Overvågning endoplasmatisk reticulum Calcium Homeostase Ved hjælp af en * These authors contributed equally

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Yan, X., Harvey, B. K. Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP. J. Vis. Exp. (103), e53199, doi:10.3791/53199 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det endoplasmatiske reticulum (ER) indeholder det højeste niveau af intracellulær calcium, med koncentrationer på ca. 5.000 gange større end cytoplasmiske niveau. Tight kontrol over ER calcium er bydende nødvendigt for protein foldning, modifikation og menneskehandel. Perturbationer til ER calcium kan resultere i aktivering af det udfoldede protein respons, en trestrenget ER stress respons mekanisme og bidrage til patogenesen i en række sygdomme. Muligheden for at overvåge ER calcium ændringer i sygdomsstart og progression er vigtigt i princippet, men udfordrende i praksis. I øjeblikket tilgængelige metoder til overvågning ER calcium, såsom calcium-afhængige fluorescerende farvestoffer og proteiner, har givet indsigt i ER calcium dynamik i celler, men disse værktøjer er ikke velegnede til in vivo studier. Vores laboratorium har vist, at en ændring af carboxyterminalen af Gaussia luciferase giver sekretion af reporteren som reaktion påER calcium udtynding. Fremgangsmåderne til anvendelse af en luciferase baseret, udskilles ER monitorering af calcium protein (SERCaMP) til in vitro og in vivo anvendelser er beskrevet heri. Denne video fremhæver hepatiske injektioner, farmakologisk manipulation af gluc-SERCaMP, blod indsamling og behandling, og analyseparametre for langsgående overvågning af ER calcium.

Introduction

Det endoplasmatiske reticulum (ER) fungerer i mange cellulære kapacitet herunder proteinfoldning, protein sekretion, lipid homeostase og intracellulær signalering 1. Centralt for normal ER funktion er at opretholde luminale calcium koncentrationer ved ~ 5.000 gange de fundet i cytoplasmaet 2-4. Denne energiintensiv proces er reguleret af Sarco / endoplasmatisk reticulum calcium ATPase (SERCA), en pumpe, der bevæger sig calciumioner ind på skadestuen. Udstrømning af calcium fra ER medieres primært af ryanodine (RyR) og inositoltriphosphat (IP3R) receptorer. Fordi mange ER processer er afhængige af calcium, kan forstyrre butikken føre til ER stress og eventuel celledød.

ER calcium dysregulering er blevet observeret i sygdomme, herunder kardiomyopati, diabetes, Alzheimers og Parkinsons 5. På grund af den progressive karakter af disse sygdomme, har det været en udfordring at afgrænse årsag-effekt relationship mellem patogenese og ændringer i ER calcium butikken. En række teknologier har tilladt for betydelige fremskridt i vores forståelse af ER calcium dynamik, herunder farvestoffer og genetisk kodede calcium indikatorer (GECIs). Lav affinitet calcium farvestoffer, som stigning i fluorescens ved binding til Ca2 +, kan indlæses i celler for at undersøge subcellulære rum med høje koncentrationer af calcium 6. GECIs, såsom D1ER og Catcher giver mulighed for overvågning af calcium udsving med mere præcis styring af subcellulære lokalisering 7-9. For nylig, en anden klasse af GECIs kaldet calcium-måling organel-indkapslet protein indikatorer (CEPIA) er blevet beskrevet 10. En tredje tilgang, der kombinerer genetik og lille molekyle kemi er målrettet-esterase farvestof belastning (TED), som benytter en genetisk kodet carboxylesterase (målrettet til skadestuen) med en ester-baseret calcium farvestof 11.

Mens aTændementioned tilgange har iboende styrker og svagheder, de kan give værdifuld indsigt i ER calcium dynamik gennem akutte målinger af fluorescens. De er imidlertid ikke optimal for de langsgående undersøgelser ofte er nødvendige for at undersøge sygdomsprogression. Med det mål at udtænke en fremgangsmåde til at overvåge calcium dynamik over længere tidsperioder, vi identificeret og udviklet et protein modifikation for at skabe de udskilte ER calcium proteiner overvågning (SERCaMPs) 12.

SERCaMP omgår flere begrænsninger forbundet med andre metoder, ved at give en minimalt invasiv tilgang til gentagne gange afhøre ER calcium butikken. Vi har tidligere vist, at den carboxyterminale peptid ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-threonin-asparaginsyre-leucin) er tilstrækkelige til at fremme ER retention; dog under betingelser, der forårsager fald i ER calcium, peptidsekvensen er ikke længere i stand til at bevare ER localization og proteinet udskilles 13. Grundlaget for SERCaMP teknologi er vedhænget i ASARTDL til carboxyterminalen af et udskilt protein (f.eks Gaussia luciferase eller gluc), således at udskillelse udløses af ER calcium udtømning, således at der skabes en robust reporter af ER calcium dysregulering 12. Ekspressionen af ​​gluc-SERCaMP via transgene metoder muliggør biologiske væsker, herunder cellekulturmedium og plasma, der skal analyseres for ændringer i gluc aktivitet som en indikator for ER calciumhomeostase. Metoden har applikationer til den langsgående undersøgelse af progressive ændringer i ER calcium butikken både in vitro og in vivo. Følgende protokol er skrevet som en generel skitse for brug gluc-baserede SERCaMP at studere ER calciumhomeostase, men protokollen kan tjene som vejledning for alternative reporter SERCaMPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. In vitro assay: Afsløring SERCaMP Frigivelse fra et Stabil SH-SY5Y cellelinje

  1. Plate SH-SY5Y-gluc-ASARTDL (SERCaMP) i vævskulturbehandlet plader ved 150.000 celler pr cm2 overfladeareal. For plader med 96 brønde, for eksempel frø 50.000 celler per brønd (figur 1A). Grow SH-SY5Y-celler i DMEM (høj glucose, GlutaMAX, pyruvat) + 10% bovint serum vækst + 1x penicillin / streptomycin.
    1. Passage celler op til 15 gange (figur 1b). Højere passage nummer er ikke blevet testet.
    2. Retur celler til befugtet inkubator ved 37 ° C med 5,5% CO2 og inkuberes natten over.
  2. Før eksperimentel behandling (r), indsamle en basislinieprøven for hver brønd ved at overføre 5 pi kultursupernatant til en uigennemsigtig walled 96-brønds plade. Før indsamling, blidt tryk på pladen på alle sider og slyng at undgå gradient effekter. Forsegl uigennemsigtig plade med et klæbemiddel sEaling ark og opbevares ved 4 ° C indtil tidspunktet for enzymatisk analyse.
    Bemærk: udskilt gluc-SERCaMP er meget stabil i celledyrkningsmedium. Vi har tidligere rapporteret ca. 5-10% af gluc aktivitet blev tabt efter en 72 timers inkubation ved 37 ° C (inkuberet på SH-SY5Y-celler) 12.
  3. Behandle celler som ønsket for at undersøge ER calcium depletion (f.eks miljøet, farmakologiske, genetiske manipulationer). Undgå langvarig udsættelse for omgivende miljø (uden for den kontrollerede inkubator) som pH-ændringer vil hurtigt opstå ved atmosfærisk CO2. Tilføj HEPES til dyrkningsmediet ved 20 mM, til stabilisering af pH 14, hvis der kræves langvarig manipulationer. Undgå udsættelse for lys, når du bruger HEPES i dyrkningsmedium 15.
    1. Positiv kontrol: Behandl celler med 100 nM thapsigargin (Tg) eller 50 uM cyclopiazonsyre (CPA) for 4-6 timer til forsøg i SH-SY5Y celler. Maksimale reaktion i andre cellelinjer kan kræve længere inkubationer eller forskellige koncentioner af forbindelser.
    2. Negativ kontrol: Collect dyrkningsmedium fra forældrenes SH-SY5Y celler. Det er vores erfaring, baggrunden luminescens for denne analyse er mindre end 0,05% af basal sekretion fra stabile SH-SY5Y-gluc-SERCaMP celler.
  4. Indsamle og prøver af konditioneret medium lager 5 pi ved de ønskede tidspunkter, som beskrevet i trin 1.2.
  5. Vurdere enzymatiske aktivitet i mediet som skitseret i afsnit 5.
  6. Undersøg intracellulær gluc ved immunoblot eller luminescens-assay.
    1. For immunoblot: lyserer cellerne i modificeret RIPA-buffer indeholdende 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA, 1% NP40, og proteasehæmmere. Separat på SDS-polyacrylamidgel og overført til 0,20 um PVDF-membran. Inkuber membranen med gluc antistof (1: 2.000 fortynding) natten over ved 4 ° C. Udfør sekundære antistof inkubation og membran vasker som pr brugerdefineret protokol til detektionsreagens af valg.
    2. Forluminescens assay (figur 2): udføre følgende trin på is:
      1. Fjern alle medium fra brønde i vævskulturpladen og skyl med 200 pi kold PBS.
      2. Tilføj 75 pi lysisbuffer indeholdende 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 og proteasehæmmere til hver brønd.
      3. Drej pladen på en orbitalryster (120 rpm) ved 4 ° C i 20 minutter.
      4. Forsigtigt pipetteres lysatet op og ned ved hjælp af en multikanal pipette, undgå luftbobler. Overfør 5 pi lysat til en uigennemsigtig plade og vurdere luminescens som skitseret i afsnit 5.

2. In vitro assay: Forbigående Transfektion af Immortaliserede Celler med SERCaMP

Bemærk: Vi har observeret, at forbigående transfektion procedurer kan inducere cellulært stress og sløve den efterfølgende gluc-SERCaMP respons. Følgende fremgangsmåde blev udviklet for at minimere transfektion eff ECTS i SH-SY5Y celler. Det kan være nødvendigt at optimere denne procedure (herunder valg af transfektionsreagens) efter alternative cellelinier. Når det er muligt, anbefales det at anvende stabile cellelinier eller virale transduktion metoderne i afdeling 1 og 3 hhv.

  1. Plade SH-SY5Y-celler i en 100 mm skål på 4 x 10 6 celler. Denne skål vil være tilstrækkelig til at re-seed cirka 300 brønde (96-brønds plade-format) efter transfektionsproceduren.
  2. Transficere celler med Xfect reagens under anvendelse af 20 ug plasmid-DNA (der koder gluc-SERCaMP) og 6 pi Xfect reagens. Skala DNA og Xfect reagens i overensstemmelse hermed for større eller mindre dyrkningsbeholdere.
  3. Retur celler til inkubatoren i 48 timer.
  4. Trypsinisér cellerne og reseed til 96-brønds plader ved 60.000 celler per brønd. Følg efterfølgende trin er skitseret i afsnit 1.

3. In vitro assay: virusvektor-medieret ekspression af gluc-SERCaMP

telt "> Bemærk: Adenoassocieret viral (AAV) vektor emballage 16 og rensning 12 og lentivirus produktion 13 er tidligere blevet rapporteret.

  1. Titer gluc-SERCaMP AAV anvendelse af følgende primere og prober: fremadrettet primer, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; reverse primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; sonde (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 mærket), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'til kvantitativ PCR.
    1. Forbered standardkurven ved linearisering et plasmid indeholdende gluc og oprense DNA ved hjælp af en spin-søjle (f.eks Machery-Nagel NucleoSpin Gel og PCR oprydning). Kvantificere DNA'et ved at separere på en agarosegel sammen med en masse stige. Forbered 1:10 fortyndinger af DNA fra 100 pg / ml til 10 fg / ml i PBS. Beregn kopier / ml gluc plasmid-DNA ved hver af koncentrationerne baseret på molekylvægten af ​​plasmidet.
    2. Fortynde AAV lagre i PBS (passende fortynding vil være afhængig afparametre for viral forberedelse og bestemmes empirisk).
    3. Kør PCR-reaktionen i en real-time PCR-system under anvendelse af følgende betingelser: 95 ° C x 5 min, 94 ° C x 20 sek, og 60 ° C x 1 min for 41 cykler. Beregn kopier / ml ved hjælp af standardkurven.
  2. Titer lentivirus med en p24 Lenti-X hurtig titer kit. Tø lentiviral portioner på is og fortyndes p24 kontrol protein i SH-SY5Y medium.
    1. Fortynd lentivirus, således at den vil falde på standardkurven (f.eks 1: 20.000 eller 1: 100.000). Fortyndingsfaktoren krævede vil variere baseret på de lentivirale forberedelse parametre og skal bestemmes empirisk. Følg producentens anvisninger for alle efterfølgende trin.
  3. Plate celler til plader med 96 brønde. For SH-SY5Y celler, kan følges plating procedurerne i § 1. For rotte primære kortikale neuroner bør celler isoleres og podet på passende overtrukne plader ens tidligere beskrevet 16. Opretholde rotte primære corticale neuroner i Neurobasal medium suppleret med 1 x B27 og 500 pM L-glutamin. Udfør halv mellemstore udvekslinger hver anden dag.
  4. Transducere cellerne med virus. Målet med viral transduktion er at opnå ekspression på lavt niveau, som Gaussia luciferase giver robust signal.
    1. AAV transduktion SH-SY5Y celler: transducere dagen efter plating. Fortynd AAV til 6,0 x 10 7 vg / pl i AAV fortyndingsbuffer (PBS + 0,5 mM MgCl2). Tilsæt 5 pi fortyndet AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI på ca. 6.000) pr brønd i 96 brønds plade (figur 3A). Brug 10% blegemiddel for at inaktivere viral vektor affald.
    2. AAV transduktion af rotte primære kortikale neuroner: transducere 6-8 dage efter udpladning. Fortynd AAV til 4,0 x 10 6 vg / pl i AAV fortyndingsbuffer. Tilsæt 5 pi af fortyndet AAV (2,0 x 10 7 vg, MOI på ca. 350) per brønd afPlade med 96 brønde (figur 3B). Den optimale MOI bør bestemmes empirisk for andre celletyper. Brug 10% blegemiddel for at inaktivere viral vektor affald.
    3. Lentiviral transduktion af SH-SY5Y celler: transducere dagen efter plating. Fortynd lentivirus til 20 pg / pl p24 (koncentration bestemt ved anvendelse titrering kit) i Hanks balancerede saltopløsning. Tilføj 5 pi af den fortyndede virus per brønd (100 pg p24, svarende til 1.250.000 lentivirale partikler eller ~ 1.250 IFUs), i en 96-brønds plade indeholdende 100 pi volumen. Skalere derfor til større formater. Brug 10% blegemiddel at inaktivere viral affald.
  5. Saml en forbehandling prøve af medium og begynde forsøgsbehandlinger 48 timer (SH-SY5Y) eller 5-7 dage (rotte primære kortikale neuroner) efter transduktion.

4. In vivo-assay SERCaMP

Bemærk: Før udførelse af nogen dyreforsøg være sikker på at få ordentlig godkendelse via din institution. Alleoverlevelse operationer skal udføres under sterile forhold med tilstrækkelig anæstesi. Alle procedurer, der er beskrevet nedenfor, er blevet godkendt og er i overensstemmelse med NIH ACUC retningslinjer.

  1. Autoklave kirurgiske instrumenter før start af kirurgi (121 ° C, 30 min sterilisation, 20 min tørretid). Rengør alle instrumenter i en ultrasonikator umiddelbart efter alle procedurer og før autoklavering. Opretholde sterile forhold under overleve operationen. For operationer, der kræver flere dyr, tørre kirurgiske instrumenter med 70% alkohol, ultralydsbehandles og perle sterilisere mellem rotter. Se Materialer liste for nødvendige instrumenter.
  2. Forbered rotte til operation. Vi bruger Sprague-Dawley (180-200 g).
    1. Bedøver rotter under anvendelse af gas isofluran i 3 minutter (4-5% isofluran leveret på 1.000 cc / min) efterfulgt af intraperitoneale injektioner af xylazin (8 mg / kg) og ketamin (80 mg / kg). Anvend oftalmisk salve for at beskytte hornhinder mod udtørring. BeGIN kirurgi når rotten er dybt bedøvet som påvist ved manglende tilbagetrækning refleks efter hale eller fod knivspids.
    2. Barbere regionen maven lidt under ribbenene (lav thorax område) til midten af ​​maveregionen. Skrub kirurgiske område tre gange, skiftevis 70% alkohol og Betadine krat. Placer rotte i liggende stilling på steril kirurgisk område med sterile kirurgiske gardiner.
  3. Fortynd AAV-gluc-SERCaMP til 7,6 x 10 9 vg / ml (slutkoncentration). Bland godt ved at vende røret.
    Bemærk: Rækkevidde af viral koncentration kan variere (figur 4).
    1. Pipetter 105 pi fortyndet AAV i en steril skål. Brug en 30-gauge nål til at indsamle virus i en sprøjte.
  4. Udføre kirurgi for at eksponere leveren og injicere AAV-gluc-SERCaMP.
    1. Forud for at gøre et snit i maven, gælder 0,25% bupivacain til snittet området. Ved hjælp af en skalpel, lave en vandret snit under brystkassen (apkring 2-3 cm). Blunt dissekere at adskille bindevæv fra hypodermis.
    2. Skær mavemuskel, udsætter den rigtige mediale lap af leveren.
      Bemærk: ekstra lapper kan injiceres baseret på enden ansøgning.
    3. Placer dyret under kirurgisk mikroskop og justere for at få højre mediale lap af leveren i synsfeltet. Injicere virus i parenkym af den mediale lap; 3 separate steder, cirka 33 pi pr webstedet.
      Bemærk: Lad nål i væv i 5-10 sek efter injektion for at sikre levering af injektionsvolumen hele.
    4. Sy den abdominale muskler og hud separat og tilføje Neosporin hjælp bomuld applikator. Placer rotte i et opsving kammer, indtil bevidstheden er genvundet, og rotte er i stand til at opretholde oprejst position. Efterlad ikke rotte (r) uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. House enkeltvis, indtil snittet er helet, og suturer er blevet fjernet (7-14 dage).
  5. Begynd hale blodtapning 4-7 dage efter injektion. Forbered blodopsamlingsrør af mærkning og præ-vejning. Der tilsættes 50 pi heparin (1.000 U / ml) til hvert rør.
  6. Sted rotte i isofluran anæstesi kammer i 3 minutter (4-5% isofluran leveret på 1.000 cc / min). Fjern rotte fra kammeret og sted i næsekegle (2-3% isofluran leveret ved 500 cc / min). Blodopsamling kan begynde, når rotten er dybt bedøvet som påvist ved mangel på tilbagetrækning refleks følgende hale piNCH.
    1. Brug steril saks klippe halespids (1-2 mm) og indsamle blod dråbevis i fyldt heparin rør. Indsamle blod, indtil volumen bliver større end 2: 1 blod til heparin ratio (> 100 pi blod / 50 pi heparin). Blood indsamling mængder kan justeres baseret på eksperimentelle design. Brug en våd bomuldsapplikator at anvende blodstillende pulver til halen for at stoppe blødningen.
    2. Store blod rør ved 4 ° C, hvis indsamle efterfølgende prøver. Tør saks med ethanol pad og perle sterilisere mellem samlinger.
    3. Opsamlingsrør vejes, og juster med heparin til opnåelse af 2: 1-forhold (blod: heparin). Dette trin vil normalisere mængden af heparin i hver prøve (tabel 1).
    4. Centrifugerør ved 2.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten (plasma) til et frisk rør og opbevares ved -80 ° C indtil tidspunktet for luciferase assay (afsnit 5).
      Bemærk: Opbevaring af prøver ved 4 ° C op til 72 timer før enzymatisk assay har minimal virkning på luminescens (figur 5A). Op til 3 fryse-tø cyklusser af plasmaprøver har ingen indvirkning på luminescens (figur 5B).
  7. Thapsigargin administration (positiv kontrol):
    1. Forbered thapsigargin ved fortynding i ethanol til en slutkoncentration på 2,5 mg / ml. Injicere thapsigargin ved 1 mg / kg ip i underlivet.
      Bemærk: thapsigargin øger thrombininduceret blodpladekoagulation 17 og kan gøre indsamling af blod fra halen vanskeligere.
  8. Gaussia luciferase assay:
    1. Optø plasmaprøverne på is.
      Bemærk: longitudinelle studier, tø og udfører luminescens assay for alle tidspunkterne prøver på samme dag (ved hjælp af enkelt præparat af substrat).
    2. Overfør 10 pi plasma til en uigennemsigtig walled plade og måle enzymatisk aktivitet, som beskrevet i afsnit 5. Run 3-4 tekniske replikater af hver plasmaprøve.
  9. Euthanasien
    Bemærk: Fordelen ved SERCaMP teknologi er evnen til at overvåge langsgående ER calcium. Afhængig af eksperimentelle parametre og endpoint analyser, er dyr, der skal aflives ved foranstaltninger egnede til endepunkt analyser og i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer ACUC.

5. Luminescence Assay

  1. Forbered coelenterazine (CTZ) stamopløsninger ved fortynding af forbindelsen i sur methanol (30 pi 10 N HCI til 3 ml methanol) til 20 mM. Forbered engangsbrug portioner og opbevares ved -80 ° C.
  2. Forbered arbejder substrat på dagen for analysen.
    1. For in vitro-analyser, fortyndes coelenterazine til 8 uM i PBS, fx tilføje 10 pi 20 mM CTZ lager til 25 ml PBS (figur 6A, B).
    2. Til in vivo assays, fortyndes coelenterazine til 100 uM i PBS, 500 mM ascorbinsyre, 5 mM NaCl.
  3. Inkuber forberedt CTZ i mindst 30 minutterved stuetemperatur inden analysen startes.
    Bemærk: Dette trin er ofte inkluderet i Gaussia luciferaseassays da der er rapporter om hurtig substrat henfald i løbet af første 30 minutter efter forberedelse. Vi har ikke observeret denne effekt i vores system (figur 6C); Men vi ofte omfatter inkubationstrinet som vi har fundet nogen negativ indvirkning på analysen.
  4. Brug en pladelæser, der er stand til at overvåge bioluminescens og udstyret med et substrat injektor. Prime linjerne med underlaget.
    Bemærk: Den oprindelige substrat gennem linjer kan være tilbøjelige til nedbrydning. For at undgå kunstigt lave aflæsninger for tidlige prøver, injicere 20-30 tomme brønde (loading en tom plade på læseren) før måling eksperimentelle prøver.
  5. Indsprøjtes 100 pi substrat i godt, ryste medium hastighed i 5 sekunder, og måle lysemission. På Biotek Synergy II pladelæser, integrere lysemission i løbet af 0,5 sek (in vitro prøver) og 5 sekunder (ivivo prøver) til den læste trin. Optimer plade læser parametre for ideel assay ydeevne.
    Bemærk: Gaussia luciferase udviser flash kinetik med hurtig signal henfald (i forhold til at gløde kinetik observeret med andre luciferaser). Blitzen kinetik gluc påvirkes af serum i cellekultur medium (figur 7A), fremhæver betydningen af at styre til mellemstore sammensætning på tværs af prøver. På grund af den hurtige henfald af luminescens efter tilsætning substrat (flash kinetik), tiden mellem injicere og læse skridt skal være ensartet for alle prøver. Pladen Læseren skal indstilles til at indsprøjte substrat til et godt, vente en fast tid (f.eks vi bruger en 5 sek ryste trin), og læse, at godt. Tilsætning af substrat til en hel plade, før læsning er en betydelig udfordring, medmindre substrat kan tilsættes til alle brønde samtidigt. Hvis en injektor ikke er tilgængelig, kan problemet være delvist omgås ved at inkubere pladen i 10 min mellem substrat Addiog måling (hvorved man undgår den stejle del af henfaldskurven) (figur 7B).
  6. Gentag injektion, ventetid og læs trin for hver brønd på pladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den gluc-SERCaMP fremgangsmåde muliggør vurdering af ER calciumhomeostase ved stikprøver ekstracellulære væsker. Flere kontroller kan indgå i det eksperimentelle design kan forbedre fortolkning af resultaterne. For det første kan brug af et konstitutivt udskilt reporter (f.eks gluc uden C-terminale ASARTDL eller "gluc-Nr Tag") anvendes til at vurdere virkningerne af eksperimentelle behandlinger på sekretionsvejen (global cellulær sekretion) og transgen ekspression. For eksempel ville en stigning i de ekstracellulære niveauer af både gluc-SERCaMP og gluc-Nr Tag betragtes som en tvetydig resultat. Alternativt støtter en stigning i gluc-SERCaMP sekretion med en tilsvarende mangel på gluc-nr Tag respons en ER calciumafhængig begivenhed (figur 8). Udskillelsen af ​​gluc-SERCaMP som reaktion på ER calcium udtømning kan yderligere vurderes ved at måle intracellulær gluc, selv om dette er begrænset til en enkelt tidspunkterne som lysis er påkrævet. Int racellular gluc-SERCaMP vil falde som reaktion på ER calcium udtynding, som det gradvist udskilles, og det ekstracellulære: intracellulære forhold (beregnet for hver individuel brønd) vil stige (figur 2B). Det ekstracellulære: intracellulære forholdet er nyttigt at kontrollere for ændringer i transgen ekspression.

Farmakologiske modulatorer af ER calcium butikken kan anvendes til at bekræfte bidrag ER calcium til SERCaMP frigivelse i nye paradigmer. Dantrolen, en RyR antagonist, er kendt for at stabilisere ER calcium, som skal reducere eller inhibere frigivelsen af SERCaMP som reaktion på Tg (figur 8B). Det anbefales, når det er muligt, for at teste yderligere forbindelser, som påvirker ER calciumflux (f.eks Xestospongin C, 4-chlor-m-cresol) i nye eksperimentelle paradigmer beskæftiger SERCaMP. Disse undersøgelser er ofte en udfordring in vivo, men kan være mulig i tilsvarende vævskulturplader modeller.

"> For in vitro undersøgelser med gluc-baserede SERCaMP, anbefales det at beregne svar på individuelle plader i forhold til kontrolgruppen (r). Kan" behandling-inducerede 'svar vurderes over tidsforløbet ved at spore ændringer i relative respons versus kontrol ( til mellem-plade sammenligninger). Det er ikke tilrådeligt at sammenligne rå tal på tværs af flere plader, på grund af henfald af substrat, hvilket kan føre til ændringer i de rå værdier mellem tidspunkter (figur 6c). Making relative sammenligninger inden en plade minimerer denne virkning (figur 6D). Et eksempel på dataanalyse for en in vitro Tg-induceret SERCaMP frigivelse eksperiment er vist i figur 9.

Til in vivo undersøgelser med gluc-SERCaMP, bør data vurderes uafhængigt for hvert dyr, med hvert dyr tjener som sin egen "forbehandling" kontrol. Dette er nødvendigt at tage højde for variation i transgen delivery og ekspression mellem dyr (figur 4A).

Størrelsen af ​​SERCaMP svar vil blive påvirket af en række faktorer, hvoraf mange er relateret til baseline sundhed af cellerne og kan kontrolleres direkte af investigator. For maksimal SERCaMP lydhørhed, er det bydende nødvendigt at optimere betingelser, der begunstiger basal ER calciumhomeostase. Dette omfatter seeding celler ved optimal tæthed og brug af lave virustitere. Forskellige celle- og vævstyper kan have yderligere krav, som skal bestemmes empirisk.

Figur 1
Figur 1:. Stabil SH-SY5Y cellelinie podningstæthed og passage nummer overvejelser (A) SH-SY5Y-gluc-SERCaMP celler blev podet ved forskellige tætheder og inkuberet i 40 timer. Udskilt gluc-SERCaMP blev målt 4 timer efter behandling med 300 nM Tg okontrol R køretøj (middelværdi ± SD, n = 6). Thapsigargin-inducerede stigning i gluc-SERCaMP sekretion er indiceret til hver celle tæthed. (B) SH-SY5Y-gluc-SERCaMP celler ved passage nummer 2 og 15 blev undersøgt for thapsigargin-induceret sekretion. Celler blev behandlet med 100 nM Tg i 2 timer eller 4 timer, og udskilles gluc aktivitet blev normaliseret til vehikelbehandlede kontroller (middelværdi ± SD, n = 4, ingen signifikant effekt af passage-faktor, 2-vejs ANOVA). Stiplede linje angiver y = 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Enzymatisk assay til måling af intracellulær gluc-SERCaMP (A) intracellulære og (B) ekstracellulære gluc enzymatisk aktivitet blev vurderet i rotter primære cortiske neuroner (transduceret med AAV-gluc-SERCaMP). Seks dage efter transduktion, blev cellerne behandlet med 60 nM thapsigargin i 4 timer. Som gluc-ASARTDL akkumuleres i mediet, er tilsvarende fald i intracellulære niveauer observeret. (C) Et forhold af ekstracellulær: intracellulær gluc aktivitet kan beregnes for hver individuel brønd.

Figur 3
Figur 3:. AAV-gluc-ASARTDL titer versus thapsigargin-inducerede respons for SH-SY5Y-celler og rotte primære corticale neuroner (A) SH-SY5Y-celler blev podet i plader med 96 brønde ved 5 x 10 4 celler per brønd og fik lov til at klæbe natten over. Celler blev transduceret ved den angivne infektionsmultiplicitet (MOI), inkuberet i 48 timer og derefter behandlet med 300 nM Tg eller vehikel. Luminescens blev målt i mediet efter 8 timer (gennemsnit ± SEM, n = 3). * P <0,05, mulcomputeren genstarter måske flere t-test (Holm-Sidak korrektion). (B) Rotte primære kortikale neuroner blev transduceret på DIV8 med AAV-gluc-ASARTDL i de angivne MOI (beregnet 60.000 celler per brønd tilnærmelse på tidspunktet for transduktion). Fem dage efter transduktion, blev celler behandlet med 100 nM Tg eller kontrol køretøjet og luminescens i mediet blev målt efter 8 timer (gennemsnit ± SEM, n = 6). * P <0,05, flere t-test (Holm-Sidak korrektion).

Figur 4
Figur 4:. Thapsigargin-induceret gluc-SERCaMP udsætning i blod efter intrahepatiske injektioner end vifte af virustitere (A) Rå luminescens værdier fra rotter (n = 8) intrahepatisk injiceret med forskellige AAV-gluc-ASARTDL titre. Thapsigargin (1 mg / kg) injektion (ip) blev administreret på dag 12. Blod blev opsamlet ved angivne tidspunkter og opbevaret ved -80 & #176; C indtil tidspunktet for analysen. (B) Normaliseret luminescens værdier fra panel A, hvilket viser thapsigargin-inducerede SERCaMP respons i rotter (n = 8), der udtrykker forskellige mængder af AAV-gluc-ASARTDL.

Figur 5
Figur 5:. Håndtering og opbevaring af gluc-SERCaMP plasmaprøver (in vivo) (A) Plasma blev opsamlet fra rotter intrahepatisk udtrykker gluc-SERCaMP (n = 10), opdelt i portioner og opbevaret ved -80 ° C indtil tidspunktet for assays. Rørene blev fjernet fra -80 ° C og opbevaret ved 4 ° C i angivne tidspunkter forud for luminescensmåling (middelværdi ± SD). (B) Virkning af flere fryse / smelter af plasmaprøver på gluc enzymatisk aktivitet. Plasmaprøver indsamles fra rotter intrahepatisk udtrykker AAV-gluc-SERCaMP (n = 10) blev udsat for det angivne antalaf fryse-tø cykler og analyseret for luminescens (middelværdi ± SD).

Figur 6
Figur 6:. Forberedelse coelenterazin substrat for gluc-SERCaMP assays (A) Dyrkningsmediet blev opsamlet fra SH-SY5Y-gluc-SERCaMP cellelinjer blev behandlet med 300 nM Tg (eller vehikelkontrol) i 5 timer. Gluc aktivitet i mediet blev vurderet ved at injicere PBS + forskellige koncentrationer af coelenterazin (middelværdi ± SD, n = 6). (B) luminescens værdier fra panel A blev normaliseret til køretøjet behandlet kontrol ved hver substratkoncentration at vurdere thapsigargin-inducerede virkning. (C) Substrat henfald over flere timer. Luminescens fra en kendt mængde rekombinant gluc (0,1 ng eller 0,02 ng) blev målt over flere timer efter fremstilling substrat (middelværdi ± SD, n = 4). (D) Mens den rå luminescens for det rekombinanteGluc faldt over tid på grund substrat forfald, blev fold forskel i prøverne (som bestemt ved luminescens) opretholdes.

Figur 7
Figur 7:. Overvejelser for gluc-SERCaMP analyser relateret til kinetik gluc / CTZ reaktion (A) Kultur medie ændrer forfald gluc / CTZ signalet. 5 pi supernatant indeholdende gluc-SERCaMP blev blandet med varierende forhold mellem PBS og dyrkningsmediet. 100 pi substrat (15 uM CTZ i PBS + 500 mM ascorbinsyre) blev tilsat til 50 pi prøve, der blev fortyndet som beskrevet i tabellen. Lysemission blev overvåget i løbet af 15 min. (B) 5 pi medium blev opsamlet fra SH-SY5Y-gluc-ASARTDL celler og 100 pi substrat (8 uM CTZ i PBS + 5 mM NaCl) blev tilsat. Luminescens blev målt umiddelbart efter tilsætning af substrat (T = 0) og hver 30 s i løbet af løbet af 15 min (± SD, n = 12). Data afbildes som procent signal i forhold til det foregående 30 sek interval for at vurdere omfanget af forfald. Det indsatte viser de rå data luminescens.

Figur 8
Figur 8:. Farmakologisk bekræftelse af ER calcium depletion (A) Effekt af 100 nM thapsigargin på gluc sekretion blev undersøgt for gluc-ASARTDL og gluc-nr Tag kontrol (middelværdi ± SD, n = 6). (B) Stabiliserende ER calcium med dantrolen (RyR antagonist) hæmmer Tg-induceret SERCaMP frigivelse. Celler blev forbehandlet med de angivne koncentrationer af dantrolen i 30 minutter eller 16 timer før tilsætning af 100 nM thapsigargin. Gluc aktivitet i mediet blev målt efter 4 timer (gennemsnit ± SD, n = 6).

99fig9.jpg "/>
Figur 9:. Mock repræsentative resultater for gluc-SERCaMP assay Bemærk køretøjet behandlede værdier kan falde mellem pladerne, på grund af substrat opdeling (afhængig af tidsintervallet mellem læsning individuelle plader). At tage højde for denne effekt, er behandlingen specifik effekt beregnes uafhængigt for hver plade, og dette forhold sammenlignes på tværs af plader.

Dato Rotte Tube masse (mg) Heparin volumen (ml) Heparin densitet (g / ml) heparin masse (mg) Masse af rør + heparin (mg) Samlet masse efter blodprøvetagning (mg) Masse af opsamlede blod (mg) Density blod (g / ml) Beregnet volumen blod (UL) Volumen af ​​heparin er nødvendig for forholdet 2: 1 i ml yderligere heparin for at tilføje før centrifugering
01.01.15 SD Mand 1135,9 50 1,117 55,83 1191,73 1317,70 125,97 1.05 119,97 59,98 9.98

Tabel 1:. Blood samling tabel Eksempel på blodprøvetagning loggen for SERCaMP studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol fremhæver in vitro og in vivo anvendeligheden af gluc-SERCaMP at overvåge depletering af ER calcium. Selvom det protein modifikation at generere SERCaMP synes at generalisere til andre reporter proteiner 12, valgte vi Gaussia luciferase for sin robuste (200-1.000 gange større) bioluminescens i forhold til andre luciferaser 18. Vi demonstrerer påviselig thapsigargin-inducerede gluc-SERCaMP frigivelse over en 100-fold dosisinterval på gluc-SERCaMP virus leveret til primær rotte corticale neuroner, SH-SY5Y-celler, og rottelever (figur 3 og 4). Vi har tidligere beskrevet dannelsen af en stabilt transficeret cellelinie, der udtrykker gluc-ASARTDL og viste, at så få som 20 celler i en population på 5 x 10 4 celler umærkede kan rapportere en thapsigargin-induceret respons 12. Her viser vi, at den stabile cellelinje konsekvent kan rapportere Tg-induceret respons ud til 15 passager, de mest analyzED, hvilket indikerer, at vedvarende ekspression af reporter over tid ikke påvirker dets evne til at blive frigivet i respons til ER calcium depletion (figur 1). Vores data indikerer, at gluc-SERCaMP primært holdes i ER af en celle, indtil en tid med ER calcium udtømning, når det udskilles. Under "normale" forhold, der er en lav basale sekretion, der tillader oprettelsen af baseline ER calciumhomeostase 12. Efter ER calcium tømt af thapsigargin, niveauer af intracellulære og ekstracellulære luminescens ændring i modsatte retninger. Dette kan udtrykkes som et forhold til at angive en ændring i steady state fordeling af sensoren (figur 2). Det er vigtigt, da SERCaMP frigivelse moduleres ved KDEL receptorekspression 12, kan størrelsen af frigivelse varierer afhængigt af celletype. Vi forestiller at erstatte 'ASARTDL "med alternative KDEL-lignende carboxyterminale sekvenser kan være nødvendigt for at opnå maximal SERCaMP respons i en bestemt celle eller vævstype.

For in vitro-analyser, vil niveauet af ekstracellulær gluc-SERCaMP akkumulere over tid på grund af stabiliteten af det udskilte reporter; vi rapporterede en omtrentlig 5-10% fald i aktivitet efter 72 timer 12. Som sådan kan udveksle medium før initiering af en farmakologisk eller genetisk udfordring for ER calciumhomeostase være nødvendigt at reducere baggrundssignal på grund af ophobning sensor. I modsætning hertil halveringstiden af gluc-SERCAMP in vivo er 3,5-4,7 min 12 indikerer signal i plasma repræsenterer en nylige løsladelse af journalisten i cirkulerende blod. Når blod er ex vivo og behandles til plasma imidlertid gluc-SERCaMP er meget stabil (figur 5).

For de beskrevne metodikker, er medium eller plasma overføres til uigennemsigtige plader med 96 brønde før enzymatiske assays. To vigtige faktorer til at overveje, når du bruger gluc-baserede journalists er enzymets flash kinetik og fordeling af coelenterazin substrat. Pladeaflæsere udstyret med injektorer er bedst egnet til at køre gluc enzymatiske assays for at normalisere tiden mellem substratet og tilsætning luminescensmålinger. De kemiske egenskaber af coelenterazin gør det tilbøjelige til forfald, hvilket udelukker en sammenligning rå luminescens værdier målt på forskellige tidspunkter efter forberedelse af underlaget. Fold forskelle mellem prøver, dog opretholdes (figur 6), hvilket muliggør den relative forskel mellem kontrol og forsøgsprøver, der skal spores over varigheden af eksperimenter (figur 9).

Evnen til at overvåge ER calcium udsving in vivo er en fordel, når de efterforsker progressive sygdomme. Mens andre metoder, såsom fluorescerende cytoplasmatiske farvestoffer, er egnede til akut in vitro-undersøgelser, en SERCaMP reporter er den første til at tillade langsgående ER calcium overvågning. OuR-protokollen skitserer direkte hepatiske injektioner af AAV-gluc-SERCaMP. Vi har opdaget stabile niveauer af gluc-SERCaMP i omløb af ubestridte dyr til 56 dage efter injektion (seneste tidspunkterne testet hidtil) og forudsige længere eksperimenter er mulige 12. AAV vektorer er lille i størrelse, måler ca. 20 nm i diameter, og udgør en minimal biosikkerhed krav 19. For at omgå omdannelsen af AAV enkeltstrenget genom til dobbeltstrenget DNA blev AAV-SERCaMP pakket som en AAV serotype-1 dobbelt-strenget vektor 20. AAV-serotype-1 har vist sig effektivt at transducere rottelevere 19,21; Men det forbehold vor injektionsteknik er potentiale for virus til at rejse til andre væv i hele kroppen. Selvom vektoren blev injiceret direkte ind i leveren, kan vores metode som præsenteres ikke se kilden til SERCaMP frigivelse, og det er derfor muligt, at andre end levervæv kan bidrage til gluc-SERCAmp-signal. Fremtidige genetiske manipulationer vil begrænse udtryk at målrette vævstyper. For eksempel vævsspecifikke Cre driver linjer krydses med en Cre-afhængig gluc-SERCaMP vil give mulighed for vævsspecifik overvågning af ER calcium via plasma prøveudtagning.

Den beskrevne in vivo teknik anvender lave virale titere på grund af den robuste karakter af reporter. Gluc-SERCaMP frigivelse kan detekteres fra en viral række 7,6 x 10 7 vg til 7,6 x 10 9 vg (figur 4). Denne serie er 4-400 gange lavere end rapporteret i tidligere arbejde udnytte ildflueluciferase-baserede virale injektioner af leveren 19. Ved højere koncentrationer, observerede vi et tab af detekterbar ekspression over tid, hvilket skyldes muligvis et immunrespons af dyret til transgenet 22. Højere titere af virus bør så vidt muligt undgås på grund af øget risiko for tab af signal. Lavere titre end de præsenterede ikke væreen testet. Denne protokol skitserer injektioner af AAV-gluc-SERCaMP i leveren; lignende metoder er i teorien muligt for andre vævstyper. Parametre såsom viral koncentration og serotype skal optimeres for tilstrækkelig ekspression i andre væv.

På grund af den robuste karakter af reporter, kan små mængder af blod (100-150 pi) indsamles fra hale udklip, der giver mulighed for gentagne samlinger i hele eksperimenter. Det var nyttigt for langsgående karakterisering af gluc-SERCaMP frigivelse som reaktion på thapsigargin, hvor vi observerede forhøjede niveauer efter thapsigargin administration efterfulgt af en tilbagevenden til baseline niveau (figur 4). Korrekt håndtering af plasmaprøver efter blodprøvetagning er også vigtig. Som sådan har vi vist, at SERCaMP er stabil i plasma opbevares ved 4 ° C op til 72 timer før enzymatisk assay (figur 5). Endvidere kan plasmaprøver underkastes mindst tre fryse / tHaw cykler med minimal indvirkning på luminescens (figur 5). I praksis har vi gemme alle prøver ved -80 ° C, undgå unødvendige fryse-tø cykler forud for vurderingen enzymatisk assay, og analysere alle prøver til et eksperiment på samme tid.

ER calcium udtømning er impliceret i patogenesen af ​​en række sygdomme. Det er ofte menes at være en begivenhed tidligere, som hindrer cellefunktioner og fører til aktivering af det udfoldede protein respons (UPR). UPR er en adaptiv respons ansat af Skadestuen at genetablere homeostatiske vilkår 5. Kroniske tilstande af ER stress overstige kapaciteten af ​​UPR at genoprette homeostase, i sidste ende fører til celledød. ER stress og ER calcium dysregulering observeres i sygdomme som type 1-diabetes, diabetisk nefropati, neurodegenerative sygdomme og hjerte-kar-dieases 5. Forholdet mellem calcium og dysregulering sygdomspatogenese, er imidlertid difficult at afgrænse. Den SERCaMP teknologien har potentiale til at spore denne proces over levetiden for et dyr, hvilket giver indsigt i udvikling og progression sygdom. Desuden er vurderingen af ​​potentielle lægemidler til formål at forebygge eller korrigere ER calcium dysregulering kan vurderes ved brug af SERCaMP. Endelig identificere sygdomme, hvor gluc-SERCaMP frigivelse sker giver mulighed for at konstruere og anvende udskilte terapeutiske proteiner eller peptider som SERCaMPs som et middel til sygdom reguleret genterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes Fisher  02-682-550
10% NP-40 solution  Pierce 28324 for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes Fisher 14-823-30
200 microliter filter tips Rainin RT-L200F
3-0 surgical sutures Fisher NC9598192
30 G needles Fisher Scientific 14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheets Thermo AB-0558
Alcohol prep pads Fisher 22-246-073
Anesthesia Auto Flow System E-Z Anesthesia EZ-AF9000
Animal recovery chamber Lyon Vet ICU-912-004
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Betadine solution Fisher NC9386574
Bleach Clorox n/a
Bovine growth serum Thermo SH30541.03
Coelenterazine, Native Regis Technologies 1-361204-200
Cotton tipped applicators Puritan 806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures WPI 501803
Digital ultrasconic cleaner Fisher Scientific FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate Life Technologies 10569-010
DNA mass ladder Life Technologies 10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein) Nanolight 321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) New England Biolabs E8023S 1:2,000 (WB)
Germinator 500 CellPoint Scientific DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque) Fisher 07-200-589
Hank's balanced salt solution Life Technologies 14175-095
Heparin Allmedtech 63323-276-02
Isoflurane Butler Schein 29404
Ketamine Henry Schein 995-2949
Kwik Stop Styptic powder Butler Schein 5867
L-glutamine Sigma G8540
Methanol Fisher a452-4
Microfuge 22R Centrifuge Bekman Colter 368831
Neosporin Fisher 19-898-143
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
Nikon Stereoscope Nikon SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup Machery-Nagel 740609
P200 pipet Rainin L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit Clontech 632200
PCR film seal Fisher AB0558
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
ReFresh Charcoal Filter canister E-Z Anesthesia EZ-258
Scalpel blades, #10 Fine Science tools Inc 10010-00
SD rats 150-200 g Charles River Rats rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags National Band and Tag co 1005-1
Sterile surgical drapes Braintree Scientific SP-MPS
Synergy 2 plate reader BioTek n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
Thapsigargin Sigma T9033 harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix Life Technologies K4975-00
Xfect Transfection reagent Clontech 631318
Xylazine Valley Vet 468RX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426, (6968), 891-894 (2003).
  2. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, (3-4), 303-310 (2005).
  3. Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473, (7348), 528-531 (2011).
  4. Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10, (8), 763-773 (2010).
  5. Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (6), (2011).
  6. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, (3), 143-151 (2008).
  7. Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
  8. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (39), 16265-16270 (2011).
  9. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (50), 17404-17409 (2004).
  10. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  11. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, (4), 386-399 (2008).
  12. Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25, (18), 2828-2839 (2014).
  13. Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288, (6), 4209-4225 (2013).
  14. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130, (1), 305-310 (1969).
  15. Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21, (5), 282-287 (1985).
  16. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372, (1), 24-34 (2008).
  17. Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70, (6), 1024-1029 (1993).
  18. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, (4), 582-591 (2009).
  19. Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19, (4), 411-417 (2012).
  20. Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10, (26), 2105-2111 (2003).
  21. Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13, (6), 1085-1092 (2006).
  22. Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23, (6), 399-413 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics