Valutazione della perigenitale Sensibilità e prostatica Mast attivazione delle cellule in un modello murino di Neonatale separazione materna

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Summary

Stiamo misurando la sensibilità e l'albero di attivazione perigenitale cella meccanico nella prostata maschile C57BL / 6 topi che ha subito un paradigma di stress primi anni di vita - la separazione materna neonatale, al fine di indurre un modello preclinico di sindrome da dolore pelvico / cronico prostatite cronica.

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Fuentes, I. M., Pierce, A. N., O'Neil, P. T., Christianson, J. A. Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation. J. Vis. Exp. (102), e53181, doi:10.3791/53181 (2015).

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Abstract

Prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS) ha una prevalenza una tantum del 14% ed è la diagnosi urologica più comune per gli uomini di età inferiore ai 50 anni, ma è la malattia dolore pelvico cronico meno compresi e studiati. Un sottoinsieme significativo di pazienti con la relazione del dolore cronico pelvico avendo sperimentato presto lo stress della vita o di abuso, che può notevolmente influenzare il funzionamento e la regolamentazione del (HPA) dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene. L'attivazione dei mastociti, che ha dimostrato di aumentare sia nelle urine e ha espresso secrezioni prostatiche di CP pazienti / CPPS, è parzialmente regolato dall'attivazione valle dell'asse HPA. Neonatale separazione materna (NMS) è stato utilizzato per oltre due decenni a studiare i risultati di stress primi anni di vita in modelli di roditori, compresi i cambiamenti di HPA e la sensibilità viscerale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di NMS come modello preclinico di CP / CPPS in maschi C57BL / 6 topi. Descriviamo la metodologiaper l'esecuzione di NMS, valutando perigenitale allodinia meccanica, ed evidenza istologica di attivazione dei mastociti. Inoltre forniamo la prova che presto lo stress psicologico può avere effetti di lunga durata sul sistema urogenitale maschile in topi.

Introduction

Dolore pelvico cronico, non è di per sé una malattia, ma piuttosto un termine associato con il dolore in corso spontaneo e / o evocata vissuta dai pazienti con diagnosi di sindrome dell'intestino irritabile (IBS), cistite interstiziale / sindrome della vescica dolorosa (IC / PBS), vulvodinia, o prostatite cronica / sindrome da dolore pelvico cronico (CP / CPPS). Queste sindromi sono spesso coesistenti e condividere molte caratteristiche che non hanno patologia associata o identificati eziologia, anche se disfunzioni all'interno del sistema immunitario, sistema nervoso centrale e del sistema nervoso periferico ha dimostrato di contribuire al mantenimento e la progressione di questi disturbi 1 -3. I pazienti con dolore pelvico cronico sono più propensi a presentare sintomi di addizionale, non pelvico relativi disturbi del dolore funzionali e disturbi dell'umore, tra cui ansia, depressione, attacchi di panico e 4-6, che è stato associato con alterata funzionamento del ipotalamo ipofisisurrene (HPA) 7-10. L'esposizione a presto lo stress della vita o trauma è un fattore di rischio significativo per lo sviluppo di anomalie HPA e associati sindromi da dolore cronico 10,11 e, in quanto tale, un sottoinsieme significativo di pazienti con disturbi del dolore pelvico funzionali dichiara di aver sperimentato eventi avversi dell'infanzia come l'abuso o negligenza 12-14.

