माउस ब्रेन वेसल्स की शुद्धि

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

मस्तिष्क में, नाड़ी तंत्र में से अधिकांश एक चयनात्मक बाधा के होते हैं, मस्तिष्क और रक्त के बीच अणुओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के आदान-प्रदान को नियंत्रित करता है कि रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB)। इसके अलावा, विशाल न्यूरोनल चयापचय की मांग रक्त के प्रवाह का एक पल-टू-पल विनियमन की आवश्यकता है। उल्लेखनीय है कि इन नियमों की असामान्यताएं सबसे मस्तिष्क विकृतियों के etiological पहचान कर रहे हैं; , ब्रेन ट्यूमर, साथ ही इस तरह के मल्टिपल स्क्लेरोसिस, दिमागी बुखार और पूति प्रेरित मस्तिष्क रोग के रूप में भड़काऊ शर्तों: ग्लियोब्लास्टोमा, स्ट्रोक, सूजन, मिर्गी, अपक्षयी रोगों (पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग पूर्व) भी शामिल है। इस प्रकार, cerebrovascular शरीर क्रिया विज्ञान नियमन संकेत घटनाओं को समझने के लिए एक बड़ी चुनौती है। Cerebrovascular सिस्टम रचना कि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के सेलुलर और आणविक गुणों में बहुत अंतर्दृष्टि हौसले से अलग मस्तिष्क के ऊतकों से छँटाई प्राथमिक संस्कृति या सेल से प्राप्त किया जा सकता है। तथापि,इस तरह के सेल polarity, आकृति विज्ञान और कहनेवाला संबंधों के रूप में गुण इस तरह की तैयारी में नहीं रखा जाता। हम यहाँ वर्णन है कि प्रोटोकॉल संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने, मस्तिष्क पोत टुकड़े को शुद्ध करने के लिए बनाया गया है। हम अलग-थलग वाहिकाओं एक सतत आधारी पटल से घिरे रहे हैं कि तंग जंक्शनों द्वारा सील endothelial कोशिकाओं से मिलकर बनता है कि दिखा। Pericytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ ही परिवाहकीय अस्थिकणिका endfeet झिल्ली endothelial परत में जुड़े रहते हैं। अंत में, हम शुद्ध मस्तिष्क जहाजों पर immunostaining के प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन है।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के समुचित कार्य के एक उच्च विनियमित बाह्य वातावरण की आवश्यकता होती है, और इसके चयापचय की मांग अन्य अंगों 1 की तुलना में भारी रहे हैं। सीएनएस भी आम तौर पर परिधीय अंगों को नुकसान न पहुंचाने लेकिन यह करने के लिए, न्यूरोटौक्सिक रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बेहद संवेदनशील है। सही कार्य सुनिश्चित करने के लिए, सीएनएस 'वाहिका के सबसे एक endothelial बाधा रूपों; अणुओं और आयनों के प्रवाह के साथ ही खून और दिमाग के बीच प्रतिरक्षा कोशिकाओं के पारित होने को नियंत्रित करता है जो रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी), इस प्रकार में बाधा उपचार जिससे उचित समस्थिति 2 को बनाए रखने, लेकिन यह भी चिकित्सीय औषधियों के प्रवेश को सीमित के मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 3। सेलुलर स्तर पर, बीबीबी मुख्य रूप से endothelial कोशिकाओं, तपका ट्रांसपोर्टरों की ध्रुवीकृत अभिव्यक्ति और एक बहुत कम transcytosis दर 4 के बीच व्यापक तंग जंक्शनों द्वारा निरंतर है। गुण और BBB के कार्यों ज्यादातर NE द्वारा प्रेरित कर रहे हैंighboring कोशिकाओं 4। विशेष रूप से, pericytes बीबीबी 5,6 उत्प्रेरण और बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। बड़े जहाजों के आसपास के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में करते सिकुड़ा कोशिकाओं होने के नाते, pericytes भी रक्त प्रवाह 7 विनियमित। अंत में, astrocytes, मस्तिष्क के प्रमुख glial कोशिकाओं, endfeet के आसपास नामित बड़े प्रक्रियाओं भेजने के मस्तिष्क वाहिका 8 की सबसे अधिक है और बीबीबी अखंडता और प्रतिरक्षा निष्क्रियता 9, 10 न्यूरॉन्स को चयापचयों का हस्तांतरण मिलाना, और neuronal गतिविधि के बीच तंग युग्मन प्रेरित और रक्त का प्रवाह 11,12।

cerebrovascular सिस्टम के आणविक और सेलुलर गुणों का अध्ययन करने की क्षमता मस्तिष्क शरीर विज्ञान और physiopathology के लिए अपने योगदान बेहतर चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस सवाल से निपटने के लिए, मस्तिष्क के cerebrovascular सिस्टम को अलग-थलग करने के लिए रणनीति बरकरार मस्तिष्क पोत टुकड़े की तैयारी के लिए अनुमति देते हैं, जो विकसित किया गया है। सेरेब्रल पोत पीurification शुरू में विशेष कृन्तकों 14 में, अन्य प्रजातियों के लिए गोजातीय दिमाग 13 का उपयोग वर्णित और सुधार हुआ है और अनुकूलित किया गया था। यह पिछले अध्ययन में, अलग-अलग आकार के फिल्टर के उपयोग के विभिन्न व्यास की वाहिकाओं में समृद्ध भिन्न करने में मस्तिष्क वाहिकाओं को अलग करने के लिए पेश किया गया था। दिलचस्प है, इस तरह की तैयारी में, endothelial कोशिकाओं उनके चयापचय गुण 15, ट्रांसपोर्टर कार्यक्षमता 16 और ध्रुवीकरण 17 रखा। यहाँ, हम विस्तार में इस प्रोटोकॉल का वर्णन है और आगे पृथक वाहिकाओं सीटू संरचनाओं में अपने के अधिकांश बरकरार है कि प्रदर्शित करता है। Endothelial कोशिकाओं तंग जंक्शनों से जुड़ा हुआ है और एक सतत आधारी पटल से घिरे रहते हैं। Pericytes और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं endothelial परत, साथ ही परिवाहकीय अस्थिकणिका झिल्ली में जुड़े रहते हैं। हालांकि, astrocytes, microglial कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और oligodendrocytes समाप्त हो जाते हैं। अन्त में, हम पृथक मस्तिष्क जहाजों पर immunostaining प्रदर्शन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। अब तक मस्तिष्क प्रणाली के विषय में आणविक और सेलुलर अध्ययन के सबसे द्वारा अलग शुद्ध मस्तिष्क पोत कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया है सेल सेल छँटाई विशेष संवाददाता माउस उपभेदों या immunostaining आधारित प्रक्रियाओं 18,19 इस्तेमाल करते हैं। इन तकनीकों के लगभग शुद्ध cerebrovascular सेल आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देता है, अलग कक्षों पूरी तरह से बदले में, बहुत अपने आणविक और सेलुलर गुणों को प्रभावित करता है जो उनके बगल में आकृति विज्ञान और बातचीत, खो देते हैं। प्रोटोकॉल, विशिष्ट एंटीबॉडी या ट्रांसजेनिक माउस दाग की कोई जरूरत के साथ पूरे cerebrovascular टुकड़े के अलगाव के लिए अनुमति देता है, यहाँ वर्णित उनके आणविक संपत्तियों पर नतीजों को कम करने, इस प्रकार, संरक्षित है पृथक मस्तिष्क वाहिकाओं के समग्र संरचना के रूप में एक अच्छा विकल्प प्रदान करता है। हाल ही में 20,21 वर्णित के रूप में पृथक वाहिकाओं तो बीबीबी पर जीन गतिविधि, प्रोटीन संश्लेषण और विनियमन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 22,23 की तुलना में वर्तमान प्रोटोकॉल, सस्ती प्रदर्शन करने के लिए आसान है और किसी भी प्रयोगशाला में तेजी से अनुकूल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. समाधान और सामग्री

  1. अलगाव पोत समाधान तैयार: बी 1, HBSS के 150 मिलीलीटर के लिए HEPES 1M के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने; बी 2, 20 बी 1 की मिलीलीटर dextran की 3.6 ग्राम जोड़ने; बी 3, बी 1 के 100 मिलीलीटर के लिए बीएसए की 1 ग्राम जोड़ें।
  2. ऊपरी पंगा हिस्सा बंद नीचे काटने से फिल्टर धारक को संशोधित करें।
  3. Immunostaining के समाधान तैयार: फिक्सेशन समाधान, पीबीएस 7.4 पीएच में 4% paraformaldehyde; Permeabilization / अवरुद्ध समाधान, 5% करने के लिए बकरी सीरम पतला और पीबीएस 7.4 पीएच में 0.25% की ट्राइटन X100।
    नोट: फिक्सेशन इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रकार पर निर्भर करता है।

2. विच्छेदन

नोट: वाहिकाओं सेल संस्कृति प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, जब तक बाँझ परिस्थितियों, आवश्यकता नहीं है।

  1. बी 1 की 20 मिलीलीटर के साथ एक 150 मिलीलीटर बीकर तैयार करें। बर्फ पर रखें और हवा संक्रमण से बचने के parafilm के साथ कवर किया।
  2. गहरा पूर्णांक जोड़ दिया जाता है कि शुद्ध isoflurane की 1 मिलीलीटर में लथपथ एक छोटे से कागज तौलिया के साथ एक डाकू के तहत माउस anesthetizeपिंजरे ओ। संज्ञाहरण एक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी के द्वारा सत्यापित है। ग्रीवा अव्यवस्था से माउस को मार डालो।
    नोट: ये कदम राष्ट्रीय और संस्थागत नियमों के अनुपालन में पूरा कर रहे हैं।
  3. वैकल्पिक: खून की सामग्री 24 को समाप्त करने के लिए पीबीएस 1x के 20 मिलीलीटर के साथ intracardiac छिड़काव कार्य करें।
  4. धारा नाक को गर्दन से एक छुरी के साथ त्वचा और इसे दूर खींच। पीबीएस 1x के साथ सभी को दूषित बाल निकालें।
  5. खोपड़ी खोलने के लिए, पहली घ्राण बल्ब के लिए पूर्व से कैंची डालें, और दो भागों में खोपड़ी टूटना करने के लिए कैंची खुला।
  6. ध्यान से एक मस्तिष्क रंग का उपयोग कर मस्तिष्क को हटा दें। वे रक्त वाहिनियों की तैयारी 38 को दूषित होगा के रूप में पार्श्व निलय से रंजित जाल काटना।
    नोट: वैकल्पिक: अंतिम तैयारी parenchymal और तानिका वाहिकाओं में शामिल होंगे। वांछित नहीं हैं, तो तानिका 38 से वर्णित प्रक्रिया के बाद से खुली किया जा सकता है।
  7. टीआरबर्फ पर बी 1 समाधान युक्त बीकर में मस्तिष्क ansfer। ऊपर से 8 दिमाग एक साथ इलाज किया जा सकता है।

3. मस्तिष्क ऊतक homogenization

  1. दो नलियां, का उपयोग कर मैन्युअल और सख्ती बाद में लगभग 2 मिमी के छोटे टुकड़े प्राप्त बी 1 समाधान में मस्तिष्क को हराया।
  2. 400 rpm पर 20 स्ट्रोक प्रदर्शन, एक automatized Dounce homogenizer के साथ तैयारी Homogenize। ग्लास ट्यूब बर्फ में और हवा जेब के गठन को रोकने के लिए, ताकि नीचे तक चलती है और जब douncer के ऊपरी भाग के घोल में है कि बनाए रखा है कि सुनिश्चित करें। कई नमूने तैयार कर रहे हैं, तो प्रत्येक homogenization के बीच आयनित पानी के साथ douncer धो लें।

4. पोत शुद्धीकरण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 जी पर centrifugation के लिए एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में homogenate स्थानांतरण और आगे बढ़ना है। कोई छिड़काव प्रदर्शन किया गया था, तो एक बड़े सफेद इंटरफेस (ज्यादातर माइलिन) पोत गोली (लाल के शीर्ष पर बनेगी)।
  2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पोत गोली और सफेद इंटरफ़ेस एक साथ जुड़े रहेंगे। ठंडा बी 2 समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए मैन्युअल रूप से और सख्ती ट्यूब हिला।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,400 ग्राम पर दूसरे centrifugation करने के लिए आगे बढ़ें। माइलिन अब सतह पर तैरनेवाला की सतह पर एक घने सफेद परत के रूप में होगा।
  4. ध्यान से ट्यूब पकड़ रहा है और धीरे-धीरे यह सतह पर तैरनेवाला दीवारों के साथ पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए घूर्णन द्वारा ट्यूब दीवारों से माइलिन परत अलग। सतह पर तैरनेवाला साथ माइलिन त्यागें। वाहिकाओं युक्त गोली ट्यूब के नीचे जुड़ा रहता है।
  5. एक 5 मिलीलीटर की प्लास्टिक पिपेट के चारों ओर लिपटा एक शोषक कागज के साथ ट्यूब के अंदर दीवार ब्लाट और सभी अवशिष्ट तरल पदार्थों को हटाने, पोत गोली छूने से बचें। किसी भी शेष तरल निकास के लिए एक शोषक कागज पर ट्यूब ऊपर से नीचे रखें।
  6. कम से बाध्यकारी टिप्स, keepi साथ pipetting और नीचे ठंडा बी 3 समाधान के 1 मिलीलीटर में गोली निलंबितबर्फ पर ट्यूब एनजी, तो बी 3 समाधान का एक और 5 मिलीलीटर जोड़ें। वाहिकाओं संभव के रूप में ज्यादा के रूप में बिखरे हैं और समुच्चय के रूप में नहीं है कि सुनिश्चित करें।

5. निस्पंदन

  1. ठंडा बी 3 समाधान के 30 मिलीलीटर के साथ बर्फ पर एक बीकर तैयार करें। हवा संक्रमण से बचने के parafilm के साथ कवर।
  2. एक बेकर कुप्पी के शीर्ष पर एक संशोधित फिल्टर धारक पर एक 20 माइक्रोन जाल फिल्टर रखें और ठंडा बी 3 समाधान के 10 मिलीलीटर लगाने से संतुलित करना।
  3. फिल्टर पर पोत तैयारी डालो और ठंडा बी 3 समाधान के 40 मिलीलीटर के साथ जहाजों कुल्ला।
  4. साफ संदंश का उपयोग फिल्टर की वसूली और तुरंत बी 3 समाधान युक्त बीकर में विसर्जित कर दिया। यह धीरे झटकों से फिल्टर से जहाजों को अलग करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 ग्राम पर एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में बीकर सामग्री को डालो।
  6. नोट: वैकल्पिक रूप से, 4.6 कदम से मस्तिष्क 'जहाजों निलंबन एक 100 माइक्रोन जाल फिल्टर पर फ़िल्टर किया जा सकता है।प्रवाह के माध्यम से उसके ऊपर के रूप में एक 20 माइक्रोन जाल फिल्टर पर छान रहे हैं जो microvessels (मुख्य रूप से केशिकाओं), होता है, जबकि इस मामले में, बड़े जहाजों अधिमान्यतया फिल्टर पर रखा जाता है।
  7. ठंडा बी 3 समाधान के 1 मिलीलीटर में microvessels की गोली Resuspend और एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में pipetting द्वारा यह हस्तांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र।

6. फिक्सेशन, Permeabilization और अवरुद्ध

  1. एक 1.0 मिलीलीटर कम बाध्यकारी टिप का उपयोग पीबीएस युक्त 0.2 मिलीग्राम पीसीआर ट्यूबों में pipetting द्वारा स्थानांतरण वाहिकाओं। वे टिप के बाहर भाग का पालन कर सकते हैं के रूप में जहाजों को छू नहीं सावधान रहना होगा। एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत सभी निम्न चरणों का प्रदर्शन।
  2. निम्न मध्यम परिवर्तन से प्रत्येक के लिए, जहाजों नीचे पहुंच गया है, जब तक बर्फ पर ट्यूब छोड़ देते हैं, और लंबी और बात यह है कि जेल लोडिंग pipet सुझावों का उपयोग कर तरल पदार्थ का सबसे बाहर विंदुक।
  3. पीबीएस के सबसे निकालें और लगानेवाला समाधान के 200 μl जोड़ें।धीरे झटकों से जहाजों को निरस्त करने और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. लगानेवाला समाधान बाहर पिपेट और 1x पीबीएस (पहली बार धोने) के 200 μl के साथ बदलें, आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और इस कदम 3 बार दोहराएँ। हर बार, जहाजों को सही ढंग से जहाजों को छुआ तक नहीं कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने 1x पीबीएस बाहर ट्यूब और पिपेट की तह तक डूब गए हैं कि सत्यापित करें।
  5. पिछले धोने के बाद, समय-समय पर धीरे झटकों से जहाजों resuspending, permeabilization / अवरुद्ध समाधान द्वारा 1x पीबीएस की जगह है और आरटी पर 1 घंटे सेते हैं।

7. Immunostaining

  1. Permeabilization / अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री टेम्पलेट तालिका में यहाँ और dilutions इस्तेमाल किया एंटीबॉडी का संदर्भ देखें) के मिश्रण के साथ permeabilization / अवरुद्ध समाधान बदलें, और 4 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  2. आरटी पर पीबीएस में 3 washes के बाद, 2 घंटे के लिए पीबीएस में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ जहाजों सेतेआरटी पर।
  3. नोट: खुर्दबीन के नीचे बाल या धूल दूषित संभव से जहाजों भेद करने के क्रम में: (2,000 1) या DAPI: हम दृढ़ता से Hoechst (2,000 1) के साथ परमाणु धुंधला प्रदर्शन कर सलाह देते हैं।
  4. पीबीएस में 3 washes के बाद, पीबीएस के 50 μl में जहाजों resuspend।

8. बढ़ते और अवलोकन

  1. एक siliconized केशिका गिलास के साथ एक टिप तैयार: एक छुरी का उपयोग कर एक P200 विंदुक टिप में कटौती और अंदर केशिका समायोजित। केशिका की अनुमानित मात्रा 40 μl है।
  2. Siliconized गिलास केशिका का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड के लिए जहाजों के स्थानांतरण और ध्यान से शोषक कागज के एक टुकड़े के साथ तरल हटा दें।
  3. जहाजों पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद भी लागू करें और ड्रॉप पर्ची की बढ़त के साथ प्रसार करने के लिए अनुमति देने के लिए 45 डिग्री पर एक coverslip पकड़। Coverslip बंद चलते हैं और मध्यम धीरे धीरे प्रसार करने के लिए अनुमति देते हैं। यह सूखा हे / एन आरटी पर प्रकाश से सुरक्षा के साथ करते हैं। वेसल्स एक fluoresc नीचे देखा जा सकताईएनटी confocal खुर्दबीन।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ, हम। मस्तिष्क वाहिकाओं 14 के यांत्रिक अलगाव के लिए अनुमति देने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन 1 इस तकनीक का मुख्य कदम का सार चित्रा। मस्तिष्क वाहिकाओं की वास्तुकला जटिल है और कई प्रकार की कोशिकाओं को भी शामिल है, यानी, endothelial कोशिकाओं तंग जंक्शनों द्वारा सील और pericytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, और अस्थिकणिका पैर प्रक्रियाओं 9 से घिरा हुआ है। इस प्रकार, मस्तिष्क वाहिकाओं के अलगाव के बाद, हम हमारे प्रोटोकॉल के दूसरे भाग के रूप में वर्णित immunostaining द्वारा शुद्ध जहाजों की संरचना को चिह्नित करने के उद्देश्य से। Agrin, endothelial बेसल पटल के एक घटक के लगातार और एक ही ढंग से endothelial सतह (2A चित्रा) में चिह्नित किया गया। उत्तरी occludens -1 (ZO-1), एन्दोथेलिअल तंग जंक्शनों के घटकों में से एक एन्दोथेलिअल तंग जंक्शनों (चित्रा 2 बी) संरक्षित किया गया है, सुझाव है कि कोई स्पष्ट अलगाव के साथ immunostained था। pericyte एन्दोथेलिअल कवरेज, लेबलपहले 25 (चित्रा -2) के रूप में वर्णित Ng2 से एड, लगभग निरंतर दिखाई दिया। अंत में, चिकनी पेशी actin लेबलिंग बड़े शुद्ध वाहिकाओं (चित्रा 2 डी) की सतहों पर एक घने चिकनी पेशी सेल परत की उपस्थिति का पता चला। इन परिणामों सीटू मस्तिष्क पोत संरचना में समग्र पृथक पोत टुकड़ों में संरक्षित किया गया था कि पता चला है।

Astrocytes लगभग पूरी तरह से मस्तिष्क प्रणाली 8 sheathing, जहाजों की सतह के लिए बड़े प्रक्रियाओं, या 'endfeet' भेजने के लिए दिखाया गया है। वाहिकाओं के साथ उनके तंग बातचीत और बनाए रखने और विभिन्न cerebrovascular कार्यों को विनियमित करने में उनकी भूमिका, neurovascular इकाई 9 के एक महत्वपूर्ण भाग के रूप में उन्हें नामित। हम आगे पृथक मस्तिष्क वाहिकाओं के अस्थिकणिका संवहनी कवरेज का विश्लेषण किया। सामान्य रूप से पूरी अस्थिकणिका में GFAP, वर्तमान astrocytic मध्यवर्ती फिलामेंट की Immunolabelling (चित्रा 3), वाकेवल आंशिक रूप से उपस्थित endothelial सतह (चित्रा 3 बी-सी) पर कुछ कम फाइबर दिखा शुद्ध जहाजों पर एस। इसके विपरीत, connexin 43, अत्यधिक परिवाहकीय astroglial झिल्ली 26 में समृद्ध एक अंतराल जंक्शन प्रोटीन, उच्च शुद्ध बड़े जहाजों (चित्रा 3 डी) और केशिकाओं (3E चित्रा) की सतह पर पाया गया था। इसी तरह, Aquaporin -4 (Aqp4) की immunolabelling, पानी चैनल के परिवार के एक सदस्य को बहुत पृथक वाहिकाओं (चित्रा 3F-जी) की दीवारों की रूपरेखा, वाहिकाओं 27, 26 का सामना करना पड़ अस्थिकणिका झिल्ली के स्तर पर व्यक्त की है। Astrocytes के जहाजों के साथ सह-शुद्ध नहीं किया गया है, उनकी परिवाहकीय endfeet झिल्ली मस्तिष्क पोत अलगाव के यांत्रिक प्रक्रिया के दौरान जुड़े रहे।

