رصد الباطنة شبكية الكالسيوم باستخدام
1National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Yan, X., Harvey, B. K. Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP. J. Vis. Exp. (103), e53199, doi:10.3791/53199 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الشبكة الإندوبلازمية (ER) يحتوي على أعلى مستوى الكالسيوم داخل الخلايا، مع تركيز حوالي 5000 أضعاف أكبر من مستويات هيولية. رقابة مشددة على ER الكالسيوم هي ضرورة حتمية للطي البروتين، وتعديل والاتجار. الاضطرابات إلى ER الكالسيوم يمكن أن يؤدي إلى تنشيط الاستجابة البروتين المطوية، وآلية الاستجابة للضغط النفسي ER ثلاثة الشق، وتسهم في التسبب في مجموعة متنوعة من الأمراض. القدرة على رصد التغيرات ER الكالسيوم أثناء ظهور المرض وتطور مهم من حيث المبدأ، ولكن التحدي في الممارسة العملية. وقد وفرت الوسائل المتاحة حاليا لرصد ER الكالسيوم، مثل الأصباغ والبروتينات الفلورية التي تعتمد على الكالسيوم ونظرة ثاقبة ديناميات ER الكالسيوم في الخلايا، ولكن هذه الأدوات ليست مناسبة تماما للدراسات في الجسم الحي. وقد أظهرت مختبرنا أن التعديل إلى محطة-كربوكسي من Gaussia luciferase المراسل يمنح إفراز مراسل استجابة لاستنزاف الكالسيوم ER. ووصف الطرق لاستخدام luciferase المراسل مقرها، ER يفرز البروتين مراقبة الكالسيوم (SERCaMP) لفي التجارب المختبرية وتطبيقات المجراة في هذه الوثيقة. هذا الفيديو يسلط الضوء على حقن الكبد، والتلاعب الدوائية للGLuc-SERCaMP، جمع الدم والتجهيز، والمعلمات فحص لرصد الطولي للER الكالسيوم.

Introduction

الشبكة الإندوبلازمية (ER) وظائف في العديد من القدرات الخلوية بما في ذلك لطي البروتين، وإفراز البروتين، والدهون التوازن، وداخل الخلايا مما يشير إلى 1. المركزية إلى وظيفة ER الطبيعية والحفاظ على تركيزات الكالسيوم اللمعية في ~ 5000 مرات تلك التي وجدت في السيتوبلازم 2-4. وينظم هذه العملية كثيفة الاستهلاك للطاقة من قبل أتباز ساركو / الشبكة الإندوبلازمية الكالسيوم (SERCA)، وهو المضخة التي تتحرك أيونات الكالسيوم في ER. وتوسطت هروب رأس المال من الكالسيوم من ER في المقام الأول من قبل ryanodine (RYR) وثلاثي اينوزيتول (IP3R) مستقبلات. لأن العديد من العمليات ER تعتمد على الكالسيوم، وتعطيل مخزن يمكن أن تؤدي إلى الإجهاد ER وموت الخلايا في نهاية المطاف.

ER وقد لوحظ التقلبات الكالسيوم في الأمراض بما في ذلك القلب والسكري ومرض الزهايمر، وباركنسون 5. ونظرا لطبيعة التدريجي لهذه الأمراض، فقد كان تحدي لتحديد السبب والنتيجة إعادةlationship بين المرضية والتغييرات في مخزن ER الكالسيوم. وقد سمحت لعدد من التقنيات لتحقيق تقدم كبير في فهمنا للديناميات ER الكالسيوم، بما في ذلك الأصباغ ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs). الأصباغ الكالسيوم تقارب منخفضة، مما يزيد في مضان عندما يتجهون الى كا 2+، يمكن تحميلها في الخلايا لفحص مقصورات التحت خلوية مع تركيزات عالية من الكالسيوم (6). GECIs، مثل D1ER والماسك تسمح لرصد تقلبات الكالسيوم مع مراقبة أكثر دقة لتوطين التحت خلوية 7-9. وقد وصفت مؤخرا، فئة أخرى من GECIs تسمى مؤشرات البروتين شرك عضية قياس الكالسيوم (CEPIA) 10. وثمة نهج ثالث يجمع بين علم الوراثة والكيمياء جزيء صغير هو استهداف استريز صبغ تحميل (TED)، الذي يستخدم إستيراز الكربوكسيل المشفرة وراثيا (تستهدف ER) مع الصبغة الكالسيوم القائم على استر 11.

في حين أن aforالنهج ementioned لها نقاط القوة ونقاط الضعف الكامنة، فإنها يمكن أن توفر معلومات قيمة حول ديناميات الكالسيوم ER من خلال القياسات الحادة من مضان. فهي، مع ذلك، ليس الأمثل للدراسات طولية غالبا المطلوبة لتحقيق تطور المرض. بهدف ابتكار طريقة لرصد ديناميات الكالسيوم على مدى فترات طويلة من الوقت، حددنا وضعت تعديل البروتين لخلق البروتينات مراقبة يفرز الكالسيوم ER (SERCaMPs) 12.

SERCaMP تلتف العديد من القيود المرتبطة منهجيات أخرى، من خلال توفير نهج مينيملي لاستجواب مرارا وتكرارا على مخزن ER الكالسيوم. لقد أثبتنا سابقا أن الببتيد ASARTDL-كربوكسي محطة (ألانين-سيرين-ألانين، أرجينين، ثريونين-الأسبارتيك حمض ليسين) كافية لتعزيز الاحتفاظ ER؛ ومع ذلك، في ظل الظروف التي تسبب انخفاض في ER الكالسيوم، وتسلسل الببتيد لم يعد قادرا على الاحتفاظ ER localizatioن ويفرز البروتين 13. على أساس من التكنولوجيا SERCaMP هو أطرافهم من ASARTDL إلى كربوكسي-محطة للبروتين يفرز (على سبيل المثال Gaussia luciferase المراسل، أو GLuc) بحيث إفراز يتم تشغيلها بواسطة نضوب ER الكالسيوم، وبالتالي خلق مراسل قوية من ER التقلبات الكالسيوم 12. التعبير عن GLuc-SERCaMP عبر وسائل المعدلة وراثيا يمكن السوائل البيولوجية بما في ذلك زراعة الخلايا المتوسطة والبلازما ليتم تحليلها لإجراء تغييرات في النشاط GLuc كمؤشر على التوازن ER الكالسيوم. طريقة تطبيقات لدراسة طولية من التعديلات التقدمية في مخزن الكالسيوم ER سواء في التجارب المختبرية والحية. يتم كتابة بروتوكول التالية باعتباره المخطط العام لاستخدام SERCaMP استنادا GLuc لدراسة ER الكالسيوم، ولكن البروتوكول يمكن أن تكون بمثابة دليل للSERCaMPs مراسل بديل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. في المختبر الفحص: كشف SERCaMP بيان من خط الخلية مستقرة SH-SY5Y

