة المبكر الذي غالبا ما أوردته المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض 12-14، فضلا عن دمج التعريفي غير الغازية، كما بدلا من أكثر شيوعا، chemically- والتهاب البروستاتا 34،36-39 مناعيا التي يسببها. وعلاوة على ذلك، وقد تبين NMS في الفئران لانتاج symptomology المرضية، بما في ذلك السلوكيات المرتبطة بالقلق مثل وanhedonic المتغيرة، وزيادة معدلات التبول، وhindpaw فرط الحساسية (16؛ لا تظهر البيانات)، على غرار جسدية، والمزاج، واضطرابات عميقة المرضية التي أظهرتها CP / CPPS patieاليلة 4-6.

والميزة الرئيسية لاستخدام NMS للحث CP / CPPS في الفئران هو أنه يستخدم التدخل النفسي لبدء التغيرات الفسيولوجية. المرضى الذين يعانون من CP / CPPS يكون البديل المسببات التي إلى حد كبير لا تنطوي على إصابة سابقة أو الإصابة المباشرة للالبروستاتا 1-3. على الرغم من هذا الواقع، وأدرجت النماذج المنشورة من CP / CPPS التهاب مباشر أو غير مباشر في البروستاتا للحث على فرط الحساسية للمنطقة محيط بالغدد التناسلية و / أو تنشيط الخلايا البدينة. وهناك نسبة كبيرة من CP / CPPS ومرضى آلام الحوض المزمنة في العام، التقرير بعد أن شهدت في وقت مبكر الشدائد الحياة، والذي قد ذهب فعلا غير مدروس في نماذج القوارض من متلازمات الألم البولي التناسلي. وقد أظهرت الأعمال السابقة من مختبرنا أن NMS يدفع فرط الحساسية عن طريق المهبل واضطراب يرتبط به من حسن سير العمل في HPA محور 16. عمل في المستقبل باستخدام هذا النموذج سوف التحقيق في الآليات التي يقودها ضغوط الحياة في وقت مبكر لإنتاج طنانه تغيير النمط الظاهري في مرحلة البلوغ، وكذلك لاستكشاف التدخلات الدوائية أو نمط الحياة المحتملة التي يمكن تطبيقها في بيئة ما قبل السريرية أو الإكلينيكية.

تحقيق أفضل النتائج ومتكررة من هذا البروتوكول يعتمد على مراقبة العديد من الخطوات الهامة التي قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل اعتمادا على البيئة والمعدات المستخدمة. وبالنظر إلى أن المتحف يؤثر بشكل كبير على سير العمل في محور HPA، فمن المهم للسيطرة على مثيرات الخارجية والإجهاد البيئي على حد سواء خلال فترات حديثي الولادة وتعليم الكبار. يجب أن تكون ولدت العمر المتطابقة، الفئران ساذجة غير المتداولة والموجودة في التوافق مع كل فوج من الفئران للمرفق للسيطرة على الضغوطات الخارجية الموجودة في البيئة التي قد تؤثر على تطور محور HPA. من المهم تحديد عدد من الفئران اللازمة لأداء التجربة المقصودة قبل الشروع في تربية أو يأمر النساء الحوامل إلى منشأة الحيوان. أثناء أداء NMS، وgreatesر القلق هو رفض الجراء من السد، وبالتالي فإنه لا بد من الحفاظ على رائحة قفص المنزل طوال بروتوكول NMS. للحد من آثار إيقاعات نهاري، والوقت الفاصل المقترحة لNMS هو خلال منتصف الدورة الخفيفة (11:00 حتي 14:00). وينبغي الحصول على قياسات محيط بالغدد التناسلية حساسية في الناضج تماما ذكور الفئران، ما يقرب من 8 أسابيع من العمر، واتخذت في الوقت نفسه من اليوم لكل مجموعة، ويفضل في دورة الخفيفة في وقت مبكر ليتزامن مع الحوض الصغير في إيقاعات نهاري. للحد من وقوع تحركات غير استحضر خلال هذا الإجراء، يمكن إجراء تقييم في غرفة إثبات الصوت التحكم في درجة حرارته مع الضوضاء البيضاء اللعب (20 - 20000 هرتز). نفس محقق يجب أن يقيم جميع عتبات انسحاب طوال فترة الدراسة للحفاظ على التناسق في الاحتفال من ردود الفعل الإيجابية والسلبية. كبدائل للقياس عتبة الميكانيكية 50٪، وتواتر الانسحاب إلى فصول التوجيه الجامعي حيدة واحديتم تقييم دينار أو الاجهزة الالكترونية فون فراي 46 يمكن الاستفادة منها. لرؤية الخلايا البدينة، ينبغي معالجة كافة الشرائح التي سيتم تحليلها معا لضمان تلطيخ متساو من الخلايا البدينة، وكثافة تلطيخ يمكن أن تختلف بين التجارب. A درجة الحموضة أقل من 1.0 ضرورية على النقيض السليم بين الخلايا البدينة الأرجواني العميق وخلفية زرقاء فاتحة. كثيرة جدا يشطف في الكحول يمكن أن تغسل وصمة عار من الخلايا البدينة ويؤثر سلبا على النقيض من ذلك. أخيرا، بتركيب شبكة على الأنسجة يمكن أن تكون مفيدة في عد الخلايا في جميع أنحاء قسم الأنسجة كله.

وينبغي بذل اعتبارات عدة قبل استخدام NMS للحث CP / الهادئ أو اضطرابات الألم مركزية ذات الصلة. لأول مرة، وقد تم القيام به الغالبية العظمى من المنشورات التي أدرجت ضغوط الحياة في وقت مبكر في نماذج الفئران من المتحف، وذلك باستخدام فترة الفصل اقتطاع من P1 - P14. وقد أظهرت العديد من المجموعات أن هذا النموذج يولد IBS مثل symptomology في صالمنشطات والفئران 15؛ ومع ذلك، في دراسة سابقة لدينا P1 - فترة الفصل P14 في C57BL / 6 الفئران لم تولد زيادة كبيرة في حساسية المهبل 16، كما أنها لم تولد فرط الحساسية القولون والمستقيم (لا تظهر البيانات). لذلك، قد الأنواع وطول NMS تحديد نتائج محددة في مرحلة البلوغ، بما في ذلك شدة symptomology وجهاز معين (ق) التي يتأثر. الثانية، والتغيرات السلوكية والجزيئية الناتجة عن NMS هي إلى حد كبير بسبب ديسريغولاتيون من محور HPA 15-18، مما يشير إلى أن التأثير مركزيا بوساطة ويمكن أن يكون لها نتائج المرضية، بما في ذلك التغيرات في anxiety- و / أو السلوكيات للاكتئاب مثل و زيادة الحساسية في أجهزة الحوض أخرى أو أماكن بعيدة. هذا النمط الظاهري المرضية يدل على ما هو شائع ينظر سريريا، وربما تكون أكثر تمثيلا للمرضى CP / الهادئ ككل 5،28-31،42. ثالثا، بناء على هذه التغيرات تحدث نتيجة لHPA محور dysregulأوجه، يجب أن يكون تأثير الضغوط النفسية من القلق البالغ على حد سواء أثناء إجراء NMS والاختبارات السلوكية لاحق والتحليل في المختبر. الإخراج من محور HPA هو نهاري، مع زيادة الانتاج خلال دورة الظلام أكثر نشاطا والمخرجات أقل خلال دورة الضوء أكثر هدوءا، مما قد يؤثر على نتائج سلوكية أو في تحليل المختبر اعتمادا على الوقت من الاختبار / تضحية 47. وبالمثل، والتعرض للإجهاد، بما في ذلك تمر محيط بالغدد التناسلية اختبار حساسية الميكانيكية، يمكن أن تؤثر بشكل عابر عمل HPA محور 18 ويحتمل أن يغير التعبير الجيني داخل مناطق الدماغ المرتبطة بها والأنسجة الطرفية المصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 female mice  Charles River 027 Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s) Sigma-Aldrich CLS10002L Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic VWR International 414005-124 The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) Stoelting 58011 The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats) IITC 435 Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. 
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) IITC 410 Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose Sigma-Aldrich S5016 Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane Sigma-Aldrich 246654 Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold  VWR International 4557 To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound Sakura 4583 12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide VWR International 48311-703 75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161 Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  BioExpress C-3394 Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover Fisher Scientific 08-815 Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological) Fisher Scientific X3P Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place VWR International 82003 Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box Fisher Scientific 22-363-400 These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific VWR International 4111 Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 VWR International 48393-106 A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope Nikon The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
  2. Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
  3. Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
  4. Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
  5. Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
  6. Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
  7. Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
  8. Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
  9. Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
  10. Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
  11. Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
  12. Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
  13. Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
  14. Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
  15. Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
  16. Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
  17. Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
  18. Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
  19. Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
  20. Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
  21. Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
  22. Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
  23. DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
  24. Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
  25. Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
  26. Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
  27. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
  28. Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
  29. Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
  30. Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
  31. Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
  32. Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
  33. Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
  34. Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
  35. Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
  36. Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
  37. Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
  38. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  39. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  40. Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
  41. Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
  42. Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
  43. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  44. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. e3791 (2012).
  45. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (2012).
  46. Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. e51212 (2013).
  47. Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics