नवजात मातृ जुदाई का एक माउस मॉडल में Perigenital संवेदनशीलता और प्रोस्टेटिक मस्त सेल सक्रियण का आकलन

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Summary

जीर्ण prostatitis / जीर्ण पैल्विक दर्द सिंड्रोम का एक क्लिनिक पूर्व मॉडल को प्रेरित करने के क्रम में नवजात मातृ जुदाई, - हम एक प्रारंभिक जीवन तनाव प्रतिमान कराना पड़ा कि पुरुष C57BL / 6 चूहों की प्रोस्टेट में perigenital यांत्रिक संवेदनशीलता और मस्तूल सेल सक्रियण मापने हैं।

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Fuentes, I. M., Pierce, A. N., O'Neil, P. T., Christianson, J. A. Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation. J. Vis. Exp. (102), e53181, doi:10.3791/53181 (2015).

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Abstract

जीर्ण prostatitis / जीर्ण पैल्विक दर्द सिंड्रोम (सीपी / सीपीपी) 14% की एक जीवन भर के प्रसार है और 50 से कम आयु के पुरुषों के लिए सबसे आम मूत्र संबंधी निदान है, अभी तक यह कम से कम समझ और अध्ययन किया जीर्ण पैल्विक दर्द विकार है। जीर्ण पैल्विक दर्द रिपोर्ट के साथ रोगियों का एक महत्वपूर्ण सबसेट स्पष्ट रूप से हाइपोथैलेमस पीयूषिका- अधिवृक्क (एचपीए) अक्ष के कामकाज और विनियमन को प्रभावित कर सकते हैं, जो प्रारंभिक जीवन तनाव या दुरुपयोग, अनुभव होना। दिखाया गया है जो मस्तूल सेल सक्रियण, आंशिक रूप से एचपीए धुरी के बहाव के सक्रियण द्वारा नियंत्रित किया जाता है, दोनों मूत्र में वृद्धि हुई है और वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी रोगियों के प्रोस्टेटिक स्राव व्यक्त किया जाना है। नवजात मातृ जुदाई (एनएमएस) एचपीए धुरी और आंत संवेदनशीलता में परिवर्तन सहित, कृंतक मॉडल में प्रारंभिक जीवन तनाव के परिणामों का अध्ययन करने के लिए दो दशक से अधिक के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ हम पुरुष C57BL / 6 चूहों में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी के एक क्लिनिक पूर्व मॉडल के रूप में एनएमएस का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम पद्धति का वर्णनperigenital यांत्रिक परपीड़ा, और मस्तूल सेल सक्रियण के histological सबूत का आकलन करने, एनएमएस के प्रदर्शन के लिए। हम भी जल्दी मानसिक तनाव चूहों में पुरुष मूत्रजननांगी प्रणाली पर लंबे समय से स्थायी प्रभाव हो सकता है कि सबूत प्रदान करते हैं।

Introduction

जीर्ण पैल्विक दर्द अपने आप में कोई बीमारी नहीं है, बल्कि चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम (IBS) के साथ का निदान रोगियों द्वारा अनुभव चल रही सहज और / या पैदा दर्द, मध्य cystitis / दर्दनाक मूत्राशय सिंड्रोम (आईसी / पीबीएस), vulvodynia के साथ जुड़े एक शब्द है, या जीर्ण prostatitis / जीर्ण पैल्विक दर्द सिंड्रोम (सीपी / सीपीपी)। ये लक्षण अक्सर प्रतिरक्षा प्रणाली, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, और परिधीय तंत्रिका तंत्र के भीतर शिथिलता इन विकारों 1 के रखरखाव और प्रगति की दिशा में योगदान करने के लिए दिखाया गया है, हालांकि वे नहीं जुड़े विकृति या पहचान अंतर्निहित एटियलजि है कि में कई विशेषताओं comorbid और साझा कर रहे हैं -3। जीर्ण पैल्विक दर्द के साथ रोगियों के लक्षणों के साथ पेश करने के लिए और अधिक होने की संभावना है अतिरिक्त, गैर श्रोणि संबंधी hypothalamic- की बदल कामकाज के साथ संबद्ध किया गया है जो चिंता, अवसाद, और आतंक विकार 4-6, सहित कार्यात्मक दर्द विकारों और मूड विकारों, pituitary-अधिवृक्क (एचपीए) धुरी 7-10। प्रारंभिक जीवन तनाव या मानसिक आघात के संपर्क में एचपीए असामान्यताएं और एसोसिएटेड पुराने दर्द सिंड्रोम 10,11 और, इस तरह के रूप में विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है, कार्यात्मक पैल्विक दर्द बीमारियों के साथ रोगियों की एक महत्वपूर्ण सबसेट इस तरह के दुरुपयोग या उपेक्षा के रूप में प्रतिकूल बचपन की घटनाओं का अनुभव होने की रिपोर्ट 12-14।

Preweaning अवधि के दौरान समय का एक निर्धारित अवधि के लिए उनकी बांध से पिल्ले को दूर करना शामिल है, जो नवजात मातृ जुदाई (एनएमएस), के कृंतक मॉडल, प्रारंभिक जीवन तनाव के परिणामों का अध्ययन करने के लिए पिछले दो दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है। सामान्य में, एनएमएस सीधे हाइपोथेलेमस के भीतर जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर रहा है, साथ ही लिम्बिक संरचनाओं 15-18 से नीचे की ओर विनियमन में खलल न डालें से, एचपीए धुरी सक्रियण, और उसके एवज में चिंता की तरह व्यवहार को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। उचित एचपीए धुरी कामकाज के विघटन की वृद्धि हुई कोलोरेक्टल 19-22 की दिशा में योगदान करने के लिए दिखाया गया है 16 संवेदनशीलता कृंतक एनएमएस मॉडलों द्वारा प्रदर्शित है, लेकिन प्रसव के बाद मूत्राशय सूजन 23-25 ​​के दीर्घकालिक प्रभाव का व्यापक लक्षण वर्णन के बावजूद प्रारंभिक जीवन तनाव के प्रभाव को काफी हद तक मूत्रजननांगी अंगों में अशिक्षित चला गया है। इसलिए, निम्न अध्ययन चूहों में एनएमएस प्रदर्शन करते हैं और बाद में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी के लिए एक क्लिनिक पूर्व मॉडल के रूप में पुरुष एनएमएस चूहों का उपयोग करने के लिए मान्य प्रोस्टेट में perigenital यांत्रिक संवेदनशीलता और मस्तूल सेल घुसपैठ / सक्रियण मूल्यांकन करने के लिए कैसे का वर्णन करेंगे।

निदान जीर्ण पैल्विक दर्द विकारों के सब से, वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी पीठ के निचले हिस्से में दर्द या रुमेटी की है कि दो बार शायद एक लगभग 14% से 26 के जीवनकाल व्यापकता और $ 4400 (कम से अनुमानित वार्षिक रोगी लागत होने के बावजूद कम से कम अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है और विशेषता सिंड्रोम है, गठिया 27)। मूलाधार, मलाशय, प्रोस्टेट, लिंग, अंडकोष, और / या पेट में 28, एक उच्च अनुभव में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी रिपोर्ट दर्द के साथ रोगियोंघेर नियंत्रण रोगियों में 29 से अधिक मानसिक तनाव की डिग्री है, और या के लक्षणों के साथ आमतौर पर उपस्थित comorbid जीर्ण पैल्विक दर्द या मूड विकारों 5,29-31 के साथ का निदान कर रहे हैं। आवर्तक संक्रमण, टपकाया उपकला, तंत्रिकाजन्य सूजन, और औतोइम्मुिनित सभी संभावित अंतर्निहित / सीपीपी 2,32,33 सी.पी. का कारण बनता है, और साथ ही मस्तूल सेल सक्रियण और degranulation 34 के रूप में अनुमान लगाया गया है। इनमें भी बढ़ रहे थे, मस्तूल सेल सक्रियण के एक मार्कर सीपी / सीपीपी के साथ पुरुषों से व्यक्त किया प्रोस्टेटिक स्राव मस्तूल सेल tryptase और तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) के स्तर में 34 से वृद्धि हुई थी, और बाद में एक अध्ययन tryptase पुष्टि की है कि और ए (CPA3) carboxypeptidase वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी रोगियों 35 के मूत्र। शुरुआत और वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी के रखरखाव में मस्तूल कोशिकाओं के लिए संभावित भूमिका इस प्रकार अब तक इस रोग पर पशु अनुसंधान के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित किया गया है। सबसे आम तौर पर कार्यरत कृंतक मॉडल सी.पी. अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया / सीपीपी एक प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित prostatitis है (ईएपी) मॉडल जनरल34,36-39 इस्तेमाल किया प्रजातियों और तनाव के आधार पर प्रोस्टेटिक सूजन के विभिन्न डिग्री में जो परिणाम पूरा Freund के सहायक, में प्रोस्टेट प्रतिजन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा erated। मस्तूल सेल घुसपैठ और सक्रियण / degranulation ईएपी 34,35,40 के निम्न प्रेरण बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। मस्तूल कोशिकाओं 34 या tryptase रिसेप्टर PAR2 35 या तो की कमी ट्रांसजेनिक चूहों wildtype ईएपी चूहों के विपरीत ईएपी निम्नलिखित प्रोस्टेटिक रणनीति संवेदनशीलता, विकसित नहीं है। इस क्लिनिक पूर्व मॉडल मानव सीपी / सीपीपी की विशेषताओं के कई replicates जबकि, प्रेरण प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष सूजन, संक्रमण, या प्रोस्टेट की चोट को शामिल नहीं करता अक्सर एक विविध एटियलजि है और जो मानव की स्थिति का संकेत नहीं है।

मानव में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी के विकास पर प्रारंभिक जीवन तनाव का प्रभाव काफी हद तक uninvestigated चला गया है, हालांकि, हू, एट अल। 41 के एक अध्ययन, मुझे उस का प्रदर्शनएन बचपन शारीरिक, भावनात्मक का एक इतिहास की सूचना दी, और / या यौन शोषण वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी की विचारोत्तेजक लक्षणों का अनुभव करने के लिए काफी अधिक होने की संभावना थे। इसके अलावा, वे दर्द और मूत्र स्कोर के दोनों शारीरिक और भावनात्मक शोषण का एक इतिहास के साथ रोगियों में बढ़ रहे थे कि पता चला है। हम पहले महिला C57BL / 6 चूहों में एक ही एनएमएस प्रतिमान में योनि अतिसंवेदनशीलता और असामान्य जीन अभिव्यक्ति का उत्पादन दिखा दिया है कि दोनों योनि और बेकार एचपीए धुरी उत्पादन 16 की विचारोत्तेजक मूत्राशय। अधिक स्पष्ट रूप से प्रारंभिक जीवन तनाव जोखिम 12-14 के साथ जुड़े होने के लिए दिखाया गया है कि आईसी / पीबीएस और मूड विकारों सहित अन्य comorbidities के 42, के साथ पेश सीपी / सीपीपी रोगियों की उच्च व्यापकता के साथ संयुक्त सबूत, एक प्रयोग करने के लिए औचित्य प्रदान करता है एनएमएस मॉडल चूहों में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी की जांच करने के लिए।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगों कान्सास मेडिकल सेंटर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा निर्दिष्ट दिशा निर्देशों के अनुसार एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुरूप।

1. नवजात मातृ पृथक्करण (एनएमएस)

  1. कूड़े जन्मों के लिए दैनिक गर्भवती बांधों की निगरानी करें।
    नोट: पैदा होता है कूड़े P0 माना जाता है दिन।
  2. P1 पर, घर के पिंजरे से बांध को हटाने और एक साफ माध्यमिक कंटेनर में रखें।
  3. घर के पिंजरे की खुशबू बनाए रखने के लिए स्वच्छ दस्ताने हाथ के बीच बिस्तर के एक मुट्ठी रगड़ो।
  4. उचित एल 2 गिलास बीकर लेबल, एक स्वच्छ में घर पिंजरे बिस्तर के 2 सेमी - 1 की गहराई जोड़ें। कांच बीकर, घर पिंजरे में मौजूद है जो किसी भी अतिरिक्त संवर्धन बिस्तर सामग्री, जैसे, nestlet, crinkle कागज के लगभग आधा जोड़ें।
  5. धीरे एक ही बीकर में, व्यक्तिगत रूप से, एक भी कूड़े से पिल्ले के सभी जगह है।
  6. तुरंत जगहएक मशीन में बीकर 180 मिनट के लिए 33 सी और 50% आर्द्रता में आयोजित किया।
  7. माध्यमिक कंटेनर से बांध निकालें और घर के पिंजरे में उसकी वापसी। मछली पालने का बाड़ा के भीतर अपनी उचित आवास के स्थान पर घर पिंजरे लौटें।
  8. , एनएमएस के दौर से गुजर प्रत्येक कूड़े / बांध के लिए स्वच्छ दस्ताने और माध्यमिक कंटेनरों का उपयोग कर प्रत्येक कूड़े के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  9. वे हटा दिया गया है के रूप में 180 मिनट जुदाई की अवधि के अंत में, उसी क्रम में उनके घर पिंजरों को litters के लिए वापसी।
  10. पहले दिन में अलग हो गया था कि पहले कूड़े के घर पिंजरे निकालते हैं। घर पिंजरे से बांध निकालें और एक साफ माध्यमिक कंटेनर में रखें।
  11. इनक्यूबेटर से पहले बीकर निकालें और पिल्ले से निपटने जबकि घर के पिंजरे की खुशबू बनाए रखने के लिए स्वच्छ दस्ताने हाथ के बीच बिस्तर के एक मुट्ठी रगड़ें।
  12. धीरे घर पिंजरे में बीकर से व्यक्तिगत रूप से, पिल्ले चाल है।
  13. बीकर में शेष किसी भी संवर्धन और बिस्तर पर लौटेंघर पिंजरे।
  14. घर पिंजरे में माध्यमिक कंटेनर से बांध लौटें और मछली पालने का बाड़ा के भीतर अपनी उचित आवास स्थान पर लौटने।
  15. पानी के साथ बीकर कुल्ला और इनक्यूबेटर करने के लिए इसे वापस। जुदाई प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक कूड़े के लिए एक ही बीकर का प्रयोग करें।
  16. वे इनक्यूबेटर में रखा गया था के रूप में एक ही क्रम में एनएमएस के दौर से गुजर प्रत्येक कूड़े के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  17. प्रत्येक कूड़े के दौर से गुजर एनएमएस P21 के माध्यम से हर दिन के लिए इस पूरी प्रक्रिया को दोहराएँ।
  18. भोजन और पानी के साथ पूरी तरह साफ पिंजरों में एक साथ एक ही लिंग के littermates रखकर P22 पर एनएमएस और भोले पिल्ले छुड़ाना। भोले पिल्ले पैदा हुआ था और एनएमएस चूहों के रूप में एक ही परिस्थितियों में रखे, लेकिन सामान्य पशुपालन कार्यों के बाहर कोई अतिरिक्त हैंडलिंग गुजरना किया जाना चाहिए।

2. Perigenital यांत्रिक संवेदनशीलता

  1. वॉन फ्रे उपकरण सेटअप
    1. परीक्षण के कमरे के लिए चूहों लाने और उन्हें 30 के लिए acclimate करने की अनुमतिन्यूनतम उनके घर पिंजरों में रहते हुए।
    2. अन्वेषक चूहों, ऊंचाई में लगभग 55 सेमी चौंकाने बिना नीचे से दृष्टिकोण करने के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करता है कि एक ऊंचा तार जाल टॉप तालिका (79 सेमी x 28 सेमी) के नीचे एक शोषक Underpad रखकर परीक्षण क्षेत्र तैयार करें।
    3. स्पष्ट है, छिद्रित प्लास्टिक कक्षों के तहत व्यक्तिगत रूप से, 12 चूहों को तार जाल तालिका के शीर्ष पर (11 सेमी एक्स 5 सेमी x 3.5 सेमी) के ऊपर रखें। भागने से चूहों को रोकने के लिए कक्षों की चोटी पर एक भारी वस्तु रखें।
    4. वापसी दहलीज आकलन करने से पहले स्क्रीन पर एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए चूहों जलवायु के अनुकूल बनाना।
  2. Perigenital यांत्रिक संवेदनशीलता आकलन
    1. वर्गीकृत वॉन फ्रे monofilaments 43 का एक मानक सेट का उपयोग कर ऊपर से नीचे विधि प्रदर्शन करते हैं। निम्नलिखित monofilaments का उपयोग करें: 1.65 जी, 2.36 ग्राम, 2.83 ग्राम, 3.22 ग्राम, 3.61 ग्राम, 4.08 ग्राम, 4.31 ग्राम, और 4.74 छ।
      1. 3.22 छ monofilament के आधार पकड़ो और मुकर मोनो का पर्दाफाशरेशा।
        नोट: कुछ मॉडलों के एक मुकर monofilament के लिए नहीं हो सकता।
      2. Monofilament खड़ी उन्मुख है, ताकि जांच बैठाना और माउस, चेतावनी स्थिर है, और उसके शरीर के वजन हिंद पंजे के बीच समान रूप से वितरित किया जाता है जब एक मामूली है, जब तक मध्यम रेखा से परहेज है, अंडकोश की बाईं या दाईं ओर या तो इसे लागू मोड़ फिलामेंट में मनाया जाता है।
      3. 10 सेकंड के लिए या जानवर एक सकारात्मक प्रतिक्रिया से पता चलता है जब तक जगह में monofilament पकड़ो।
        नोट: एक सकारात्मक प्रतिक्रिया monofilament आवेदन या चाट या monofilament की ओर निर्देशित काटने व्यवहार के जवाब में एक तेज झटका या कूद माना जाता है। इन कार्यों में प्रदर्शित किए बिना 10 सेकंड monofilament के आवेदन के दौरान माउस चाल, monofilament एक न्यूनतम 1 मिनट के लंबे बाकी अवधि के बाद पुनर्परीक्षण किया जाना चाहिए। एक माउस न तो चलता रहता है और न ही 10 सेकंड monofilament के आवेदन के दौरान सूचीबद्ध व्यवहार से ऊपर के किसी भी दर्शाती है, यह एक नकारात्मक प्रतिक्रिया माना जाता है।
      4. एक प्रयोगशाला नोटबुक या लैपटॉप में, नकारात्मक या सकारात्मक, या तो प्रतिक्रिया रिकॉर्ड और 3.22 छ monofilament का उपयोग कर शेष चूहों के सभी पर इस प्रक्रिया को दोहराने।
      5. फिर अगले उपयुक्त monofilament का उपयोग चूहों के सभी परीक्षण। नोट: माउस 3.22 छ monofilament के लिए एक नकारात्मक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन करते हैं, तो एक ही तरीके से 3.61 छ monofilament लागू करते हैं और प्रतिक्रिया रिकॉर्ड है। माउस 3.22 छ monofilament के लिए एक सकारात्मक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन करते हैं, तो 2.83 छ monofilament लागू करते हैं और प्रतिक्रिया रिकॉर्ड है।
    2. पहला सकारात्मक प्रतिक्रिया मनाया जाता है के बाद एक अतिरिक्त 4 अनुप्रयोगों के लिए, उचित रूप में, अगले बड़ा या छोटा monofilament का उपयोग करते हुए प्रत्येक माउस के परीक्षण के लिए आगे बढ़ें।
    3. घर पिंजरों में चूहों लौटें।
    4. Chaplan एट अल। 43 में वर्णित के रूप में एक 50% छ वापसी दहलीज गणना करने के लिए लॉग इन इकाइयों में परीक्षण श्रृंखला में लागू अंतिम वॉन फ्रे monofilament के मूल्य का प्रयोग करें।
शीर्षक "> 3। अम्लीकृत Toluidine ब्लू मस्त सेल धुंधला

  1. ऊतक प्रसंस्करण
    1. Intracardially ठंडा 4% paraformaldehyde के 45 के साथ perfused किया गया है कि चूहों से प्रोस्टेट ऊतक 44 काटना। पोस्टफिक्स आरटी पर 1 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में ऊतक और फिर 4 डिग्री सीओ / एन पर 1x पीबीएस में 30% sucrose में cryoprotect।
    2. हेपटैन का एक छोटा सा (30 मिलीलीटर) स्नान को तैयार है और सूखी बर्फ पर जगह है।
    3. 1X पीबीएस में प्रोस्टेट ऊतक कुल्ला और एक प्रकाश कर्तव्य पोंछे का उपयोग कर शुष्क।
    4. यह जमे हुए है जब तक ठंड हेपटैन में प्रोस्टेट ऊतक डालें।
    5. जमे हुए जब तक तुरंत सूखी बर्फ पर बढ़ते मीडिया और जगह से युक्त एक cryomold में जमे हुए प्रोस्टेट ऊतक जगह है।
    6. स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर cryomolds।
    7. Transversely एक cryostat का उपयोग 7 माइक्रोन मोटी cryosections में प्रोस्टेट ऊतक में कटौती।
    8. सकारात्मक आरोप लगाया खुर्दबीन स्लाइड पर, ऊतक की लंबाई है कि अवधि 12 गैर धारावाहिक cryosections - 8 जगह।
    9. स्टोर आगे की प्रक्रिया जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड समाप्त हो गया।
  2. अम्लीकृत Toluidine ब्लू की तैयारी
    1. एक 1% शेयर समाधान तैयार करने के लिए समाधान में जब तक 100 मिलीलीटर 70% इथेनॉल और भंवर Toluidine ब्लू हे की 1 ग्राम जोड़ें। शेयर समाधान अप करने के लिए तीन सप्ताह के लिए आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है।
    2. हलचल प्लेट के शीर्ष पर रखा एक बीकर में 100 मिलीलीटर पानी के लिए 1 ग्राम सोडियम क्लोराइड जोड़ें।
    3. 1.0 हासिल की है - 0.5 के पीएच रेंज तक 12 एम एचसीएल का उपयोग कर NaCl समाधान के पीएच को समायोजित करें।
    4. Toluidine ब्लू शेयर समाधान के 8 मिलीग्राम और 1% NaCl समाधान के 32 मिलीलीटर के संयोजन से 0.25% Toluidine ब्लू काम कर समाधान तैयार है। Toluidine ब्लू शेयर समाधान की कुल समावेश सुनिश्चित करने और एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और। काम कर समाधान ताजा किया और उपयोग करने के बाद खारिज कर दिया जाना चाहिए।
  3. प्रोस्टेट cryosections धुंधला
    1. फ्रीजर से संसाधित करने के लिए स्लाइड निकालें और लगभग 30 मीटर के लिए आरटी को संतुलित करने की अनुमतिमें।
    2. अलग-अलग स्लाइड पर चढ़कर ऊतक वर्गों पूरी तरह से जलमग्न हो जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए 1x पीबीएस की पर्याप्त मात्रा युक्त एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में लगभग 1 सेकंड के लिए स्लाइड सूई से ऊतक वर्गों धो लें। स्लाइड एक कागज तौलिया पर शुष्क हवा की अनुमति दें।
    3. पर्याप्त 0.25% काम Toluidine ब्लू समाधान युक्त एक गिलास धुंधला जार में रखें स्लाइड स्लाइड पर चढ़कर ऊतक वर्गों पूरी तरह से जलमग्न हो जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए और 10 के लिए सेते हैं - जबकि 15 rpm पर सेट एक मंच घुमाव पर 15 मिनट।
    4. लगभग 1 सेकंड के लिए 1x पीबीएस में डुबकी स्लाइड अतिरिक्त Toluidine ब्लू बाहर धोने के लिए।
    5. स्लाइड जल निकासी के लिए अनुमति देने के लिए उनके पक्ष पर कर रहे हैं कि इस तरह से एक स्लाइड बॉक्स या रैक में स्लाइड रखें।
    6. 2 बजे या आरटी पर हे / एन की एक न्यूनतम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में स्लाइड्स सूखी।
    7. शराब जोखिम के बीच स्लाइड करने के लिए पूरी तरह से सूखे की अनुमति देता है, जल्दी से शराब का उपयोग कर स्लाइड्स निर्जलीकरण। एक कागज तौलिया एक पर draining से सूखी स्लाइड्सएन डी एक प्रकाश कर्तव्य के साथ पोंछते पीठ और किनारों पोंछ।
      1. लगभग 1 सेकंड के लिए 95% EtOH में स्लाइड को विसर्जित कर दिया और पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें। ऊतक बैंगनी अधिक से अधिक नीले सूख जाता है जब तक 10 बार - इस प्रक्रिया 1 दोहराएँ।
      2. लगभग 1 सेकंड के लिए 100% EtOH में स्लाइड को विसर्जित कर दिया और पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें। ऊतक मध्यम नीले रंग के लिए अंधेरा है, लेकिन बैंगनी नहीं है जब तक 10 बार - इस प्रक्रिया 1 दोहराएँ।
    8. 3 मिनट के लिए 100% xylene में स्लाइड incubating द्वारा दाग को ठीक करें। शुष्क करने की अनुमति।
    9. ग्लिसरॉल, पीबीएस, या xylene आधारित स्थायी बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड coverslip। आरटी पर अतिरिक्त मीडिया और दुकान नाली।
  4. बढ़ाता मस्तूल कोशिकाओं
    1. 20X बढ़ाई प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग (चित्रा 2) पर toluidine नीले रंग से सना हुआ ऊतक वर्गों कल्पना।
    2. कल्पना की क्षेत्र के भीतर मौजूद मस्तूल कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना और गैर degranulated और degranulated मस्तूल कोशिकाओं के बीच अंतर। 40X Magnificatआयन कुछ मस्तूल कोशिकाओं में दानेदार बनाने का कार्य स्थिति की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
      नोट: गैर-degranulated मस्तूल कोशिकाओं नहीं या बेहोश परमाणु रूपरेखा और / या सेल के आसपास कोई बारीक बाहर निकालना के साथ घने metachromasia दिखा रहे हैं। Degranulated मस्तूल कोशिकाओं को कम तीव्र metachromasia प्रदर्शन और कोशिका द्रव्य के भीतर और सेल सीमा के बाहर नाभिक और / या मुफ्त कणिकाओं का एक स्पष्ट स्पष्ट रूपरेखा है।
    3. वर्तमान ऊतक खंड की संपूर्णता में गैर degranulated और degranulated मस्तूल कोशिकाओं की कुल संख्या का आकलन करने के लिए आगे बढ़ें। लंबाई प्रत्येक ऊतक फैले, कम से कम 7 अतिरिक्त अलग अलग वर्गों पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
    4. निम्न समीकरण के अनुसार प्रत्येक ऊतक / माउस के लिए कुल मस्तूल कोशिकाओं को degranulated (डीजी) के प्रतिशत की गणना: (डीजी मस्तूल कोशिकाओं / कुल मस्तूल कोशिकाओं) 100 x।

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Representative Results

एनएमएस आया है कि चूहे सीपी / सीपीपी का संकेत व्यवहार सबूत से पता चला है। वॉन फ्रे monofilaments, 8 सप्ताह पुरानी एनएमएस चूहों के एक वर्गीकृत श्रृंखला के साथ जब जांच (एन = 4) भोले समकक्षों की तुलना में जब perigenital यांत्रिक परपीड़ा प्रदर्शित (एन = 5, चित्रा 2)। Monofilament की ओर निर्देशित monofilament आवेदन या चाट या काट व्यवहार के जवाब में एक तेज झटका या कूद के रूप में दर्ज है, एक सकारात्मक व्यवहार प्रतिक्रिया हासिल कि यांत्रिक वापसी सीमा में, यह एक महत्वपूर्ण कमी (छात्र के टी-परीक्षण पी <0.01) के रूप में इसका सबूत है ।

एनएमएस से अवगत कराया गया कि चूहे भी वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी के histological सबूत का प्रदर्शन किया। प्रोस्टेट ऊतक के cryostat वर्गों मस्तूल कोशिकाओं (चित्रा 3-डी) के भीतर स्थित tryptase कणिकाओं का निरीक्षण करने के acidified ओ-Toluidine ब्लू के साथ दाग रहे थे। सक्रियण, जैसे, फैलाना metachroma के सबूत से पता चला है कि मस्तूल कोशिकाओं का प्रतिशतSIA, सेल सीमा (चित्रा 3 डी) के कणिकाओं उपस्थित बाहर, काफी भोले की तुलना में 8 सप्ताह पुरानी एनएमएस चूहों से प्रोस्टेट ऊतक में वृद्धि की गई थी (पी <0.0001, छात्र के टी-परीक्षण, 3E चित्रा)। घुसपैठ की मस्तूल कोशिकाओं की कुल संख्या की परवाह किए बिना दानेदार बनाने का कार्य स्थिति की, भोले (99.5 ± 15.2 कोशिकाओं / अनुभाग) और एनएमएस चूहों (108.2 ± 22.5 कोशिकाओं / अनुभाग) के बीच काफी अलग नहीं था।

चित्र 1
चित्रा 1. प्रक्रियात्मक समय लाइन। योजनाबद्ध वर्णित कार्यप्रणाली प्रदर्शन के लिए एक सिफारिश की समय रेखा की रूपरेखा। P21 और चूहों P22 पर weaned रहे हैं जब तक नवजात मातृ जुदाई (एनएमएस) 1 प्रसव के बाद दिन (पी) से दैनिक किया जाता है। वे perigenital यांत्रिक Sens के लिए परीक्षण कर रहे हैं जब चूहे उम्र के 8 सप्ताह तक सामान्य पशुपालन के बाहर अछूता रहनाitivity। एक ही चूहों मस्तूल सेल धुंधला के लिए मूल्यांकन किया जा करने के लिए जा रहे हैं, एक सप्ताह के हल करने के लिए किसी भी अवशिष्ट तनाव के प्रभावों के लिए अनुमति देने के लिए निम्नलिखित व्यवहार परीक्षण बीत करने की अनुमति दी जानी चाहिए।

चित्र 2
चित्रा 2. Perigenital यांत्रिक संवेदनशीलता। Perigenital यांत्रिक संवेदनशीलता वॉन फ्रे monofilament आवेदन का उपयोग मापा गया था। नवजात मातृ जुदाई (एनएमएस) कराना पड़ा कि नर चूहों यांत्रिक परपीड़ा का संकेत भोले चूहों की तुलना में, वापसी दहलीज में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया। डाटा मतलब है SEM का प्रतिनिधित्व करता है, एन = प्रत्येक समूह के लिए 4। * पी <0.05, छात्र के टी परीक्षण।

चित्र तीन
नीले चित्रा 3. मस्तूल सेल सक्रियण। अम्लीकृत toluidine tryptase कणिकाओं कल्पना और प्रोस्टेट ऊतक के cryostat वर्गों में सक्रिय / degranulated मस्तूल कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रतिनिधि photomicrographs सक्रिय (degranulated) मस्तूल कोशिकाओं का संकेत बरकरार (गैर degranulated) और तीर का संकेत तीर के साथ भोले (ए) से toluidine नीला दाग वर्गों और एनएमएस (बी) प्रोस्टेट के दिखाए जाते हैं। हायर भोले (सी) से बढ़ाई छवियों और एनएमएस (डी) मूत्राशय गैर degranulated (सी) से ऊतकीय मतभेदों को वर्णन करने के लिए दिखाया गया है और (डी) मस्तूल कोशिकाओं degranulated कर रहे हैं। भोले चूहों (ई) की तुलना में जब degranulated मस्तूल कोशिकाओं के एक काफी उच्च प्रतिशत एनएमएस चूहों से प्रोस्टेट वर्गों में मनाया गया। डाटा मतलब है SEM का प्रतिनिधित्व करता है, एन = प्रत्येक समूह के लिए 4। **** पी <0.0001, छात्र के टी परीक्षण।= "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल वयस्क नर चूहों में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी का संकेत symptomology प्रेरित करने के लिए, एनएमएस के रूप में, नवजात तनाव का उपयोग करने के लिए पद्धति प्रदान करता है। वयस्क के रूप में, एनएमएस चूहों महत्वपूर्ण perigenital यांत्रिक परपीड़ा, साथ ही प्रोस्टेट ऊतक में मस्तूल सेल degranulation के सबूत प्रदर्शित करते हैं। एनएमएस के उपयोग के रूप में, यह अक्सर जीर्ण पैल्विक दर्द 12-14 के साथ रोगियों द्वारा सूचना दी है कि प्रारंभिक जीवन तनाव, कि replicates में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी के एक क्लिनिक पूर्व मॉडल को विकसित करने के साथ ही एक गैर इनवेसिव प्रेरण को शामिल करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण है अधिक सामान्यतः chemically-, इस्तेमाल और प्रोस्टेट 34,36-39 की सूजन immunologically प्रेरित करने का विरोध किया। , द्वारा प्रदर्शित comorbid दैहिक, मूड, और आंत संबंधी विकारों के लिए भी इसी तरह, (नहीं दिखाया डेटा 16) इसके अलावा, चूहों में एनएमएस अतिसंवेदनशीलता बदल चिंता की तरह है और anhedonic व्यवहार सहित comorbid symptomology, वृद्धि हुई है, बारंबार पेशाब करने की इच्छा दरों का उत्पादन, और hindpaw दिखाया गया है वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी patieएनटीएस 4-6।

चूहों में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी प्रेरित करने के लिए एनएमएस उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि शारीरिक परिवर्तनों को आरंभ करने के लिए एक मनोवैज्ञानिक हस्तक्षेप का उपयोग करता है। वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी के साथ मरीजों को काफी हद तक प्रोस्टेट 1-3 के पिछले संक्रमण या सीधे चोट को शामिल नहीं करता है कि संस्करण एटियलजि है। इस तथ्य के बावजूद, वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी की प्रकाशित मॉडल perigenital क्षेत्र और / या मस्तूल सेल सक्रियण की अतिसंवेदनशीलता को प्रेरित करने के लिए प्रोस्टेट के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से सूजन को शामिल किया है। जनरल, रिपोर्ट में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी और जीर्ण पैल्विक दर्द के रोगियों का एक महत्वपूर्ण अनुपात काफी हद तक मूत्रजननांगी दर्द सिंड्रोम के कृंतक मॉडल में अशिक्षित चला गया है जो प्रारंभिक जीवन प्रतिकूल परिस्थितियों, अनुभव होना। हमारी प्रयोगशाला से पिछला काम एनएमएस योनि अतिसंवेदनशीलता और 16 अक्ष एचपीए के समुचित कार्य के जुड़े विघटन को प्रेरित करता है कि दिखाया गया है। टी का उत्पादन करने के लिए प्रारंभिक जीवन तनाव से प्रेरित हैं कि तंत्र की जांच करेंगे कि इस मॉडल का उपयोग करते हुए भविष्य के कामवह वयस्कता में फेनोटाइप बदल दिया है, साथ ही एक पूर्व नैदानिक ​​या नैदानिक ​​सेटिंग में लागू किया जा सकता है कि संभावित औषधीय या जीवन शैली हस्तक्षेप का पता लगाने के लिए।

इस प्रोटोकॉल से इष्टतम और repeatable परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता पर्यावरण और उपकरणों के आधार पर अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है कि कई महत्वपूर्ण कदम देख पर निर्भर करता है। कि नाटकीय रूप से एचपीए धुरी के कामकाज को प्रभावित करता है NMS देखते हुए, यह दोनों नवजात और वयस्क अवधि के दौरान बाहर उत्तेजनाओं और पर्यावरण के तनाव के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। उम्र से मिलान, गैर संभाला भोले चूहों का जन्म हुआ और एचपीए धुरी के विकास को प्रभावित कर सकता है कि वातावरण में मौजूद बाह्य तनाव के लिए नियंत्रित करने के लिए एनएमएस चूहों के प्रत्येक पलटन के साथ सामंजस्य में रखा जाना चाहिए। यह प्रजनन की शुरुआत या जानवरों की सुविधा में गर्भवती महिलाओं के आदेश देने के लिए पहले इच्छित प्रयोग करने की जरूरत चूहों की संख्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रदर्शन करते हुए एनएमएस, greatesटी चिंता का विषय है, इसलिए यह एनएमएस प्रोटोकॉल भर घर पिंजरे की खुशबू बनाए रखने के लिए आवश्यक है, बांध से पिल्ले की अस्वीकृति है। प्रतिदिन लय के प्रभाव को कम करने के लिए, एनएमएस के लिए सुझाव दिया जुदाई समय (11:00-02:00) प्रकाश चक्र के मध्य के दौरान होता है। Perigenital संवेदनशीलता माप, पूरी तरह से परिपक्व वयस्क नर चूहों में उम्र के लगभग 8 सप्ताह प्राप्त है, और प्रत्येक समूह के लिए दिन के एक ही समय पर लिया जाना चाहिए, अधिमानतः जल्दी प्रकाश चक्र में प्रतिदिन लय में गर्त के साथ मेल खाना। (- 20,000 हर्ट्ज 20) इस प्रक्रिया के दौरान गैर पैदा आंदोलनों की घटना को कम करने, मूल्यांकन खेलने के सफेद शोर के साथ एक तापमान नियंत्रित, ध्वनि सबूत कमरे में प्रदर्शन किया जा सकता है। एक ही अन्वेषक सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रियाओं के पालन में निरंतरता बनाए रखने के लिए अध्ययन के दौरान सभी वापसी थ्रेसहोल्ड का आकलन करना चाहिए। 50% यांत्रिक दहलीज, एक भी monofilament cou करने के लिए वापसी आवृत्ति को मापने के लिए विकल्प के रूप मेंएलडी का आकलन किया जा सकता है या एक इलेक्ट्रॉनिक वॉन फ्रे तंत्र 46 उपयोग किया जा सकता है। मस्तूल सेल दृश्य के लिए, विश्लेषण करने के लिए कर रहे हैं कि सभी स्लाइड धुंधला तीव्रता प्रयोगों के बीच अलग-अलग हो सकते हैं, मस्तूल कोशिकाओं के बराबर धुंधला सुनिश्चित करने के लिए एक साथ कार्रवाई की जानी चाहिए। 1.0 नीचे एक पीएच गहरे बैंगनी मस्तूल कोशिकाओं और हल्के नीले रंग की पृष्ठभूमि के बीच उचित विपरीत के लिए आवश्यक है। बहुत शराब में कई rinses के मस्तूल कोशिकाओं से दाग धो सकते और नकारात्मक विपरीत असर पड़ता है। अंत में, ऊतक पर एक ग्रिड superimposing पूरे ऊतक अनुभाग भर में कोशिकाओं की गिनती करने में सहायक हो सकते हैं।

कई कारणों से पूर्व सीपी / सीपीपी या संबंधित केंद्रीकृत दर्द विकारों को उत्पन्न करने के लिए एनएमएस का उपयोग करने के लिए किया जाना चाहिए। P14 - सबसे पहले, प्रारंभिक जीवन तनाव को शामिल किया है कि प्रकाशनों के विशाल बहुमत P1 का एक छोटा जुदाई अवधि का उपयोग करते हुए, एनएमएस के चूहे मॉडल में किया गया है। कई समूहों इस प्रतिमान आर में एक IBS की तरह symptomology उत्पन्न करता है कि पता चला हैएटीएस और चूहों 15; हालांकि, हमारे पिछले अध्ययन में एक P1 - C57BL / 6 चूहों में P14 जुदाई अवधि योनि संवेदनशीलता 16 में एक उल्लेखनीय वृद्धि उत्पन्न नहीं किया, न ही यह कोलोरेक्टल अतिसंवेदनशीलता उत्पन्न किया था (डेटा) नहीं दिखाया। इसलिए, एनएमएस की प्रजातियों और लंबाई symptomology की गंभीरता और प्रभावित है कि विशिष्ट अंग (एस) सहित, वयस्कता में विशिष्ट परिणाम तय हो सकता है। दूसरा, एनएमएस से उत्पन्न व्यवहार और आणविक परिवर्तनों को प्रभावी केंद्रीय रूप से मध्यस्थता है और anxiety- में परिवर्तन और / या अवसाद की तरह व्यवहार और सहित comorbid परिणाम है, हो सकता है, सुझाव है कि एचपीए धुरी 15-18 का अनियंत्रण करने के लिए बड़े पैमाने पर होने वाले हैं अन्य पेल्विक अंगों या अधिक दूर के स्थानों में वृद्धि की संवेदनशीलता। इस comorbid फेनोटाइप सामान्यतः चिकित्सकीय क्या देखा है का संकेत है और एक पूरी 5,28-31,42 के रूप में वाणिज्यिक पत्र / सीपीपी मरीजों की अधिक प्रतिनिधि हो सकता है। तीसरा, एचपीए धुरी dysregul का एक परिणाम के रूप में होने वाली इन परिवर्तनों के आधार परसमझना, तनाव के प्रभाव एनएमएस प्रक्रिया और बाद में व्यवहार परीक्षण दोनों के दौरान और इन विट्रो विश्लेषण में अत्यंत चिंता का विषय होना चाहिए। एचपीए धुरी से आउटपुट व्यवहार या इन विट्रो विश्लेषण में परीक्षण के समय पर निर्भर करता है के परिणाम को प्रभावित कर सकता है जो अधिक मौन प्रकाश चक्र के दौरान और अधिक सक्रिय अंधेरे चक्र के दौरान अधिक से अधिक उत्पादन और कम उत्पादन के साथ, दीन का है / 47 बलिदान। इसी तरह, perigenital यांत्रिक संवेदनशीलता परीक्षण के दौर से गुजर सहित तनाव, के संपर्क में, क्षणिक 18 अक्ष एचपीए के कामकाज को लागू कर सकते हैं और संभावित रूप से जुड़े मस्तिष्क क्षेत्रों और नीचे की ओर परिधि के ऊतकों के भीतर जीन की अभिव्यक्ति बदल।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 female mice  Charles River 027 Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s) Sigma-Aldrich CLS10002L Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic VWR International 414005-124 The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) Stoelting 58011 The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats) IITC 435 Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. 
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) IITC 410 Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose Sigma-Aldrich S5016 Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane Sigma-Aldrich 246654 Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold  VWR International 4557 To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound Sakura 4583 12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide VWR International 48311-703 75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161 Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  BioExpress C-3394 Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover Fisher Scientific 08-815 Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological) Fisher Scientific X3P Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place VWR International 82003 Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box Fisher Scientific 22-363-400 These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific VWR International 4111 Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 VWR International 48393-106 A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope Nikon The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.  

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