अंत में, हम अन्य तंत्रिका कोशिका प्रकार से हमारी तैयारियों के संभावित संक्रमण की जांच की। न्यूरोनल मध्यवर्ती तंतु की Immunolabelling (NFM) (Hornun1999) जी एट अल कुछ न्यूरोनल टर्मिनलों के संभावित सह-शुद्धि (चित्रा -4 ए-बी) का संकेत है, जहाजों से जुड़ी कुछ शेष तंतुओं की उपस्थिति का पता चला। Olig2 (चित्रा 4E-एफ) द्वारा लेबल Iba1 (चित्रा 4C-डी) और oligodendrocytes, द्वारा लेबल Microglia, पृथक वाहिकाओं में पता नहीं थे। इस प्रकार, न्यूरॉन्स, microglia और oligodendrocytes मस्तिष्क वाहिकाओं के साथ सह-शुद्ध नहीं कर रहे थे।

साथ में, इन परिणामों वर्णित प्रोटोकॉल परिवाहकीय astrocytic झिल्ली संलग्न रहते हैं, जिस पर संरचनात्मक रूप से संरक्षित मस्तिष्क पोत टुकड़े की शुद्धि के लिए अनुमति देता है कि संकेत मिलता है।

चित्र 1
ब्रेन पोत शुद्धि प्रोटोकॉल का चित्रा 1. सारांश योजना। प्रिंसिपल कदम प्रस्तुत कर रहे हैं। यह स्केच फाई के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है कि तीन संभावित पोत अंशों को इंगित करता है इस्तेमाल किया lters (20 या 100 माइक्रोन जाल)। एस 1: microvessels और बड़े जहाजों, एस 2: बड़े जहाजों और S3:। Microvessels यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पृथक वेसल्स सीटू संरचना में उनके से अधिकांश को बनाये रखें। Immunostained पृथक माउस मस्तिष्क वाहिकाओं के Confocal छवि अनुमानों। (ए) Agrin (लाल) के लिए immunolabelled आधारी पटल। (बी) endothelial सेल तंग जंक्शनों Zonula Occludens (ZO-1 के लिए immunolabelled ) (लाल)। (सी) pericytes NG2 (लाल)। (डी) चिकनी पेशी actin (SMA) के लिए immunolabelled चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (लाल) के लिए immunolabelled। नाभिक Hoechst (नीला) के साथ दाग रहे हैं।पीजी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. अस्थिकणिका Endfeet झिल्ली शुद्ध जहाजों के लिए संलग्न रहते हैं। Confocal छवि अनुमानों। (ए) एन्दोथेलिअल PECAM (सफेद) के लिए immunostained एक cortical पोत दिखा एक मस्तिष्क अनुभाग, astrocytic GFAP (लाल) और connexin 43 (Cx43) (हरे रंग की छवि )। Isolectin बी 4 (सफेद द्वारा लेबल एक अलग केशिका की सतह पर (बी, सी) GFAP immunolabelling (हरा)) (बी) या चिकनी पेशी actin (एसएमए) (लाल) (सी) के लिए लेबल एक बड़े पोत की। (सी) Isolectin बी 4 (सफेद) (डी) द्वारा लेबल एक अलग केशिका की सतह पर 20 (डी, ई) Cx43 immunolabelling (हरा) से अनुमति के साथ एक फिर से प्रिंट है या चिकनी पेशी actin (SMA) के लिए लेबल एक बड़े पोत (लाल) की (एफ, जी) Isolectin बी 4 (सफेद) (एफ) द्वारा लेबल एक अलग केशिका की सतह पर Aquaporin 4 (Aqp4) immunolabelling (हरा) या चिकनी पेशी actin (SMA) के लिए लेबल एक बड़े पोत की (लाल) (जी)। नाभिक Hoechst (नीला) के साथ दाग रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:।। न्यूरॉन्स, Microglia और oligodendrocytes मस्तिष्क वाहिकाओं के साथ शुद्ध सह नहीं कर रहे हैं Confocal छवि अनुमानों (ए, बी) neurofilament (NFM) एक 20 माइक्रोन मोटी hippocampal टुकड़ा (लाल) (ए) और शुद्ध मस्तिष्क जहाजों पर immunostaining ( बी)। (सी, बी) के एक 20 माइक्रोन मोटी cortical टुकड़ा पर microglial Iba1 immunostaining (आरईडी) (सी) और शुद्ध मस्तिष्क वाहिकाओं (डी)। (ई, एफ) एक 20 माइक्रोन मोटी cortical टुकड़ा (लाल पर Oligodendrocyte Olig2 immunostaining) (ई) और शुद्ध मस्तिष्क वाहिकाओं (एफ)। नाभिक Hoechst द्वारा दाग रहे हैं (सफेद ), Isolectine बी 4 (Ib4) (हरा) द्वारा अन्तःचूचुक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

रक्त मस्तिष्क बाधा सीएनएस के अंदर और बाहर शारीरिक पदार्थों के पारित होने को नियंत्रित करता है और रक्त में मौजूद हानिकारक पदार्थ के खिलाफ यह सुरक्षा करता है। यह neurodegenerative रोगों 2 और मस्तिष्क ट्यूमर 28 सहित कई सीएनएस विकृतियों में शामिल है। बीबीबी की बेहद कम पारगम्यता भी तंत्रिका कोशिकाओं और मस्तिष्क अनुसंधान 3 के एक बहुत सक्रिय क्षेत्र है के लिए reversibly कोई हानिकारक परिणामों के साथ बीबीबी खोलने के लिए इच्छुक विधियों के विकास को लक्षित चिकित्सीय एजेंटों के पारित होने बाधित। कई प्रयासों के कृंतक मस्तिष्क से जहाजों को अलग-थलग करने के लिए मूल्यवान मॉडल और बीबीबी की, सेलुलर आणविक और औषधीय जांच की इजाजत देने की तकनीक, और विशेष रूप से, प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए बनाया गया है। पहला प्रयास बस मस्तिष्क parenchymal कोशिकाओं 13 contaminating त्यागने के लिए चर ताकना आकार मेश का उपयोग कर यंत्रवत् अलग मस्तिष्क के ऊतकों से microvessels एकत्र, 29, 30, 31। घनत्व ढाल centrifugation बाद में कॉलम 32, 33, 15 नायलॉन meshes पर या कांच के मोती पर मस्तिष्क वाहिकाओं के छानने का काम करने के लिए संबद्ध पेश किया गया था। इन प्रक्रियाओं में, नायलॉन जाल निस्पंदन बनाम गिलास मनका उच्च गति centrifugation भी जीन अभिव्यक्ति 15, 32 को प्रभावित करता है, जो कतरनी तनाव लाती है, हालांकि पैदावार में सुधार और कम गति centrifugation, microvessel पवित्रता बनाम उच्च दिखाई दिया। Enzymatic पाचन का एक अतिरिक्त कदम भी microvessel पवित्रता 35 बढ़ाने के लिए पक्षपाती न्यूरॉन्स और astrocytes detaching के उद्देश्य से हदबंदी कदम 34 के बाद कुछ प्रोटोकॉल में पेश किया गया था। हालांकि, एक अत्यधिक पूर्व पाचन भी microcapillary अखंडता 36, 37 को बाधित कर सकता है। अभी हाल ही में इम्युनो लेजर कब्जा microdissection (इम्युनो एलसीएम) जहाजों की या यहां तक ​​कि vesse में अलग सेल आबादी की पुनर्प्राप्ति सक्षम करने के लिए दिखाया गया हैइस तकनीक के द्वारा प्राप्त सामग्री की राशि 23 बहुत सीमित है, हालांकि रास, बीबीबी जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए।

यहाँ, हम शुरू में Yousif एट अल 14 द्वारा सविस्तार मस्तिष्क वाहिकाओं के एक यांत्रिक अलगाव के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। यह संभावना शुद्ध मस्तिष्क वाहिकाओं प्राप्त करने के लिए, और उनके व्यास के अनुसार उन्हें अलग करने के लिए प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल पूरे मस्तिष्क संवहनी डिब्बे की शुद्धि के लिए अनुमति देने के लिए बहाना नहीं है, और हम पिछले प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ इसकी क्षमता की तुलना नहीं की थी। हालांकि, ढाल, विशिष्ट स्तंभों और उच्च गति centrifugation कदम के अभाव समग्र प्रक्रिया बहुत आसान और सस्ता बना देता है। मस्तिष्क के homogenization से पहले 38 से वर्णित के रूप में हम प्रदूषण का एक संभावित स्रोत के रूप में यह अनुभव के रूप में महत्वपूर्ण है, हम दृढ़ता से रंजित जाल दूर करने के लिए सलाह देते हैं। अन्य महत्वपूर्ण सिफारिशें की हैं: 1) "कम बाध्यकारी" प्लास्टिक मेटर का उपयोगial वाहिकाओं अनुपचारित प्लास्टिक के लिए स्वाभाविक रूप से (विशेष पिपेट सुझावों में) का पालन करना है। सबसे वाहिकाओं के नुकसान पर नतीजा होगा इस बिंदु को छोड़ते हुए; 2) छानने का काम करने से पहले नायलॉन फिल्टर (कदम 5.2) से सावधान संतुलन; 3) निस्पंदन से पहले जितना संभव हो उतना बफर में गोली का मेजबान नमूना की शुद्धता बढ़ाने के लिए; 3) यदि आवश्यक हो, रक्त कोशिकाओं और शुद्ध वाहिकाओं में फंस प्रोटीन मस्तिष्क विच्छेदन करने से पहले पीबीएस के साथ intracardiac छिड़काव से बाहर धोया जा सकता है; 4) शुद्ध जहाजों की उपज dextran में दो या तीन बार (4.2 कदम) 39,40 माइलिन से जुदाई दोहरा द्वारा सुधार किया जा सकता है। Immunostaining के लिए, हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं: 1) एंटीबॉडी महान गैर विशिष्ट आकर्षण है, जिसके लिए बाल और धूल contaminating से जहाजों भेद करने के क्रम में एक परमाणु लेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए; 2) यह सामग्री का एक विकट गेंद के गठन में परिणाम हो सकता है के रूप में प्रत्येक मध्यम परिवर्तन से पहले centrifugation द्वारा जहाजों इकट्ठा करने से बचने के लिए।

बरकरार मस्तिष्क वाहिकाओं के शोधन बीबीबी की आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए महान लाभ प्रस्तुत करते हैं। विशिष्ट या समृद्ध endothelial और pericyte जीन और रास्ते अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं 18,19 पर transcriptomic और प्रोटिओमिक अध्ययन के द्वारा पहचान की गई है, यद्यपि यह अच्छी तरह से हदबंदी और सेल छँटाई तकनीकों के बीच परस्पर संपर्क के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल polarity और आकृति विज्ञान की हानि हो सकती है कि जाना जाता है दृढ़ता से अपने आणविक प्रोफाइल को प्रभावित जो सेल प्रकार,। Astrocytes के अपवाद के साथ, यहाँ वर्णित के रूप में बरकरार पूरे संवहनी डिब्बे रखे हुए इस संदर्भ में, एक महान लाभ का प्रतिनिधित्व हो सकता है। इसके अलावा, सेल छँटाई की तुलना में, मस्तिष्क वाहिकाओं की शुद्धि विशिष्ट ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस उपभेदों या लंबी immunostaining आधारित प्रक्रियाओं के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। मस्तिष्क वाहिकाओं के उपयोग के लिए एक और लाभ यह है कि पहले से ही murine14 के लिए के रूप में दिखाया अन्य प्रजातियों के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल अनुकूल करने की संभावना है, मनुष्य 41,42 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से bovine13। अंत में, वर्तमान तकनीक का एक और विकास मस्तिष्क जहाजों के टुकड़े की इन विट्रो संस्कृति होगा। प्राथमिक astrocytes न्यूरॉन्स और microglial कोशिकाओं के साथ शुद्ध जहाजों के सह संस्कृति कोशिकाओं पहले बरकरार मस्तिष्क वाहिकाओं के 43. इस प्रकार शुद्धि reassembled किया जा रहा से पहले अलग-थलग और शुद्ध कर रहे हैं, जहां जटिल 3 आयामी बहुकोशिकीय संस्कृति प्रणालियों की तुलना में एक सही तरीके से neurovascular इकाई पुनः करने के लिए मदद कर सकता है बीबीबी अध्ययन करने के लिए इन विट्रो assays के किसी भी प्रकार के विकास के लिए बहुत मदद की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस काम Labex MemoLife द्वारा और ARSEP द्वारा समर्थित किया गया (फ़ोंडेशं ला Recherche सुर ला sclérose एन सजीले टुकड़े à ल सहयोगी डालना)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77, (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468, (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508, (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58, (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7, (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14, (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468, (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10, (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185, (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276, ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166, (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192, (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5, (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34, (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35, (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9, (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14, (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23, (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17, (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44, (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207, (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17, (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24, (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94, (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70, (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics