एक का उपयोग जालिका कैल्शियम हेमोस्टेटिस निगरानी
1National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health
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Biology

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Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Yan, X., Harvey, B. K. Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP. J. Vis. Exp. (103), e53199, doi:10.3791/53199 (2015).

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Abstract

जालिका (ईआर) सांद्रता लगभग साइटोप्लास्मिक स्तर की तुलना में अधिक से अधिक 5,000 गुना साथ intracellular कैल्शियम के उच्चतम स्तर होते हैं। ईआर कैल्शियम पर कड़ा नियंत्रण प्रोटीन तह, संशोधन और तस्करी के लिए जरूरी है। ईआर कैल्शियम को अव्यवस्थाएं सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया, एक तीन शूल ईआर तनाव प्रतिक्रिया तंत्र की सक्रियता के परिणाम में, और रोगों की एक किस्म में रोगजनन के लिए योगदान कर सकते हैं। रोग की शुरुआत और प्रगति के दौरान ईआर कैल्शियम परिवर्तन नजर रखने की क्षमता व्यवहार में सिद्धांत रूप में महत्वपूर्ण है, अभी तक चुनौतीपूर्ण है। जैसे कैल्शियम निर्भर फ्लोरोसेंट रंगों और प्रोटीन के रूप में निगरानी ईआर कैल्शियम के लिए वर्तमान में उपलब्ध तरीकों, लेकिन इन उपकरणों में vivo अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं, कोशिकाओं में ईआर कैल्शियम की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हमारी प्रयोगशाला Gaussia luciferase की carboxy टर्मिनस के लिए एक संशोधन के जवाब में रिपोर्टर के स्राव प्रदान दिखा दिया है किईआर कैल्शियम की कमी। इन विट्रो के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों में एक luciferase आधारित, स्रावित ईआर कैल्शियम निगरानी प्रोटीन (SERCaMP) का उपयोग करने के लिए तरीकों के साथ साथ वर्णित हैं। यह वीडियो ईआर कैल्शियम के अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए यकृत इंजेक्शन, gluc-SERCaMP, रक्त संग्रह और प्रसंस्करण के औषधीय हेरफेर, और परख के मापदंडों पर प्रकाश डाला गया।

Introduction

जालिका (ईआर) एक संकेत प्रोटीन तह, प्रोटीन स्राव, लिपिड समस्थिति, और intracellular सहित कई सेलुलर क्षमताओं में कार्य करता है। सामान्य ईआर समारोह के लिए केन्द्रीय ~ 5,000 बार में ल्यूमिनल कैल्शियम की सांद्रता कोशिका द्रव्य 2-4 में पाए जाने वाले को बनाए रखते है। यह ऊर्जा गहन प्रक्रिया SARCO / जालिका कैल्शियम ATPase (SERCA), ईआर में कैल्शियम आयनों चलता है कि एक पंप द्वारा नियंत्रित किया जाता है। ईआर से कैल्शियम की तपका मुख्य रूप से ryanodine (RYR) और inositol ट्रायफ़ोस्फेट (IP3R) रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता है। कई ईआर प्रक्रियाओं कैल्शियम पर निर्भर होते हैं, क्योंकि दुकान में खलल न डालें ईआर तनाव और अंततः सेल मौत हो सकती है।

ईआर कैल्शियम अनियंत्रण, कार्डियोमायोपैथी, मधुमेह सहित अल्जाइमर रोग में देखा गया है, और पार्किंसंस 5। इन रोगों के प्रगतिशील प्रकृति के कारण, यह कारण प्रभाव फिर से चित्रित करने के लिए चुनौती रहा हैईआर कैल्शियम की दुकान में रोगजनन और परिवर्तन के बीच संबंधों। प्रौद्योगिकियों के एक नंबर के रंगों और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIS) सहित ईआर कैल्शियम गतिशीलता, के बारे में हमारी समझ में उल्लेखनीय प्रगति के लिए अनुमति दी है। सीए 2 के लिए बाध्य जब प्रतिदीप्ति में वृद्धि, जो कम आत्मीयता कैल्शियम रंजक, कैल्शियम 6 की उच्च सांद्रता के साथ subcellular डिब्बों की जांच करने के लिए कोशिकाओं में लोड किया जा सकता है। ऐसे D1ER और पकड़ने के रूप में GECIS, subcellular स्थानीयकरण 7-9 से और अधिक सटीक नियंत्रण के साथ कैल्शियम उतार चढ़ाव की निगरानी के लिए अनुमति देते हैं। हाल ही में, GECIS का एक अन्य वर्ग कहा जाता कैल्शियम मापने organelle-फँस प्रोटीन संकेतक (Cepia) 10 वर्णित किया गया है। आनुवंशिकी और संयोजन के लिए एक तीसरा दृष्टिकोण छोटे अणु रसायन शास्त्र है लक्षित-esterase डाई लोड हो रहा है एक एस्टर आधारित कैल्शियम डाई 11 के साथ (ईआर के लिए लक्षित) एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग carboxylesterase इस्तेमाल करता है जो (टेड),।

Afor जबकिementioned दृष्टिकोण वे प्रतिदीप्ति की तीव्र माप के माध्यम से ईआर कैल्शियम की गतिशीलता में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं, निहित शक्तियों और कमजोरियों है। उन्होंने, हालांकि, अक्सर रोग प्रगति की जांच के लिए आवश्यक अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं। समय की विस्तारित अवधि में कैल्शियम की गतिशीलता पर नजर रखने के लिए एक विधि तैयार करने के लक्ष्य के साथ, हम पहचान और स्रावित ईआर कैल्शियम की निगरानी प्रोटीन (SERCaMPs) 12 बनाने के लिए एक प्रोटीन संशोधन विकसित की है।

SERCaMP बार-बार ईआर कैल्शियम की दुकान से पूछताछ करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करके, अन्य तरीकों के साथ जुड़े कई सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न। हम पहले carboxy टर्मिनल पेप्टाइड ASARTDL (एलनाइन-सेरीन-एलनाइन-arginine-threonine एसपारटिक एसिड ल्यूसिन) ईआर अवधारण को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त है कि प्रदर्शन किया है; हालांकि, ईआर कैल्शियम में घटने का कारण है कि शर्तों के तहत, पेप्टाइड अनुक्रम नहीं रह ईआर localizatio बनाए रखने में सक्षम हैn और प्रोटीन 13 स्रावित होता है। SERCaMP प्रौद्योगिकी के आधार एक स्रावित प्रोटीन की carboxy टर्मिनस स्राव इस प्रकार ईआर कैल्शियम अनियंत्रण 12 के एक मजबूत रिपोर्टर बनाने, ईआर कैल्शियम की कमी से शुरू हो रहा है कि इस तरह के (जैसे Gaussia luciferase, या gluc) को ASARTDL के उपांग है। ट्रांसजेनिक विधियों के माध्यम से gluc-SERCaMP की अभिव्यक्ति ईआर कैल्शियम homeostasis के एक संकेत के रूप gluc गतिविधि में परिवर्तन के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से और प्लाज्मा सहित जैविक तरल पदार्थ में सक्षम बनाता है। विधि इन विट्रो और इन विवो में दोनों ईआर कैल्शियम की दुकान में प्रगतिशील परिवर्तन के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए आवेदन किया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईआर कैल्शियम homeostasis को अध्ययन करने के लिए gluc आधारित SERCaMP प्रयोग करने के लिए एक सामान्य रूपरेखा के रूप में लिखा गया है, लेकिन प्रोटोकॉल विकल्प संवाददाता SERCaMPs के लिए एक गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं।

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Protocol

इन विट्रो परख में: 1. एक स्थिर एसएच SY5Y सेल लाइन से पता लगाने SERCaMP रिलीज

  1. प्लेट एसएच SY5Y-gluc-ASARTDL (SERCaMP) टिशू कल्चर में सतह क्षेत्र के 2 सेमी प्रति 150,000 कोशिकाओं पर प्लेटों का इलाज किया। 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, उदाहरण के लिए, 50,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए) बीज। DMEM में (उच्च ग्लूकोज, GlutaMAX, पाइरूवेट) + 10% गोजातीय वृद्धि सीरम + 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एसएच SY5Y कोशिकाओं को विकसित।
    1. 15 बार (चित्रा 1 बी) तक पारित होने कोशिकाओं। उच्चतर बीतने संख्या परीक्षण नहीं किया गया।
    2. 5.5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें और रातोंरात सेते हैं।
  2. प्रयोगात्मक उपचार (एस) से पहले, अच्छी तरह से एक अपारदर्शी संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 5 μl हस्तांतरण से प्रत्येक के लिए एक आधारभूत नमूना इकट्ठा 96 अच्छी तरह से थाली घिरी। इकट्ठा करने से पहले, धीरे सभी पक्षों पर थाली नल और ढाल प्रभाव से बचने के लिए ज़ुल्फ़। एक चिपकने के साथ अपारदर्शी थाली सीलएंजाइमी परख के समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ईलिंग चादर और दुकान।
    नोट: स्रावित gluc-SERCaMP सेल संस्कृति माध्यम में बहुत स्थिर है। हम पहले gluc गतिविधि के लगभग 5-10% (एसएच SY5Y कोशिकाओं पर incubated) 37 डिग्री सेल्सियस से 12 में एक 72 घंटा ऊष्मायन के बाद खो गया था की सूचना दी।
  3. ईआर कैल्शियम की कमी की जांच करने के लिए वांछित के रूप में (जैसे पर्यावरण, pharmacologic, आनुवंशिक जोड़तोड़) कोशिकाओं को समझो। तेजी से वायुमंडलीय सीओ 2 में घटित होगा पीएच परिवर्तन के रूप में (नियंत्रित इनक्यूबेटर के बाहर) परिवेश में पर्यावरण के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचें। लंबे समय तक जोड़तोड़ आवश्यक हैं, पीएच 14 को स्थिर करने के लिए, 20 मिमी पर संस्कृति के माध्यम से HEPES जोड़ें। संस्कृति के माध्यम से 15 में HEPES का उपयोग करते समय प्रकाश के संपर्क से बचें।
    1. सकारात्मक नियंत्रण: एसएच SY5Y कोशिकाओं में प्रयोगों के लिए 4-6 घंटे के लिए 100 एनएम thapsigargin (टीजी) या 50 माइक्रोन cyclopiazonic एसिड (सीपीए) के साथ कोशिकाओं को समझो। अन्य सेल लाइनों में अधिक से अधिक प्रतिक्रिया अब incubations या अलग ध्यान केंद्रित आवश्यकता हो सकती हैयौगिकों के trations।
    2. नकारात्मक नियंत्रण: पैतृक एसएच SY5Y कोशिकाओं से एकत्र संस्कृति के माध्यम से। हमारे अनुभव में, इस परख के लिए पृष्ठभूमि luminescence स्थिर एसएच SY5Y-gluc-SERCaMP कोशिकाओं से बेसल स्राव के कम से कम 0.05% है।
  4. 1.2 चरण में उल्लिखित के रूप में, वांछित timepoints पर लीजिए और वातानुकूलित मीडिया की दुकान 5 μl नमूने हैं।
  5. धारा 5 में उल्लिखित के रूप में मध्यम में enzymatic गतिविधि का आकलन करें।
  6. Immunoblot या luminescence परख द्वारा इंट्रासेल्युलर gluc जांच करते हैं।
    1. 50 मिमी Tris (7.4 पीएच), 150 मिमी NaCl, 0.25% सोडियम deoxycholate, 1 मिमी EDTA, 1% NP40 युक्त संशोधित RIPA बफर में ल्य्से कोशिकाओं, और प्रोटीज अवरोधकों: immunoblot लिए। 0.20 माइक्रोन PVDF झिल्ली के लिए एसडीएस polyacrylamide जेल और हस्तांतरण पर अलग। (: 2,000 कमजोर पड़ने 1) 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर gluc एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं। पसंद का पता लगाने अभिकर्मक के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित प्रोटोकॉल के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन और झिल्ली washes के प्रदर्शन करना।
    2. के लिएluminescence परख (चित्रा 2): बर्फ पर निम्न चरणों का पालन:
      1. टिशू कल्चर प्लेट के कुओं से सभी के माध्यम से निकालें और ठंड पीबीएस के 200 μl से कुल्ला।
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 मिमी Tris (7.5 पीएच), 150 मिमी NaCl, 1% NP40 युक्त lysis बफर और प्रोटीज अवरोधकों के 75 μl जोड़ें।
      3. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन (120 आरपीएम) पर थाली घुमाएँ।
      4. धीरे ऊपर और, एक multichannel pipettor का उपयोग हवा के बुलबुले से बचने के नीचे lysate विंदुक। एक अपारदर्शी थाली करने के लिए lysate के 5 μl स्थानांतरण और धारा 5 में उल्लिखित के रूप में चमक का आकलन करें।

इन विट्रो परख में 2.: SERCaMP साथ अमर कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक

नोट: हम क्षणिक अभिकर्मक प्रक्रियाओं सेलुलर तनाव प्रेरित और बाद gluc-SERCaMP प्रतिक्रिया को कुंद कर सकते हैं कि मनाया गया है। निम्नलिखित दृष्टिकोण अभिकर्मक eff कम करने के लिए विकसित किया गया था एसएच SY5Y कोशिकाओं में ECTS। वैकल्पिक सेल लाइनों के लिए (अभिकर्मक अभिकर्मक के चुनाव सहित) इस प्रक्रिया के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। जब संभव हो, यह क्रमश: धारा 1 और 3 में उल्लिखित स्थिर सेल लाइनों या वायरल पारगमन तरीकों का उपयोग करने की सिफारिश की है।

  1. 4 x 10 6 कोशिकाओं में एक 100 मिमी पकवान में प्लेट एसएच SY5Y कोशिकाओं। यह पकवान अभिकर्मक प्रक्रिया के बाद लगभग 300 कुओं (96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप) फिर से बीज के लिए पर्याप्त होगा।
  2. Xfect प्लास्मिड डीएनए के 20 माइक्रोग्राम (एन्कोडिंग gluc-SERCaMP) का उपयोग अभिकर्मक और Xfect अभिकर्मक के 6 μl साथ Transfect कोशिकाओं। बड़ा हो या छोटा संस्कृति वाहिकाओं के लिए तदनुसार स्केल डीएनए और Xfect अभिकर्मक।
  3. 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें।
  4. कोशिकाओं Trypsinize और अच्छी तरह से प्रति 60,000 कोशिकाओं में 96 अच्छी तरह प्लेटें reseed। धारा 1 में उल्लिखित बाद के चरणों का पालन करें।

इन विट्रो परख में 3: के वायरल वेक्टर की मध्यस्थता अभिव्यक्ति gluc-SERCaMP

तम्बू "> नोट: एडिनो जुड़े वायरल (एएवी) वेक्टर पैकेजिंग 16 और शुद्धि 12 और lentivirus उत्पादन 13 पहले से सूचित किया गया है।

  1. अनुमापांक gluc-SERCaMP एएवी निम्नलिखित प्राइमरों और जांच का उपयोग: आगे प्राइमर, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT -3 '; रिवर्स प्राइमर, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG -3 '; जांच (5'-6-परिवार / 3'-BHQ -1 लेबल) मात्रात्मक पीसीआर के लिए, 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC -3 '।
    1. Gluc युक्त एक प्लाज्मिड linearizing और एक स्पिन स्तंभ (जैसे Machery-नागेल NucleoSpin जेल और पीसीआर सफाई) का उपयोग डीएनए शुद्ध द्वारा मानक वक्र तैयार करें। एक बड़े पैमाने पर सीढ़ी के बगल में एक agarose जेल पर अलग से डीएनए quantitate। पीबीएस में 10 FG / एमएल एमएल 100 स्नातकोत्तर / से डीएनए के 1:10 dilutions तैयार करें। प्लाज्मिड की आणविक वजन के आधार पर सांद्रता में से प्रत्येक में gluc प्लास्मिड डीएनए की प्रतियां / एमएल की गणना।
    2. पीबीएस में एएवी शेयरों पतला (उपयुक्त कमजोर पड़ने पर निर्भर हो जाएगावायरल तैयारी के मापदंडों और) अनुभव से निर्धारित।
    3. 94 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड ×, 95 डिग्री सेल्सियस × 5 मिनट, और 41 चक्र के लिए 60 डिग्री सेल्सियस × 1 मिनट: निम्न शर्तों का उपयोग एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएँ। एमएल मानक वक्र का उपयोग / प्रतियों की गणना।
  2. एक पी 24 Lenti एक्स तेजी अनुमापांक किट के साथ अनुमापांक lentivirus। बर्फ पर lentiviral aliquots गला लें और एसएच SY5Y माध्यम में पी 24 नियंत्रण प्रोटीन पतला।
    1. यह मानक वक्र (: 20,000 या 1: 100,000 जैसे 1) पर गिर जाएगी कि इस तरह के lentivirus पतला। आवश्यक कमजोर पड़ने कारक lentiviral तैयारी मापदंडों के आधार पर अलग अलग होंगे और अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। बाद के सभी चरणों के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  3. 96 अच्छी तरह प्लेटें प्लेट कोशिकाओं। एसएच SY5Y कोशिकाओं के लिए, धारा 1 में उल्लिखित चढ़ाना प्रक्रियाओं का पालन किया जा सकता है। चूहे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के लिए, कोशिकाओं को अलग किया और उचित रूप से लेपित प्लेटें एक पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिएएस पहले 16 में वर्णित है। 1x B27 और 500 माइक्रोन एल glutamine के साथ पूरक Neurobasal माध्यम में चूहे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स को बनाए रखें। हर दूसरे दिन आधे मध्यम एक्सचेंजों को पूरा करें।
  4. वायरस के साथ कोशिकाओं transduce। Gaussia luciferase मजबूत संकेत देता है के रूप में वायरल पारगमन का लक्ष्य है, कम स्तर अभिव्यक्ति को प्राप्त है।
    1. एएवी पारगमन एसएच SY5Y कोशिकाओं: चढ़ाना अगले दिन transduce। एएवी कमजोर पड़ने बफर (पीबीएस + 0.5 मिमी 2 MgCl) में 6.0 10 x 7 वी.जी. / μl को एएवी पतला। (; लगभग 6000 के MOI 3.0 x 10 8 वी.जी.) 96 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 3) के प्रति अच्छी तरह पतला एएवी के 5 μl जोड़ें। वायरल वेक्टर अपशिष्ट निष्क्रिय करने के लिए 10% ब्लीच का प्रयोग करें।
    2. चूहे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स की एएवी पारगमन: चढ़ाना के बाद 6-8 दिनों transduce। एएवी कमजोर पड़ने बफर में 4.0 एक्स 10 6 वी.जी. / μl को एएवी पतला। पतला एएवी के 5 μl जोड़ें (2.0 10 x 7 वी.जी.; MOI के लगभग 350 में से) की अच्छी तरह से प्रति96 अच्छी तरह से थाली (3B चित्रा)। इष्टतम MOI के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। वायरल वेक्टर अपशिष्ट निष्क्रिय करने के लिए 10% ब्लीच का प्रयोग करें।
    3. एसएच SY5Y कोशिकाओं के lentiviral पारगमन: चढ़ाना अगले दिन transduce। हांक संतुलित नमक के घोल में (एकाग्रता titering के किट का उपयोग निर्धारित) 20 स्नातकोत्तर / μl पी 24 के लिए lentivirus पतला। 100 μl मात्रा युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली की (1,250,000 lentiviral कणों के बराबर पी 24 के 100 पीजी, या ~ 1,250 IFUs) प्रति अच्छी तरह पतला वायरस की 5μl जोड़ें। बड़े प्रारूपों के लिए तदनुसार पैमाने। वायरल अपशिष्ट निष्क्रिय करने के लिए 10% ब्लीच का प्रयोग करें।
  5. माध्यम की एक पूर्व उपचार नमूना ले लीजिए और प्रयोगात्मक उपचार 48 घंटा (एसएच SY5Y) या पारगमन के बाद 5-7 दिन (चूहा प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स) शुरू करते हैं।

विवो SERCaMP परख में 4.

नोट: किसी भी पशु प्रक्रियाओं अपनी संस्था के माध्यम से उचित अनुमोदन प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित किया जाना आयोजित करने से पहले। सबअस्तित्व सर्जरी पर्याप्त संज्ञाहरण के साथ बाँझ शर्तों के तहत किया जा रहे हैं। नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और एनआईएच ACUC दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया है।

  1. आटोक्लेव सर्जिकल उपकरणों सर्जरी की शुरुआत से पहले (121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट नसबंदी, 20 मिनट शुष्क समय)। तुरंत सभी प्रक्रियाओं और पूर्व वाष्पदावी करने के बाद एक ultrasonicator में सभी उपकरणों को साफ करें। अस्तित्व सर्जरी के दौरान बाँझ शर्तों को बनाए रखें। कई जानवरों की आवश्यकता होती है सर्जरी के लिए, 70% शराब, ultrasonicate और मनका चूहों के बीच बाँझ साथ सर्जिकल उपकरणों पोंछे। आवश्यक उपकरणों के लिए सामग्री सूची को देखें।
  2. सर्जरी के लिए चूहा तैयार करें। यहाँ हम पुरुष Sprague-Dawley (180-200 ग्राम) का उपयोग करें।
    1. Xylazine (8 मिलीग्राम / किग्रा) और ketamine (/ किलो 80 मिलीग्राम) के intraperitoneal इंजेक्शन के बाद 3 मिनट (4-5% Isoflurane 1,000 सीसी / मिनट पर दिया) के लिए गैस isoflurane का उपयोग चूहों anesthetize। बाहर सुखाने से कॉर्निया की रक्षा के लिए नेत्र मरहम लागू करें। बीपूंछ या पैर चुटकी निम्नलिखित वापसी पलटा के अभाव के कारण प्रदर्शन के रूप में चूहे एक बार egin सर्जरी गहरा anesthetized है।
    2. थोड़ा मध्य पेट क्षेत्र को पसलियों (कम वक्ष क्षेत्र) से नीचे पेट के क्षेत्र दाढ़ी। शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में 70% शराब और betadine रगडें बारी में तीन बार, साफ़। बाँझ सर्जिकल पर्दे के साथ बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर लापरवाह स्थिति में चूहे रखें।
  3. 7.6 एक्स 10 9 वी.जी. / एमएल (अंतिम एकाग्रता) को एएवी-gluc-SERCaMP पतला। Inverting ट्यूब द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: वायरल एकाग्रता की रेंज (चित्रा 4) अलग-अलग हो सकते हैं।
    1. Pipet एक बाँझ डिश में पतला एएवी के 105 μl। एक सिरिंज में वायरस इकट्ठा करने के लिए एक 30 गेज सुई का प्रयोग करें।
  4. एएवी-gluc-SERCaMP जिगर बेनकाब और इंजेक्षन करने के लिए सर्जरी प्रदर्शन।
    1. पहले पेट में एक चीरा बनाने के लिए, चीरा क्षेत्र के लिए 0.25% Bupivacaine लागू होते हैं। एक छुरी का उपयोग करना, रिब पिंजरे के नीचे एक क्षैतिज चीरा (एपी बनानेproximately 2-3 सेमी)। हाइपोडर्मिस से संयोजी ऊतक अलग करने के लिए काटना कुंद।
    2. जिगर की सही औसत दर्जे का पालि उजागर, पेट की मांसपेशियों में कटौती।
      नोट: अतिरिक्त पालियों अंत आवेदन के आधार पर इंजेक्ट किया जा सकता है।
    3. सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत पशु प्लेस और देखने के क्षेत्र में जिगर की सही औसत दर्जे का पालि पाने के लिए समायोजित करें। औसत दर्जे का पालि की पैरेन्काइमा में वायरस इंजेक्षन; 3 अलग साइटों, साइट के अनुसार लगभग 33 μl।
      नोट: पूरे इंजेक्शन की मात्रा का वितरण सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन के बाद 5-10 सेकंड के लिए ऊतक में सुई छोड़ दें।
    4. अलग से पेट की मांसपेशियों और त्वचा सिवनी और कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर Neosporin जोड़ें। होश आ गया और चूहे ईमानदार स्थिति बनाए रखने में सक्षम है, जब तक एक वसूली कक्ष में चूहे रखें। यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक चूहे (एस) पहुंच से बाहर मत छोड़ो। हाउस अकेले चीरा चंगा किया है और जब तक टांके (7-14 दिन) हटा दिया गया है।
  5. 4-7 दिनों के इंजेक्शन के बाद पूंछ रक्त संग्रह शुरू करते हैं। लेबलिंग और पूर्व वजन द्वारा रक्त संग्रह ट्यूब तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब 50 μl हेपरिन (1,000 यू / एमएल) जोड़ें।
  6. (1,000 सीसी / मिनट पर दिया 4-5% isoflurane) 3 मिनट के लिए isoflurane संज्ञाहरण कक्ष में रखें चूहा। (500 सीसी / मिनट पर दिया 2-3% isoflurane) नाक शंकु में चैम्बर और जगह से चूहे निकालें। पूंछ गड़बड़ी के बाद वापसी पलटा के अभाव के कारण प्रदर्शन के रूप में रक्त संग्रह चूहे गहरा anesthetized है एक बार शुरू कर सकते हैंएनसीएच।
    1. बाँझ कैंची पूंछ (1-2 मिमी) की कटौती टिप का उपयोग करना है और पहले से भरे हेपरिन ट्यूब में बूंद के लिहाज से रक्त एकत्र। हेपरिन अनुपात (> 100 μl रक्त / 50 μl हेपरिन) के लिए एक रक्त: मात्रा अधिक से अधिक 2 से पहुंचता है जब तक खून ले लीजिए। रक्त संग्रह की मात्रा प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। रक्तस्राव को रोकने के पूंछ को कसैला पाउडर लागू करने के लिए एक गीला कपास applicator का उपयोग करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर रक्त नलियों बाद के नमूने इकट्ठा करने हैं। संग्रह के बीच बाँझ इथेनॉल पैड और मनका के साथ कैंची साफ कर लें।
    3. संग्रह ट्यूब वजन और 2 को प्राप्त करने के लिए हेपरिन के साथ समायोजित: 1 के अनुपात (रक्त: हेपरिन)। यह कदम प्रत्येक नमूना (तालिका 1) में हेपरिन की राशि मानक के अनुसार होगा।
    4. अपकेंद्रित्र ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर। Luciferase परख (धारा 5) के समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ताजा ट्यूब और स्टोर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला (प्लाज्मा) स्थानांतरण।
      नोट: 72 घंटा के लिए ऊपर से पहले एंजाइमी परख करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की भंडारण मीटर हैluminescence (चित्रा 5 ए) पर inimal प्रभाव। प्लाज्मा नमूनों में से 3 के लिए ऊपर फ्रीज पिघलना चक्र luminescence पर कोई प्रभाव (चित्रा 5 ब) है।
  7. Thapsigargin प्रशासन (सकारात्मक नियंत्रण):
    1. 2.5 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए इथेनॉल में गिराए द्वारा thapsigargin तैयार करें। पेट के निचले हिस्से में 1 मिलीग्राम / किग्रा आईपी पर thapsigargin इंजेक्षन।
      नोट: thapsigargin थ्रोम्बिन प्रेरित प्लेटलेट जमावट 17 बढ़ता है और अधिक कठिन पूंछ से रक्त संग्रह कर सकते हैं।
  8. Gaussia luciferase परख:
    1. बर्फ पर प्लाज्मा नमूनों गला लें।
      अनुदैर्ध्य अध्ययन, पिघलना के लिए और (सब्सट्रेट के एकल तैयारी का उपयोग) एक ही दिन में सभी timepoint नमूने के लिए luminescence परख प्रदर्शन: ध्यान दें।
    2. एक अपारदर्शी घिरी थाली पर स्थानांतरण प्लाज्मा के 10 μl और खंड में प्रत्येक प्लाज्मा नमूना 5. भागो 3-4 तकनीकी प्रतिकृति के रूप में वर्णित enzymatic गतिविधि को मापने।
  9. Euthanasiए
    नोट: SERCaMP प्रौद्योगिकी का लाभ मॉनिटर ईआर कैल्शियम Longitudinally करने की क्षमता है। प्रयोगात्मक मानकों और समापन बिंदु का विश्लेषण करती है पर निर्भर करता है, जानवरों समापन बिंदु विश्लेषण के लिए उचित और संस्थागत ACUC दिशा निर्देशों के अनुसार उपायों द्वारा euthanized जा रहे हैं।

5. Luminescence परख

  1. 20 मिमी के लिए (मेथनॉल के 3 मिलीग्राम के लिए 10 एन एचसीएल के 30 μl) अम्लीय मेथनॉल में यौगिक गिराए द्वारा coelenterazine (CTZ) शेयर समाधान तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर एकल उपयोग aliquots और दुकान तैयार करें।
  2. परख के दिन पर काम कर सब्सट्रेट तैयार करें।
    1. इन विट्रो assays के लिए, उदाहरण के लिए, पीबीएस में 8 माइक्रोन के लिए coelenterazine पतला पीबीएस के 25 एमएल के लिए 20 मिमी CTZ शेयर के 10 μl जोड़ने (चित्रा 6A, बी)।
    2. इन विवो assays के लिए, पीबीएस में 100 माइक्रोन, 500 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, 5 मिमी NaCl को coelenterazine पतला।
  3. कम से कम 30 मिनट के लिए तैयार CTZ सेतेपरख की शुरुआत से पहले कमरे के तापमान पर।
    नोट: तैयारी के बाद पहले 30 मिनट के दौरान तेजी से सब्सट्रेट क्षय की खबरें हैं, क्योंकि यह कदम अक्सर Gaussia luciferase assays में शामिल किया गया है। हम हमारी प्रणाली (चित्रा 6C) में इस आशय नहीं मनाया है; हम परख पर कोई नकारात्मक प्रभाव पाया है लेकिन, जैसा कि हम अक्सर ऊष्मायन कदम शामिल हैं।
  4. निगरानी bioluminescence में सक्षम है और एक सब्सट्रेट इंजेक्टर से लैस है कि एक प्लेट रीडर का उपयोग। सब्सट्रेट के साथ प्रधानमंत्री लाइनों।
    नोट: लाइनों के माध्यम से प्रारंभिक सब्सट्रेट गिरावट होने का खतरा हो सकता है। जल्दी नमूने के लिए कृत्रिम रूप से कम रीडिंग से बचने के लिए प्रयोगात्मक नमूने मापने से पहले (रीडर पर एक खाली प्लेट लोड हो रहा है) 20-30 खाली कुओं इंजेक्षन।
  5. , कुएं में सब्सट्रेट के 100 μl इंजेक्षन 5 सेकंड के लिए मध्यम गति हिला, और प्रकाश उत्सर्जन को मापने। बायोटेक सिनर्जी द्वितीय प्लेट पाठक के लिए, में (0.5 सेकंड से अधिक (इन विट्रो नमूने) और 5 सेकंड के प्रकाश उत्सर्जन एकीकृतपढ़ें कदम के लिए विवो नमूने)। आदर्श परख प्रदर्शन के लिए प्लेट पाठक मापदंडों का अनुकूलन।
    नोट: (अन्य luciferases के साथ मनाया कैनेटीक्स चमक की तुलना में) तेजी से संकेत क्षय के साथ Gaussia luciferase दर्शाती फ्लैश कैनेटीक्स। gluc के फ़्लैश कैनेटीक्स नमूने भर में मध्यम रचना के लिए नियंत्रित करने के महत्व पर प्रकाश डाला, सेल संस्कृति के माध्यम से (चित्रा 7A) में सीरम से प्रभावित है। कारण सब्सट्रेट (फ्लैश कैनेटीक्स) जोड़ने के बाद luminescence के तेजी से क्षय, सुई और सभी नमूनों के लिए समान होना चाहिए कदम पढ़ा के बीच के समय को। प्लेट पाठक (हम एक 5 सेकंड हिला कदम का उपयोग उदाहरण के लिए), और कहा कि अच्छी तरह से पढ़ एक निश्चित समय तक इंतजार, एक अच्छी तरह से करने के लिए सब्सट्रेट इंजेक्षन करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। सब्सट्रेट एक साथ सभी कुओं में जोड़ा जा सकता है, जब तक पढ़ने से पहले एक पूरी थाली के लिए सब्सट्रेट जोड़ना एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है। एक इंजेक्टर उपलब्ध नहीं है, तो इस मुद्दे को आंशिक रूप से सब्सट्रेट addi के बीच 10 मिनट के लिए थाली incubating द्वारा धोखा दिया जा सकतामोर्चे और माप (चित्रा 7B) (इस प्रकार क्षय वक्र की खड़ी हिस्सा परहेज)।
  6. , इंजेक्शन दोहराएँ समय प्रतीक्षा करें, और अच्छी तरह से थाली पर प्रत्येक के लिए कदम पढ़ा।

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Representative Results

Gluc-SERCaMP विधि बाह्य तरल पदार्थ के नमूने से ईआर कैल्शियम homeostasis के आकलन के लिए अनुमति देता है। कई नियंत्रण परिणामों की व्याख्या को बढ़ाने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल किया जा सकता है। सबसे पहले, (सी टर्मिनल ASARTDL या "gluc-कोई टैग" बिना जैसे gluc) एक अनिवार्यता से स्रावी रिपोर्टर के उपयोग स्रावी मार्ग (ग्लोबल सेलुलर स्राव) और transgene अभिव्यक्ति पर प्रयोगात्मक उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, gluc-SERCaMP और gluc-कोई टैग दोनों के बाह्य स्तर में वृद्धि के एक अस्पष्ट परिणाम पर विचार किया जाएगा। वैकल्पिक रूप से, gluc-कोई टैग प्रतिक्रिया की इसी कमी के साथ gluc-SERCaMP स्राव में वृद्धि का एक ईआर कैल्शियम निर्भर घटना (चित्रा 8) का समर्थन करता है। सेल की आवश्यकता है के रूप में यह एक एकल timepoint तक सीमित है, हालांकि ईआर कैल्शियम की कमी के जवाब में gluc-SERCaMP का स्राव आगे, इंट्रासेल्युलर gluc को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इंट (प्रत्येक व्यक्ति के लिए अच्छी तरह से गणना) इंट्रासेल्युलर अनुपात (चित्रा 2 बी) में वृद्धि होगी: यह उत्तरोत्तर स्रावित होता है के रूप में racellular gluc-SERCaMP, ईआर कैल्शियम की कमी के जवाब में कमी होगी, और बाह्य। कोशिकी: इंट्रासेल्युलर अनुपात transgene अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए नियंत्रित करने के लिए उपयोगी है।

ईआर कैल्शियम की दुकान के Pharmacologic माड्युलेटर्स उपन्यास मानदंड में SERCaMP रिहाई के लिए ईआर कैल्शियम का योगदान पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। Dantrolene, एक RYR प्रतिपक्षी, कम करने या टीजी (चित्रा 8B) के जवाब में SERCaMP की रिहाई रोकना चाहिए, जो ईआर कैल्शियम, स्थिर करने के लिए जाना जाता है। यह ईआर कैल्शियम प्रवाह (जैसे Xestospongin सी, 4-क्लोरो-M-cresol) SERCaMP रोजगार उपन्यास प्रयोगात्मक मानदंड में प्रभावित करने वाले अतिरिक्त यौगिकों का परीक्षण करने के लिए, जब भी संभव हो, की सिफारिश की है। इन अध्ययनों से अक्सर विवो में चुनौती दे रहे हैं, लेकिन टिशू कल्चर मॉडल इसी में संभव हो सकता है।

"> Gluc आधारित SERCaMP का उपयोग कर इन विट्रो अध्ययन के लिए, नियंत्रण (एस) के सापेक्ष व्यक्तिगत प्लेटों पर प्रतिक्रियाओं की गणना करने के लिए सिफारिश की है। 'उपचार प्रेरित' प्रतिक्रिया (नियंत्रण बनाम रिश्तेदार प्रतिक्रिया में परिवर्तन पर नज़र रखने से timecourse पर मूल्यांकन किया जा सकता है बीच-प्लेट से तुलना)। यह। timepoints (चित्रा 6C) के बीच कच्चे मूल्यों में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो सब्सट्रेट के क्षय के कारण एक प्लेट के भीतर रिश्तेदार तुलना करना, कई प्लेटें भर में कच्चे संख्या की तुलना करने के लिए उचित नहीं है के लिए इस आशय को कम करता है (चित्रा 6D)। इन विट्रो टीजी प्रेरित SERCaMP रिहाई के प्रयोग के लिए डेटा विश्लेषण का एक उदाहरण 9 चित्रा में प्रस्तुत किया है।

Gluc-SERCaMP का उपयोग कर इन विवो पढ़ाई के लिए, डेटा अपने 'पूर्व उपचार' नियंत्रण के रूप में सेवारत हर जानवर के साथ, प्रत्येक जानवर के लिए स्वतंत्र रूप से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। इस ट्रांस्जीन डेल में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में करने के लिए आवश्यक हैivery और जानवरों (चित्रा -4 ए) के बीच अभिव्यक्ति।

SERCaMP प्रतिक्रियाओं की भयावहता कोशिकाओं के आधारभूत स्वास्थ्य से संबंधित हैं और सीधे अन्वेषक द्वारा नियंत्रित किया जा सकता, जिनमें से कई कारकों की एक किस्म से प्रभावित हो जाएगा। अधिक से अधिक SERCaMP जवाबदेही के लिए, यह बेसल ईआर कैल्शियम हेमोस्टेटिस पक्ष में है कि शर्तों का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है। इस बोने कोशिकाओं इष्टतम घनत्व और कम वायरल titers का उपयोग कर भी शामिल है। अलग सेल और ऊतक प्रकार के अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए जो अतिरिक्त आवश्यकताओं, हो सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। स्थिर एसएच SY5Y सेल लाइन बोने घनत्व और बीतने संख्या विचार (ए) एसएच SY5Y-gluc-SERCaMP कोशिकाओं विभिन्न घनत्व पर वरीयता प्राप्त और 40 घंटे के लिए incubated रहे थे। स्रावित gluc-SERCaMP 300 एनएम टीजी ओ के साथ उपचार के बाद 4 घंटा मापा गया थाआर वाहन नियंत्रण (एसडी ± मतलब, एन = 6)। Gluc-SERCaMP स्राव में thapsigargin प्रेरित वृद्धि प्रत्येक कोशिका घनत्व के लिए संकेत दिया है। बीतने संख्या 2 और 15 (बी) एसएच SY5Y-gluc-SERCaMP कोशिकाओं thapsigargin प्रेरित स्राव के लिए जांच की गई। प्रकोष्ठों 2 घंटा या 4 घंटे के लिए 100 एनएम टीजी साथ इलाज किया गया है, और वाहन में इलाज नियंत्रण करने के लिए स्रावित gluc गतिविधि सामान्यीकृत था (एसडी ± मतलब, एन = 4, पारित होने के कारक की कोई महत्वपूर्ण प्रभाव, 2-तरह एनोवा)। धराशायी लाइन Y 1. = इंगित करता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। इंट्रासेल्युलर gluc-SERCaMP की माप के लिए एंजाइमी परख (ए) intracellular और (बी) के बाह्य gluc enzymatic गतिविधि चूहे प्राथमिक भ्रष्टाचार में मूल्यांकन किया गया था(एएवी-gluc-SERCaMP साथ transduced) राजनैतिक न्यूरॉन्स। छ: दिन पारगमन के बाद, कोशिकाओं 4 घंटे के लिए 60 एनएम thapsigargin के साथ इलाज किया गया। Gluc-ASARTDL माध्यम में जम जाता है, intracellular स्तर में इसी घटने मनाया जाता है। (सी) कोशिकी का एक अनुपात: इंट्रासेल्युलर gluc गतिविधि प्रत्येक व्यक्ति के लिए अच्छी तरह से गणना की जा सकती है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। एसएच SY5Y कोशिकाओं और प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स चूहे के लिए thapsigargin प्रेरित प्रतिक्रिया बनाम एएवी-gluc-ASARTDL अनुमापांक (ए) एसएच SY5Y कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं में 96 अच्छी तरह से प्लेट में वरीयता प्राप्त और पालन करने के लिए अनुमति दी गई थी रात भर। प्रकोष्ठों 48 घंटे के लिए incubated और फिर 300 एनएम टीजी या वाहन के साथ इलाज किया, संक्रमण का संकेत बहुलता (MOI) पर transduced थे। Luminescence 8 घंटे के बाद मध्यम में मापा जाता है (मतलब ± SEM, एन = 3) था। * पी <0.05, एमयूएलtiple टी परीक्षण (होल्म-Sidak सुधार)। (बी) चूहा प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स (पारगमन के समय में अच्छी तरह से सन्निकटन प्रति 60,000 कोशिकाओं का उपयोग गणना) संकेत दिया MOI में एएवी-gluc-ASARTDL साथ DIV8 पर transduced थे। (एन =, मतलब ± SEM 6) पांच दिन पारगमन के बाद, कोशिकाओं 100 एनएम टीजी साथ इलाज किया गया या माध्यम से वाहन पर नियंत्रण और luminescence 8 घंटे के बाद मापा गया था। * पी <0.05, कई टी परीक्षण (होल्म-Sidak सुधार)।

चित्रा 4
चित्रा 4:। वायरल titers की सीमा पर intrahepatic इंजेक्शन के बाद रक्त में gluc-SERCaMP रिहाई thapsigargin प्रेरित (ए) कच्चे luminescence मूल्यों चूहों से (एन = 8) intrahepatically अलग एएवी-gluc-ASARTDL titers के साथ इंजेक्शन। Thapsigargin (1 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्शन (आईपी) 12. रक्त संकेत समय बिंदुओं पर एकत्र और -80 & # पर जमा हो गया था दिन पर दिलाई176; परख के समय तक सी। (बी) के चूहों में thapsigargin प्रेरित SERCaMP प्रतिक्रिया (एन = 8) एएवी-gluc-ASARTDL के विभिन्न मात्रा व्यक्त का प्रदर्शन पैनल से सामान्यीकृत luminescence मूल्यों,।

चित्रा 5
चित्रा 5:। हैंडलिंग और (विवो में) gluc-SERCaMP प्लाज्मा नमूनों के भंडारण (ए) प्लाज्मा, intrahepatically (एन = 10) gluc-SERCaMP व्यक्त चूहों से एकत्र aliquoted और assays के समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो गया था। ट्यूब -80 डिग्री सेल्सियस से हटा दिया है और पहले luminescence माप करने के लिए संकेत समय के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा थे (मतलब ± एसडी)। Gluc enzymatic गतिविधि पर प्लाज्मा नमूनों की कई फ्रीज / thaws (बी) प्रभाव। प्लाज्मा नमूनों संकेत संख्या के अधीन थे (एन = 10) intrahepatically एएवी-gluc-SERCaMP व्यक्त चूहों से एकत्रफ्रीज पिघलना चक्र की और luminescence के लिए यत्न किया (एसडी ± मतलब है)।

चित्रा 6
चित्रा 6:। Gluc-SERCaMP assays के लिए coelenterazine सब्सट्रेट तैयारी (ए) संस्कृति के माध्यम से 5 घंटे के लिए 300 एनएम टीजी (या वाहन नियंत्रण) के साथ इलाज एसएच SY5Y-gluc-SERCaMP कोशिकाओं लाइनों से एकत्र किया गया था। मध्यम में gluc गतिविधि (एसडी ± मतलब, एन = 6) coelenterazine की पीबीएस + विभिन्न सांद्रता इंजेक्शन द्वारा मूल्यांकन किया गया था। वाहन thapsigargin प्रेरित प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रत्येक सब्सट्रेट एकाग्रता पर नियंत्रण में इलाज करने के लिए एक पैनल से (बी) Luminescence मूल्यों सामान्यीकृत थे। कई घंटे से अधिक (सी) सब्सट्रेट क्षय। पुनः संयोजक gluc (0.1 एनजी या 0.02 एनजी) का एक ज्ञात राशि से luminescence (एसडी ± मतलब, एन = 4) सब्सट्रेट तैयारी के बाद कई घंटे से अधिक मापा गया था। (डी) जबकि पुनः संयोजक के लिए कच्चे luminescenceGluc क्षय सब्सट्रेट करने के कारण समय के साथ कम, नमूनों में गुना अंतर (luminescence द्वारा निर्धारित) बनाए रखा गया था।

चित्रा 7
चित्रा 7:। Gluc / CTZ प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स से संबंधित gluc-SERCaMP assays के लिए विचार (ए) संस्कृति के माध्यम gluc / CTZ संकेत के क्षय को बदल देता है। Gluc-SERCaMP युक्त सतह पर तैरनेवाला के 5 μl पीबीएस और संस्कृति के माध्यम से अलग-अलग अनुपात के साथ मिलाया गया था। सब्सट्रेट के 100 μl (पीबीएस + 500 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड में 15 माइक्रोन CTZ) तालिका में उल्लिखित के रूप में पतला था कि नमूने के 50 μl को जोड़ा गया है। प्रकाश उत्सर्जन में 15 मिनट से अधिक नजर रखी थी। (बी) के माध्यम के 5 μl एसएच SY5Y-gluc-ASARTDL कोशिकाओं और 100 μl सब्सट्रेट (पीबीएस + 5 मिमी NaCl में 8 माइक्रोन CTZ) से एकत्र किया गया था जोड़ा गया है। Luminescence खत्म सब्सट्रेट (टी = 0) और हर 30 सेकंड जोड़ने के बाद तुरंत मापा गया था 15 मिनट (± एसडी, एन = 12) के पाठ्यक्रम। डेटा क्षय की दर का आकलन करने के लिए पिछले 30 सेकंड के अंतराल प्रतिशत संकेत रिश्तेदार के रूप में साजिश रची है। इनसेट कच्चे luminescence डेटा से पता चलता है।

आंकड़ा 8
8 चित्रा:। Gluc स्राव पर 100 एनएम thapsigargin के ईआर कैल्शियम की कमी के Pharmacologic मंडन (ए) प्रभाव gluc-ASARTDL और gluc-कोई टैग नियंत्रण के लिए जांच (एसडी ± मतलब, एन = 6) किया गया था। (बी) dantrolene (RYR प्रतिपक्षी) के साथ ईआर कैल्शियम स्थिर टीजी प्रेरित SERCaMP रिहाई को रोकता है। प्रकोष्ठों 30 मिनट या 100 एनएम thapsigargin के अलावा पहले 16 घंटे के लिए dantrolene का संकेत दिया सांद्रता के साथ पहले से इलाज किया गया। मध्यम में gluc गतिविधि 4 घंटे के बाद (एसडी ± मतलब, एन = 6) मापा गया था।

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9 चित्रा:। Gluc-SERCaMP परख के लिए मॉक प्रतिनिधि परिणाम (व्यक्तिगत प्लेटों को पढ़ने के बीच समय अंतराल पर निर्भर) टूटने सब्सट्रेट करने के कारण इलाज किया मूल्यों प्लेटों के बीच कम हो सकती है वाहन, ध्यान दें। इस आशय के लिए खाते में करने के लिए, उपचार विशिष्ट प्रभाव एक थाली के लिए स्वतंत्र रूप से गणना की जाती है और इस अनुपात प्लेटें भर तुलना की जाती है।

तारीख चूहा ट्यूब द्रव्यमान (एमजी) हेपरिन मात्रा (एमएल) हेपरिन घनत्व (छ / एमएल) हेपरिन द्रव्यमान (एमजी) ट्यूब + हेपरिन (एमजी) के मास रक्त संग्रह के बाद कुल द्रव्यमान (एमजी) एकत्र रक्त का मास (एमजी) घनत्व रक्त (छ / एमएल) गणना की मात्रा रक्त (उल) 2 के लिए आवश्यक हेपरिन की मात्रा: 1 के अनुपात स्पिन से पहले जोड़ने के लिए अतिरिक्त हेपरिन मिलीलीटर
01.01.15 एसडी पुरुष 1135.9 50 1.117 55.83 1,191.73 1,317.70 125.97 1.05 119.97 59.98 9.98

तालिका 1:। SERCaMP अध्ययन के लिए रक्त संग्रह प्रवेश के रक्त संग्रह तालिका उदाहरण।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो पर प्रकाश डाला गया और gluc-SERCaMP की विवो उपयोगिता में ईआर कैल्शियम की कमी नजर रखने के लिए। SERCaMP उत्पन्न करने के लिए प्रोटीन संशोधन अन्य संवाददाता प्रोटीन से 12 सामान्यीकरण करने के लिए प्रकट होता है, हम अन्य luciferases 18 की तुलना में अपनी मजबूत (200-1,000 गुना अधिक) bioluminescence के लिए Gaussia luciferase चुना है। हम प्राथमिक चूहा cortical न्यूरॉन्स, एसएच SY5Y कोशिकाओं, और चूहा जिगर के लिए दिया gluc-SERCaMP वायरस की एक 100 गुना खुराक रेंज भर में पहचाने जाने thapsigargin प्रेरित gluc-SERCaMP रिहाई का प्रदर्शन (आंकड़े 3 और 4)। हम पहले gluc-ASARTDL व्यक्त एक स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइन की पीढ़ी का वर्णन किया और 5 एक्स 10 4 लेबल हटाया कोशिकाओं की आबादी में के रूप में कुछ के रूप में 20 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया 12 प्रेरित एक thapsigargin रिपोर्ट कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया। यहाँ हम स्थिर सेल लाइन लगातार 15 मार्ग, सबसे analyz के लिए बाहर टीजी प्रेरित प्रतिक्रिया रिपोर्ट कर सकते हैं कि पता चलता हैसमय के साथ रिपोर्टर के निरंतर अभिव्यक्ति की इसकी क्षमता को प्रभावित नहीं करता यह दर्शाता है कि एड, ईआर कैल्शियम की कमी के जवाब (चित्रा 1) में जारी किया जाएगा। हमारे आंकड़े यह स्रावित होता है जब gluc-SERCaMP मुख्य रूप से ईआर कैल्शियम की कमी का एक समय तक एक सेल के ईआर के भीतर आयोजित किया जाता है कि संकेत मिलता है। "सामान्य" शर्तों के तहत, आधारभूत ईआर कैल्शियम हेमोस्टेटिस 12 की स्थापना की अनुमति देता है कि एक कम बेसल स्राव होता है। Thapsigargin द्वारा ईआर कैल्शियम की कमी, विपरीत दिशाओं में intracellular और बाह्य luminescence परिवर्तन के स्तर के बाद। यह सेंसर (चित्रा 2) के स्थिर राज्य वितरण में बदलाव का संकेत करने के लिए एक अनुपात के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। SERCaMP रिहाई KDEL रिसेप्टर अभिव्यक्ति 12 से ठीक किया जाता है के रूप में महत्वपूर्ण, रिहाई की भयावहता सेल प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। हम वैकल्पिक KDEL-तरह carboxy टर्मिनल दृश्यों के साथ 'ASARTDL' प्रतिस्थापन मैक्सी प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि कल्पनाएक विशेष सेल या ऊतक प्रकार में मल SERCaMP प्रतिक्रिया।

इन विट्रो assays के लिए, बाह्य gluc-SERCaMP के स्तर की वजह से स्रावित रिपोर्टर की स्थिरता के लिए समय पर जमा होगा; हम 72 घंटा 12 के बाद गतिविधि में एक अनुमानित 5-10% की कमी की सूचना दी। जैसे, ईआर कैल्शियम homeostasis को एक pharmacologic या आनुवंशिक चुनौती की शुरुआत करने से पहले मध्यम आदान प्रदान सेंसर संचय के कारण पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इसके विपरीत, विवो में gluc-SERCAMP के आधे जीवन प्लाज्मा में संकेत संकेत 3.5-4.7 मिनट 12 रक्त संचार में रिपोर्टर की हाल ही में रिलीज का प्रतिनिधित्व करता है। रक्त पूर्व vivo और प्लाज्मा के लिए कार्रवाई की है एक बार, तथापि, gluc-SERCaMP (चित्रा 5) बहुत स्थिर है।

वर्णित तरीके के लिए, मध्यम या प्लाज्मा एंजाइमी assays के पहले अपारदर्शी 96 अच्छी तरह प्लेटें को सौंप दिया है। Gluc आधारित संवाददाता का उपयोग करते समय दो महत्वपूर्ण कारकों पर विचार करने के लिएएंजाइम का फ्लैश कैनेटीक्स और coelenterazine सब्सट्रेट के टूटने हैं। इंजेक्टर से लैस प्लेट पाठकों सबसे अच्छा सब्सट्रेट अलावा और luminescence माप के बीच के समय को सामान्य करने के gluc एंजाइमी assays के चलाने के लिए उपयुक्त हैं। coelenterazine के रासायनिक गुणों सब्सट्रेट तैयारी के बाद अलग-अलग समय पर मापा कच्चे luminescence मूल्यों की तुलना precludes जो क्षय, के लिए यह खतरा बना। प्रयोगों की अवधि (9 चित्रा) पर नज़र रखी जा करने के लिए नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने के बीच सापेक्ष अंतर की इजाजत दी है, तथापि, रखा जाता है (चित्रा 6) नमूनों के बीच मतभेद मोड़ो।

प्रगतिशील रोगों की जांच जब विवो में ईआर कैल्शियम उतार चढ़ाव की निगरानी करने की क्षमता फायदेमंद है। जैसे फ्लोरोसेंट साइटोप्लास्मिक रंगों के रूप में अन्य तरीकों, इन विट्रो अध्ययन में तीव्र के लिए उपयुक्त हैं, वहीं एक SERCaMP संवाददाता अनुदैर्ध्य ईआर कैल्शियम की निगरानी की अनुमति के लिए सबसे पहले है। कहांआर प्रोटोकॉल एएवी-gluc-SERCaMP का सीधा यकृत इंजेक्शन की रूपरेखा। हम के बाद इंजेक्शन 56 दिन के लिए चुनौती जानवरों के संचलन में gluc-SERCaMP के स्तर को स्थिर का पता चला (नवीनतम timepoint इस प्रकार अब तक परीक्षण) और अब 12 प्रयोगों संभव हो रहे हैं भविष्यवाणी की है। एएवी वैक्टर व्यास में लगभग 20 एनएम मापने, आकार में छोटे हैं, और कम से कम जैव सुरक्षा आवश्यकताओं को 19 मुद्रा। डबल असहाय डीएनए को एएवी एकल असहाय जीनोम के रूपांतरण को नाकाम करने के लिए, एएवी-SERCaMP एक एएवी सीरोटाइप-1 डबल असहाय वेक्टर 20 के रूप में पैक किया गया था। एएवी सीरोटाइप -1 प्रभावी ढंग से चूहे यकृत 19,21 transduce दिखाया गया है; हालांकि, हमारे इंजेक्शन तकनीक की चेतावनी पूरे शरीर में अन्य ऊतकों की यात्रा करने के वायरस के लिए संभावित है। वेक्टर सीधे जिगर में इंजेक्ट किया गया था हालांकि, के रूप में प्रस्तुत हमारी कार्यप्रणाली SERCaMP रिहाई के स्रोत विचार नहीं कर सकते हैं, और इसलिए यह जिगर के अलावा अन्य ऊतकों gluc-एसईआरसी में योगदान कर सकते हैं कि संभव हैएएमपी संकेत। भविष्य आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रकार के ऊतकों को निशाना बनाने की अभिव्यक्ति को सीमित होगा। उदाहरण के लिए, ऊतक विशेष रचनात्मक चालक लाइनों प्लाज्मा नमूने के माध्यम से ईआर कैल्शियम की ऊतक विशेष निगरानी के लिए अनुमति देगा एक Cre पर निर्भर gluc-SERCaMP साथ पार किया।

वर्णित इन विवो तकनीक रिपोर्टर के मजबूत प्रकृति के कारण कम वायरल titers का उपयोग करता है। Gluc-SERCaMP रिहाई 7.6 एक्स 10 9 वी.जी. (चित्रा 4) के लिए 7.6 10 x 7 वी.जी. के एक वायरल रेंज से पता लगाया जा सकता है। इस रेंज जिगर 19 के जुगनू luciferase आधारित वायरल इंजेक्शन के उपयोग के पिछले काम में रिपोर्ट की तुलना में 4-400 गुना कम है। उच्च सांद्रता में, हम कारण ट्रांस्जीन से 22 जानवर की एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए संभवतः है जो समय के साथ पता लगाने योग्य अभिव्यक्ति का नुकसान मनाया। वायरस के उच्च titers संभव है जब कारण संकेत नुकसान की वृद्धि की संभावना के लिए बचा जाना चाहिए। प्रस्तुत उन से कम titers होना नहीं किया हैएन परीक्षण किया। इस प्रोटोकॉल जिगर में एएवी-gluc-SERCaMP के इंजेक्शन की रूपरेखा; इसी तरह के दृष्टिकोण से अन्य प्रकार के ऊतकों के लिए संभव सिद्धांत रूप में कर रहे हैं। इस तरह के वायरल एकाग्रता और सीरोटाइप रूप मापदंडों अन्य ऊतकों में पर्याप्त अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

कारण रिपोर्टर के मजबूत प्रकृति के कारण, रक्त (100-150 μl) की छोटी मात्रा में प्रयोगों भर में दोहराया संग्रह के लिए अनुमति देता है, पूंछ की कतरनों से एकत्र किया जा सकता है। यह हम आधारभूत स्तर पर एक वापसी के बाद thapsigargin प्रशासन (चित्रा 4) के बाद ऊंचा स्तर मनाया जहां thapsigargin, के जवाब में gluc-SERCaMP रिहाई के अनुदैर्ध्य लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी था। रक्त संग्रह के बाद प्लाज्मा नमूनों की समुचित से निपटने के लिए भी महत्वपूर्ण है। जैसे, हम SERCaMP से पहले एंजाइमी परख (चित्रा 5) को 72 घंटा अप करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लाज्मा में स्थिर है कि प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, प्लाज्मा नमूनों में कम से कम तीन फ्रीज / टी गुजरना कर सकते हैंluminescence पर न्यूनतम प्रभाव (चित्रा 5) के साथ बड़बड़ाना चक्र। अभ्यास में, हम -80 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों, एंजाइमी परख का आकलन करने से पहले अनावश्यक फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए, और एक ही समय में एक प्रयोग के लिए सभी नमूनों का विश्लेषण दुकान।

ईआर कैल्शियम की कमी रोगों की एक किस्म के रोगजनन में फंसा है। यह अक्सर सेलुलर कार्यों में अवरोध उत्पन्न होता है और सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया (UPR) के सक्रियण की ओर जाता है कि एक नदी के ऊपर घटना माना जाता है। UPR होमियोस्टैटिक शर्तों 5 पैर जमाने के लिए ईआर द्वारा नियोजित एक अनुकूली प्रतिक्रिया है। ईआर तनाव के जीर्ण राज्यों अंततः कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी, समस्थिति बहाल करने के लिए UPR की क्षमता से अधिक है। ईआर तनाव और ईआर कैल्शियम अनियंत्रण ऐसे टाइप 1 मधुमेह, मधुमेह अपवृक्कता, neurodegenerative रोगों और हृदय dieases 5 जैसे रोगों में मनाया जाता है। कैल्शियम अनियंत्रण और रोग रोगजनन के बीच के रिश्ते, तथापि, diffic हैULT चित्रित करने के लिए। SERCaMP प्रौद्योगिकी इस प्रकार की बीमारी के विकास और प्रगति में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, एक जानवर की उम्र से अधिक के लिए इस प्रक्रिया को ट्रैक करने की क्षमता है। इसके अलावा, को रोकने के लिए या सही ईआर कैल्शियम अनियंत्रण SERCaMP के उपयोग के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता डिज़ाइन किया गया संभावित चिकित्सा का मूल्यांकन। अन्त में, gluc-SERCaMP रिलीज होता है, जहां रोगों की पहचान करने के लिए इंजीनियर और रोग विनियमित जीन थेरेपी का एक साधन के रूप में SERCaMPs रूप स्रावी चिकित्सकीय प्रोटीन या पेप्टाइड्स को रोजगार के लिए अवसर प्रदान करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes Fisher  02-682-550
10% NP-40 solution  Pierce 28324 for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes Fisher 14-823-30
200 microliter filter tips Rainin RT-L200F
3-0 surgical sutures Fisher NC9598192
30 G needles Fisher Scientific 14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheets Thermo AB-0558
Alcohol prep pads Fisher 22-246-073
Anesthesia Auto Flow System E-Z Anesthesia EZ-AF9000
Animal recovery chamber Lyon Vet ICU-912-004
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Betadine solution Fisher NC9386574
Bleach Clorox n/a
Bovine growth serum Thermo SH30541.03
Coelenterazine, Native Regis Technologies 1-361204-200
Cotton tipped applicators Puritan 806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures WPI 501803
Digital ultrasconic cleaner Fisher Scientific FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate Life Technologies 10569-010
DNA mass ladder Life Technologies 10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein) Nanolight 321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) New England Biolabs E8023S 1:2,000 (WB)
Germinator 500 CellPoint Scientific DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque) Fisher 07-200-589
Hank's balanced salt solution Life Technologies 14175-095
Heparin Allmedtech 63323-276-02
Isoflurane Butler Schein 29404
Ketamine Henry Schein 995-2949
Kwik Stop Styptic powder Butler Schein 5867
L-glutamine Sigma G8540
Methanol Fisher a452-4
Microfuge 22R Centrifuge Bekman Colter 368831
Neosporin Fisher 19-898-143
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
Nikon Stereoscope Nikon SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup Machery-Nagel 740609
P200 pipet Rainin L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit Clontech 632200
PCR film seal Fisher AB0558
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
ReFresh Charcoal Filter canister E-Z Anesthesia EZ-258
Scalpel blades, #10 Fine Science tools Inc 10010-00
SD rats 150-200 g Charles River Rats rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags National Band and Tag co 1005-1
Sterile surgical drapes Braintree Scientific SP-MPS
Synergy 2 plate reader BioTek n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Thapsigargin Sigma T9033 harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix Life Technologies K4975-00
Xfect Transfection reagent Clontech 631318
Xylazine Valley Vet 468RX

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References

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