Modelli di roditori neonatale separazione materna (NMS), che comporta la rimozione dei cuccioli dalla loro madre per un determinato periodo di tempo durante il periodo preweaning, sono stati utilizzati negli ultimi due decenni a studiare i risultati di stress primi anni di vita. In generale, la NMS ha dimostrato di aumentare la HPA asse di attivazione, e comportamenti ansiosi come risultanti, influenzando direttamente l'espressione genica all'interno dell'ipotalamo, così come disturbare regolazione a valle di strutture limbiche 15-18. Interruzione del buon funzionamento dell'asse HPA ha dimostrato di contribuire a un aumento del colon-retto 19-22 16 sensibilità visualizzata roditori NMS modelli, ma nonostante estesa caratterizzazione degli effetti a lungo termine di postnatale infiammazione della vescica 23-25, l'impatto dello stress primi anni di vita è in gran parte andata non studiato negli organi urogenitali. Pertanto, il seguente studio descrive come eseguire NMS nei topi e poi valutare perigenitale sensibilità meccanica e l'infiltrazione dei mastociti / attivazione nella prostata per validare l'uso di topi maschi NMS come modello preclinico per CP / CPPS.

Di tutti i disturbi del dolore pelvico cronico diagnosi, CP / CPPS è forse la sindrome almeno ben riconosciuto e caratterizzato, pur avendo una prevalenza una tantum di circa il 14% 26 e costo annuo dei pazienti stimati a 4.400 dollari (il doppio di quella di lombalgia o reumatoide artrite 27). I pazienti con CP rapporto / CPPS dolore nel perineo, del retto, della prostata, pene, testicoli, e / o l'addome 28, l'esperienza di un hiGrado gher di stress psicologico rispetto ai pazienti di controllo 29, e comunemente presenti con sintomi di o con diagnosi di comorbidità del dolore o disturbi dell'umore pelvici cronici 5,29-31. Infezioni ricorrenti, epitelio che perde, l'infiammazione neurogena e autoimmunità sono stati tutti ipotizzato come potenziali cause sottostanti di CP / CPPS 2,32,33, così come l'attivazione dei mastociti e degranulazione 34. Espresso secrezioni prostatiche da uomini con CP / CPPS erano aumentati triptasi mastocitaria e fattore di crescita nervoso (NGF) livelli di 34, e uno studio successivo confermato che triptasi e carbossipeptidasi A (CPA3), un marker di attivazione dei mastociti, sono stati aumentati nel urine dei pazienti CP / CPPS 35. Il ruolo potenziale di mastociti nella insorgenza e la manutenzione di CP / CPPS è stato un importante centro di ricerca animale su questa sindrome finora. Il modello di roditore più comunemente impiegato utilizzato per studiare CP / CPPS è una prostatite autoimmune sperimentale (EAP) Modello genazionata mediante iniezione sottocutanea di antigene prostatico in adiuvante completo di Freund, che si traduce in vari gradi di infiammazione prostatica seconda specie e ceppo usati 34,36-39. Infiltrazione dei mastociti e l'attivazione / degranulazione ha dimostrato di aumentare dopo induzione di EAP 34,35,40. Topi transgenici carenti in entrambi i mastociti 34 o il recettore triptasi PAR2 35 non sviluppano prostatica sensibilità tattica seguente EAP, a differenza di topi di tipo selvatico EAP. Anche se questo modello preclinico replica molte delle caratteristiche della CP umana / CPPS, il protocollo di induzione non è indicativo della condizione umana, che ha un'eziologia diverse e spesso non comporta l'infiammazione diretta, infezioni o lesioni della prostata.

L'influenza dello stress primi anni di vita sullo sviluppo del CP / CPPS negli esseri umani ha in gran parte andato uninvestigated; tuttavia, uno studio di Hu, et al. 41, ha dimostrato che men che ha riportato una storia di infanzia fisico, emotivo, e / o di abusi sessuali erano significativamente più probabilità di avere sintomi suggestivi di CP / CPPS. Inoltre, essi hanno dimostrato che sia il dolore e decine urinari sono aumentati nei pazienti con una storia di abuso fisico ed emotivo. Abbiamo precedentemente dimostrato che lo stesso paradigma NMS in femmina C57BL / 6 topi produce ipersensibilità vaginale e l'espressione genica anormale sia nella vagina e vescica suggestiva HPA disfunzionale uscita asse 16. Questa evidenza combinata con l'alta prevalenza di pazienti CP / CPPS presentano altre patologie concomitanti, tra cui 42 IC / PBS e disturbi dell'umore, che sono state più chiaramente dimostrato di essere collegati con l'esposizione allo stress primi anni di vita 12-14, fornisce il razionale per l'utilizzo di un modello di NMS per indagare CP / CPPS nei topi.

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Protocol

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono conformi alle linee guida NIH in conformità con le linee guida indicate dalla University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. neonatale materna Separation (NMS)

  1. Monitorare le dighe in gravidanza al giorno per le nascite lettiera.
    Nota: Il giorno la lettiera è nato è considerato P0.
  2. Il P1, rimuovere la diga dalla gabbia di casa e mettere in un contenitore secondario pulito.
  3. Strofinare una manciata di assestamento tra le mani pulite guantate per mantenere il profumo della gabbia di casa.
  4. Aggiungere una profondità di 1-2 cm della biancheria da letto gabbia a casa in un ambiente pulito, adeguatamente etichettati 2 bicchiere L vetro. Aggiungere circa metà di qualsiasi arricchimento lettiera aggiuntivo che è presente nella gabbia casa, per esempio, nestlet, carta crespa, il bicchiere di vetro.
  5. Posizionare delicatamente tutti i cuccioli da un'unica cucciolata, singolarmente, nello stesso becher.
  6. Immediatamente postoil becher in un incubatore tenuto a 33 ° C e 50% di umidità per 180 min.
  7. Rimuovere la diga dal contenitore secondario e il suo ritorno alla gabbia di casa. Riportare la gabbia a casa per la sua posizione appropriata alloggiamento all'interno del vivaio.
  8. Ripetere questa procedura per ogni disordine in fase di NMS, utilizzando guanti puliti e contenitori secondari per ogni disordine / bacino.
  9. Alla fine del periodo di separazione 180 min, restituire cucciolate alle loro gabbie a casa nello stesso ordine in cui sono stati rimossi.
  10. Recuperare la gabbia a casa della prima cucciolata che è stato separato in precedenza nel corso della giornata. Rimuovere diga dalla gabbia di casa e mettere in un contenitore secondario pulito.
  11. Rimuovere il primo bicchiere dal termostato e strofinare una manciata di assestamento tra le mani guantate pulite per mantenere il profumo della gabbia di casa durante la manipolazione dei cuccioli.
  12. Spostare delicatamente i cuccioli, individualmente, dal bicchiere alla gabbia di casa.
  13. Rientro arricchimento e biancheria da letto rimanendo nel bicchiere perla gabbia di casa.
  14. Ritorno alla diga dal contenitore secondario alla gabbia a casa e tornare alla sua posizione appropriata alloggiamento all'interno del vivaio.
  15. Sciacquare il bicchiere con acqua e restituirlo al incubatrice. Utilizzare lo stesso bicchiere per ogni disordine durante tutta la procedura di separazione.
  16. Ripetere questa procedura per ogni cucciolata subire NMS nello stesso ordine in cui sono stati messi in incubatrice.
  17. Ripetere l'intera procedura per ogni sottoposti cucciolata NMS ogni giorno attraverso P21.
  18. Wean cuccioli NMS e naif su P22 mettendo nidiata dello stesso sesso insieme in gabbie pulite complete di cibo e acqua. Cuccioli ingenui dovrebbero nascere e alloggiati sotto le stesse condizioni dei topi NMS, ma subiscono nessun trattamento aggiuntivo al di fuori delle normali attività di allevamento.

2. perigenitale Sensibilità meccanica

  1. Setup Apparecchio von Frey
    1. Portare i topi alla camera di prova e consentire loro di acclimatare per 30min pur rimanendo nelle loro gabbie a casa.
    2. Preparare l'area di prova mettendo un underpad assorbente sotto un filo di elevata tavolo maglia-top (79 centimetri x 28 cm) che offre spazio sufficiente per consentire al ricercatore di avvicinarsi dal lato inferiore, senza sorprendente topi, circa 55 cm di altezza.
    3. Posizionare fino a 12 topi, individualmente, in base a chiare, le camere di plastica forata (11 centimetri x 5 cm x 3.5 cm) sulla parte superiore del tavolo rete metallica. Posizionare un oggetto pesante sulla parte superiore delle Camere per evitare che i topi di fuggire.
    4. Acclimatare topi per altri 30 min sullo schermo prima valutazione soglia di ritiro.
  2. Valutazione perigenitale sensibilità meccanica
    1. Eseguire il metodo up-down con un set standard di graduati monofilamenti von Frey 43. Utilizzare i seguenti monofilamenti: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g, e 4,74 g.
      1. Tenere la base del 3,22 g monofilamento ed esporre il mono retrattafilamento.
        Nota: alcuni modelli non possono avere un monofilamento retratta.
      2. Collocare la sonda in modo che il monofilamento è orientato verticalmente e quando il mouse è vigile, immobile, e il suo peso corporeo è distribuito uniformemente tra le zampe posteriori applicare sia al lato sinistro o destro dello scroto, evitando la linea mediana, fino ad un lieve bend è osservata nel filamento.
      3. Tenere il monofilamento in posizione per 10 secondi o finché l'animale mostra una risposta positiva.
        Nota: Una risposta positiva è considerato uno scatto veloce o salto in risposta all'applicazione monofilamento o leccare o comportamenti mordere diretta verso il monofilamento. Se il mouse si muove durante l'applicazione monofilamento 10 secondi senza visualizzare questi comportamenti, il monofilamento devono essere ritestati dopo un periodo di riposo 1 min a lungo minimo. Se un topo né mosse né mostra uno dei comportamenti elencati sopra durante l'applicazione monofilamento 10 sec, viene considerata una risposta negativa.
      4. Registrare la risposta, negativo o positivo, in un quaderno di laboratorio o portatile e ripetere questa procedura su tutti i rimanenti topi utilizzando il 3,22 g monofilamento.
      5. Testare tutti i topi utilizzando nuovamente la prossima monofilamento appropriata. Nota: Se il mouse esibito una risposta negativa al 3,22 g monofilamento, applicare il 3,61 g monofilamento nello stesso modo e registrare la risposta. Se il mouse esibito una risposta positiva al 3,22 g monofilamento, applicare il 2,83 g monofilamenti e registrare la risposta.
    2. Continuare il test ogni mouse usando la prossima monofilamento maggiore o minore, a seconda dei casi, per altri 4 applicazioni dopo la prima risposta positiva si osserva.
    3. Topi Ritorno a gabbie a casa.
    4. Utilizzare il valore della finale von Frey monofilamento applicata nella serie processo in unità logaritmiche per calcolare una soglia g recesso 50% come descritto nel Chaplan et al. 43.
title "> 3. Colorazione cellulare acidificati toluidina blu Mast

  1. Tissue Processing
    1. Sezionare prostata tessuto 44 da topi che sono stati intracardiaca perfusi con ghiacciata 4% paraformaldeide 45. Postfix il tessuto in 4% paraformaldeide per 1 ora a RT e poi cryoprotect nel 30% di saccarosio in 1x PBS a 4 ° CO / N.
    2. Preparare una piccola (30 ml) bagno di eptano e posizionarlo sul ghiaccio secco.
    3. Sciacquare il tessuto prostatico in 1x PBS e asciugare con un panno leggeri.
    4. Inserire il tessuto prostatico in eptano freddo fino a quando non è congelato.
    5. Porre immediatamente il tessuto prostatico congelato in un cryomold contenente mezzi di montaggio e posto in ghiaccio secco fino congelati.
    6. Conservare cryomolds a -20 ° C.
    7. Trasversalmente tagliare il tessuto prostatico in 7 criosezioni micron di spessore con un criostato.
    8. Inserire 8 - 12 criosezioni non seriali che estendono la lunghezza del tessuto, su vetrini da microscopio caricati positivamente.
    9. Conservare finito diapositive a -20 ° C, fino al procedimento.
  2. Preparazione acidificata toluidina blu
    1. Aggiungere 1 g di blu di toluidina O a 100 ml 70% di etanolo e vortice fino a soluzione per preparare una soluzione madre 1%. La soluzione madre può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di tre settimane.
    2. Aggiungere 1 g di NaCl a 100 ml di acqua in un becher posto sulla sommità di una piastra di agitazione.
    3. Regolare il pH della soluzione NaCl usando HCl 12 M fino a pH compreso tra 0,5 - 1,0 si ottiene.
    4. Preparare la Toluidine Blu soluzione di lavoro 0,25% combinando 8 ml della soluzione madre blu di toluidina e 32 ml di soluzione NaCl 1%. Pipetta su e giù per garantire integrazione totale della soluzione stock blu di toluidina e miscelare con un vortice. La soluzione di lavoro deve essere preparata fresca e scartato dopo l'uso.
  3. Colorazione criosezioni prostata
    1. Rimuovere i vetrini da elaborare dal freezer e lasciare equilibrare a temperatura ambiente per circa 30 min.
    2. Lavare le sezioni di tessuto immergendo singolarmente i vetrini per circa 1 secondo in una provetta conica da 50 ml contenente un volume sufficiente di 1x PBS per assicurare che le sezioni di tessuto montati scorrevoli saranno completamente sommerse. Lasciare i vetrini per asciugare sul un tovagliolo di carta.
    3. Posizionare i vetrini in una vaschetta di colorazione di vetro contenente abbastanza 0,25% la soluzione di blu di toluidina per garantire che le sezioni di tessuto montati diapositive saranno completamente sommerse e incubare per 10 - 15 minuti, mentre su una sedia a dondolo piattaforma fissato a 15 giri al minuto.
    4. Immergere i vetrini in PBS 1x per circa 1 secondo per lavare l 'eccesso di toluidina blu.
    5. Posizionare i vetrini in una scatola diapositiva o rack in modo tale che i vetrini sono sui loro lati per permettere il drenaggio.
    6. Essiccare i vetrini in un forno a 37 ° C per un minimo di 2 ore o O / N a RT.
    7. Disidratare scivoli rapidamente utilizzando alcol, permettendo i vetrini per asciugare completamente tra le esposizioni di alcol. Diapositive Dry drenando su un tovagliolo di carta unnd spalle asciugandosi e bordi con un light duty wipe.
      1. Immergere i vetrini in 95% EtOH per circa 1 secondo e lasciare asciugare completamente. Ripetere questa procedura 1-10 volte fino tessuto asciuga più azzurro che viola.
      2. Immergere i vetrini in 100% EtOH per circa 1 secondo e lasciare asciugare completamente. Ripetere questa procedura 1-10 volte fino tessuto è scuro al blu medio, ma non viola.
    8. Fissare la macchia incubando i vetrini in 100% xilene per 3 min. Lasciare asciugare.
    9. Coverslip le diapositive con glicerolo, PBS, o un supporto di montaggio permanente basato xilene. Scolare l'eccesso dei media e conservare a temperatura ambiente.
  4. Quantificare mastociti
    1. Visualizzare le sezioni di tessuto blu-tinto toluidina a 20X di ingrandimento tramite microscopio ottico (Figura 2).
    2. Contare il numero totale di cellule presenti all'interno della zona visualizzata albero e distinguere tra mastociti non degranulati e degranulati. 40X magnificatione può essere necessario confermare lo stato di granulazione in alcuni mastociti.
      Nota: mastociti non degranulati presentano denso metacromasia senza o con profilo debole nucleare e / o non estrusione granuli intorno alla cellula. Mastociti degranulati esporre meno intenso metacromasia e hanno un evidente chiara descrizione del nucleo e / o granuli liberi all'interno del citoplasma e al di fuori del bordo della cella.
    3. Continuare per valutare il numero totale dei mastociti non degranulati e degranulati nell'interezza della sezione di tessuto corrente. Ripetere questa procedura su almeno 7 ulteriori sezioni distinte, che lo porterà lungo ogni tessuto.
    4. Calcolare la percentuale di degranulati (DG) per mastociti totali per ciascun tessuto / mouse in base alla seguente equazione: (DG mastociti / Totale mastociti) x 100.

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Representative Results

I topi che hanno subito NMS ha mostrato la prova del comportamento indicativa di CP / CPPS. Quando la prova con una serie graduata di monofilamenti von Frey, a 8 settimane di età topi NMS (n = 4) visualizzato perigenitale allodinia meccanica rispetto alle controparti ingenui (n = 5, figura 2). Ciò è evidenziato come una riduzione significativa (p <0.01; test t) del limite meccanico recesso che ha suscitato una risposta comportamentale positiva, iscritto a scatto veloce o salto in risposta all'applicazione monofilamento o leccare o comportamenti mordere diretta verso il monofilamento .

I topi che sono stati esposti a NMS visualizzati anche evidenza istologica di CP / CPPS. Sezioni al criostato di tessuto prostatico sono state colorate con o-toluidina acidificato blu osservare granuli triptasi alloggiati all'interno mastociti (Figura 3A-D). La percentuale dei mastociti che mostrava evidenza di attivazione, ad esempio, metachroma diffusaSIA, granuli presenti al di fuori del bordo della cella (Figura 3D), è risultato significativamente aumentato nel tessuto prostatico dalle 8 settimane di età topi NMS, rispetto al naïve (p <0,0001, test t, Figura 3E). Il numero totale dei mastociti infiltrati, indipendentemente dallo stato di granulazione, non era significativamente differente tra ingenuo (99,5 ± 15,2 cellule / sezione) e topi NMS (108,2 ± 22,5 cellule / sezione).

Figura 1
Figura 1. linea del tempo regolamentare. Lo schema illustra una linea del tempo consigliato per eseguire la metodologia descritta. Neonatale separazione materna (NMS) è effettuata tutti i giorni dalle postnatale giorno (P) 1 fino P21 e topi vengono svezzati su P22. I topi rimangono indisturbati al di fuori del normale zootecnia fino a 8 settimane di età quando sono testati per sens meccanici perigenitaleitivity. Se lo stesso topi stanno per essere valutati per la colorazione dei mastociti, una settimana dovrebbe essere consentito di trascorrere seguente test comportamentali per consentire eventuali effetti dello stress residuo da risolvere.

Figura 2
Figura 2. perigenitale sensibilità meccanica. Perigenitale sensibilità meccanica è stata misurata utilizzando l'applicazione monofilamento von Frey. Topi maschi sottoposti a separazione neonatale materna (NMS) hanno mostrato una riduzione significativa soglia di ritiro, rispetto ai topi naive, indicativi di allodinia meccanica. I dati rappresentano medio SEM, n = 4 per ogni gruppo. * P <0,05, test t.

Figura 3
Figura 3. l'attivazione dei mastociti. Toluidina acidato blu è stato usato per visualizzare granuli triptasi e calcolare la percentuale di / mastociti degranulati attivate in sezioni criostatiche di tessuto prostatico. Microfotografie rappresentativi sono riportati di toluidina sezioni blu macchiato da naïve (A) e NMS (B) prostata con le frecce che indicano intatti (non degranulati) e frecce che indicano attivati ​​(degranulati) mastociti. Immagini superiori ingrandenti da naïve (C) e NMS (D) vescica sono mostrati per illustrare le differenze istologiche da non degranulati (C) e (D) degranulati mastociti. Una percentuale significativamente maggiore di mastociti degranulati stati osservati in sezioni prostata di topi NMS rispetto ai topi naive (E). I dati rappresentano medio SEM, n = 4 per ogni gruppo. **** P <0,0001, test t.= "_ Blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo prevede una metodologia per l'utilizzo di stress neonatale, sotto forma di NMS, per indurre sintomatologia indicativa di CP / CPPS nei topi maschi adulti. Da adulti, i topi NMS mostrano significativo allodinia meccanica perigenitale, così come prova della degranulazione dei mastociti nel tessuto della prostata. L'uso di NMS è un nuovo approccio allo sviluppo di un modello preclinico di CP / CPPS in quanto riproduce lo stress primi anni di vita che viene spesso segnalato dai pazienti con dolore pelvico cronico 12-14, oltre a riprendere una induzione non invasivo, come contrasto più comunemente utilizzati, chemically- e infiammazione della prostata 34,36-39 immunologicamente-indotta. Inoltre, NMS nei topi ha dimostrato di produrre sintomatologia comorbidità, compresi i comportamenti ansia-come e anedonico alterati, aumento dei tassi della minzione, e hindpaw ipersensibilità (16; dati non riportati), simili alle comorbidità somatiche, l'umore e disturbi viscerali esposti da CP / CPPS patienti 4-6.

Il vantaggio principale di utilizzare NMS per indurre CP / CPPS nei topi è che usa un intervento psicologico per avviare cambiamenti fisiologici. I pazienti con CP / CPPS hanno un'eziologia variante che in gran parte non comporta precedente infezione o lesioni dirette alla prostata 1-3. Nonostante ciò, i modelli pubblicati di CP / CPPS hanno incorporato infiammazione diretta o indiretta della prostata per indurre ipersensibilità della regione perigenitale e / o l'attivazione mastocitaria. Una parte significativa di CP / CPPS e pazienti con dolore pelvico cronico in generale, la relazione avendo sperimentato presto le avversità della vita, che è in gran parte andata non studiato in modelli di roditori di sindromi dolorose urogenitale. Impieghi precedenti dal nostro laboratorio hanno dimostrato che NMS induce ipersensibilità vaginale e interruzioni associate di buon funzionamento del HPA all'asse 16. I lavori futuri con questo modello si investigare i meccanismi che sono guidati da stress primi anni di vita per la produzione di tha alterato fenotipo in età adulta, nonché per esplorare potenziali interventi farmacologici o di stile di vita che potrebbero essere applicati in un contesto preclinico e clinico.

Il raggiungimento di risultati ottimali e ripetibili di questo protocollo dipende osservare diversi passaggi critici che possono avere bisogno di essere ottimizzato a seconda dell'ambiente e delle attrezzature utilizzate. Considerando che NMS colpisce drammaticamente il funzionamento dell'asse HPA, è importante da controllare per gli stimoli esterni e stress ambientale durante i periodi neonatale e adulti. Di pari età, topi naive non trattati dovrebbero nascere e alloggiati in concordanza con ogni coorte di topi NMS per il controllo per fattori di stress esterni presenti nell'ambiente che possono influenzare lo sviluppo dell'asse HPA. E 'importante per determinare il numero di topi necessari per eseguire l'esperimento previsto prima di iniziare l'allevamento o ordinare femmine gravide nella stabulario. Durante l'esecuzione di NMS, i greatest preoccupazione è il rifiuto dei cuccioli dalla diga, quindi è indispensabile per mantenere il profumo della gabbia di casa in tutto il protocollo di NMS. Per ridurre al minimo gli effetti di ritmi diurni, il tempo di separazione consigliato per NMS è durante la metà del ciclo luce (11:00-2:00). Misurazioni sensibilità perigenitale devono essere ottenuti in piena maturità adulti topi maschi, circa 8 settimane di età, e portati alla stessa ora del giorno per ogni gruppo, preferibilmente nelle prime fasi del ciclo di luce in coincidenza con la depressione in ritmi diurni. Per ridurre l'insorgenza di movimenti non evocato durante questa procedura, le valutazioni possono essere eseguite in un suono stanza a prova a temperatura controllata con rumore bianco a giocare (20 - 20.000 Hz). Lo stesso ricercatore dovrebbe valutare tutte le soglie di ritiro durante lo studio per mantenere la coerenza nel rispetto delle risposte positive e negative. Come alternative alla misurazione della soglia meccanica 50%, la frequenza di ritiro a un singolo cou monofilamentold valutata o un elettronico von Frey apparato 46 potrebbe essere utilizzato. Per la visualizzazione dei mastociti, tutte le diapositive che sono da analizzare devono essere trattati insieme per garantire la parità di colorazione dei mastociti, come intensità di colorazione può variare tra esperimenti. Un pH inferiore a 1.0 è necessario per il corretto contrasto tra le profonde mastociti viola e lo sfondo azzurro. Troppi lavaggi in alcol può lavare la macchia dai mastociti e influenzare negativamente il contrasto. Infine, sovrapponendo una griglia sul tessuto può essere utile per il conteggio delle cellule durante l'intera sezione di tessuto.

Alcune considerazioni devono essere effettuate prima dell'uso di NMS per indurre CP / CPPS o correlati disturbi del dolore centrale. In primo luogo, la stragrande maggioranza delle pubblicazioni che hanno incorporato lo stress primi anni di vita sono stati fatti in modelli di ratto di NMS, con un periodo di separazione tronca di P1 - P14. Molti gruppi hanno dimostrato che questo paradigma genera una sintomatologia IBS-like in rats e topi 15; Tuttavia, nel nostro studio precedente un P1 - periodo di separazione P14 in C57BL / 6 topi non ha generato un significativo aumento della sensibilità vaginale 16, né ha generare ipersensibilità del colon-retto (dati non riportati). Pertanto, la specie e la durata di NMS possono determinare il risultato specifico in età adulta, compresa la gravità della sintomatologia e l'organo specifico (s) che è interessato. In secondo luogo, i cambiamenti comportamentali e molecolari derivanti da NMS sono in gran parte a causa di una disregolazione dell'asse HPA 15-18, il che suggerisce che l'effetto è mediati a livello centrale e potrebbe avere risultati comorbidità, incluse le variazioni di ansietà e / o comportamenti depressione-simili e maggiore sensibilità in altri organi pelvici o posizioni più distanti. Questo fenotipo comorbidità è indicativo di quello che è comunemente considerato clinicamente e può essere più rappresentativo di pazienti CP / CPPS nel suo complesso 5,28-31,42. In terzo luogo, in base a questi cambiamenti che si verificano a seguito di HPA asse dysregulzione, l'impatto dello stress dovrebbe essere di grande preoccupazione sia durante la procedura NMS e test comportamentali, successivamente e in vitro analisi. Output dall'asse HPA è diurna, con maggior uscita durante il ciclo di buio più attivo e uscita minore durante il ciclo di luce più quiescente, che potrebbe influenzare l'esito comportamentale o in vitro analisi a seconda del momento della prova / sacrificare 47. Allo stesso modo, l'esposizione a fattori di stress, tra cui in fase di perigenitale test di sensibilità meccanica, può transitoriamente il buon funzionamento della HPA all'asse 18 e potenzialmente alterare l'espressione genica all'interno delle regioni del cervello associate e dei tessuti periferici a valle.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 female mice  Charles River 027 Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s) Sigma-Aldrich CLS10002L Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic VWR International 414005-124 The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) Stoelting 58011 The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats) IITC 435 Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. 
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) IITC 410 Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose Sigma-Aldrich S5016 Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane Sigma-Aldrich 246654 Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold  VWR International 4557 To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound Sakura 4583 12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide VWR International 48311-703 75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161 Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  BioExpress C-3394 Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover Fisher Scientific 08-815 Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological) Fisher Scientific X3P Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place VWR International 82003 Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box Fisher Scientific 22-363-400 These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific VWR International 4111 Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 VWR International 48393-106 A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope Nikon The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.  

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References

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