신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fuentes, I. M., Pierce, A. N., O'Neil, P. T., Christianson, J. A. Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation. J. Vis. Exp. (102), e53181, doi:10.3791/53181 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS)은 14 %의 평생 유병률이 50 세 미만의 사람에 대한 가장 일반적인 비뇨기과 진단이다, 그러나 그것은 적어도 이해하고 연구 만성 골반 통증 질환이다. 만성 골반 통증 보고서 환자의 중요한 부분 집합은 현저하게 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축의 기능 및 규제에 영향을 미칠 수있는 생애 초기 스트레스 또는 학대를 경험 한. 표시되었습니다 비만 세포의 활성화는, 부분적으로 HPA 축 다운 스트림 활성화에 의해 조절된다, 모두 소변으로 증가 CP / CPPS 환자의 전립선 분비물을 표현한다. 신생아 산모의 분리 (NMS)는 HPA 축과 내장 감도의 변화를 포함한 설치류 모델에서 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 20 년 이상 사용되어왔다. 여기에서 우리는 남성 C57BL / 6 마​​우스에서 CP / CPPS의 전임상 모델로 NMS를 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 방법을 설명perigenital 기계적 이질통 및 비만 세포 활성화의 증거를 조직 학적 평가, NMS를 행하는. 우리는 또한 초기의 심리적 스트레스가 마우스에서 남성 비뇨 생식기 시스템에 오래 지속되는 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공한다.

Introduction

만성 골반통 자체가 질병이 아니라, 과민성 대장 증후군 (IBS)으로 진단 환자가 경험 지속적인 자발 및 / 또는 유발 통증, 간질 성 방광염 / 통증 방광 증후군 (IC / PBS), vulvodynia와 연관된 기간, 만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS). 이러한 증후군은 종종 면역계, 중추 신경계, 말초 신경계 내에서 부전 이러한 질환 (1)의 유지 보수 및 진행에 기여하는 것으로되어 있지만, 그들이, 연관된 병리 또는 식별 근본적인 원인이 없다고 많은 특성을 동반하고 공유되고 -3. 만성 골반 통증 환자의 증상을 제시 할 가능성이 추가, 비 골반 관련 hypothalamic-의 변경된 기능과 관련되어 불안, 우울증과 공황 장애 4-6, 포함 기능 통증 질환 및 기분 장애를, pituitary-부신 (HPA) 축 7-10. 초기 생활 스트레스 나 외상에 노출 HPA 이상과 관련된 만성 통증 증후군 (10, 11)과 같은 개발을위한 중요한 위험 인자, 기능 골반 통증 장애 환자의 상당 부분 집합은 학대 나 방치 등의 부작용 어린 시절의 사건을 경험 한보고한다 12-14.

preweaning 기간 동안 일정 시간 동안 자신의 댐에서 새끼를 제거하는 것을 포함 신생아 산모의 분리 (NMS)의 설치류 모델은 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 지난 20 년간 사용되어왔다. 일반적으로, NMS 직접 시상 하부 내에서 유전자 발현에 영향을 미칠뿐만 아니라, 변연 구조 15-18 하류 조절을 방해하여, HPA 축의 활성화 및 결과적인 불안 같은 행동을 증가시키는 것으로 나타났다. 적절한 HPA 축 작동 중단 증가 대장 19-22에 기여하는 것으로 나타났다 (16) 감도는 NMS 설치류 모델이 표시되지만 산후 방광 염증 23-25의 장기적인 효과의 광범위한 특성에도 불구하고, 초기 생명 응력의 영향은 크게 비뇨 기관에서 배우지왔다. 따라서, 다음의 연구는 마우스에서 NMS을 수행하고 나중에 CP / CPPS위한 전임상 모델로서 남성 NMS 마우스의 사용을 확인하는 전립선 perigenital 기계적 감도 및 비만 세포 침윤 / 활성화를 평가하는 방법을 설명한다.

진단 만성 골반 통증 질환의 모든 중, CP / CPPS는 요통이나 류마티스의 두 번 아마도 약 14 % (26)의 평생 유병률과 4,400달러 (추정 연간 환자 비용에도 불구하고 가장 잘 인식과 특징 증후군이다 관절염 27). 회음부, 항문이, 전립선, 음경, 고환, 및 / 또는 복부 (28)는, 하이를 경험에 CP / CPPS 보고서 통증 환자gher 대조군 (29)보다 심리적 스트레스의 정도, 그리고 나의 증상이 일반적으로 현재는 동반 만성 골반 통증이나 기분 장애 5,29-31으로 진단된다. 재발 성 감염, 누설 상피, 신경성 염증 및자가 면역 모두 기저 전위 / CPPS 2,32,33 CP의 요인뿐만 아니라, 비만 세포 활성 및 탈과립 (34)로 추측되고있다. 또한 증가하고, 비만 세포 활성화 마커 CP / CPPS 남성로부터 발현 전립선 분비물 비만 세포 트립 타제 및 신경 성장 인자 (NGF) 레벨 (34)이 증가하였고, 이후 연구 트립 타 아제를 확인하고 (CPA3)를 카르복시 CP / CPPS 환자 (35)의 소변. 발병 및 CP / CPPS의 유지 보수에 비만 세포의 잠재적 인 역할은 지금까지이 증후군에 대한 동물 연구의 주요 초점이되고있다. 가장 일반적으로 사용되는 설치류 모델이 CP를 연구하는 데 사용 / CPPS는 실험자가 면역 전립선 염이다 (EAP) 모델 겐34,36-39 사용 종과 변형에 따라 전립선 염증의 변화도 초래 완전 프로 인트 보조제, 전립선 항원의 피하 주사에 의해 erated. 비만 세포의 침윤 및 활성화 / 탈과립은 EAP 34,35,40의 다음 유도를 증가하는 것으로 나타났다. 비만 세포 (34) 또는 트립 타제 수용체 PAR2 (35) 중 하나에 결함이 형질 전환 마우스는 야생형 EAP 마우스와 달리 EAP 다음 전립선 전술 감도를 개발하지 않습니다. 이 전임상 모델은 인간의 CP / CPPS의 많은 특징을 복제하는 동안, 유도 프로토콜 직접적인 염증, 감염, 또는 전립선의 손상을 포함하지 않는 종종 다양한 원인을 가지고 있으며, 인간의 상태를 나타내는 아니다.

인간의 CP / CPPS의 개발에 초기 생활 스트레스의 영향은 크게 uninvestigated 갔다; 그러나, 후진타오, 등. (41)에 의해 연구는 나를 시연N 어린 시절 신체적, 감정적 인의 역사를보고, 및 / 또는 성적 학대는 CP / CPPS을 암시하는 증상을 경험 훨씬 더 많은 것으로 나타났다 사람들. 또한, 그들은 고통과 소변 점수가 모두 신체적, 정서적 학대의 역사를 가진 환자에서 증가 된 것으로 나타났다. 우리는 이전에 암컷 C57BL / 6 마우스에서 NMS 같은 패러다임에 질 과민증 비정상적인 유전자 발현을 생산하고 있음을 증명하고있다 양쪽 성기 및 역기능 HPA 축 (16)의 출력 암시 방광. 보다 명확 어릴 응력 노출 12-14과 연계되는 것으로 도시되었다 IC / PBS 및 기분 장애를 포함하는 다른 동반 질환 (42), 제시하는 CP / CPPS 환자의 높은 유병률과 결합이 증거는, 사용에 대한 근거를 제공한다 NMS 모델 생쥐에서 CP / CPPS을 알아보고자 하였다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 캔자스 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 지정된 지침에 따라 NIH 가이드 라인을 준수합니다.

1. 신생아 모자 분리 (NMS)

  1. 쓰레기 출생 매일 임신 댐을 모니터링합니다.
    참고 : 태어난 쓰레기가 P0으로 간주되는 날.
  2. (P1)에서 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다.
  3. 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러.
  4. 적절하게 2 패 유리 비커를 표시, 깨끗한로 홈 케이지 침구 1-2cm의 깊이를 추가합니다. 유리 비커에 홈 케이지에 존재하는 추가 농축 침구 소재, 예를 들어, nestlet, 주름 종이의 약 절반을 추가합니다.
  5. 부드럽게 같은 비커에, 개별적으로, 하나의 쓰레기에서 새끼를 모두 넣습니다.
  6. 즉시 배치인큐베이터에서 비커는 180 분 동안 33 O C와 50 %의 습도에서 개최.
  7. 차 컨테이너에서 댐을 제거하고 홈 케이지에 그녀를 돌려줍니다. 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 홈 케이지를 돌려줍니다.
  8. , NMS를 받고 각 쓰레기 / 댐 깨끗한 장갑 및 보조 용기를 사용하여 각 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다.
  9. 그들은 제거로 180 분간 분리 기간의 끝에서와 같은 순서로 자신의 홈 케이지로 돌려 담가.
  10. 이전에 하루에 분리 된 첫 번째 쓰레기의 홈 케이지를 검색합니다. 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다.
  11. 인큐베이터에서 첫 번째 비커를 제거하고 새끼를 처리하는 동안 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러.
  12. 조심스럽게 집 케이지에 비커에서, 개별적으로, 새끼를 이동합니다.
  13. 에 비커에 남아있는 우라늄 농축과 침구를 돌려줍니다홈 케이지.
  14. 홈 케이지에 차 컨테이너에서 댐을 돌아 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 돌아갑니다.
  15. 물을 비이커를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 분리 절차를 통해 각각의 쓰레기에 대해 동일한 비커를 사용합니다.
  16. 그들은 배양기에 넣고, 같은 순서로 NMS를 받고 각각의 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다.
  17. 각각의 쓰레기 겪고 NMS (P21)를 통해 매일 매일이 전체 절차를 반복합니다.
  18. 음식과 물을 완벽하게 깨끗한 케이지에서 함께 동성의 한배 새끼를 배치하여 P22에 NMS와 순진한 새끼를 유아. 순진한 새끼가 태어나 NMS 마우스와 같은 조건에서 보관하지만 일반 축산 작업 이외의 추가 처리를 받게 될 수 없습니다.

2. Perigenital 기계 감도

  1. 프레이 장치 설치
    1. 테스트 룸에 마우스를 가져오고 그들이 30 적응 할 수 있도록분은 자신의 홈 케이지에 남아있다.
    2. 연구자는 마우스, 높이 약 55cm를 깜짝 놀랄없이 아래쪽에서 접근 할 수 있도록 충분한 공간을 제공하는 높은 와이어 메쉬 탑 테이블 (79cm X 28cm) 아래에 흡수 underpad을 배치하여 테스트 영역을 준비합니다.
    3. 분명,이 뚫린 플라스틱 챔버에서, 개별적으로, 12 마우스에 철망 테이블 상단에 (11cm X 5cm X 3.5 cm)를 놓습니다. 탈출 마우스를 방지하기 위해 챔버 위에 무거운 물체를 놓습니다.
    4. 움츠림 역치 평가 이전 화면에 추가로 30 분 동안 마우스를 적응.
  2. Perigenital 기계 감도 평가
    1. 경사 본 프레이 모노 필라멘트 (43)의 표준 세트를 사용하는 업 - 다운 방법을 수행. 다음과 같은 모노 필라멘트를 사용하여 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g 및 4.74 g의.
      1. 3.22 G 모노 필라멘트의 기초를 잡고 후퇴 모노 노출필라멘트.
        참고 : 일부 모델은 후퇴 모노 필라멘트가 없을 수 있습니다.
      2. 모노 필라멘트가 수직 배향되도록 프로브를 놓다 및 마우스, 경보 움직이며, 그 체중이 뒷발에 고르게 분배 될 때 약간까지, 정중선을 피하고, 음낭 좌우 양측에 적용 벤드는 필라멘트에서 관찰된다.
      3. 10 초 동안이나 동물이 긍정적 인 반응을 보일 때까지 자리에 모노 필라멘트를 잡습니다.
        참고 : 긍정적 인 반응은 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 모노 필라멘트 지향 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 간주됩니다. 이러한 행동을 표시하지 않고, 10 초 모노 필라멘트의인가 마우스 이동, 모노 필라멘트는 최소 1 분 길이의 휴지 기간 다음 재시험되어야한다면. 마우스 이동도도 10 초 모노 필라멘트인가에 나열된 전술 한 동작이 나타나는 경우, 부정 응답 여겨진다.
      4. 실험실 노트북 또는 노트북에, 음 또는 양 중, 응답을 기록하고 3.22 g의 모노 필라멘트를 사용하여 나머지 쥐 모두에서이 절차를 반복합니다.
      5. 다시 다음 적절한 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 모두 테스트합니다. 주 : 마우스 3.22 g 모노 필라멘트로 부정 응답을 나타내 경우 동일한 방법으로 3.61 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. 마우스 3.22 g 모노 필라멘트에 양성 반응을 나타내 경우 2.83 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다.
    2. 제 양성 반응이 관찰 된 후에 추가의 애플리케이션을위한 4, 적절한 다음 크거나 작은 각 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 시험 계속.
    3. 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다.
    4. Chaplan 등. (43)에 기재된 바와 같이 50 % g 움츠림 역치를 계산하는 로그 단위 시험 시리즈인가 최종 본 프레이 모노 필라멘트의 값을 사용한다.
제목 "> 3. 산성화 톨루이딘 블루 비만 세포 염색

  1. 조직 처리
    1. intracardially 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 45 관류 된 마우스로부터 전립선 조직 44 해부. 후위 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 한 후 4 ° CO / N에 1X PBS의 30 % 자당에 cryoprotect.
    2. 헵탄의 작은 (30 ml)에 목욕을 준비하고 드라이 아이스에 놓습니다.
    3. 1X PBS에서 전립선 조직을 씻어 빛 의무 닦아 사용하여 건조.
    4. 이 동결 될 때까지 차가운 헵탄으로 전립선 조직을 삽입합니다.
    5. 냉동 될 때까지 즉시 드라이 아이스에 장착 매체와 장소를 포함하는 cryomold에 냉동 전립선 조직을 배치합니다.
    6. 스토어는 -20 ° C에서 cryomolds.
    7. 가로 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm의 두께 저온부로 전립선 조직을 잘라.
    8. 긍정적으로 충전 된 현미경 슬라이드에, 조직의 길이에 걸쳐 12 비 직렬 저온부 - 8 놓습니다.
    9. 저장소 추가 처리 할 때까지 -20 ° C에서 슬라이드를 마쳤다.
  2. 산성화 된 톨루이딘 블루 준비
    1. 1 % 스톡 용액을 제조 할 때까지 용액에 100 ml의 70 % 에탄올과 와류에 톨루이딘 블루 O 1 g을 넣고. 원액은 최대 3 주 동안 실온에서 저장 될 수있다.
    2. 교반 판의 상단에 배치 비커에 100ml의 물에 1g의 NaCl을 추가합니다.
    3. 달성되는 1.0 - 0.5의 pH 범위까지 12 M 염산을 사용하여 NaCl 용액의 pH를 조정한다.
    4. 톨루이딘 블루 스톡 용액 8 ml의 1 % NaCl 용액 32 ㎖에 결합하여 0.25 % 톨루이딘 블루 작업 용액을 준비한다. 톨루이딘 블루 원액의 전체 통합을 보장하고 소용돌이를 사용하여 혼합 아래로 피펫합니다. 작업 솔루션은 신선한 만든 및 사용 후 폐기해야합니다.
  3. 전립선 저온부 염색
    1. 냉동고에서 처리되는 슬라이드를 제거하고 약 30 m에서 RT로 평형을 허용있다.
    2. 개별적으로 슬라이드 마운트 조직 섹션 완전히 잠수되는 것을 보장하기 위해 1X PBS의 충분한 양을 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 약 1 초 동안 침지하여 슬라이드 조직 절편을 씻는다. 슬라이드는 종이 타월에 공기 건조하도록 허용합니다.
    3. 충분히 0.25 % 작업 톨루이딘 블루 솔루션을 포함하는 유리 염색 항아리에 넣어 슬라이드는 슬라이드에 장착 된 조직 절편이 완전히 침수 될 수 있도록 10 동안 배양 - 동안 15 rpm으로 설정 플랫폼 로커에 15 분.
    4. 약 1 초 동안 1X PBS에서 딥 슬라이드 초과 톨루이딘 블루를 씻어.
    5. 슬라이드 배수를 허용하도록 그들의 양쪽되는 방식으로 슬라이드 박스 또는 선반 슬라이드를 놓는다.
    6. 2 시간 또는 RT에서 O / N의 최소 37 ° C의 오븐에서 슬라이드를 건조.
    7. 알코올 노출 사이의 슬라이드는 완전히 건조 있도록 신속 알코올을 사용하여 슬라이드를 탈수. 종이 수건에 배수에 의해 건조 슬라이드차 경량으로 닦아 백업 및 가장자리가 닦습니다.
      1. 약 1 초 동안 95 % EtOH로에서 슬라이드를 담그고 완전히 건조 할 수 있습니다. 조직이 보라색보다 더 푸른 건조 될 때까지 10 회 -이 절차 1을 반복합니다.
      2. 약 1 초 동안 100 %의 EtOH에 슬라이드를 담그고 완전히 말리십시오. 조직이 매체 파란색으로 어두운하지만, 보라색되지 때까지 10 배 -이 절차 1을 반복합니다.
    8. 3 분 동안 100 % 크실렌의 슬라이드를 배양하여 얼룩을 수정합니다. 건조하도록 허용합니다.
    9. 글리세롤, PBS, 또는 자일 렌 계 영구 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 커버 슬립. 실온에서 초과 용지 및 저장을 배출합니다.
  4. 정량화 비만 세포
    1. 20X 배율 광학 현미경을 사용하여 (그림 2)에서 톨루이딘 블루 스테인드 조직 섹션을 시각화.
    2. 가시 영역 내에 존재하는 비만 세포의 총 수를 계산 및 비 degranulated degranulated 및 비만 세포를 구별. 40X의 MAGNIFICAT이온 일부 비만 세포에서 과립의 상태를 확인하기 위해 필요할 수있다.
      참고 : 비 degranulated 비만 세포가 없거나 희미 핵 개요 및 / 또는 세포 주위에 세분화 된 압출과 밀도 metachromasia을 나타낸다. Degranulated 비만 세포는 덜 심한 metachromasia를 나타내고 세포질 내 및 셀 경계 외부 핵 및 / 또는 자유 과립 명백한 명확한 윤곽을 갖는다.
    3. 현재 조직 절편의 전체 비 degranulated degranulated 및 비만 세포의 총 수를 지속적으로 평가. 길이 각 조직에 걸쳐, 최소 7 추가적인 별도의 섹션에서이 절차를 반복합니다.
    4. 하기 식에 따라 각 조직 / 전체 마우스 비만 세포에 degranulated (DG)의 비율을 계산한다 (DG 비만 세포 / 총 비만 세포) × 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NMS받은 마우스는 CP / CPPS를 나타내는 행동의 증거를 보여 주었다. 프레이 모노 필라멘트 8 주령 NMS 마우스의 등급 일련의 시험 할 때 (N = 4) 순진 대응에 비해 perigenital 기계적 이질통을 표시 (N = 5, 그림 2). 모노 필라멘트 지향 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 기록, 긍정적 인 행동 반응을 이끌어 낸 기계 탈퇴 임계 값에서, 이것은 상당한 감소 (학생의 t- 테스트 P <0.01)로 입증된다 .

NMS에 노출 된 마우스는 CP / CPPS의 조직 학적 증거를 표시. 전립선 조직의 저온 섹션은 비만 세포 (도 3A-D)에 수납 트립 타 아제 과립을 관찰로 산성화 O 톨루이딘 블루 염색 하였다. 활성화, 예를 들면, 확산 metachroma 증거를 보였다 비만 세포의 백분율SIA, 셀 테두리 (그림 3D)의 과립 현재 외부가 상당히 순진한에 비해 8 주령 NMS 쥐에서 전립선 조직에서 증가 하였다 (P <0.0001, 학생의 t-test를, 그림 3E). 침투 비만 세포의 총 수에 관계없이 과립 상태, 순진 (99.5 ± 15.2 세포 / 절) 및 NMS 마우스 (108.2 ± 22.5 세포 / 부분) 사이에 유의 한 차이가 있었다.

그림 1
그림 1. 절차 타임 라인. 회로도는 기술 된 방법을 수행하기위한 권장 시간 라인을 설명합니다. P21와 마우스가 P22에 젖을 때까지 신생아 산모의 분리 (NMS는) 1 출생 후 하루 (P)에서 매일 수행됩니다. 그들은 perigenital 기계 SENS 검사를 할 때 마우스는 나이 8 주까지 정상 축산 이외의 평온 유지itivity. 같은 마우스는 비만 세포 염색에 대한 평가하려는 경우, 일주를 해결하기 위해 어떤 잔류 응력 효과를 할 수 있도록 다음과 같은 행동 테스트를 경과하도록 허용해야한다.

그림 2
도 2 Perigenital 기계적 감성. Perigenital 기계적 감도는 본 프레이 모노 필라멘트 응용 프로그램을 사용하여 측정 하였다. 신생아 산모 분리 (NMS)을받은 수컷 마우스 기계적 이질통 나타내는 나이브 마우스에 비해, 움츠림 역치의 상당한 감소를 표시. 데이터는 평균 SEM을 나타내고, n은 각 그룹에 대해 4. * P <0.05, 학생 t-test를.

그림 3
푸른 그림 3. 비만 세포 활성화. 산성화 톨루이딘 트립 타 아제 과립을 시각화 및 전립선 조직의 저온 유지 부에서 활성화 / degranulated 비만 세포의 백분율을 계산하는데 사용 하였다. 대표 현미경 활성화 (degranulated) 비만 세포를 나타내는 손상 (비 degranulated)과 화살촉을 나타내는 화살표와 함께 순진 (A)에서 톨루이딘 블루 염색 섹션 및 NMS (B) 전립선의 표시됩니다. 고등 나이브 (C)에서 확대 이미지 및 NMS (D) 방광 비 degranulated (C)에서 조직 학적 차이를 설명하기 위해 도시 및 (D) 비만 세포를 degranulated된다. 나이브 마우스 (E)에 비해 degranulated 비만 세포의 상당히 높은 비율 NMS 생쥐 전립선 섹션에서 관찰되었다. 데이터는 평균 SEM을 나타내고, n은 각 그룹에 대해 4. **** P <0.0001, 학생의 t-test를.= "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜은 성인 수컷 마우스에서 CP / CPPS 나타내는 symptomology를 유도하기 위해, NMS의 형태, 신생아 응력을 사용하는 방법을 제공한다. 성인, NMS 마우스는 상당한 perigenital 기계적 이질통뿐만 아니라 전립선 조직 비만 세포 탈과립의 증거를 표시. NMS의 사용으로, 그것은 종종 만성 골반통 12-14 환자에서보고 어릴 응력을 복제하는 것을 CP / CPPS의 전임상 모델을 개발할뿐만 아니라 비 침습적 유도를 포함하는 신규 한 접근법 더 일반적으로, 화학적으로, 사용 전립선 34,36-39의 염증을 면역 학적으로 유도하는 데 반대했다. ,에 의해 전시 된 동반 신체, 기분, 그리고 내장 질환과 유사 (데이터가 표시되지 16) 또한, 마우스의 NMS는 과민 반응을 변경된 불안 같은과 anhedonic 행동을 포함하여 동반 symptomology, 증가 배뇨 속도를 생산하고, 뒷발 것으로 나타났다 CP / CPPS의 patie국세청 4-6.

마우스에서 CP / CPPS을 유도하는 NMS 사용의 주요 이점은 생리적 변화를 시작하는 심리적 개입을 사용한다는 것이다. CP / CPPS 환자는 주로 전립선 1-3로의 이전 감염 또는 직접 상해를 포함하지 않는 변형 원인이있다. 이러한 사실에도 불구하고, CP / CPPS 공표 모델 perigenital 영역 및 / 또는 비만 세포 활성화의 과민성을 유도 전립선 직간접 염증을 인용 하였다. 일반적으로, 보고서의 CP / CPPS 및 만성 골반 통증 환자의 상당 부분은 주로 비뇨 생식기 통증 증후군의 설치류 모델에서 배우지 간 초기 삶의 역경을 경험 한. 우리 실험실에서 이전 작업은 NMS는 질 과민 반응, 16 축 HPA의 적절한 기능의 관련 혼란을 유도 것으로 나타났습니다. T를 생산하기 위해 생애 초기 스트레스에 의해 구동되는 메커니즘을 조사 할 것입니다이 모델을 이용하여 미래의 일그는 성인의 표현형을 변경뿐만 아니라 전임상 또는 임상에 적용 할 수있는 잠재적 약물이나 생활 습관 개입을 탐구.

이 프로토콜에서 최적의와 반복 가능한 결과를 달성하는 것은 사용 환경 및 장비에 따라 최적화해야 할 수있는 몇 가지 중요한 단계를 관찰에 따라 달라집니다. 그 극적 HPA 축의 작용에 영향을 NMS 고려할 때 두 신생아 및 성인 기간 동안 외부 자극 및 환경 스트레스에 대해 제어하는​​ 것이 중요하다. 나이 일치, 비 처리 순진 마우스가 탄생하고 HPA 축 개발에 영향을 미칠 수있는 환경에 존재하는 외부 스트레스에 대한 통제하는 NMS 마우스의 각 코호트와 일치에 보관해야한다. 또한 번식을 개시 또는 동물 시설로 임신 여성을 주문하기 전에 의도 실험을 수행하는데 필요한 마우스의 수를 결정하는 것이 중요하다. 수행하는 동안 NMS, greatesT 우려 따라서는 NMS 프로토콜을 통해 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 필수적입니다, 댐에 의해 새끼의 거부이다. 주간 리듬의 영향을 최소화하기위한 NMS 제안 분리 시간 (오전 11시에서 오후 2시까지) 광주기 동안 중간이다. Perigenital 감도 측정은, 완전히 성숙한 성인 수컷 마우스에서 생후 약 8 주 얻어지는, 각 그룹에 대해 일의 동일한 시간에 이동해야 바람직 이른 빛 사이클은 주간 리듬에 맞춰 트로프. (- 20,000 Hz에서 20),이 과정 동안 비 - 유발 된 운동의 발생을 억제하기 위해, 재생 평가는 백색 잡음과 온도 조절, 방음 룸에서 수행 될 수있다. 같은 조사는 긍정적이고 부정적인 응답의 준수의 일관성을 유지하기 위해 연구를 통해 모든 철수 임계 값을 평가해야한다. 50 % 기계적 임계 단일 모노 필라멘트 COU에 인출 주파수 측정에 대한 대안으로서LD는 평가 또는 전자 장치에 본 프레이 (46)가 이용 될 수있다. 비만 세포 시각화, 분석 될 수있는 모든 슬라이드는 염색 강도는 실험마다 다를 수 있으므로, 비만 세포의 동일한 염색을 위해 함께 처리되어야한다. 1.0 아래의 pH는 딥 퍼플 비만 세포와 밝은 파란색 배경의 적절한 대비가 필요합니다. 너무 알코올 많은 린스는 비만 세포에서 얼룩을 씻어 수 있으며, 부정적인 대비에 영향을 미칩니다. 마지막으로, 조직에 그리드를 중첩하면 전체 조직 섹션을 통해 세포를 계산에 도움이 될 수 있습니다.

몇몇 고려 전에 CP / CPPS 또는 관련 집중화 통증 장애를 유도하는 NMS의 사용되어야한다. P14 - 첫째, 생애 초기의 스트레스를 통합 한 출판물의 대부분 (P1)의 절단 분리 기간을 사용하여, NMS의 쥐 모델에서 수행되고있다. 많은 그룹은이 패러다임이 연구에서 IBS 같은 symptomology를 생성하는 것으로 나타났습니다ATS와 마우스 (15); 그러나, 우리의 이전 연구에서 P1 - C57BL / 6 마우스에서 분리 P14 기간은 질 (16)의 감도의 상당한 증가를 생성하지 않으며 대장 과민증을 생성 않았다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, NMS의 종류와 길이는 symptomology의 정도와 영향을받는 특정 기관 (들)을 포함, 성인에서 특정 결과를 결정할 수있다. 둘째, NMS에서 발생하는 행동 및 분자 변화는 효과가 중앙 매개과 anxiety-의 변화 및 / 또는 우울증 같은 행동 등 동반 결과를 가질 수있는 제안, HPA 축 15-18의 조절 곤란에 주로 기인 다른 골반 장기 또는 더 먼 위치에 감도 증가. 이 동반 표현형은 일반적으로 임상 적으로 볼 무엇을 나타내는이며 전체 5,28-31,42으로 CP / CPPS 환자를보다 잘 나타내는 수 있습니다. 셋째, HPA 축 dysregul의 결과로서 발생한 변경에 기초ATION는 스트레스의 영향은 NMS 절차 및 이상 행동 테스트 모두 동안 체외 분석에서 최고의 관심사가 될 것이다. HPA 축로부터 출력 행동 또는 시험 관내 분석은 테스트 시간에 의존의 결과에 영향을 미칠 수있는보다 대기 광주기 동안 더 적극적인 암주기 동안 큰 출력과 낮은 출력으로 일주 인 / 47 희생. 마찬가지로 perigenital 기계적 감도 테스트를 진행 포함한 스트레스에 노출되면, 일시적으로 18 축 HPA의 기능에 영향을 줄 수 잠재적으로 관련된 뇌 영역과 하류 말초 조직 내에서 유전자 발현을 변경.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 female mice  Charles River 027 Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s) Sigma-Aldrich CLS10002L Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic VWR International 414005-124 The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) Stoelting 58011 The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats) IITC 435 Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. 
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) IITC 410 Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose Sigma-Aldrich S5016 Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane Sigma-Aldrich 246654 Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold  VWR International 4557 To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound Sakura 4583 12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide VWR International 48311-703 75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161 Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  BioExpress C-3394 Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover Fisher Scientific 08-815 Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological) Fisher Scientific X3P Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place VWR International 82003 Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box Fisher Scientific 22-363-400 These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific VWR International 4111 Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 VWR International 48393-106 A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope Nikon The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
  2. Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
  3. Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
  4. Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
  5. Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
  6. Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
  7. Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
  8. Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
  9. Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
  10. Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
  11. Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
  12. Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
  13. Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
  14. Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
  15. Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
  16. Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
  17. Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
  18. Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
  19. Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
  20. Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
  21. Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
  22. Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
  23. DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
  24. Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
  25. Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
  26. Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
  27. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
  28. Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
  29. Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
  30. Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
  31. Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
  32. Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
  33. Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
  34. Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
  35. Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
  36. Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
  37. Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
  38. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  39. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  40. Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
  41. Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
  42. Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
  43. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  44. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. e3791 (2012).
  45. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (2012).
  46. Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. e51212 (2013).
  47. Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics