Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein * These authors contributed equally

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Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Yan, X., Harvey, B. K. Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP. J. Vis. Exp. (103), e53199, doi:10.3791/53199 (2015).

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Abstract

Das endoplasmatische Retikulum (ER) enthält, die höchste Stufe von intrazellulärem Calcium, wobei Konzentrationen etwa 5000-fach größer als cytoplasmatische Ebenen. Strenge Kontrolle über ER Calcium ist zwingend notwendig für die Proteinfaltung, Änderung und Menschenhandel. Perturbationen ER Calcium kann in der Aktivierung des ungefalteten Protein-Reaktion, einer dreipoligen ER Stressantwort Mechanismus führen und tragen zur Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Die Fähigkeit, ER Kalzium Veränderungen während der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu überwachen ist wichtig, im Prinzip, dennoch schwierig in der Praxis. Derzeit verfügbare Verfahren zur Überwachung von ER Calcium, wie Calcium-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe und Proteine, Einsicht in ER Calciumdynamik in Zellen bereitgestellt, aber diese Werkzeuge sind nicht für in-vivo-Studien geeignet. Unserem Labor haben gezeigt, dass eine Modifikation des Carboxyterminus von Gaussia-Luciferase vermittelt die Sekretion des Reporters in Reaktion aufER Kalzium Erschöpfung. Die Verfahren zur Verwendung einer Luciferase beruht, sezerniert ER Calciumüberwachungsprotein (SERCaMP) zum in vitro und in vivo-Anwendungen werden hier beschrieben. Dieses Video zeigt Leber Injektionen, pharmakologische Manipulation von Gluc-SERCaMP, Blutentnahme und Verarbeitung, und Assay-Parameter für Längs Überwachung der ER Kalzium.

Introduction

Das endoplasmatische Retikulum (ER) Funktionen in vielen Zellkapazitäten einschließlich Proteinfaltung, Proteinsekretion Lipidhomöostase und intrazelluläre Signal 1. Von zentraler Bedeutung für normale ER-Funktion wird beibehalten Lumencalciumkonzentrationen bei ~ 5.000 Mal jene im Zytoplasma 2-4 gefunden. Dieser energieintensive Prozess wird durch die sarco / endoplasmatischen Reticulum Calcium ATPase (SERCA), eine Pumpe, die Calcium-Ionen in das ER bewegt geregelt. Efflux von Kalzium aus dem ER wird hauptsächlich durch den Ryanodin (RyR) und Inositol-Triphosphat (IP3R) -Rezeptoren vermittelt werden. Da viele ER Prozesse sind abhängig von Kalzium, kann stören den Speicher, um ER Stress und schließlich zum Zelltod führen.

ER Calcium Dysregulation in Krankheiten wie Kardiomyopathie, Diabetes, Alzheimer beobachtet und Parkinson-5. Infolge der Progressivität dieser Krankheiten wurde schwierig, die Ursache-Wirkungs-Wieder abgrenzenhung zwischen Pathogenese und Veränderungen in der ER Kalziumspeicher. Eine Anzahl von Technologien für signifikante Fortschritte im Verständnis der ER Calciumdynamik, einschließlich Farbstoffe und genetisch kodierte Calciumindikatoren (GeCIS) erlaubt. Geringe Affinität Calcium-Farbstoffe, die in der Fluoreszenz zu erhöhen, wenn Ca 2+ gebunden ist, kann in die Zellen geladen werden, um subzellulären Kompartimenten mit hohen Konzentrationen an Calcium 6 zu untersuchen. GeCIS wie D1ER und Catcher ermöglichen Überwachung Calciumschwankungen genauere Steuerung der subzellulären Lokalisation 7-9. Vor kurzem hat eine weitere Klasse von GeCIS sogenannter Kalziummess Organell eingeschlossenen Proteinindikatoren (CEPIA) beschrieben worden sind 10. Ein dritter Ansatz, der Genetik und der Chemie kleiner Moleküle ist gezielte Esterase-Farbstoffbeladung (TED), die eine genetisch kodierte Carboxylesterase (zum ER gezielte) mit einem Ester-basierten Calcium Farbstoff 11 verwendet.

Während der AFORementioned Ansätze haben inhärenten Stärken und Schwächen, können sie wertvolle Einblicke in ER Kalziumdynamik durch akute Fluoreszenzmessungen bereitzustellen. Sie sind jedoch für die Langzeitstudien oft erforderlich, um den Krankheitsverlauf zu untersuchen nicht optimal. Mit dem Ziel der Entwicklung einer Methode zur Calciumdynamik über längere Zeiträume hinweg zu beobachten, wurde identifiziert und entwickelt eine Proteinmodifikation, die sezerniert ER Calcium Überwachung Proteine ​​(SERCaMPs) 12 zu schaffen.

SERCaMP umgeht einige Einschränkungen mit anderen Methoden verbunden sind, durch die Bereitstellung einer minimal-invasiven Ansatz, um wiederholt zu verhören die ER Kalziumspeicher. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Carboxy-terminalen Peptids ASARTDL (Alanin-Serin-Alanin-Arginin-Threonin-Asparaginsäure-Leucin) ausreicht, um ER-Retentions fördern; jedoch unter Bedingungen, die Abnahme der ER Calcium verursachen kann, ist die Peptidsequenz nicht mehr ER localizatio behaltenn und das Protein sekretiert 13. Die Basis der SERCaMP Technologie ist das Anhängsel ASARTDL zum Carboxy-Terminus eines sezernierten Proteins (zB Gaussia-Luciferase oder Gluc), so dass die Sekretion von ER Calciumverarmung ausgelöst, wodurch eine robuste Reporter ER Calcium Dysregulation 12. Die Expression von Gluc-SERCaMP über transgene Methoden können biologische Flüssigkeiten wie Zellkulturmedium und Plasma, um Änderungen der Gluc-Aktivität als Indikator für die ER Calciumhomöostase analysiert werden. Das Verfahren findet Anwendung für die Langzeitstudie über progressive Veränderungen in der ER Calciumspeicher sowohl in vitro als auch in vivo. Das folgende Protokoll wird als eine allgemeine Übersicht zur Verwendung von Gluc-basierte SERCaMP zu ER Calciumhomöostase studieren geschrieben, aber das Protokoll kann als Leitfaden für alternative Reporter SERCaMPs dienen.

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Protocol

1. In vitro-Test: Entdecken SERCaMP Mitteilung von einer stabilen SH-SY5Y-Zelllinie

  1. Platte SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) in Gewebekultur-behandelten Platten mit 150.000 Zellen pro cm 2 Oberfläche. Für Platten mit 96 Vertiefungen, zum Beispiel Saatgut 50.000 Zellen pro Vertiefung (1A). Wachsen SH-SY5Y-Zellen in DMEM (hoher Glukose, GlutaMAX, Pyruvat) + 10% Rinderwachstumsserum + 1x Penicillin / Streptomycin.
    1. Passage-Zellen bis zu 15 mal (1B). Höhere Durchlaufhäufigkeit wurde nicht getestet.
    2. Zurückzukehren Zellen befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5,5% CO 2 und über Nacht inkubieren.
  2. Vor Versuchs Behandlung (en) zu sammeln eine Ausgangsprobe für jede Vertiefung durch Übertragung von 5 ul Kulturüberstand zu einem opaken mauert Platte mit 96 Vertiefungen. Vor dem Sammeln, klopfen Sie die Platte auf allen Seiten und wirbeln Gradienten Effekte zu vermeiden. Verschließen Sie die undurchsichtige Platte mit einem Klebstoff sEaling Blatt und bei 4 ° C bis zur enzymatischen Assay.
    Anmerkung: Secreted Gluc-SERCaMP ist in Zellkulturmedium sehr stabil. Wir bereits berichtet etwa 5-10% der Gluc-Aktivität wurde nach einer 72-stündigen Inkubation bei 37 ° C (auf SH-SY5Y-Zellen inkubiert) 12 verloren.
  3. Gönnen Zellen wie gewünscht, um ER Kalziumabbau zu untersuchen (zB Umwelt-, pharmakologische, genetische Manipulationen). Vermeiden Sie lange Aussetzung an Umgebungsbedingungen (außerhalb der Brutapparat) als pH-Änderungen schnell bei atmosphärischem CO 2 entstehen. Hinzufügen HEPES zum Kulturmedium auf 20 mM, pH-Stabilisierung 14, wenn längerer Manipulationen erforderlich sind. Lichteinwirkung zu vermeiden, wenn mit HEPES in Kulturmedium 15.
    1. Positive Kontrolle: Behandeln Sie die Zellen mit 100 nM Thapsigargin (Tg) oder 50 uM Cyclopiazonsäure (CPA) für 4-6 Stunden für Experimente in SH-SY5Y-Zellen. Maximale Reaktion in anderen Zelllinien können längere Inkubationen oder verschiedene Konzen erforderlichtrationen von Verbindungen.
    2. Negative Kontrolle: Collect Kulturmedium aus der Eltern SH-SY5Y-Zellen. Nach unserer Erfahrung ist die Hintergrundlumineszenz für diesen Test weniger als 0,05% der basale Sekretion von stabil SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP Zellen.
  4. Sammeln und speichern 5 ul Proben des konditionierten Medien zu den gewünschten Zeitpunkten, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  5. Beurteilen Sie enzymatischer Aktivität in dem Medium, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
  6. Untersuchen intrazellulärer Gluc durch Immunoblot oder Lumineszenz-Assays.
    1. Für Immunoblot: lysieren Zellen in modifiziertem RIPA-Puffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren. Separate auf SDS-Polyacrylamid-Gel und Transfer zu 0,20 um PVDF-Membran. Dazu werden die Membranen mit Gluc Antikörpers (1: 2000 Verdünnung) über Nacht bei 4 ° C. Führen sekundären Antikörper Inkubation und Membran wäscht nach benutzerdefinierten Protokolls für Nachweisreagenz der Wahl.
    2. FürLumineszenz-Assays (Abbildung 2): Führen Sie folgende Schritte auf dem Eis:
      1. Entfernen Sie das gesamte Medium aus Vertiefungen der Gewebekulturplatte und spülen mit 200 ul kaltem PBS.
      2. Hinzuzufügen 75 ul Lysepuffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren in jede Vertiefung.
      3. Drehen der Platte auf einem Orbitalschüttler (120 Upm) bei 4 ° C für 20 min.
      4. Pipette vorsichtig das Lysat nach oben und unten mit einer Mehrkanalpipette, die Vermeidung von Luftblasen. Bringen Sie 5 ul Lysat zu einer undurchsichtigen Platte und bewerten Lumineszenz, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

2. In vitro-Test: transiente Transfektion von immortalisierten Zellen mit SERCaMP

Hinweis: Wir haben festgestellt, dass die transiente Transfektion Verfahren können zellulären Stress zu induzieren und stumpf die anschließende Gluc-SERCaMP Antwort. Der folgende Ansatz wurde entwickelt, um die Transfektion eff minimieren ECTS in SH-SY5Y-Zellen. Optimierung dieses Verfahrens (einschließlich Auswahl des Transfektionsreagenz) zum alternativen Zelllinien erforderlich. Wenn möglich, ist es empfehlenswert, stabile Zelllinien oder viralen Transduktion Methoden in den Abschnitten 1 und 3 jeweils beschriebenen verwenden.

  1. Platte SH-SY5Y-Zellen in einer 100 mm-Schale mit 4 × 10 6 Zellen. Dieses Gericht wird ausreichen, um re-Samen etwa 300 Brunnen (96 Well-Plattenformat) nach der Transfektion Verfahren.
  2. Transfizierenden Zellen mit Xfect Reagens unter Verwendung von 20 ug Plasmid-DNA (kodiert Gluc-SERCaMP) und 6 ul Xfect Reagenz. Skala DNA und Xfect Reagenz entsprechend für größere oder kleinere Kulturgefäße.
  3. Zurückzukehren Zellen für 48 Stunden Inkubator.
  4. Trypsinize Zellen und reseed Platten mit 96 Vertiefungen mit 60.000 Zellen pro Vertiefung. Folgen Sie den nachfolgenden Schritten in Kapitel 1 beschrieben.

3. In vitro-Test: viralen Vektor-vermittelte Expression von Gluc-SERCaMP

Zelt "> Hinweis: Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektor Verpackung 16 und Reinigung 12 und Lentivirus Produktions 13 wurde bereits berichtet.

  1. Titer Gluc-SERCaMP AAV unter Verwendung der folgenden Primer und Sonden: Vorwärts-Primer, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; Rückwärts-Primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Sonde (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 bezeichnet), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'für die quantitative PCR.
    1. Vorbereitung der Standardkurve durch Linearisierung eines Plasmids, welches Gluc und Reinigung der DNA unter Verwendung einer Spin-Säule (Macherey-Nagel zB NucleoSpin Gel und PCR-Reinigung). Quantifizierung der DNA durch Trennen an einem Agarosegel zusammen mit einer Masse-Leiter. Vorzubereiten 1.10 Verdünnungen von DNA von 100 pg / ml bis 10 fg / ml in PBS. Berechnung der Kopien / ml Gluc Plasmid-DNA in jeder der Konzentrationen, bezogen auf das Molekulargewicht des Plasmids.
    2. Verdünnen Sie die AAV-Stamm in PBS (entsprechender Verdünnung wird abhängig sein,Parameter der Viruspräparat und empirisch bestimmt).
    3. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Echtzeit-PCR-System unter den folgenden Bedingungen: 95 ° C × 5 min, 94 ° C × 20 Sekunden und 60 ° C × 1 min für 41 Zyklen. Berechnen Sie Kopien / ml unter Verwendung der Standardkurve.
  2. Titer Lentivirus mit einer p24 Lenti-X schnellen Titer Kit. Auftauen lentiviralen Aliquots auf Eis und verdünnen das p24-Kontrollprotein in SH-SY5Y Medium.
    1. Verdünnen Sie die Lentivirus, so dass es auf die Standardkurve (zB 1: 20.000 oder 1: 100.000) fällt. Die erforderliche Verdünnung Faktor wird auf dem lentiviralen Herstellungsparameter variieren und muss empirisch ermittelt werden. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für alle folgenden Schritte.
  3. Platten Zellen auf 96-Well-Platten. Für SH-SY5Y-Zellen, können Beschichtungsverfahren in Abschnitt 1 dargelegt befolgt werden. Für Ratten primären kortikalen Neuronen, sollten Zellen isoliert und auf entsprechend beschichtete Platten ein ausgesät werdens die zuvor beschriebenen 16. Pflegen Ratte primären kortikalen Neuronen in Neurobasalmedium mit 1x B27 und 500 & mgr; M L-Glutamin. Führen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte mittel Börsen.
  4. Transduktion der Zellen mit Virus. Das Ziel ist es, virale Transduktion Expression auf niedrigem Niveau zu erreichen, wie Gaussia-Luciferase bietet robuste Signal.
    1. AAV-Transduktion SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnter AAV bis 6,0 x 10 & sup7; VG / & mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer (PBS + 0,5 mM MgCl 2). In 5 ul verdünnt AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI von etwa 6.000) pro Well von 96-Well-Platte (3A). Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren.
    2. AAV-Transduktion Ratten primären kortikalen Neuronen: transduzieren 6-8 Tage nach der Plattierung. Verdünnter AAV bis 4,0 x 10 & sup6; VG / & mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer. In 5 ul verdünnt AAV (2,0 x 10 7 vg; MOI von etwa 350) pro VertiefungPlatte mit 96 Vertiefungen (3B). Die optimale MOI sollte empirisch für andere Zelltypen bestimmt werden. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren.
    3. Lentivirale Transduktion von SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnen Sie Lentivirus zu 20 pg / ul p24 in Hanks ausgewogener Salzlösung (mit Titerung Kit Konzentration bestimmt). Add 5 ul der verdünnten Virus pro Vertiefung (100 pg von p24, das entspricht 1.250.000 lentivirale Partikel oder ~ 1.250 IFUs) einer Platte mit 96 Vertiefungen 100 ul Volumen. Skalieren entsprechend für größere Formate. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf virale Abfall inaktivieren.
  5. Sammeln Sie eine Vorbehandlung Probe des Mediums und beginnen experimentelle Behandlungen 48 h (SH-SY5Y) oder 5-7 Tage (rat primären kortikalen Neuronen) nach Transduktion.

4. In Vivo SERCaMP Assay

Hinweis: Vor der Durchführung von Tierversuchen irgendwelche Achten Sie auf ordnungsgemäße Genehmigung durch Ihre Einrichtung zu erhalten. AlleÜberleben Operationen sind unter sterilen Bedingungen mit ausreichender Betäubung durchgeführt werden. Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden genehmigt und sind in Übereinstimmung mit NIH ACUC Richtlinien.

  1. Autoklaven chirurgische Instrumente vor der Operation zu starten (121 ° C, 30 min Sterilisations, 20 min Trockenzeit). Reinigen Sie alle Instrumente in einem Ultraschallgerät unmittelbar nach allen Verfahren und vor dem Autoklavieren. Pflegen sterilen Bedingungen während des Überlebens der Operation. Für Operationen mehrere Tiere erfordern, wischen chirurgische Instrumente mit 70% Alkohol, ultrasonicate und Perlen sterilisieren zwischen Ratten. Siehe Materialliste für die notwendigen Instrumente.
  2. Bereiten rat für die Chirurgie. Hier verwenden wir männliche Sprague-Dawley (180-200 g).
    1. Betäuben Ratten mit Isofluran Gas für 3 Minuten (4-5% Isofluran bei 1000 cm³ / min zugeführt), gefolgt von intraperitoneale Injektionen von Xylazin (8 mg / kg) und Ketamin (80 mg / kg). Bewerben Augensalbe zur Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen. BEgin Operation, sobald die Ratte ist tief narkotisierten, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz oder Fuß Prise demonstriert.
    2. Rasieren Sie die Region des Bauches leicht unter den Rippen (niedrig BWS) auf die Mitte der Bauchregion. Scrub die OP-Bereich dreimal im Wechsel 70% Alkohol und Betadine Scrub. Zeigen Ratte in Rückenlage auf sterilen OP-Bereich mit sterilen OP-Abdeckungen.
  3. Verdünnter AAV-Gluc-SERCaMP bis 7,6 x 10 9 vg / ml (Endkonzentration). Gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens.
    Anmerkung: Reichweite der Viruskonzentration (Abbildung 4) variieren.
    1. Pipette 105 ul verdünnt AAV in eine sterile Schale. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um das Virus in eine Spritze zu sammeln.
  4. Durchführung von Operationen, die Leber zu entlarven und zu injizieren AAV-Gluc-SERCaMP.
    1. Vor dem Vornehmen eines Einschnitts in der Bauchhöhle, gelten 0,25% Bupivacain zu dem Schnittbereich. Mit einem Skalpell einen horizontalen Schnitt unterhalb Brustkorb (apnäherungs 2-3 cm). Stumpf sezieren, um das Bindegewebe aus Unterhaut zu trennen.
    2. Schneiden Sie Bauchmuskel, Freilegung der rechten medialen Leberlappen.
      Hinweis: zusätzliche Lappen kann basierend auf End-Anwendung injiziert werden.
    3. Zeigen Tier unter Operationsmikroskop und passen Sie nach rechts medialen Leberlappen in das Blickfeld zu bekommen. Spritzen Sie Virus in Parenchym der medialen Lappen; 3 separate Websites, etwa 33 & mgr; l pro Standort.
      Hinweis: Lassen Sie Nadel im Gewebe für 5-10 sec nach der Injektion bis zur Lieferung des gesamten Einspritzvolumen zu gewährleisten.
    4. Naht der Bauchmuskeln und die Haut getrennt und fügen Neosporin mit Wattestäbchen. Zeigen Ratte in einem Wiedergewinnungskammer, bis das Bewusstsein wiedererlangt und Ratten in der Lage, aufrecht zu erhalten. Lassen Ratten (n) nicht unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Haus einzeln, bis der Einschnitt verheilt und Nahtmaterialien entfernt worden sind (7-14 Tage).
  5. Beginnen Schwanz Blutentnahme 4-7 Tage nach der Injektion. Bereiten Blutentnahmeröhrchen Etiketten und pre-Wiegen. Zugabe von 50 & mgr; l Heparin (1000 U / ml) zu jedem Röhrchen.
  6. Platz Ratte in Isofluran-Narkose Kammer 3 min (4-5% Isofluran bei 1.000 cm³ / min geliefert). Entfernen Ratte aus der Kammer und in Nasenkegel (2-3% Isofluran bei 500 cm³ / min geliefert). Blutentnahme kann beginnen, sobald die Ratte ist tief anästhesiert, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz pi nachgewiesennch.
    1. Mit einer sterilen Schere Rutenspitze (1-2 mm) und sammeln Bluttropfenweise in vorgefüllten Heparin Röhrchen. Blutentnahme bis zum Volumen von mehr als 2 erreicht: 1 Blut in Heparin-Verhältnis (> 100 & mgr; l Blut / 50 ul Heparin). Blutabnahmemengen können basierend auf experimentellen Design angepasst werden. Verwenden Sie einen feuchten Watte zur blutstillende Pulver an den Schwanz gelten die Blutung zu stoppen.
    2. Speicher Blutröhrchen bei 4 ° C, wenn das Sammeln nachfolgende Proben. Wischen Schere mit Ethanol-Pad und Perlen sterilisieren zwischen Sammlungen.
    3. Wiegen Sammelröhrchen und stellen Sie mit Heparin, um 2: 1-Verhältnis (Blut: Heparin). Dieser Schritt wird die Menge von Heparin in jeder Probe (Tabelle 1) zu normalisieren.
    4. Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand (Plasma) in ein frisches Röhrchen und bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Luciferase-Assay (Abschnitt 5).
      Anmerkung: Lagerung von Proben bei 4 ° C bis zu 72 Stunden vor der enzymatischen Assay weist minimal Wirkung auf Lumineszenz (5A). Bis zu 3 Gefrier-Tau-Zyklen von Plasmaproben keine Wirkung auf die Lumineszenz (5B).
  7. Thapsigargin Verwaltung (Positivkontrolle):
    1. Vorbereitung Thapsigargin durch Verdünnung in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mg / ml. Injizieren Thapsigargin bei 1 mg / kg ip in den Unterleib.
      Hinweis: Thapsigargin erhöht Thrombin-induzierte Blutplättchengerinnungs 17 und kann die Blutentnahme aus Schwanz erschweren.
  8. Gaussia-Luciferase-Assay:
    1. Tauen die Plasmaproben auf Eis.
      Hinweis: Für die Längsschnittstudien, Tauwetter und führen Lumineszenz-Assay für alle Zeitpunkt Proben am selben Tag (mit Einzel Herstellung von Substrat).
    2. Transfer 10 ul Plasma zu einem opaken Wandplatte und messen Enzymaktivität, wie in Abschnitt 5. Führen Sie 3-4 technischen Wiederholungen jeder Plasmaprobe beschrieben.
  9. Euthanasiein
    Anmerkung: Der Vorteil SERCaMP Technologie ist die Fähigkeit zur Überwachung ER Calcium longitudinal. Je nach Versuchsparameter und Endpoint-Analysen, sind Tiere, die von Maßnahmen zur Endpunktanalysen angebracht und im Einklang mit den institutionellen ACUC Richtlinien eingeschläfert werden.

5. Lumineszenzassay

  1. Vorbereitung Coelenterazin (CTZ) Stammlösungen durch Verdünnen der Verbindung in angesäuertem Methanol (30 ul 10 N HCl auf 3 ml Methanol), 20 mM. Bereiten Sie den einmaligen Gebrauch und Aliquots bei -80 ° C.
  2. Herstellung der Arbeits Substrat am Tag des Assays.
    1. Für in-vitro-Tests, zu verdünnen Coelenterazin bis 8 um in PBS, zB fügen 10 ul 20 mM CTZ Lager zu 25 ml PBS (6A, B).
    2. Zur in vivo-Assays, verdünnter Coelenterazin bis 100 & mgr; M in PBS, 500 mM Ascorbinsäure, 5 mM NaCl.
  3. Inkubieren bereit CTZ für mindestens 30 minbei Raumtemperatur vor dem Test.
    Anmerkung: Dieser Schritt wird häufig in Gaussia-Luciferase-Assays enthalten, da es Berichte über raschen Zerfall Substrat während ersten 30 min nach der Herstellung. Wir haben diesen Effekt nicht in unserem System (6C) beobachtet; jedoch sind wir oft die Inkubationsschritt, da haben wir keine negativen Auswirkungen auf den Test gefunden.
  4. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, das in der Lage Überwachung Biolumineszenz und mit einem Substrat Injektor ausgestattet ist. Prime die Linien mit dem Substrat.
    Hinweis: Das Ausgangssubstrat durch die Leitungen können anfällig für Abbau sein. Künstlich niedrige Werte für die frühe Proben zu vermeiden, zu injizieren 20-30 leere Brunnen (Laden eines leeren Teller auf dem Lesegerät) vor der Messung experimentellen Proben.
  5. Injizieren Sie 100 ul Substrat in gut schütteln mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden, und messen die Lichtemission. Für die Biotek Synergy II-Plattenlesegerät, integriert Lichtemission über 0,5 s (in vitro Proben) und 5 sec (invivo Proben) für den Leseschritt. Optimierungs-Plattenleseparameter für optimale Testleistung.
    Hinweis: Gaussia-Luciferase Exponate Flash-Kinetik mit schneller Signalabfall (im Vergleich zu mit anderen Luciferasen beobachteten Kinetik leuchten). Die Flash-Kinetik Gluc durch Serum in Zellkulturmedium (7A) beeinflusst, Hervorhebung der Bedeutung der Kontrolle für den Mittelzusammensetzung in Proben. Aufgrund des schnellen Zerfalls der Lumineszenz nach Zugabe von Substrat (Flash-Kinetik), der Zeit zwischen spritzen und lesen müssen bei allen Proben gleichförmig sein. Das Plattenlesegerät sollte so eingestellt sein Substrat auf eine gut zu injizieren, warten Sie eine feste Zeit (zum Beispiel verwenden wir eine 5 sec schütteln Schritt), und lesen, dass auch. Hinzufügen Substrat auf eine gesamte Platte, bevor Lesung stellt eine erhebliche Herausforderung, wenn Substrat in alle Vertiefungen gleichzeitig zugegeben werden. Wenn ein Einspritzer nicht verfügbar ist, kann das Problem teilweise durch Inkubation der Platte für 10 Minuten zwischen Substrat ADDI umgangention und Messung (wodurch die steilen Teil der Zerfallskurve) (7B).
  6. Wiederholen Sie die Injektion, die Wartezeit, und lesen Sie Schritte für jede Vertiefung auf der Platte.

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Representative Results

Die Gluc-SERCaMP Methode ermöglicht die Beurteilung ER Calcium-Homöostase durch Abtasten extrazellulären Flüssigkeiten. Mehrere Steuerungen können in der Versuchsplanung einbezogen werden, um die Interpretation der Ergebnisse zu verbessern. Erstens kann die Verwendung eines konstitutiv sezerniertes Reporter (zB Gluc ohne die C-terminale ASARTDL oder "Gluc-No tag") eingesetzt werden, um die Auswirkungen der experimentellen Behandlungen auf den sekretorischen Weg (global zellulären Sekretion) und Transgenexpression zu bewerten. Zum Beispiel würde eine Erhöhung der extrazellulären Spiegel von Gluc-SERCaMP und Gluc-Nr Tag als ein zwiespältiges Ergebnis werden. Alternativ kann eine Erhöhung der Gluc-SERCaMP Sekretion mit einem entsprechenden Mangel an Gluc-No tag Reaktion unterstützt eine ER calciumabhängige Ereignis (Abbildung 8). Die Sekretion von Gluc-SERCaMP Reaktion auf ER Calciumverarmung kann durch Messung der intrazellulären Gluc beurteilt werden, obwohl dies zu einem einzelnen Zeitpunkt beschränkt, Lyse erforderlich. Int racellular Gluc-SERCaMP wird in Reaktion auf ER Calciumverarmung zu verringern, wie es fortschreitend ausgeschieden wird, und die extrazelluläre: intrazellulärem Verhältnis (für jede einzelne Vertiefung berechnet) zunehmen (2B). Die extrazelluläre: intrazellulärem Verhältnis ist nützlich, um Veränderungen der Expression des Transgens zu steuern.

Pharmakologische Modulatoren der ER Kalziumspeicher kann genutzt werden, um den Beitrag der ER Calcium zu SERCaMP Release im neuen Paradigmen bestätigen. Dantrolen ein RyR Antagonist, ist bekannt, dass ER Kalzium, die Verringerung oder die Freisetzung von SERCaMP hemmen als Reaktion auf Tg (8B) zu stabilisieren. Empfiehlt es sich, wenn möglich, um zusätzliche Verbindungen, die ER Calciumfluss (zB Xestospongin C, 4-Chlor-m-cresol) in neuen experimentellen Paradigmen Verwendung SERCaMP beeinflussen testen. Diese Studien sind oft eine Herausforderung in vivo, kann aber machbar in entsprechenden Gewebekultur-Modelle sein.

"> Für in vitro-Studien mit Gluc-basierte SERCaMP, wird empfohlen, die Reaktionen auf einzelne Platten in Bezug auf die Kontrolle (n) zu berechnen. Können die 'Behandlung induzierten' Gang über den Zeitverlauf durch die Verfolgung Änderungen der relativen Reaktion gegenüber der Kontrolle (bewertet werden für zwischen-Platte Vergleiche). Es ist nicht ratsam, rohen Zahlen über mehrere Platten zu vergleichen, aufgrund Zerfall von Substrat, das auf Veränderungen der Rohwerte zwischen Zeitpunkten (6C) führen kann. Erstellen relative Vergleiche innerhalb einer Platte diesen Effekt minimiert (6D). Ein Beispiel für die Datenanalyse für ein in vitro-Tg-induzierte SERCaMP Freisetzungsexperiment ist in 9 dargestellt.

Für die in vivo-Studien mit Gluc-SERCaMP sollten Daten unabhängig für jedes Tier festgelegt, die jedes Tier als seine eigene "Vorbehandlung" Kontrolle dient. Dies ist notwendig, um die Variabilität in Transgen del Kontoivery und Ausdruck zwischen Tieren (4A).

Der Betrag SERCaMP Antworten werden von einer Vielzahl von Faktoren, von denen viele auf den Ausgangswert der Gesundheit der Zellen bezogen und kann direkt vom Untersucher kontrolliert werden beeinträchtigt. Für maximale SERCaMP Reaktionsfähigkeit, ist es unerlässlich, Bedingungen, die basale ER Calciumhomöostase begünstigen optimieren. Dazu gehören Aussaat Zellen bei optimaler Dichte und mit niedrigen Virustiter. Verschiedenen Zell- und Gewebetypen kann zusätzliche Anforderungen, die empirisch bestimmt werden sollte.

Abbildung 1
Abb. 1: Stabile SH-SY5Y-Zelllinie Aussaatdichte und Durchgang Nummer Überlegungen (A) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP Zellen wurden bei verschiedenen Dichten ausgesät und für 40 h inkubiert. Sekretiertes Gluc-SERCaMP wurde 4 Stunden nach der Behandlung mit 300 nM Tg o gemessenr Fahrzeugsteuerung (Mittelwert ± SD, n = 6). Thapsigargin-induzierte Zunahme der Gluc-SERCaMP Sekretion wird für jeden Zelldichte angegeben. (B) SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP Zellen bei Passage-Nummer 2 und 15 wurden für die Thapsigargin-induzierte Sekretion untersucht. Zellen wurden mit 100 nM Tg 2 h oder 4 h behandelt und sezerniert Gluc Aktivität war, normalisiert auf Träger behandelten Kontrollen (Mittelwert ± SD, n = 4 ist, keine signifikante Wirkung von Durchgangsfaktor, 2-Wege-ANOVA). Eine gestrichelte Linie zeigt y = 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Fig. 2: Enzymtest für die Messung der intrazellulären Gluc-SERCaMP (A) intrazelluläre und (B) der extrazellulären Gluc enzymatische Aktivität wurde in primären Ratten cor beurteiltschen Neuronen (AAV-Gluc-SERCaMP transduziert). Sechs Tage nach der Transduktion wurden die Zellen mit 60 nM Thapsigargin für 4 Stunden behandelt. Als Gluc-ASARTDL im Medium werden entsprechende Abnahme der intrazellulären Spiegel beobachtet. (C) ein Verhältnis von extrazellulärem: intrazellulärem Gluc Aktivität kann für jede einzelne Vertiefung berechnet.

Figur 3
Abb. 3: AAV-Gluc-ASARTDL Titer gegen Thapsigargin induzierte Antwort für SH-SY5Y-Zellen und primären kortikalen Neuronen der Ratte (A) SH-SY5Y-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen bei 5 × 10 4 Zellen pro Vertiefung ausgesät und man ließ sie anhaften Übernachtung. Zellen wurden zu den angegebenen Multiplizität der Infektion (MOI) transduziert, für 48 Stunden inkubiert und dann mit 300 nM Tg oder Vehikel behandelt. Die Lumineszenz wurde in dem Medium nach 8 h gemessen (Mittelwert ± SEM, n = 3). * P <0,05, multiple t-Tests (Holm-Sidak-Korrektur). (B) Ratten primären kortikalen Neuronen wurden auf DIV8 mit AAV-Gluc-ASARTDL bei der angegebenen MOI (berechnet mit 60.000 Zellen pro Vertiefung Angleichung bei der Weiterleitung) transduziert. Fünf Tage nach der Transduktion wurden die Zellen mit 100 nM Tg behandelt oder Fahrzeugkontrolle und Lumineszenz im Medium wurde nach 8 h gemessen (Mittelwert ± SEM, n = 6). * P <0,05, multiple t-Tests (Holm-Sidak Korrektur).

Figur 4
Abb. 4: Thapsigargin-induzierte Gluc-SERCaMP Freisetzung in Blut nach intrahepatischen Injektionen über Palette von Virus-Titer (A) Raw Lumineszenz Werte von Ratten (n = 8) intrahepatisch mit verschiedenen AAV-Gluc-ASARTDL Titer injiziert. Thapsigargin (1 mg / kg) (ip) Injektion wurde am Tag verabreicht 12. Das Blut wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt und bei -80 & # gespeicherten176; C bis zum Zeitpunkt des Assays. (B) Normalisierte Lumineszenzwerte von Feld A, zeigt, Thapsigargin induzierte SERCaMP Antwort in Ratten (n = 8), die verschiedene Mengen von AAV-Gluc-ASARTDL.

Figur 5
Abb. 5: Handhabung und Lagerung von Gluc-SERCaMP Plasmaproben (in vivo) (A) Plasma wurde aus Ratten gesammelt intrahepatisch exprimieren Gluc-SERCaMP (n = 10) aufgeteilt und bei -80ºC bis zum Zeitpunkt des Assays gelagert. Röhrchen wurden von -80 ° C entfernt und bei 4 ° C für angegebenen Zeiten vor der Lumineszenzmessung gespeichert (Mittelwert ± SD). (B) Wirkung von mehreren Frost / Tauwetter von Plasmaproben auf Gluc enzymatische Aktivität. Plasmaproben von Ratten gesammelt intrahepatisch exprimierenden AAV-Gluc-SERCaMP (n = 10) wurden in der angegebenen Anzahl unterworfender Frost-Tau-Zyklen und für die Lumineszenz untersucht (Mittelwert ± SD).

Figur 6
Abb. 6: Vorbereiten Coelenterazin Substrat für Gluc-SERCaMP Assays (A) Das Kulturmedium wurde von SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP Zellen mit 300 nM Tg (oder Fahrzeugsteuerung) für 5 h behandelt Linien gesammelt. Gluc-Aktivität im Medium wurde durch Injektion von PBS + verschiedene Konzentrationen von Coelenterazin bewertet (Mittelwert ± SD, n = 6). (B) Lumineszenz Werte von Feld A wurden normalisiert, um Vehikel-behandelten Kontroll an jeder Substratkonzentration, die Thapsigargin-induzierte Effekt beurteilen. (C) Das Substrat Verfall über mehrere Stunden. Lumineszenz aus einer bekannten Menge eines rekombinanten Gluc (0,1 ng bzw. 0,02 ng) wurde über mehrere Stunden nach der Herstellung Substrat gemessen (Mittelwert ± SD, n = 4). (D) Während der rohen Lumineszenz zur rekombinantenGluc verringert Laufe der Zeit durch Zerfall Substrat wurde die fachen Unterschied in den Proben (wie von Lumineszenz bestimmt) gehalten.

Figur 7
Abb. 7: Überlegungen für Gluc-SERCaMP Assays zur Kinetik der Gluc / CTZ Reaktionsbezogenen (A) Das Kulturmedium verändert den Zerfall von Gluc / CTZ Signal. 5 ul Überstand, der Gluc-SERCaMP mit variierenden Verhältnissen von PBS und Kulturmedium gemischt. 100 ul Substrat (15 uM CTZ in PBS + 500 mM Ascorbinsäure) wurden zu 50 ul der Probe, die verdünnt wurde, wie in der Tabelle aufgeführt zugesetzt. Lichtemission wurde über 15 Minuten überwacht. (B) 5 & mgr; l Medium wurde von SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL Zellen und 100 ul Substrat (8 uM CTZ in PBS + 5 mM NaCl) gesammelt wurde zugegeben. Lumineszenz unmittelbar nach der Zugabe von Substrat (T = 0), und alle 30 Sekunden über gemessene die innerhalb von 15 min (± SD, n = 12). Daten werden als Prozent Signals relativ zu der vorherigen 30 Sekunden Intervall, um die Zerfallsrate zu bewerten aufgetragen. Der Einschub zeigt die rohen Lumineszenz-Daten.

Figur 8
Abbildung 8:. Pharmakologische Bestätigung der ER Kalzium Erschöpfung (A) Wirkung von 100 nM Thapsigargin auf Gluc-Sekretion wurde für Gluc-ASARTDL und Gluc-No tag Steuersucht (Mittelwert ± SD, n = 6). (B) Stabilisierende ER Calcium mit Dantrolen (RyR Antagonist) hemmt Tg-induzierte SERCaMP Release. Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Dantrolen 30 min oder 16 h vor der Zugabe von 100 nM Thapsigargin vorbehandelt. Gluc-Aktivität im Medium wurde nach 4 h (Mittelwert ± SD, n = 6).

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Abb. 9: Mock repräsentative Ergebnisse für die Gluc-SERCaMP Assay Beachten Sie die Vehikel behandelten Werte können zwischen den Platten zu verringern, aufgrund eines Ausfalls (abhängig vom Zeitintervall zwischen dem Lesen einzelner Platten) Substrat. Um diesen Effekt zu berücksichtigen, wird die Behandlung spezifischer Effekt unabhängig für jede Platte berechnet und dieses Verhältnis wird über die Platten verglichen.

Datum Ratte Rohrmasse (mg) Heparin Volumen (ml) Heparin Dichte (g / ml) Heparin Masse (mg) Masse der Rohr + Heparin (mg) Gesamtmasse nach der Blutentnahme (mg) Masse der gesammelten Blut (mg) Dichte Blut (g / ml) Berechnete Volumen Blut (ul) Volume von Heparin für 2 benötigt: 1-Verhältnis ml ist zusätzliche Heparin vor Schleuder hinzufügen
01.01.15 SD Male 1.135,9 50 1.117 55.83 1.191,73 1.317,70 125,97 1.05 119,97 59.98 9.98

Tabelle 1:. Blutentnahme Tabelle Beispiel eines Blutabnahmeprotokoll für SERCaMP Studien.

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Discussion

Dieses Protokoll hebt die in vitro und in vivo Nützlichkeit Gluc-SERCaMP Erschöpfung der ER Calcium zu überwachen. Obwohl die Proteinmodifikation, um SERCaMP erzeugen scheint auf andere Reporter-Proteine ​​12 verallgemeinern, wählten wir Gaussia-Luciferase für seine robusten (200-1000-fach größer) Biolumineszenz im Vergleich zu anderen Luciferasen 18. Wir zeigen, nachweisbar Thapsigargin-induzierte Gluc-SERCaMP Mitteilung über einen 100-fachen Dosisbereich von Gluc-SERCaMP Virus auf primäre kortikale Neuronen der Ratte, SH-SY5Y-Zellen und Rattenleber geliefert (Abbildungen 3 und 4). Wir zuvor beschrieben die Erzeugung einer stabil transfizierten Zelllinie, Gluc-ASARTDL und gezeigt, dass so wenige wie 20 Zellen in einer Population von 5 · 10 4 unmarkierten Zellen können eine Thapsigargin induzierte Reaktion 12 melden. Hier zeigen wir, dass die stabile Zelllinie konsequent Tg-induzierte Reaktion berichten out bis 15 Durchgänge, die analyzed, was anzeigt, dass eine kontinuierliche Expression des Reporter über die Zeit nicht beeinflusst seine Fähigkeit, als Reaktion auf ER Calciummangel (Abbildung 1) gelöst werden. Unsere Daten zeigen, dass Gluc-SERCaMP ist in erster Linie innerhalb des ER einer Zelle gehalten, bis eine Zeit von ER Calciumverarmung, wenn sie ausgeschieden wird. Unter "normalen" Bedingungen, gibt es eine geringe basale Sekretion, die die Einrichtung von Basislinie ER Calciumhomöostase 12 erlaubt. Folgende ER Calciumverarmung durch Thapsigargin, intrazelluläre und extrazelluläre Lumineszenz Änderung in entgegengesetzte Richtungen. Dies kann als ein Verhältnis zu einer Verschiebung der stationären Leistungsverteilung des Sensors (2) zeigen, ausgedrückt werden. Wichtiger ist, als SERCaMP Freisetzung durch KDEL-Rezeptor-Expression 12 moduliert wird, das Ausmaß der Freisetzung kann je nach Zelltyp variieren. Wir stellen uns vor, dass Substitution 'ASARTDL' mit alternativen KDEL artigen carboxyterminalen Sequenzen erforderlich sein, um maxi erreichenmal SERCaMP Antwort in einem bestimmten Zell- oder Gewebetyp.

Für die in vitro-Assays, werden Niveaus von extrazellulärem Gluc-SERCaMP Laufe der Zeit aufgrund der Stabilität des sekretierten Reporter akkumulieren; berichteten wir eine ungefähre 5-10% Abnahme der Aktivität nach 72 h 12. Als solche kann vor Austauschmedium auf das Einleiten eines pharmakologische oder genetische Herausforderung ER Calciumhomöostase notwendig sein, das Hintergrundsignal aufgrund von Sensorakkumulation zu reduzieren. Im Gegensatz dazu ist die Halbwertszeit von Gluc-SERCAMP in vivo ist 3,5-4,7 min 12 Anzeigesignal im Plasma stellt eine kürzlich erfolgte Freilassung der Reporter in zirkulierenden Blut. Sobald Blut ex vivo und zur Plasmabearbeitung ist jedoch Gluc-SERCaMP sehr stabil (Abbildung 5).

Für die beschriebenen Methoden wird das Medium oder Plasma opake 96-Well-Platten vor enzymatischen Assays überführt. Zwei wichtige Faktoren, die bei Verwendung von Gluc-basierten Reporters sind Flash-Kinetik und Abbau des Coelenterazin Substrat des Enzyms. Plattenleser mit Einspritzventilen ausgestattet sind, am besten für die Ausführung von Gluc enzymatische Tests, die Zeit zwischen der Substratzugabe und Lumineszenzmessungen normalisieren geeignet. Die chemischen Eigenschaften von Coelenterazin machen es anfällig für Fäulnis, die den Vergleich raw gemessen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Untergrundvorbereitung Lumineszenz Werte ausschließt. Fach Unterschiede zwischen den Proben, jedoch erhalten (Figur 6), so dass der relative Unterschied zwischen den Kontroll- und experimentellen Proben, über die Dauer der Experimente (Abbildung 9) verfolgt werden.

Die Fähigkeit, ER Calciumschwankungen in vivo zu überwachen ist vorteilhaft, wenn die Untersuchung fortschreitenden Krankheiten. Obwohl andere Verfahren, wie Fluoreszenz zytoplasmatischen Farbstoffe eignen sich zum spitzen in vitro-Studien ist eine SERCaMP Reporter die erste Längs ER Calcium Überwachung zu ermöglichen. Our Protokoll umreißt direkte Leber Injektionen von AAV-Gluc-SERCaMP. Wir haben stetig Ebenen Gluc-SERCaMP in Zirkulation unangefochten Tieren 56 Tage nach der Injektion festgestellt (neueste Zeitpunkt bisher getestet) und vorherzusagen, mehr Experimente sind möglich 12. AAV-Vektoren sind klein, die ungefähr 20 nm im Durchmesser und ein minimales Biosicherheit Anforderungen 19. Die Umwandlung von AAV einzelsträngige Genom um doppelsträngige DNA zu umgehen, wurde AAV-SERCaMP als AAV-Serotyp-1 doppelsträngigen Vektor 20 verpackt. AAV-Serotyp-1 ist gezeigt worden, wirksam zu transduzieren Rattenlebern 19,21; jedoch ist die Einschränkung der Injektionstechnik das Potential Virus auf andere Gewebe im Körper zu reisen. Obwohl der Vektor direkt in die Leber injiziert wird, kann unsere Methode wie dargestellt die Quelle SERCaMP Freisetzung nicht zu erkennen, und daher ist es möglich, daß andere als die Lebergewebe kann dem Gluc-SERC beitragenaMP Signal. Zukünftige genetische Manipulationen wird Meinungsäußerung einschränken, um Gewebetypen abzielen. Zum Beispiel gekreuzt gewebespezifische Cre Treiberleitungen mit einem Cre-abhängigen Gluc-SERCaMP für gewebespezifische Überwachung von ER Calcium über Plasma-Probenahme zu ermöglichen.

Die beschriebene in vivo Technik nutzt niedrige Virus-Titer aufgrund der Robustheit der Reporter. Gluc-SERCaMP Mitteilung ist eine virale Bereich von 7,6 x 10 7 vg auf 7,6 x 10 9 vg (Abbildung 4) festgestellt werden. Dieser Bereich ist 4-400 mal niedriger als in früheren Arbeiten Verwendung Glühwürmchen-Luciferase-basierten viralen Injektionen von der Leber 19 gemeldet. Bei höheren Konzentrationen, beobachteten wir einen Verlust der nachweisbaren Expression im Laufe der Zeit, was möglicherweise auf eine Immunantwort des Tieres auf das Transgen 22. Höhere Titer von Virus sollte, wenn möglich, aufgrund der erhöhten Wahrscheinlichkeit von Signalverlust vermieden werden. Niedrigere Titer als die vorgestellt haben nichten getestet. Dieses Protokoll beschreibt Injektionen von AAV-Gluc-SERCaMP in der Leber; Ähnliche Ansätze werden in der Theorie möglich, für andere Gewebetypen. Parameter wie Viruskonzentration und Serotyp muss für eine ausreichende Expression in anderen Geweben optimiert werden.

Durch die robuste Natur der Reporter, können kleine Mengen von Blut (100-150 ul) aus Schwanz Schnittgut aufgefangen werden, so dass für die wiederholte Sammlungen in Experimenten. Dies war nützlich für die Längs Charakterisierung von Gluc-SERCaMP Mitteilung als Reaktion auf Thapsigargin, wo wir beobachteten erhöhte Werte nach Thapsigargin Verabreichung, gefolgt von einer Rückkehr zu den Ausgangswerten (Abbildung 4). Der richtige Umgang mit den Plasmaproben nach der Blutentnahme ist ebenfalls wichtig. Als solche haben wir gezeigt, dass SERCaMP ist vor der enzymatischen Assay (Figur 5) im Plasma bei 4 ° C bis zu 72 Stunden gelagert stabil. Weiterhin kann Plasmaproben mindestens drei Gefrier / t durchlaufenHAW Zyklen mit minimaler Wirkung auf die Lumineszenz (Abbildung 5). In der Praxis, speichern wir alle Proben bei -80 ° C, vermeiden unnötige Einfrieren und Auftauen vor der Beurteilung der enzymatischen Test, und alle Proben zu analysieren für ein Experiment zur gleichen Zeit.

ER Calciumverarmung in der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht. Es wird oft angenommen, dass ein stromaufwärts Ereignis, Zellfunktionen verhindert und führt zur Aktivierung des ungefalteten Protein Response (UPR) betragen. Die UPR ist eine adaptive Reaktion des ER eingesetzt, um homöostatischen Bedingungen 5 wiederherzustellen. Chronische Zustände von ER-Stress die Kapazität des UPR überschreiten, um die Homöostase wieder herzustellen, letztlich zum Zelltod führt. ER Stress und ER Calcium Dysregulation in Krankheiten wie Typ-1-Diabetes, diabetischer Nephropathie, neurodegenerative Erkrankungen und kardiovaskulären dieases 5 beobachtet. Das Verhältnis zwischen Calcium- Dysregulation und Pathogenese der Erkrankung ist jedoch schwierult, um abzugrenzen. Die SERCaMP Technologie hat das Potenzial, um diesen Prozess über die Lebensdauer eines Tieres zu verfolgen, wodurch Einblicke in die Entwicklung der Krankheit und Verlauf. Ferner ist die Evaluierung von potentiellen Therapeutika zur Verhütung oder zur korrekten ER Calcium Dysregulation kann durch die Verwendung von SERCaMP beurteilen. Schließlich identifiziert Krankheiten, bei denen Gluc-SERCaMP Freisetzung erfolgt, bietet die Möglichkeit, zu konstruieren und zu verwenden sezernierten therapeutischen Proteine ​​oder Peptide als SERCaMPs als Mittel der Krankheit geregelt Gentherapie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes Fisher  02-682-550
10% NP-40 solution  Pierce 28324 for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes Fisher 14-823-30
200 microliter filter tips Rainin RT-L200F
3-0 surgical sutures Fisher NC9598192
30 G needles Fisher Scientific 14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheets Thermo AB-0558
Alcohol prep pads Fisher 22-246-073
Anesthesia Auto Flow System E-Z Anesthesia EZ-AF9000
Animal recovery chamber Lyon Vet ICU-912-004
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Betadine solution Fisher NC9386574
Bleach Clorox n/a
Bovine growth serum Thermo SH30541.03
Coelenterazine, Native Regis Technologies 1-361204-200
Cotton tipped applicators Puritan 806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures WPI 501803
Digital ultrasconic cleaner Fisher Scientific FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate Life Technologies 10569-010
DNA mass ladder Life Technologies 10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein) Nanolight 321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) New England Biolabs E8023S 1:2,000 (WB)
Germinator 500 CellPoint Scientific DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque) Fisher 07-200-589
Hank's balanced salt solution Life Technologies 14175-095
Heparin Allmedtech 63323-276-02
Isoflurane Butler Schein 29404
Ketamine Henry Schein 995-2949
Kwik Stop Styptic powder Butler Schein 5867
L-glutamine Sigma G8540
Methanol Fisher a452-4
Microfuge 22R Centrifuge Bekman Colter 368831
Neosporin Fisher 19-898-143
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
Nikon Stereoscope Nikon SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup Machery-Nagel 740609
P200 pipet Rainin L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit Clontech 632200
PCR film seal Fisher AB0558
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
ReFresh Charcoal Filter canister E-Z Anesthesia EZ-258
Scalpel blades, #10 Fine Science tools Inc 10010-00
SD rats 150-200 g Charles River Rats rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags National Band and Tag co 1005-1
Sterile surgical drapes Braintree Scientific SP-MPS
Synergy 2 plate reader BioTek n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Thapsigargin Sigma T9033 harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix Life Technologies K4975-00
Xfect Transfection reagent Clontech 631318
Xylazine Valley Vet 468RX

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References

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