  1. لوحة SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL (SERCaMP) في زراعة الأنسجة تعامل وحات في 150،000 الخلايا لكل سم 2 من مساحة السطح. 96 لوحات جيدة، على سبيل المثال، البذور 50000 خلايا لكل بئر (الشكل 1A). تنمو الخلايا SH-SY5Y في DMEM (الجلوكوز المرتفع، GlutaMAX، البيروفات) + النمو البقري 10٪ مصل + 1X البنسلين / الستربتومايسين.
    1. خلايا مرور ما يصل إلى 15 مرة (الشكل 1B). لم يتم اختباره أعلى عدد مرور.
    2. العودة إلى خلايا حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5.5٪ CO 2 واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. قبل العلاج التجريبي (ق)، وجمع عينة خط الأساس لكل بئر من خلال نقل 5 ميكرولتر من ثقافة طاف إلى مبهمة الجدران 96 لوحة جيدا. قبل جمع، اضغط بلطف لوحة على جميع الاطراف ودوامة لتجنب الآثار التدرج. ختم لوحة مبهمة مع الصورة لاصقةورقة إيلينغ وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى وقت الفحص الانزيمي.
    ملاحظة: يفرز GLuc-SERCaMP غير مستقرة جدا في مستنبت الخلية. ذكرنا سابقا قد فقدت حوالي 5-10٪ من النشاط GLuc بعد حضانة 72 ساعة على 37 درجة مئوية (حضنت على الخلايا SH-SY5Y) 12.
  3. علاج الخلايا كما المطلوبة لدراسة استنزاف الكالسيوم ER (على سبيل المثال البيئية، الدوائية، التلاعب الجيني). تجنب التعرض الطويل للالبيئة المحيطة (خارج الحاضنة رقابة) كما تغييرات درجة الحموضة سوف تحدث بسرعة في الغلاف الجوي CO 2. إضافة HEPES إلى مستنبت في 20 ملي، لتحقيق الاستقرار في درجة الحموضة 14، إذا كانت هناك حاجة التلاعب فترات طويلة. تجنب التعرض للضوء عند استخدام HEPES في مستنبت 15.
    1. مراقبة إيجابية: علاج الخلايا مع 100 نيوتن متر thapsigargin (تيراغرام) أو 50 ميكرومتر حمض cyclopiazonic (CPA) لمدة 4-6 ساعة لإجراء التجارب في الخلايا SH-SY5Y. الاستجابة القصوى في خطوط الخلايا الأخرى قد تتطلب حضانات أطول أو concen مختلفةtrations من المركبات.
    2. السيطرة السلبية: اجمع مستنبت من خلايا SH-SY5Y الوالدين. في تجربتنا، والتلألؤ الخلفية لهذا الاختبار هو أقل من 0.05٪ من إفراز الخلايا القاعدية من SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP مستقرة.
  4. جمع وتخزين عينات 5 ميكرولتر من وسائل الإعلام مكيفة في timepoints المطلوب، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  5. تقييم النشاط الأنزيمي في المتوسط ​​على النحو المبين في المادة 5.
  6. دراسة GLuc داخل الخلايا بواسطة طخة مناعية أو التلألؤ الفحص.
    1. لطخة مناعية: الخلايا ليز في تعديل عازلة RIPA يحتوي على 50 ملي تريس (7.4 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.25٪ deoxycholate الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1٪ NP40، ومثبطات الأنزيم البروتيني. منفصلة على هلام SDS-بولكرلميد ونقل إلى غشاء 0.20 ميكرومتر PVDF. احتضان الغشاء مع GLuc الأضداد (1: 2000 تمييع) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أداء حضانة الأجسام المضادة ويغسل الغشاء الثانوية حسب بروتوكول المعرفة من قبل المستخدم للكشف عن كاشف الاختيار.
    2. لفحص التلألؤ (الشكل 2): تنفيذ الخطوات التالية على الجليد:
      1. إزالة كافة المتوسطة من الآبار من لوحة زراعة الأنسجة وشطف مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
      2. إضافة 75 ميكرولتر من تحلل العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ NP40 ومثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل بئر.
      3. تدوير لوحة على شاكر المداري (120 دورة في الدقيقة) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      4. ماصة بلطف المحللة صعودا وهبوطا باستخدام pipettor الأقنية، وتجنب فقاعات الهواء. نقل 5 ميكرولتر من المحللة إلى لوحة مبهمة وتقييم التلألؤ على النحو المبين في المادة 5.

2. في المختبر الفحص: ترنسفكأيشن عابر من خلايا مخلد مع SERCaMP

ملاحظة: وقد لاحظنا أن الإجراءات ترنسفكأيشن عابرة يمكن أن تحدث الإجهاد الخلوي وفظة اللاحقة الاستجابة GLuc-SERCaMP. وقد تم تطوير هذا النهج التالي للتقليل من ترنسفكأيشن ممثل المؤسسة النظام الأوروبي في الخلايا SH-SY5Y. قد تكون هناك حاجة تعظيم الاستفادة من هذا الإجراء (بما في ذلك اختيار ترنسفكأيشن الكاشف) للخطوط الخلايا البديلة. عندما يكون ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام خطوط الخلايا مستقرة أو أساليب تنبيغ الفيروسية المبينة في المادتين 1 و 3 على التوالي.

  1. لوحة الخلايا SH-SY5Y في صحن 100 ملم في 4 × 10 6 خلايا. وهذا الطبق يكون كافيا لإعادة البذور حوالي 300 بئر (96 شكل لوحة جيدا) بعد إجراء ترنسفكأيشن.
  2. خلايا Transfect مع Xfect كاشف استخدام 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (ترميز GLuc-SERCaMP) و 6 ميكرولتر من Xfect كاشف. DNA على نطاق وXfect كاشف وفقا للسفن الثقافة أكبر أو أصغر.
  3. العودة الخلايا الحاضنة لمدة 48 ساعة.
  4. يعرض للتريبسين الخلايا وRESEED إلى 96 لوحات جيدة في 60000 خلايا لكل بئر. اتبع الخطوات التالية المبينة في الفرع 1.

3. في المختبر الفحص: الفيروسية التعبير بوساطة ناقلات من GLuc-SERCaMP

خيمة "> ملاحظة: الفيروسية الغدة المصاحب (AAV) التعبئة والتغليف ناقلات 16 و 12 و تنقية الفيروسة البطيئة إنتاج 13 تم الإبلاغ سابقا.

  1. عيار GLuc-SERCaMP AAV باستخدام بادئات وتحقيقات التالية: التمهيدي إلى الأمام، 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3؛ التمهيدي العكسي، 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3؛ مسبار (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 المسمى)، 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 "لالكمي PCR.
    1. إعداد منحنى قياسي قبل linearizing البلازميد التي تحتوي على GLuc وتنقية باستخدام الحمض النووي تدور عمود (على سبيل المثال Machery-ناجل NucleoSpin جل وPCR تنظيف). Quantitate الحمض النووي عن طريق فصل على هلام الاغاروز جنبا إلى جنب مع سلم الشامل. إعداد 1:10 التخفيفات من الحمض النووي من 100 غ / مل إلى 10 FG / مل في برنامج تلفزيوني. حساب نسخة / مل من الحمض النووي البلازميد GLuc في كل من تركيزات على أساس الوزن الجزيئي للالبلازميد.
    2. تمييع الأسهم AAV في برنامج تلفزيوني (التخفيف المناسبة سوف تعتمد علىالمعلمات من إعداد الفيروسي وتحدد تجريبيا).
    3. تشغيل تفاعل PCR في نظام الوقت الحقيقي PCR باستخدام الشروط التالية: 95 ° C × 5 دقائق، 94 ° C × 20 ثانية، و 60 ° C × 1 دقيقة لمدة 41 دورات. حساب نسخ / مل باستخدام المنحنى القياسي.
  2. عيار الفيروسة البطيئة مع P24 LENTI-X عيار السريع عدة. ذوبان الجليد قسامات lentiviral على الجليد ويخفف من البروتين P24 التحكم في SH-SY5Y المتوسطة.
    1. تمييع الفيروسة البطيئة مثل أنه سوف تقع على منحنى القياسية (على سبيل المثال 1: 20000 أو 1: 100،000). فإن عامل التخفيف المطلوبة تختلف بناء على معايير إعداد lentiviral ويجب أن تحدد تجريبيا. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لجميع الخطوات اللاحقة.
  3. لوحة الخلايا إلى 96 لوحات جيدة. لخلايا SH-SY5Y، يمكن اتباع الإجراءات الطلاء المبينة في الفرع 1. لالجرذ الخلايا العصبية القشرية الأولية، والخلايا ينبغي عزل والمصنفة على لوحات مغلفة بشكل مناسب لالصورة الموصوفة سابقا 16. الحفاظ على الخلايا العصبية القشرية الأولية الفئران في Neurobasal المتوسطة تستكمل مع 1X B27 و 500 ميكرومتر L-الجلوتامين. أداء البورصات متوسطة نصف كل يوم.
  4. تنبيغ الخلايا مع فيروس. هدف تنبيغ الفيروسية هو تحقيق انخفاض مستوى التعبير، كما يوفر Gaussia luciferase المراسل إشارة قوية.
    1. AAV تنبيغ الخلايا SH-SY5Y: تنبيغ في اليوم التالي الطلاء. تمييع AAV إلى 6.0 × 10 7 VG / ميكرولتر في AAV تخفيف العازلة (PBS + 0.5MM MgCl 2). إضافة 5 ميكرولتر من AAV المخفف (3.0 × 10 8 VG؛ وزارة الداخلية ما يقرب من 6000) لكل بئر من 96 لوحة جيدا (الشكل 3A). استخدام التبييض 10٪ لتعطيل النفايات ناقلات فيروسية.
    2. AAV تنبيغ الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية: تنبيغ 6-8 أيام بعد الطلاء. تمييع AAV إلى 4.0 × 10 6 VG / ميكرولتر العازلة في AAV التخفيف. إضافة 5 ميكرولتر من AAV المخفف (2.0 × 10 7 VG؛ وزارة الداخلية ما يقرب من 350) لكل بئر من96 لوحة جيدا (الشكل 3B). وزارة الداخلية الأمثل ينبغي أن تحدد تجريبيا لأنواع الخلايا الأخرى. استخدام التبييض 10٪ لتعطيل النفايات ناقلات فيروسية.
    3. تنبيغ Lentiviral الخلايا SH-SY5Y: تنبيغ في اليوم التالي الطلاء. تمييع الفيروسة البطيئة إلى 20 جزء من الغرام / ميكرولتر P24 (تحديد تركيز باستخدام عدة titering) في محلول ملحي متوازن هانك. إضافة 5μl من الفيروس المخفف لكل بئر (100 خريج من P24، أي ما يعادل 1،250،000 الجسيمات lentiviral، أو ~ 1250 تعليمات الاستخدام) من 96 لوحة جيدا تحتوي على 100 حجم ميكرولتر. حجم وفقا لصيغ أكبر. استخدام التبييض 10٪ لتعطيل النفايات الفيروسية.
  5. جمع عينة قبل المعالجة المتوسطة وتبدأ العلاجات التجريبية 48 ساعة (SH-SY5Y) أو 5-7 أيام (الفئران الخلايا العصبية القشرية الأولية) بعد تنبيغ.

4. في فيفو SERCaMP الفحص

ملاحظة: قبل القيام بأي إجراءات الحيوان يجب التأكد من الحصول على الموافقة اللازمة من خلال مؤسستكم. كلجراحات البقاء على قيد الحياة إلى أن يتم تحت ظروف معقمة مع التخدير المناسب. وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة أدناه وهي في الامتثال للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة ACUC.

  1. الأدوات الجراحية الأوتوكلاف قبل بدء الجراحة (121 ° C، 30 دقيقة التعقيم، 20 دقيقة وقت جاف). تنظيف جميع الأدوات في ultrasonicator التالية كافة الإجراءات وقبل التعقيم على الفور. الحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة. لعملية جراحية تتطلب الحيوانات متعددة، يمسح الأدوات الجراحية مع الكحول 70٪، ultrasonicate وحبة تعقيم بين الفئران. الرجوع إلى قائمة المواد للأدوات اللازمة.
  2. إعداد الفئران لإجراء عملية جراحية. نحن هنا استخدام الذكور سبراغ داولي (180-200 ز).
    1. تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين الغاز لمدة 3 دقائق (4-5٪ الأيزوفلورين تسليمها في 1000 سم مكعب / دقيقة)، يليه الحقن داخل الصفاق من زيلازين (8 ملغ / كلغ) والكيتامين (80 ملغ / كلغ). تطبيق مرهم للعين لحماية القرنيات من الجفاف. Bجراحة egin بمجرد أن الفئران هي تخدير عميق كما يتضح من عدم الانسحاب لا ارادي التالية الذيل أو قرصة القدم.
    2. حلق منطقة البطن أقل قليلا من أضلاعه (منخفض المنطقة الصدرية) إلى المنطقة منتصف البطن. فرك المنطقة الجراحية ثلاث مرات، بالتناوب الكحول 70٪ وBetadine فرك. وضع الفئران في موقف ضعيف على منطقة العمليات الجراحية المعقمة مع الستائر الجراحية المعقمة.
  3. تمييع AAV-GLuc-SERCaMP إلى 7.6 × 10 9 VG / مل (تركيز النهائي). مزيج جيد من قبل قلب الأنبوب.
    ملاحظة: مجموعة من تركيز الفيروس يمكن أن تختلف (الشكل 4).
    1. الماصة 105 ميكرولتر من AAV المخفف في طبق العقيمة. استخدام إبرة عيار 30 لجمع الفيروس إلى حقنة.
  4. إجراء عمليات جراحية لفضح الكبد وحقن AAV-GLuc-SERCaMP.
    1. قبل إجراء شق في البطن، وتطبيق 0.25٪ بوبيفكين إلى منطقة شق. باستخدام مشرط، وجعل شق أفقي تحت القفص الصدري (ا ف بتقريبية 2-3 سم). بلانت تشريح لفصل النسيج الضام من اللحمة.
    2. قطع عضلات البطن، وفضح الفص الأيمن من الكبد وسطي.
      ملاحظة: قد يتم حقنه فصوص إضافية بناء على طلب نهاية.
    3. وضع الحيوان تحت المجهر الجراحي وضبط للحصول على الفص الأيمن من الكبد وسطي في مجال الرؤية. حقن الفيروس إلى حمة من الفص وسطي. 3 مواقع منفصلة، ​​ما يقرب من 33 ميكرولتر في الموقع.
      ملاحظة: ترك الإبرة في النسيج لمدة 5-10 ثانية بعد الحقن لضمان تسليم حجم الحقن بأكمله.
    4. خياطة عضلات البطن والجلد على حدة وإضافة Neosporin استخدام القطن يميل قضيب. وضع الفئران في غرفة الإنعاش حتى استعاد وعيه والفئران غير قادرة على الحفاظ على وضع مستقيم. لا تترك الجرذان (ق) غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. منزل منفردة حتى شفى شق وتم إزالة الغرز (7-14 يوما).
  5. بدء جمع الدم الذيل بعد 4-7 أيام الحقن. إعداد أنابيب جمع الدم عن طريق وضع العلامات وقبل وزنها. إضافة 50 ميكرولتر الهيبارين (1000 U / مل) إلى كل أنبوب.
  6. مكان الفئران في غرفة التخدير الأيزوفلورين لمدة 3 دقائق (4-5٪ الأيزوفلورين تسليمها في 1000 سم مكعب / دقيقة). إزالة الفئران من غرفة ومكان في مخروط الأنف (2-3٪ الأيزوفلورين ألقاها في 500 سم مكعب / دقيقة). جمع الدم يمكن أن تبدأ بمجرد تخدير الفئران عميقا كما يتبين من عدم الانسحاب لا ارادي التالية ذيل بيNCH.
    1. باستخدام مقص العقيمة قطع طرف الذيل (1-2 ملم) وجمع الدم قطرة من الحكمة في شغل ما قبل أنبوب الهيبارين. جمع الدم حتى تصل إلى حجم أكبر من 2: 1 الدم إلى نسبة الهيبارين (> 100 ميكرولتر الدم / 50 ميكرولتر الهيبارين). يمكن تعديل مجلدات جمع الدم على أساس التصميم التجريبي. استخدام قضيب من القطن مبللة لتطبيق مسحوق قابض على الذيل لوقف النزيف.
    2. أنابيب تخزين الدم عند 4 درجات مئوية إذا جمع عينات لاحقة. مسح مقص مع لوحة الإيثانول وحبة تعقيم بين المجموعات.
    3. تزن أنابيب جمع وضبط مع الهيبارين للحصول على نسبة 2: 1 (الدم: الهيبارين). وهذه الخطوة تطبيع كمية الهيبارين في كل عينة (الجدول 1).
    4. أنابيب الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل طاف (البلازما) إلى أنبوب جديد وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى وقت فحص luciferase المراسل (القسم 5).
      ملاحظة: تخزين العينات في 4 درجات مئوية تصل إلى 72 ساعة قبل الفحص الانزيمي ديه متأثير inimal على التلألؤ (الشكل 5A). تصل إلى 3 دورات تجميد أذاب عينات البلازما لها أي تأثير على التلألؤ (الشكل 5B).
  7. إدارة Thapsigargin (مراقبة إيجابية):
    1. إعداد thapsigargin عن طريق تمييع في الإيثانول إلى تركيز النهائي من 2.5 ملغ / مل. حقن thapsigargin في 1 ملغ / كغ الملكية الفكرية في أسفل البطن.
      ملاحظة: Thapsigargin يزيد الناجمة عن تخثر الصفائح الدموية الثرومبين 17 ويمكن أن تجعل جمع الدم من ذيل أكثر صعوبة.
  8. Gaussia luciferase الفحص:
    1. ذوبان الجليد في عينات البلازما على الجليد.
      ملاحظة: للحصول على الدراسات الطولية، وذوبان الجليد وأداء التلألؤ فحص لجميع العينات timepoint في نفس اليوم (باستخدام إعداد واحد من الركيزة).
    2. نقل 10 ميكرولتر من البلازما إلى لوحة المسورة مبهمة وقياس النشاط الأنزيمي كما هو موضح في القسم 5. تشغيل 3-4 مكررات التقنية لكل عينة البلازما.
  9. Euthanasiل
    ملاحظة: الاستفادة من التكنولوجيا SERCaMP هي القدرة على طوليا رصد ER الكالسيوم. اعتمادا على المعلمات التجريبية ونقطة النهاية التحليلات والحيوانات إلى أن يتم التخلص عن طريق اتخاذ تدابير مناسبة لنقطة النهاية التحليلات وفقا للمبادئ التوجيهية ACUC المؤسسية.

5. التلألؤ الفحص

  1. إعداد الحلول coelenterazine (CTZ) الأسهم عن طريق تمييع مجمع في الميثانول المحمض (30 ميكرولتر من 10 N حمض الهيدروكلوريك إلى 3 مل من الميثانول) إلى 20 ملم. إعداد قسامات تستخدم مرة واحدة وتخزينها في -80 ° C.
  2. إعداد الركيزة العمل في يوم الفحص.
    1. لفحوصات في المختبر، وتمييع coelenterazine إلى 8 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال إضافة 10 ميكرولتر من 20 ملي CTZ الأسهم إلى 25 مل من برنامج تلفزيوني (الشكل 6A، B).
    2. لفي الجسم الحي المقايسات، وتمييع coelenterazine إلى 100 ​​ميكرومتر في برنامج تلفزيوني، 500 ملي حمض الاسكوربيك، 5 ملي كلوريد الصوديوم.
  3. احتضان استعداد CTZ لمدة 30 دقيقة على الأقلفي درجة حرارة الغرفة قبل البدء في الفحص.
    ملاحظة: غالبا ما تتضمن هذه الخطوة في Gaussia المقايسات luciferase المراسل كما أن هناك تقارير تسوس الركيزة السريع في أول دقيقة 30 بعد إعداد. لم نلحظ هذا التأثير في نظامنا (الشكل 6C)؛ ومع ذلك، فإننا غالبا ما تشمل الخطوة الحضانة كما وجدنا أي تأثير سلبي على الفحص.
  4. استخدام قارئ لوحة قادرة على رصد تلألؤ بيولوجي ومجهزة حاقن الركيزة. رئيس الخطوط مع الركيزة.
    ملاحظة: الركيزة الأولى من خلال خطوط يمكن أن يكون عرضة للتدهور. لتجنب قراءات منخفضة بشكل مصطنع لعينات مبكرة، وضخ 20-30 آبار فارغة (تحميل لوحة فارغة على القارئ) قبل قياس العينات التجريبية.
  5. ضخ 100 ميكرولتر من الركيزة إلى جيدا، يهز سرعة متوسطة لمدة 5 ثوان، وقياس انبعاث الضوء. لوحة القارئ BIOTEK التآزر II، دمج انبعاث الضوء خلال 0.5 ثانية (في المختبر عينات) و 5 ثانية (فيفيفو عينات) لقراءة الخطوة. تحسين المعلمات قارئ لوحة لأداء الاختبار المثالي.
    ملاحظة: المعارض Gaussia luciferase المراسل حركية فلاش مع تسوس إشارة السريع (مقارنة مع توهج حركية لاحظ مع luciferases أخرى). ويتأثر حركية مضة من GLuc بواسطة المصل في مستنبت الخلية (الشكل 7A)، وتسليط الضوء على أهمية السيطرة على تكوين المتوسط ​​عبر العينات. بسبب تسوس السريع من التألق بعد إضافة الركيزة (حركية فلاش)، والوقت بين حقن وقراءة خطوات يجب أن تكون موحدة لجميع العينات. يجب تعيين قارئ لوحة لحقن الركيزة إلى بئر، وانتظر الوقت المحدد (على سبيل المثال نستخدم خطوة هزة 5 ثانية)، وقراءة ذلك جيدا. مضيفا الركيزة لوحة كاملة قبل القراءة يشكل تحديا كبيرا ما لم يمكن إضافة الركيزة لجميع الآبار في وقت واحد. إذا حاقن غير متوفر، قضية يمكن التحايل جزئيا التي يحتضنها لوحة لمدة 10 دقيقة بين الركيزة عدينشوئها والقياس (وبالتالي تجنب الجزء الحاد في منحنى الاضمحلال) (الشكل 7B).
  6. تكرار الحقن، ووقت الانتظار، وقراءة خطوات لكل بئر على طبق من ذهب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح أسلوب GLuc-SERCaMP لتقييم ER الكالسيوم عن طريق أخذ عينات السوائل خارج الخلية. يمكن إدراج عدة عناصر تحكم في التصميم التجريبي لتعزيز تفسير النتائج. أولا، استخدام مراسل يفرز بشكل جوهري (على سبيل المثال GLuc دون ASARTDL C-محطة أو "GLuc رقم بطاقة") يمكن استخدامها لتقييم آثار العلاجات التجريبية على مسار إفرازية (إفراز الخلوية العالمي) والتحوير التعبير. على سبيل المثال، سيعتبر زيادة في مستويات خارج الخلية من كلا GLuc-SERCaMP وGLuc رقم بطاقة نتيجة غامضة. بدلا من ذلك، زيادة في إفراز GLuc-SERCaMP مع عدم وجود المماثل من GLuc-أي رد العلامة تدعم حدث تعتمد ER الكالسيوم (الشكل 8). إفراز GLuc-SERCaMP ردا على استنزاف ER الكالسيوم يمكن تقييمها كذلك من خلال قياس داخل الخلايا GLuc، على الرغم من أن هذا يقتصر على timepoint واحد كما هو مطلوب تحلل. الباحث سوف racellular GLuc-SERCaMP خفض ردا على استنزاف ER الكالسيوم، ويفرز ذلك تدريجيا، وخارج الخلية: سوف الخلايا نسبة (محسوبة لكل بئر فردية) زيادة (الشكل 2B). خارج الخلية: الخلايا النسبة مفيدة للسيطرة على التغيرات في التعبير التحوير.

ويمكن استخدام جهري الدوائية للتخزين الكالسيوم ER لتأكيد مساهمة ER الكالسيوم لإطلاق SERCaMP في نماذج جديدة. دانترولين، وهو خصم RYR، ومن المعروف أن استقرار الكالسيوم ER، التي ينبغي أن تقلل أو تمنع الإفراج عن SERCaMP ردا على تيراغرام (الشكل 8B). فمن المستحسن، عندما يكون ذلك ممكنا، لاختبار المركبات الإضافية التي تؤثر على تدفق الكالسيوم ER (على سبيل المثال Xestospongin C، 4-كلورو-م-كريسول) في النماذج التجريبية الجديدة التي توظف SERCaMP. وغالبا ما تتحدى هذه الدراسات في الجسم الحي، ولكن قد يكون ممكنا في نماذج زراعة الأنسجة المقابلة.

"> على الدراسات في المختبر باستخدام SERCaMP استنادا GLuc، فمن المستحسن لحساب الاستجابات على لوحات الفردية النسبية لسيطرة (ق). ويمكن تقييم استجابة" الناجم عن المعاملة 'على timecourse من خلال تتبع التغيرات في الاستجابة النسبية مقابل التحكم ( ما بين لوحة المقارنات). ومن غير المستحسن لمقارنة الأرقام الخام عبر لوحات متعددة، نظرا لاضمحلال الركيزة، التي يمكن أن تؤدي إلى تغيرات في القيم الخام بين timepoints (الشكل 6C). يجعل المقارنات النسبية ضمن لوحة يقلل من هذا التأثير وتقدم (الشكل 6D). مثال على تحليل البيانات لفي المختبر تيراغرام الناجم عن تجربة إطلاق SERCaMP في الشكل 9.

لفي الدراسات المجراة باستخدام GLuc-SERCaMP، ينبغي تقييم البيانات بشكل مستقل عن كل حيوان، مع كل حيوان بمثابة لمراقبة "ما قبل المعالجة الخاصة. وهذا أمر ضروري لتفسير التباين في التحوير ديلivery والتعبير بين الحيوانات (الشكل 4A).

سيتأثر حجم ردود SERCaMP من قبل مجموعة متنوعة من العوامل، وكثير منها المتعلقة بالصحة الأساسية للخلايا ويمكن السيطرة عليها مباشرة من قبل المحقق. للاستجابة SERCaMP القصوى، لا بد من تحسين الظروف التي تحبذ القاعدية التوازن ER الكالسيوم. وهذا يشمل خلايا البذر في الكثافة المثلى واستخدام التتر الفيروسية المنخفضة. أنواع الخلايا والأنسجة المختلفة قد لديها متطلبات إضافية، والتي ينبغي أن تحدد تجريبيا.

الشكل 1
الشكل 1: مستقرة SH-SY5Y خط الخلية كثافة البذر والاعتبارات عدد مرور تم المصنفة (A) خلايا SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP على مختلف الكثافات والمحتضنة لمدة 40 ساعة. وقد تم قياس يفرز GLuc-SERCaMP 4 ساعات بعد العلاج مع 300 نيوتن متر تيراغرام سالسيطرة على السيارة ص (يعني ± SD، ن = 6). يشار زيادة Thapsigargin التي يسببها في إفراز GLuc-SERCaMP لكل كثافة الخلية. تم فحص خلايا (B) SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP في مرور عدد 2 و 15 لإفراز الناجم عن thapsigargin. تم علاج الخلايا مع 100 نيوتن متر تيراغرام لمدة 2 ساعة أو 4 ساعات، وكان النشاط GLuc يفرز طبيعيا في السيارة تعامل الضوابط (يعني ± SD، ن = 4، أي أثر ملموس للمرور عامل، 2-طريقة ANOVA). خط متقطع يشير ص = 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: فحص الأنزيمية للقياس بين الخلايا GLuc-SERCaMP (A) بين الخلايا و (B) تم تقييم النشاط الإنزيمي خارج الخلية GLuc في كور الأولية الفئرانالخلايا العصبية tical (transduced مع AAV-GLuc-SERCaMP). بعد ستة أيام تنبيغ، تم علاج الخلايا مع 60 نانومتر thapsigargin لمدة 4 ساعة. كما يتراكم GLuc-ASARTDL في المتوسط، لوحظ نقصان المقابلة في مستويات الخلايا. (C) وهناك نسبة من خارج الخلية: النشاط GLuc الخلايا يمكن أن تحسب لكل بئر على حدة.

الشكل (3)
الرقم 3: AAV-GLuc-ASARTDL عيار مقابل الاستجابة التي يسببها thapsigargin للخلايا SH-SY5Y والفئران الخلايا العصبية القشرية الأولية كانت المصنفة (A) خلايا SH-SY5Y في 96 لوحات جيدة في 5 × 10 4 خلايا لكل بئر والسماح للالالتزام بين عشية وضحاها. تم transduced الخلايا في تعدد المشار إليه من العدوى (وزارة الداخلية)، حضنت لمدة 48 ساعة وبعد ذلك تعامل مع 300 نيوتن متر تيراغرام أو مركبة. وقد تم قياس التألق في المتوسط ​​بعد 8 ساعات (يعني ± SEM، ن = 3). * P <0.05، MULtiple تي اختبارات (تصحيح هولم-Sidak). تم transduced (B) الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية على DIV8 مع AAV-GLuc-ASARTDL في وزارة الداخلية المشار إليها (محسوبة باستخدام 60،000 الخلايا في تقريب جيد في وقت تنبيغ). بعد خمسة أيام تنبيغ، تم علاج الخلايا مع 100 نيوتن متر تيراغرام أو تم قياسها السيطرة على السيارة والتألق في المتوسط ​​بعد 8 ساعات (يعني ± SEM، ن = 6). * P <0.05، متعددة تي اختبارات (تصحيح هولم-Sidak).

الرقم 4
الرقم 4: Thapsigargin الناجم عن إطلاق GLuc-SERCaMP في الدم بعد الحقن داخل الكبد على مجموعة من التتر الفيروسية (A) القيم التلألؤ الخام من الفئران (ن = 8) حقن intrahepatically مع مختلف التتر AAV-GLuc-ASARTDL. كانت تدار Thapsigargin (1 ملغ / كلغ) حقن (IP) في اليوم الذي جمع 12. الدم في نقاط زمنية المشار إليها وتخزينها في -80 & #176؛ C حتى وقت الفحص. (B) القيم التلألؤ تطبيع من لوحة A، مما يدل على استجابة SERCaMP التي يسببها thapsigargin في الفئران (ن = 8) التعبير عن كميات متنوعة من AAV-GLuc-ASARTDL.

الرقم 5
الرقم 5: مناولة وتخزين العينات البلازما GLuc-SERCaMP (في الجسم الحي) وجمعت (A) البلازما من الفئران معربا عن intrahepatically GLuc-SERCaMP (ن = 10)، aliquoted وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى وقت المقايسات. تم إزالة الأنابيب من -80 ° C وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة الأوقات المحددة قبل قياس التلألؤ (يعني ± SD). (B) تأثير متعددة تجميد / يذوب من عينات البلازما على GLuc النشاط الأنزيمي. عينات البلازما التي تم جمعها من الفئران معربا عن intrahepatically AAV-GLuc-SERCaMP (ن = 10) تعرضوا للوأشار عدددورات تجميد ذوبان الجليد ويعاير لالتلألؤ (يعني ± SD).

الشكل (6)
الرقم 6: إعداد coelenterazine الركيزة لفحوصات GLuc-SERCaMP تم جمع (A) الثقافة المتوسطة من SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP خلايا خطوط تعامل مع 300 نيوتن متر تيراغرام (أو السيطرة على السيارة) لمدة 5 ساعة. تم تقييم النشاط GLuc في المتوسط ​​عن طريق حقن PBS + تركيزات مختلفة من coelenterazine (يعني ± SD، ن = 6). وكانت (B) القيم التلألؤ من لوحة وتطبيع للمركبة تعامل التحكم في كل تركيز الركيزة لتقييم الأثر الناجم عن thapsigargin. (C) الركيزة الاضمحلال على مدى عدة ساعات. وقد تم قياس التلألؤ من كمية معروفة من المؤتلف GLuc (0.1 نانوغرام أو 0.02 نانوغرام) على مدى عدة ساعات بعد إعداد الركيزة (يعني ± SD، ن = 4). (D) في حين أن التلألؤ الخام لالمؤتلفانخفضت GLuc بمرور الوقت المناسب لالركيزة تسوس، والحفاظ على فارق أضعاف في عينات (على النحو الذي يحدده التلألؤ).

الرقم 7
الرقم 7: اعتبارات لفحوصات GLuc-SERCaMP المتعلقة حركية رد فعل GLuc / CTZ (A) الثقافة المتوسطة يغير اضمحلال إشارة GLuc / CTZ. كانت مختلطة 5 ميكرولتر من طاف تحتوي على GLuc-SERCaMP مع نسب متفاوتة من برنامج تلفزيوني والثقافة المتوسطة. تم إضافة 100 ميكرولتر من الركيزة (15 ميكرومتر CTZ في برنامج تلفزيوني + 500 ملي حمض الاسكوربيك) إلى 50 ميكرولتر من العينة التي تم المخفف على النحو المبين في الجدول. تم رصد انبعاث الضوء أكثر من 15 دقيقة. وأضاف (B) وقد تم جمع 5 ميكرولتر من المتوسط ​​من الخلايا SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL و 100 ميكرولتر الركيزة (8 ميكرومتر CTZ في برنامج تلفزيوني + 5 ملي كلوريد الصوديوم). وقد تم قياس التلألؤ على الفور بعد إضافة الركيزة (T = 0) وكل 30 ثانية على خلال 15 دقيقة (± SD، ن = 12). يتم رسم البيانات كما إشارة في المئة بالنسبة للفترة الزمنية 30 ثانية السابق لتقييم معدل التسوس. أقحم تظهر البيانات التلألؤ الخام.

الرقم 8
تم فحص تأييد الدوائية من استنزاف الكالسيوم ER (A) تأثير 100 نانومتر thapsigargin على إفراز GLuc لGLuc-ASARTDL وGLuc رقم بطاقة التحكم (يعني ± SD، ن = 6): الرقم 8. (B) تحقيق الاستقرار ER الكالسيوم مع دانترولين (RYR خصم) يمنع تيراغرام التي يسببها الافراج SERCaMP. خلايا عولجوا قبل مع تركيزات أشار من دانترولين لمدة 30 دقيقة أو 16 ساعة قبل إضافة 100 نانومتر thapsigargin. وقد تم قياس النشاط GLuc في المتوسط ​​بعد 4 ساعات (يعني ± SD، ن = 6).

99fig9.jpg "/>
الرقم 9: نتائج ممثلة وهمية للمقايسة GLuc-SERCaMP ملاحظة السيارة قد يقلل القيم تعامل بين لوحات، وذلك بسبب انهيار الركيزة (التي تعتمد على الفاصل الزمني بين قراءة لوحات فردية). لحساب هذا الغرض، ويتم احتساب تأثير العلاج المحددة بشكل مستقل عن كل لوحة وتتم مقارنة هذه النسبة عبر لوحات.

تاريخ فأر كتلة أنبوب (ملغ) حجم الهيبارين (مل) كثافة الهيبارين (ز / مل) كتلة الهيبارين (ملغ) كتلة أنبوب + الهيبارين (ملغ) الكتلة الكلية بعد جمع الدم (ملغ) كتلة من الدم التي تم جمعها (ملغ) الكثافة في الدم (غ / مل) يحسب حجم الدم (المجاهدين) حجم الهيبارين اللازمة لنسبة 2: 1 مل الهيبارين إضافية لإضافة تدور قبل
01.01.15 SD ذكر 1135.9 50 1،117 55.83 1191.73 1317.70 125.97 1.05 119.97 59.98 9.98

الجدول 1: الدم جمع الجدول مثال سجل جمع الدم للدراسات SERCaMP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يبرز في المختبر والمرافق الحيوية لGLuc-SERCaMP لمراقبة استنزاف ER الكالسيوم. على الرغم من أن التعديل البروتين لتوليد SERCaMP يبدو أن التعميم على البروتينات مراسل الأخرى 12، اخترنا Gaussia luciferase المراسل لمن القوي (200-1،000 أكبر أضعاف) تلألؤ بيولوجي مقارنة luciferases أخرى 18. علينا أن نظهر للكشف الناجم عن thapsigargin الإفراج GLuc-SERCaMP عبر مجموعة جرعة 100 أضعاف من فيروس GLuc-SERCaMP تسليمها إلى الفئران الأساسي العصبونات القشرية، والخلايا SH-SY5Y، وكبد الفئران (أرقام 3 و 4). وصفنا سابقا الجيل خط خلية ستابلي معربا عن GLuc-ASARTDL وأظهرت أن عدد قليل من 20 زنزانة في عدد سكانها 5 × 10 4 خلايا غير المسماة يمكن تقرير لthapsigargin الناجم عن استجابة 12. نحن هنا تبين أن خط الخلية مستقرة يمكن أن التقرير باستمرار استجابة تيراغرام التي يسببها إلى 15 الممرات، ومعظم يحللالطبعه، مشيرا إلى أن التعبير المستمر لمراسل مرور الوقت لا يؤثر على قدرتها على أن يطلق سراحه في استجابة لاستنزاف الكالسيوم ER (الشكل 1). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن GLuc-SERCaMP يقام في المقام الأول داخل ER خلية حتى وقت نضوب الكالسيوم ER عندما يفرز ذلك. في ظل ظروف "طبيعية"، وهناك إفراز القاعدية المنخفضة التي تسمح بإنشاء ER الأساس الكالسيوم 12. بعد استنزاف الكالسيوم ER التي كتبها thapsigargin، ومستويات داخل الخلايا وخارج الخلية تغيير التلألؤ في اتجاهين متعاكسين. ويمكن التعبير عن هذا كنسبة للإشارة إلى تحول في توزيع دولة المطرد للاستشعار (الشكل 2). الأهم من ذلك، كما هو التضمين الإفراج SERCaMP التي كتبها KDEL مستقبلات التعبير 12، وحجم الإفراج قد تختلف اعتمادا على نوع من الخلايا. ونحن نتصور أن استبدال 'ASARTDL' مع كربوكسي محطة متواليات مثل KDEL بديلة قد تكون هناك حاجة لتحقيق ماكسياستجابة سوء SERCaMP في خلية أو نسيج نوع معين.

لفحوصات في المختبر، ومستويات من خارج الخلية GLuc-SERCaMP تتراكم بمرور الوقت نتيجة للاستقرار مراسل يفرز؛ أبلغنا انخفاضا تقريبي 5-10٪ في النشاط بعد 72 ساعة 12. على هذا النحو، وتبادل متوسطة قبل بدء الدوائية أو التحدي وراثي لER الكالسيوم قد يكون من الضروري للحد من إشارة الخلفية بسبب تراكم الاستشعار. في المقابل، فإن نصف عمر GLuc-SERCAMP في الجسم الحي هو 3،5-4،7 دقيقة 12 تشير إشارة في البلازما يمثل الإفراج مؤخرا عن المراسل إلى تعميم الدم. مرة واحدة الدم هو الجسم الحي السابقين وتجهيزها لالبلازما، ومع ذلك، GLuc-SERCaMP غير مستقرة جدا (الشكل 5).

لمنهجيات وصفها، يتم نقل متوسطة أو البلازما لمبهمة لوحات 96-جيدا قبل المقايسات الأنزيمية. اثنين من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها عند استخدام مراسلة في GLuc-الصورة هي حركية فلاش الإنزيم وانهيار الركيزة coelenterazine. القراء لوحة مجهزة طريق الحقن هي الأنسب لتشغيل GLuc المقايسات الأنزيمية لتطبيع الوقت بين الجمع الركيزة والقياسات التلألؤ. الخصائص الكيميائية للcoelenterazine جعلها عرضة للتسوس، والذي يحول دون مقارنة القيم التلألؤ الخام قياس في أوقات مختلفة بعد إعداد الركيزة. أضعاف الاختلافات بين العينات، ومع ذلك، يتم الاحتفاظ (الشكل 6)، والسماح للالفرق النسبي بين السيطرة والعينات التجريبية لتعقبها خلال مدة التجارب (الشكل 9).

القدرة على رصد تقلبات ER الكالسيوم في الجسم الحي هو مفيد عند التحقيق الأمراض التقدمية. في حين أساليب أخرى، مثل الأصباغ حشوية الفلورسنت، هي مناسبة لحدة في الدراسات المختبرية، وهو مراسل SERCaMP هو الأول للسماح للرصد الكالسيوم ER الطولي. أويحييويحدد بروتوكول ص حقن الكبد مباشرة لAAV-GLuc-SERCaMP. لقد اكتشف مستويات ثابتة من GLuc-SERCaMP في تداول الحيوانات دون منازع لمدة 56 يوما بعد الحقن (آخر timepoint اختبار حتى الآن) والتنبؤ التجارب أطول ممكنة 12. ناقلات AAV صغيرة الحجم، وقياس ما يقرب من 20 نانومتر في القطر، وتشكل الحد الأدنى من متطلبات السلامة الأحيائية 19. للالتفاف على تحويل AAV الجينوم واحد الذين تقطعت بهم السبل في الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل، وتعبئتها AAV-SERCaMP باعتبارها AAV المصلي-1 المزدوج تقطعت بهم السبل ناقلات 20. وقد تبين AAV المصلي-1 إلى تنبيغ فعال كبد الفئران 19،21. ومع ذلك، فإن التحذير من تقنية حقن لدينا هو احتمال فيروس السفر إلى الأنسجة الأخرى في جميع أنحاء الجسم. على الرغم من أن ناقلات تم حقنها مباشرة في الكبد، ومنهجيتنا كما وردت لا يمكن تمييز مصدر إطلاق SERCaMP، وبالتالي فمن الممكن أن الأنسجة الأخرى من الكبد يمكن أن تسهم في GLuc-SERCإشارة أمبير. والتلاعب الجيني في المستقبل تقييد التعبير لاستهداف أنواع الأنسجة. على سبيل المثال، عبر خطوط سائق لجنة المساواة العرقية الأنسجة محددة مع لجنة المساواة العرقية التي تعتمد GLuc-SERCaMP تسمح لرصد الأنسجة محددة من ER الكالسيوم عن طريق أخذ عينات البلازما.

تستخدم تقنية الموضحة في الجسم الحي التتر الفيروسية المنخفضة نتيجة لطبيعة قوية لمراسل. ويمكن الكشف عن الإفراج GLuc-SERCaMP من مجموعة الفيروسي من 7.6 × 10 7 VG إلى 7.6 × 10 9 VG (الشكل 4). هذا النطاق هو أقل 4-400 مرات مما ذكر في الأعمال السابقة باستخدام القائم على luciferase المراسل الحقن الفيروسية يراعة الكبد 19. في تركيزات أعلى، لاحظنا خسارة التعبير للكشف على مر الزمن، والذي هو ربما يعود ذلك إلى استجابة مناعية من الحيوان إلى التحوير 22. وينبغي تجنب التتر أعلى من الفيروس عندما يكون ذلك ممكنا بسبب زيادة احتمال فقدان إشارة. والتتر أقل من تلك التي عرضت لا تكوناختبار قصيرة. ويحدد هذا البروتوكول حقن AAV-GLuc-SERCaMP في الكبد. نهج مماثلة في نظرية الممكنة لأنواع الأنسجة الأخرى. المعلمات مثل تركيز الفيروسي والمصلي يجب أن يكون الأمثل للتعبير كاف في الأنسجة الأخرى.

ونظرا لطبيعة قوية لمراسل، كميات صغيرة من الدم (100-150 ميكرولتر) يمكن جمعها من قصاصات الذيل، مما يسمح للمجموعات المتكررة في جميع أنحاء التجارب. كان هذا مفيدا لتوصيف الطولي الإفراج GLuc-SERCaMP ردا على thapsigargin، حيث لاحظنا مستويات مرتفعة بعد تناوله thapsigargin تليها العودة إلى مستويات خط الأساس (الشكل 4). التعامل الصحيح مع عينات البلازما بعد جمع الدم مهم أيضا. على هذا النحو، لقد أثبتنا أن SERCaMP غير مستقرة في البلازما المخزنة في 4 درجات مئوية تصل إلى 72 ساعة قبل الفحص الانزيمي (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، يمكن أن عينات البلازما الخضوع لا يقل عن ثلاثة تجميد / طندورات الزعرورة مع تأثير ضئيل على التلألؤ (الشكل 5). في الممارسة العملية، نقوم بتخزين جميع العينات في -80 ° C، وتجنب لا لزوم لها تجميد أذاب دورات سابقة لتقييم فحص الأنزيمية، وتحليل جميع العينات للتجربة في نفس الوقت.

ER متورط استنزاف الكالسيوم في التسبب في مجموعة متنوعة من الأمراض. وغالبا ما يعتقد أنه حدث المنبع الذي يعوق الوظائف الخلوية ويؤدي إلى تنشيط الاستجابة البروتين المطوية (UPR). الاستعراض الدوري الشامل هو استجابة تكيفية التي تستخدمها ER لإعادة الأوضاع التماثل الساكن 5. الدول المزمنة من الإجهاد ER تتجاوز قدرة للاستعراض الدوري الشامل لاستعادة التوازن، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلايا. لوحظ التوتر ER وER التقلبات الكالسيوم في بعض الأمراض مثل مرض السكري نوع 1، اعتلال الكلية السكري، والأمراض العصبية وأمراض الجهاز العظمي القلب والأوعية الدموية 5. العلاقة بين التقلبات الكالسيوم والمرضية المرض، ومع ذلك، هو difficالموج لتحديد. التكنولوجيا SERCaMP لديها القدرة على تتبع هذه العملية على مدى عمر الحيوان، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة تطور المرض والتقدم. وعلاوة على ذلك، وتقييم علاجات محتملة تهدف إلى منع أو يمكن تقييم الصحيح ER التقلبات الكالسيوم من خلال استخدام SERCaMP. وأخيرا، وتحديد الأمراض التي تحدث فيها الإفراج GLuc-SERCaMP يتيح الفرصة لهندسة وتوظيف البروتينات العلاجية يفرز أو الببتيدات كما SERCaMPs كوسيلة لمرض تنظيم العلاج الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes Fisher  02-682-550
10% NP-40 solution  Pierce 28324 for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes Fisher 14-823-30
200 microliter filter tips Rainin RT-L200F
3-0 surgical sutures Fisher NC9598192
30 G needles Fisher Scientific 14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheets Thermo AB-0558
Alcohol prep pads Fisher 22-246-073
Anesthesia Auto Flow System E-Z Anesthesia EZ-AF9000
Animal recovery chamber Lyon Vet ICU-912-004
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Betadine solution Fisher NC9386574
Bleach Clorox n/a
Bovine growth serum Thermo SH30541.03
Coelenterazine, Native Regis Technologies 1-361204-200
Cotton tipped applicators Puritan 806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures WPI 501803
Digital ultrasconic cleaner Fisher Scientific FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate Life Technologies 10569-010
DNA mass ladder Life Technologies 10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein) Nanolight 321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) New England Biolabs E8023S 1:2,000 (WB)
Germinator 500 CellPoint Scientific DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque) Fisher 07-200-589
Hank's balanced salt solution Life Technologies 14175-095
Heparin Allmedtech 63323-276-02
Isoflurane Butler Schein 29404
Ketamine Henry Schein 995-2949
Kwik Stop Styptic powder Butler Schein 5867
L-glutamine Sigma G8540
Methanol Fisher a452-4
Microfuge 22R Centrifuge Bekman Colter 368831
Neosporin Fisher 19-898-143
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
Nikon Stereoscope Nikon SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup Machery-Nagel 740609
P200 pipet Rainin L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit Clontech 632200
PCR film seal Fisher AB0558
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
ReFresh Charcoal Filter canister E-Z Anesthesia EZ-258
Scalpel blades, #10 Fine Science tools Inc 10010-00
SD rats 150-200 g Charles River Rats rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags National Band and Tag co 1005-1
Sterile surgical drapes Braintree Scientific SP-MPS
Synergy 2 plate reader BioTek n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Thapsigargin Sigma T9033 harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix Life Technologies K4975-00
Xfect Transfection reagent Clontech 631318
Xylazine Valley Vet 468RX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426, (6968), 891-894 (2003).
  2. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, (3-4), 303-310 (2005).
  3. Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473, (7348), 528-531 (2011).
  4. Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10, (8), 763-773 (2010).
  5. Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (6), (2011).
  6. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, (3), 143-151 (2008).
  7. Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
  8. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (39), 16265-16270 (2011).
  9. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (50), 17404-17409 (2004).
  10. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  11. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, (4), 386-399 (2008).
  12. Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25, (18), 2828-2839 (2014).
  13. Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288, (6), 4209-4225 (2013).
  14. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130, (1), 305-310 (1969).
  15. Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21, (5), 282-287 (1985).
  16. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372, (1), 24-34 (2008).
  17. Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70, (6), 1024-1029 (1993).
  18. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, (4), 582-591 (2009).
  19. Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19, (4), 411-417 (2012).
  20. Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10, (26), 2105-2111 (2003).
  21. Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13, (6), 1085-1092 (2006).
  22. Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23, (6), 399-413 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics