تنقية ماوس سفن الدماغ

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في الدماغ، أكثر من نظام الأوعية الدموية تتكون من حاجز انتقائي، حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الذي ينظم تبادل الجزيئات والخلايا المناعية بين الدماغ والدم. وعلاوة على ذلك، يتطلب الطلب الهائل التمثيل الغذائي الخلايا العصبية لائحة لحظة إلى لحظة تدفق الدم. والجدير بالذكر أن شذوذ هذه الأنظمة هي السمات المميزة المسببة لمعظم أمراض الدماغ. بما في ذلك الإصابة بالورم الأرومي الدبقي، والسكتة الدماغية، وذمة، والصرع، والأمراض التنكسية (مثلا: مرض باركنسون ومرض الزهايمر)، وأورام الدماغ، وكذلك حالات الالتهابات مثل التصلب المتعدد، والتهاب السحايا والدماغ الخلل الناجم عن الإنتان. وبالتالي، فهم الأحداث يشير إلى تحوير علم وظائف الأعضاء الدماغية يمثل تحديا كبيرا. الكثير من التبصر في خصائص الخلوية والجزيئية من مختلف أنواع الخلايا التي يتكون منها نظام الدماغية يمكن الحصول عليها من الثقافة الأساسية أو الخلية الفرز من أنسجة المخ فصلها حديثا. ومع ذلك،لا يتم الاحتفاظ بخصائص مثل الخلية القطبية، مورفولوجيا والعلاقات بين الخلايا في هذه الاستعدادات. تم تصميم البروتوكول الذي وصفنا هنا لتنقية شظايا سفينة الدماغ، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية. وتبين لنا أن السفن معزولة تتكون من الخلايا البطانية مختومة من قبل منعطفات ضيقة التي تحيط بها الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes، خلايا العضلات الملساء وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية endfeet لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية. وأخيرا، نحن تصف كيفية إجراء التجارب المناعية على السفن الدماغ تنقيته.

Introduction

يتطلب الأداء السليم للنظام العصبي المركزي (CNS) بيئة خارج الخلية درجة عالية من التنظيم، ومطالبها التمثيل الغذائي ضخمة مقارنة مع الأجهزة الأخرى 1. الجهاز العصبي المركزي هي أيضا حساسة للغاية لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية، وغير مؤذية عادة إلى الأجهزة الطرفية ولكن إلى ذلك، أعصاب. لضمان الأداء السليم، أكثر من "CNS الأوعية الدموية تشكل عائقا البطانية. حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​التي تسيطر على تدفق الجزيئات والأيونات وكذلك مرور الخلايا المناعية بين الدم والدماغ، وبالتالي المحافظة على التوازن السليم ولكن أيضا تحد من دخول الأدوية العلاجية، والعلاج مما يعوق الاضطرابات العصبية 3. على المستوى الخلوي، وحافظ على BBB أساسا من منعطفات ضيقة واسعة بين الخلايا البطانية والتعبير استقطابا للنقل هروب رأس المال ومعدل transcytosis منخفضة جدا (4). خصائص ووظائف BBB وبفعل معظمهم من شمال شرقخلايا ighboring 4. على وجه الخصوص، pericytes تلعب دورا هاما في تحريض والحفاظ على BBB 5،6. كونها خلايا مقلص، pericytes أيضا تنظيم تدفق الدم 7 كما تفعل خلايا العضلات الملساء المحيطة السفن الكبيرة. وأخيرا، النجمية، فإن الخلايا الدبقية الرئيسية في الدماغ، وترسل العمليات الكبيرة اسمه endfeet حول معظم الأوعية الدموية في الدماغ 8 و تعدل BBB النزاهة والهدوء المناعي ونقل نواتج الأيض في الخلايا العصبية 10، ولحث على اقتران ضيق بين نشاط الخلايا العصبية و تدفق الدم 11،12.

القدرة على دراسة الخصائص الجزيئية والخلوية للنظام الدماغية هي حاسمة لتوصيف أفضل مساهمته في علم وظائف الأعضاء والدماغ الفيزيوباثيا. لمعالجة هذه المسألة، وقد وضعت استراتيجيات لعزل نظام الدماغية في المخ، والتي تسمح لإعداد سليمة شظايا سفينة الدماغ. الدماغي السفينة صوقد وصفت urification في البداية باستخدام العقول البقري 13 وتحسنت وتتكيف مع الأنواع الأخرى، وخاصة القوارض 14. في هذه الدراسة الأخيرة، تم إدخال استخدام مرشحات من أحجام مختلفة لفصل الأوعية الدماغية في لكسور التخصيب في السفن من أقطار مختلفة. ومن المثير للاهتمام، في مثل هذه الاستعدادات، تبقى الخلايا البطانية خصائص الأيض الخاصة 15، وظائف نقل 16 والاستقطاب 17. هنا، نحن تصف بالتفصيل هذا البروتوكول، وكذلك إثبات أن السفن معزولة تحتفظ معظم من هم في الهياكل الموقع. الخلايا البطانية تبقى مرتبطة من قبل منعطفات ضيقة ومحاطة الصفيحة القاعدية مستمرة. Pericytes وخلايا العضلات الملساء لا تزال تعلق على طبقة الخلايا البطانية، وكذلك الأغشية المحيطة بالأوعية نجمية. ومع ذلك، يتم استبعاد الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية، الخلايا العصبية و oligodendrocytes. وأخيرا، نحن تصف الإجراء لأداء المناعية على السفن الدماغ معزولة. حتى الآن وقد أجريت معظم الدراسات الجزيئية والخلوية المتعلقة بنظام الدماغية على تنقية خلايا الدماغ سفينة فصلها باستخدام سلالات مراسل الماوس محددة الخلية أو الإجراءات القائمة على المناعية 18،19 الفرز الخلية. على الرغم من أن هذه التقنيات تتيح للعزلة من الذهب الخالص تقريبا السكان الخلية الدماغية، الخلايا المعزولة يفقد تماما في الموقع التشكل والتفاعل، وهذا بدوره يؤثر بشكل كبير ممتلكاتهم الجزيئية والخلوية. وصف بروتوكول هنا، مما يسمح لعزل شظايا الدماغية بأكملها دون الحاجة للأجسام معينة أو بقع الماوس المعدلة وراثيا، ويقدم بديلا جيدا كما في الهيكل العام للالأوعية الدماغية المعزولة يتم حفظها، وبالتالي تقليل تداعيات على ممتلكاتهم الجزيئية. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم سفن معزولة لدراسة النشاط الجيني، تخليق البروتين والتنظيم على BBB كما هو موضح في الآونة الأخيرة 20،21 22،23 هذا البروتوكول غير مكلفة وسهلة لأداء وقدرة على التكيف بسرعة إلى أي مختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. حلول والمواد

  1. إعداد الحلول سفينة العزلة: B1، إضافة 1.5 مل من HEPES 1M إلى 150 مل من HBSS. B2، إضافة 3.6 غرام من ديكستران إلى 20 مل من B1. B3، إضافة 1 غرام من BSA إلى 100 مل من B1.
  2. تعديل حامل المرشح عن طريق قطع الجزء السفلي من الجزء العلوي الشد.
  3. إعداد الحلول المناعية: حل التثبيت، 4٪ لامتصاص العرق في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. Permeabilization / عرقلة الحل، يخفف مصل الماعز إلى 5٪ وتريتون X100 إلى 0.25٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4.
    ملاحظة: التثبيت يعتمد على نوع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة.

2. تشريح

ملاحظة: ليس مطلوبا من ظروف معقمة، ما لم يتم استخدام السفن لأغراض زراعة الخلايا.

  1. إعداد كوب 150 مل مع 20 مل من B1. الحفاظ على الجليد، وتغطي مع parafilm لتجنب تلوث الهواء.
  2. عميق تخدير الماوس تحت غطاء محرك السيارة مع منشفة ورقية صغيرة غارقة في 1 مل من الأيزوفلورين النقي الذي يضاف الباحثس القفص. يتم التحقق منها التخدير بسبب عدم وجود رد فعل لقرصة أخمص قدميه. قتل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: يتم إنجاز هذه الخطوات في الامتثال للوائح الوطنية والمؤسسية.
  3. اختياري: إجراء نضح داخل القلب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني 1x إلى القضاء على محتوى الدم 24.
  4. القسم الجلد مع مشرط من الرقبة إلى الأنف وتسحبه بعيدا. إزالة الشعر عن تلويث مع PBS 1X.
  5. لفتح الجمجمة، أدخل لأول مرة مقص الأمامية إلى البصلة الشمية، وفتح المقص لتمزق في الجمجمة في جزأين.
  6. إزالة بعناية الدماغ باستخدام ملعقة الدماغ. تشريح خارج الضفيرة المشيمية من البطينات الجانبية لأنها تلوث الأوعية الدموية إعداد 38.
    ملاحظة: اختياري: سوف يحتوي على الإعداد النهائي متني والسحايا السفن. إن لم يكن المطلوب، السحايا يمكن خلع باتباع الإجراء التي وصفها 38.
  7. TRansfer الدماغ في دورق يحتوي على حل B1 على الجليد. ما يصل إلى 8 أدمغة يمكن معالجتها معا.

3. الدماغ الأنسجة التجانس

  1. باستخدام اثنين من المشارط، يدويا وبقوة للفوز على الدماغ في حل B1 الحصول بعد ذلك قطع صغيرة من حوالي 2 مم.
  2. التجانس إعداد مع Dounce الخالط المؤتمتة، وأداء 20 السكتات الدماغية في 400 دورة في الدقيقة. تأكد من أن أنبوب زجاجي يتم الاحتفاظ في الجليد وأن الجزء العلوي من douncer في حل عندما تتحرك صعودا وهبوطا، وذلك لمنع تشكيل جيوب الهواء. إذا كنت على استعداد عدة عينات، وغسل douncer مع الماء المؤين بين كل التجانس.

4. السفينة تنقية

  1. نقل جناسة في أنبوب من البلاستيك 50 مل، والشروع في الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وهناك واجهة بيضاء كبيرة (ومعظمهم من المايلين) تتشكل على الجزء العلوي من بيليه السفينة (أحمر إذا تم إجراء أي نضح).
  2. تجاهل طاف. بيليه السفينة واجهة بيضاء ستظل المرفقة معا. إضافة 20 مل من محلول B2 المثلج ويهز الأنبوب يدويا وبقوة لمدة 1 دقيقة.
  3. انتقل إلى الطرد المركزي الثاني في 4400 ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. فإن المايلين الآن تشكل طبقة بيضاء كثيفة على سطح طاف.
  4. فصل بعناية طبقة المايلين من جدران أنبوب من خلال عقد أنبوب وتناوب على السماح طاف لتمرير على طول الجدران ببطء. تجاهل المايلين مع طاف. بيليه الذي يحتوي على السفن لا تزال تعلق في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. وصمة عار على الجدار الداخلي للأنبوب مع ورقة ماصة ملفوفة حول البلاستيك 5 مل ماصة وإزالة جميع السوائل المتبقية، وتجنب لمس بيليه السفينة. الحفاظ على أنبوب رأسا على عقب على ورقة ماصة لاستنزاف أي السائل المتبقي.
  6. تعليق بيليه في 1 مل من محلول B3 المثلج قبل pipetting صعودا وهبوطا مع نصائح الاسعار المنخفضة للملزم، keepiنانوغرام أنبوب على الجليد، ثم يضاف 5 مل من محلول آخر B3. تأكد من أن السفن تنتشر بقدر الإمكان ولا تشكل الحصى.

5. الترشيح

  1. إعداد كوب على الجليد مع 30 مل من محلول B3 الجليد الباردة. تغطية مع parafilm لتجنب تلوث الهواء.
  2. وضع مرشح 20 ميكرون شبكة على حامل المرشح تعديل على الجزء العلوي من قارورة بيكر وتتوازن من خلال تطبيق 10 مل من محلول B3 الجليد الباردة.
  3. صب إعداد السفينة على مرشح وشطف السفن مع 40 مل من محلول B3 الجليد الباردة.
  4. استرداد تصفية باستخدام ملقط نظيفة وتزج فورا في دورق يحتوي الحل B3. فصل الأوعية من مرشح عن طريق هز بلطف.
  5. صب محتويات الكأس في 50 مل أنبوب من البلاستيك وأجهزة الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. ملاحظة: بدلا من ذلك، تعليق الأوعية الدماغ من الخطوة 4.6 يمكن أن تتم تصفيته على 100 مرشح ميكرون شبكة.في هذه الحالة، يتم الاحتفاظ السفن الكبيرة تفضيلي على مرشح في حين أن التدفق من خلال يتضمن microvessels (الشعيرات الدموية في المقام الأول)، والتي ثم يصفى على فلتر 20 ميكرون شبكة على النحو الوارد أعلاه.
  7. resuspend الكرية من microvessels في 1 مل من محلول B3 المثلج وتحويلها من قبل pipetting قبل ان تتحول الى 1.5 مل إيبندورف أنبوب. الطرد المركزي في 2000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

6. التثبيت، ومنع Permeabilization

  1. سفن نقل من قبل pipetting إلى 0.2 مل أنابيب PCR يحتوي PBS باستخدام 1.0 مل منخفضة طرف ملزم. يجب الحرص على عدم لمس السفن لأنها قد تنضم إلى الجزء الخارجي من الحافة. تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت المجهر مجهر.
  2. لكل من التغييرات متوسطة التالية، وترك الأنابيب على الجليد حتى وصلت سفن القاع، وماصة للخروج معظم السوائل باستخدام طويلة والشيء هلام تحميل نصائح الماصة.
  3. إزالة أكثر من برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من محلول تثبيتي.تعليق السفن عن طريق هز بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  4. ماصة من الحل تثبيتي، واستبدالها مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X (غسل الأولى)، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT وكرر هذه الخطوة 3 مرات. في كل مرة، تحقق من أن السفن قد غرقت بشكل صحيح إلى الجزء السفلي من الأنابيب وماصة من برنامج تلفزيوني 1X، ضمان عدم لمس السفن.
  5. بعد غسل الماضي، استبدال برنامج تلفزيوني 1X من قبل permeabilization / حل الحجب واحتضان 1 ساعة عند RT، إعادة التعليق على السفن عن طريق هز بلطف من وقت لآخر.

7. المناعية

  1. استبدال permeabilization / عرقلة الحل مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية (انظر المراجع من الأجسام المضادة المستخدمة هنا والتخفيفات في مواد الجدول قالب) المخفف في permeabilization / حل حظر، واحتضان عند 4 درجات CO / N.
  2. بعد 3 يغسل في برنامج تلفزيوني في RT، واحتضان السفن مع مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعةفي RT.
  3. ملاحظة: نحن نوصي بشدة أداء تلطيخ النووي مع هويشت (1: 2000) أو دابي (1: 2000) لتمييز السفن من الممكن تلويث الشعر أو الغبار تحت المجهر.
  4. بعد 3 يغسل في برنامج تلفزيوني، resuspend والسفن في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

8. تركيب ومراقبة

  1. إعداد طرف مع الزجاج الشعرية siliconized و: قطع رأس P200 ماصة باستخدام مشرط وضبط الشعرية في الداخل. حجم تقريبي من شعري 40 ميكرولتر.
  2. نقل السفن على شريحة زجاجية باستخدام الزجاج الشعرية siliconized و، وإزالة بعناية السائل مع قطعة من ورق ماص.
  3. تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة على السفن وعقد ساترة في 45º السماح للإسقاط لتنتشر على طول حافة الانزلاق. ترك قبالة ساترة والسماح المتوسطة تنتشر ببطء. السماح لها الجافة O / N في RT مع الحماية من الضوء. ويمكن ملاحظة السفن تحت fluorescالأنف والحنجرة المجهر متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، نحن تصف بروتوكول يسمح للعزلة الميكانيكية للسفن الدماغ 14 الشكل 1 يلخص الخطوات الرئيسية لهذه التقنية. عمارة السفن الدماغ معقدة وتتضمن عدة أنواع الخلايا، أي الخلايا البطانية مختومة من قبل منعطفات ضيقة ومحاطة pericytes، وخلايا العضلات الملساء، والعمليات القدم نجمية 9. وهكذا، بعد عزل الأوعية الدماغية، ونحن تهدف لتوصيف هيكل السفن تنقيتها من المناعية كما هو موضح في الجزء الثاني من بروتوكول لدينا. أجرين AGRIN، وهو مكون من الصفيحة القاعدية البطانية وبشكل مستمر ومتجانس وصفت على سطح البطانية (الشكل 2A). زونا النطيقة-1 وimmunostained (ZO-1)، واحدة من مكونات منعطفات ضيقة البطانية بدون انقطاع واضح، مما يشير إلى أن منعطفات ضيقة البطانية تم الحفاظ عليها (الشكل 2B). تغطية خلية حوطية البطانية، والتسميةإد كتبها NG2، بدا مستمر تقريبا كما هو موضح سابقا 25 (الشكل 2C). وأخيرا، كشفت على نحو سلس وصفها الأكتين العضلات وجود سلسة طبقة الخلايا العضلية الكثيفة في أسطح السفن النقاء كبيرة (الشكل 2D). وأظهرت هذه النتائج أن عموما الموقعي هيكل السفينة الدماغ في وحفظها في شظايا سفينة معزولة.

وقد ثبت أن الخلايا النجمية لارسال العمليات الكبيرة، أو "endfeet" على سطح السفن، تغليف بالكامل تقريبا على نظام الدماغية 8. على التفاعل مع ضيق الأوعية ودورها في الحفاظ على وتنظيم مختلف الوظائف الدماغية، عينت بها باعتبارها جزءا أساسيا من وحدة وعائية عصبية 9. قمنا بتحليل كذلك تغطية الأوعية الدموية نجمية الأوعية الدماغية المعزولة. Immunolabelling من خيوط المتوسط ​​نجمي الخلايا GFAP والحاضر عادة في نجمية كلها (الشكل 3A)، واليالي فقط الحاضر جزئيا على السفن النقاء تظهر بعض ألياف قصيرة على سطح البطانية (الشكل 3B-C). في المقابل، Connexin 43، وهو بروتين تقاطع الفجوة التخصيب في الأغشية المحيطة بالأوعية astroglial 26، تم الكشف للغاية على سطح السفن تنقية كبيرة (الشكل 3D) والشعيرات الدموية (الشكل 3E). وبالمثل، immunolabelling من Aquaporin-4 (Aqp4)، وهو عضو في الأسرة قناة مياه أعرب حد كبير على مستوى أغشية الخلايا النجمية التي تواجه السفن 27، 26، يحدد جدران الأوعية المعزولة (الشكل 3F-G). على الرغم من أن الخلايا النجمية لم يشارك تنقيته مع السفن، ظلت الأغشية المحيطة بالأوعية endfeet على المرفق أثناء إجراء الميكانيكي للسفينة الدماغ العزلة.

وأخيرا، درسنا احتمال تلوث تحضيراتنا قبل غيرها من أنواع الخلايا العصبية. Immunolabelling من شعيرات متوسطة العصبية (NFM) (Hornunز وآخرون، 1999) عن وجود القليلة المتبقية الألياف تعلق على السفن، مما يشير إلى إمكانية التعاون تنقية بضع محطات العصبية (الشكل 4A-B). الخلايا الدبقية الصغيرة، وصفت من قبل Iba1 (الشكل 4C-D) و oligodendrocytes، وصفت من قبل Olig2 (الشكل 4E-F) لم يتم الكشف في سفن معزولة. وهكذا، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية الصغيرة و oligodendrocytes لم يشارك تنقيته مع الأوعية الدماغية.

معا، وهذه النتائج تشير إلى أن بروتوكول صفها يسمح تنقية الحفاظ هيكليا شظايا سفينة الدماغ، والتي على الأغشية المحيطة بالأوعية نجمي لا تزال تعلق.

الشكل 1
. وتعرض الخطوات الرئيسية الشكل 1. مخطط موجز لبروتوكول تنقية سفينة الدماغ. هذا الرسم يشير إلى كسور سفينة الثلاثة الممكنة التي يمكن الحصول عليها حسب علمي lters المستخدمة (20 أو 100 ميكرون شبكة). S1: microvessels والسفن الكبيرة، S2: السفن الكبيرة وS3: microvessels الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. سفن معزولة يحتفظ معظم في بنية الموقع. التوقعات صورة متحد البؤر immunostained السفن دماغ الفأر المعزول. (A) الصفيحة القاعدية immunolabelled لأجرين AGRIN (الحمراء). (ب) الخلايا البطانية منعطفات ضيقة immunolabelled لنطيقة النطيقة (ZO-1 ) (أحمر). (C) Pericytes immunolabelled لNG2 (الحمراء). (D) خلايا العضلات الملساء immunolabelled لالعضلات الملساء الأكتين (SMA) (أحمر). هي ملطخة النوى مع هويشت (الأزرق).خريج "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نجمية Endfeet الأغشية لا تزال تعلق على سفن تنقية. التوقعات صورة متحد البؤر. (A) صورة لجزء الدماغ تظهر سفينة القشرية immunostained عن البطانية PECAM (أبيض)، نجمي GFAP (الحمراء)، وConnexin 43 (Cx43) (الأخضر ). (B، C) GFAP immunolabelling (الأخضر) على سطح أحد الشعرية معزولة وصفت من قبل Isolectin B4 (أبيض) (B) أو من سفينة كبيرة وصفت لالعضلات الملساء الأكتين (SMA) (أحمر) (C). (C) هو إعادة طباعة بإذن من 20 (D، E) Cx43 immunolabelling (الأخضر) على سطح أحد الشعرية معزولة وصفت من قبل Isolectin B4 (أبيض) (D) أو من سفينة كبيرة وصفت لالعضلات الملساء الأكتين (SMA) (أحمر) (F، G) Aquaporin 4 (Aqp4) immunolabelling (الأخضر) على سطح أحد الشعرية معزولة وصفت من قبل Isolectin B4 (أبيض) (F) أو من سفينة كبيرة وصفت لالعضلات الملساء الأكتين (SMA) (الأحمر) (G). هي ملطخة النوى مع هويشت (الأزرق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4: لا يتم تنقيته المشارك الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية الصغيرة و oligodendrocytes مع سفن الدماغ التوقعات صورة متحد البؤر (A، B) خيط عصبي (NFM) المناعية على شريحة 20 ميكرون سميكة قرن آمون (أحمر) (A) والأوعية الدماغ النقاء ( B). (C، B) دبقية Iba1 المناعية على شريحة القشرية 20 ميكرون سميكة (صإد) (C) والأوعية الدماغ النقاء (D) (E، F) دبقية قليلة التغصن Olig2 المناعية على شريحة القشرية 20 ميكرون سميكة (أحمر) (E) والأوعية الدماغ النقاء (F). الأنوية هي ملطخة بواسطة هويشت (أبيض )، البطانة التي كتبها Isolectine B4 (Ib4) (الخضراء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حاجز الدم في الدماغ وينظم مرور المواد الفسيولوجية داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي، ويحمي ضد المواد الضارة المحتملة الحالية في الدم. وتشارك في العديد من الأمراض CNS، بما في ذلك أمراض الاعصاب 2 وأورام الدماغ 28. نفاذية منخفضة للغاية من BBB أيضا يعيق مرور العوامل العلاجية استهداف الخلايا العصبية وتطوير أساليب تعتزم افتتاح عكسية على BBB مع عدم وجود عواقب وخيمة للدماغ هو حقل نشط جدا في البحوث 3. وقد بذلت الكثير من الجهود لتطوير نماذج قيمة وتقنيات السماح التحقيقات الخلوية، الجزيئية والدوائية من BBB، وعلى وجه الخصوص، بروتوكولات لعزل السفن من الدماغ القوارض. المحاولات الأولى التي جمعت ببساطة microvessels من الأنسجة الدماغية فصل ميكانيكيا باستخدام تنسجم المسام الحجم المتغير لتجاهل تلويث خلايا الدماغ متني 13، 29، 30، 31. وقدم التدرج الكثافة الطرد المركزي في وقت لاحق المرتبطة الترشيح السفن الدماغ على تنسجم النايلون أو الخرز الزجاجي الأعمدة 32، 33، 15. في هذه الإجراءات، والزجاج حبة مقابل الترشيح شبكة من النايلون ظهرت لتحسين المحاصيل وتسليط مقابل انخفاض سرعة الطرد المركزي، microvessel النقاء، على الرغم من سرعة عالية الطرد المركزي يدفع أيضا إجهاد القص الذي يؤثر على التعبير الجيني 15، 32. وقدم خطوة إضافية الهضم الأنزيمي أيضا في بعض البروتوكولات التالية الخطوة التفكك 34 بهدف فصل الخلايا العصبية ملتصقة والخلايا النجمية لزيادة microvessel نقاء 35. ومع ذلك، يمكن للما قبل الهضم المفرط أيضا تعطيل microcapillary سلامة 36 و 37. وفي الآونة الأخيرة، وقد تبين المناعية الليزر التقاط تسليخ مجهري (المناعية LCM) لتمكين استرجاع السفن أو حتى من السكان خلية متميزة في vesseليرة سورية، لدراسة التغيرات في BBB التعبير الجيني، على الرغم من أن كمية المواد التي تم الحصول عليها عن طريق هذه التقنية محدودة جدا 23.

هنا، فإننا نقدم إجراء لعزل الميكانيكية للسفن الدماغ وضعت في البداية من قبل يوسف وآخرون 14. أنها توفر إمكانية الحصول على سفن الدماغ نقية، وللفصل بينهما وفقا لقطرها. هذا البروتوكول لا أدعي أن تسمح تنقية كامل الأوعية الدموية في الدماغ مقصورة، ونحن لم تقارن فعاليته مع البروتوكولات نشرت السابقة. ومع ذلك، فإن غياب التدرج، أعمدة معينة وعالية السرعة خطوات الطرد المركزي يجعل الإجراء العام من السهل جدا وغير مكلفة. الأهم من ذلك، ونحن نوصي بشدة لإزالة الضفيرة المشيمية كما وصفها 38 قبل التجانس في الدماغ، ونحن من ذوي الخبرة على أنها مصدر محتمل للتلوث. توصيات هامة أخرى هي: 1) استخدام "منخفض ملزمة" ماتر البلاستيكيةالاتحاد العالمي للتعليم (وبخاصة نصائح ماصة) منذ السفن تلتزم بطبيعة الحال إلى البلاستيك غير المعالجة. إهمال هذه النقطة من شأنه أن يؤدي إلى فقدان معظم السفن. 2) موازنة دقيقة للمرشحات النايلون قبل الترشيح (الخطوة 5.2)؛ 3) إعادة تعليق من بيليه في الكثير من العازلة ممكن قبل الترشيح لتعزيز نقاء العينة. 3) إذا لزم الأمر، وخلايا الدم والبروتينات المحاصرين في الأوعية النقاء يمكن غسلها بها داخل القلب نضح مع برنامج تلفزيوني قبل تشريح الدماغ. 4) يمكن تحسين العائد من السفن تنقيته من خلال تكرار الانفصال عن المايلين في ديكستران مرتين أو ثلاث مرات (الخطوة 4.2) 39،40. لالمناعية، ونحن نوصي بشدة: 1) لتنفيذ العلامات النووي من أجل التمييز بين سفن من تلويث الشعر والغبار التي الأجسام المضادة لها تقارب غير محدد عظيما. 2) لتجنب جمع السفن عن طريق الطرد المركزي قبل كل تغيير المتوسطة لأنها قد تؤدي إلى تشكيل الكرة لا تنفصم من المواد.

تنقية الأوعية الدماغ سليمة تقدم مزايا كبيرة لدراسة الخصائص الجزيئية من BBB. على الرغم من أن تم تحديدها البطانية وخلية حوطية الجينات ومسارات محددة أو أثرى الدراسات transcriptomic والبروتين على أنواع الخلايا الفردية 18،19، فمن المعروف جيدا أن تقنيات التفكك والخلية الفرز تؤدي إلى فقدان الخلية القطبية والتشكل وكذلك الربط بين أنواع الخلايا، التي تؤثر بقوة الشخصية الجزيئية. في هذا السياق، والحفاظ على مقصورة الأوعية الدموية بأكملها سليمة كما هو موضح هنا، باستثناء الخلايا النجمية، قد يمثل ميزة كبيرة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع فرز الخلايا، وتنقية الأوعية الدماغ لا تتطلب استخدام السلالات المعدلة وراثيا مراسل الماوس محددة أو إجراءات المستندة المناعية طويلة. ميزة أخرى لاستخدام السفن الدماغ هي إمكانية التكيف مع بروتوكول تنقية للأنواع الأخرى كما هو موضح بالفعل لmurine14، bovine13 وكذلك في البشر 41،42. وأخيرا، فإن هذه التقنية الحالية مزيد من التطوير تكون الثقافة في المختبر من الأوعية الدماغ شظايا. شارك في الثقافة السفن النقاء مع الخلايا العصبية والخلايا النجمية الأولية دبقية قد يساعد على إعادة تجميع وحدة وعائية عصبية بطريقة دقيقة من أنظمة متعددة الخلايا 3-الأبعاد المعقدة الثقافة حيث يتم عزل الخلايا أولا والنقاء قبل أن يتم تجميعها 43. وهكذا تنقية الأوعية الدماغ سليمة قد يكون عونا كبيرا لتطوير أي نوع من فحوصات في المختبر لدراسة BBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل Labex MemoLife والتي ARSEP (مؤسسة صب L'مساعد à لا بحوث سور لا يتصلب أون لويحات)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77, (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468, (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508, (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58, (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7, (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14, (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468, (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10, (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185, (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276, ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166, (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192, (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5, (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34, (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35, (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9, (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14, (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23, (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17, (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44, (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207, (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17, (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24, (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94, (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70, (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics