La purificación de los buques de cerebro de ratón

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Boulay, A. C., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En el cerebro, la mayor parte del sistema vascular consiste en una barrera selectiva, la barrera hematoencefálica (BBB) ​​que regula el intercambio de moléculas y células inmunes entre el cerebro y la sangre. Por otra parte, la enorme demanda metabólica neuronal requiere una regulación de momento a momento del flujo sanguíneo. Cabe destacar que las anomalías de estas regulaciones son características etiológicas de la mayoría de las patologías cerebrales; incluyendo glioblastoma, accidente cerebrovascular, edema, epilepsia, enfermedades degenerativas (por ejemplo: enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer), tumores cerebrales, así como las condiciones inflamatorias tales como esclerosis múltiple, meningitis y disfunciones cerebrales sepsis inducida. Por lo tanto, la comprensión de los eventos de señalización que modulan la fisiología vascular cerebral es un gran desafío. Mucho penetración en las propiedades celulares y moleculares de los diversos tipos de células que componen el sistema cerebrovascular se puede obtener de cultivo primario o clasificación de células a partir de tejido cerebral recién disociada. Sin embargo,propiedades tales como la polaridad celular, la morfología y relaciones intercelulares no se mantienen en tales preparaciones. El protocolo que se describe aquí está diseñado para purificar fragmentos de vasos del cerebro, mientras que el mantenimiento de la integridad estructural. Se demuestra que los vasos aislados consisten en células endoteliales sellados por uniones estrechas que están rodeados por una lámina basal continua. Los pericitos, células de músculo liso, así como las membranas de astrocitos perivasculares endfeet permanecen unidos a la capa endotelial. Por último, se describe cómo llevar a cabo experimentos de inmunotinción en vasos cerebrales purificados.

Introduction

El funcionamiento adecuado del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado, y sus demandas metabólicas son enormes en comparación con otros órganos 1. El SNC es también extremadamente sensibles a una amplia gama de productos químicos, generalmente inofensivo para los órganos periféricos, pero a la misma, neurotóxico. Para garantizar el correcto funcionamiento, la mayor parte del 'vasculatura SNC forma una barrera endotelial; la barrera hematoencefálica (BBB), que controla el flujo de moléculas e iones, así como el paso de las células inmunes entre la sangre y el cerebro, lo que se mantiene la homeostasis adecuada 2, sino también limitar la entrada de drogas terapéuticas, los tratamientos que impiden por lo tanto de trastornos neurológicos 3. A nivel celular, la BBB se sostiene principalmente por extensas uniones estrechas entre las células endoteliales, la expresión de los transportadores de eflujo polarizado y una tasa muy baja transcitosis 4. Propiedades y funciones de la BBB se inducen principalmente por necélulas ighboring 4. En particular, los pericitos juegan un papel importante en la inducción y mantenimiento de la BBB 5,6. Siendo células contráctiles, pericitos también regulan el flujo sanguíneo 7 al igual que las células del músculo liso que rodean los grandes vasos. Por último, los astrocitos, las principales células gliales del cerebro, enviar grandes procesos denominados endfeet alrededor de la mayor parte de la vasculatura del cerebro 8 y modular la acreditación integridad y la quiescencia inmune 9, la transferencia de metabolitos a las neuronas 10, e inducir el estrecho acoplamiento entre la actividad neuronal y el flujo de sangre 11,12.

La capacidad para estudiar las propiedades moleculares y celulares del sistema cerebrovascular es crucial para caracterizar mejor su contribución a la fisiología del cerebro y la fisiopatología. Para abordar esta cuestión, las estrategias para aislar el sistema vascular cerebral del cerebro se han desarrollado, que permite la preparación de fragmentos de vasos cerebrales intactas. Cerebral buque purification fue descrito inicialmente utilizando cerebros bovinos 13 y mejorado y adaptado a otras especies, en particular los roedores 14. En este último estudio, se introdujo el uso de filtros de diferentes tamaños para separar los vasos cerebrales en al fracciones enriquecidas en los vasos de diferentes diámetros. Curiosamente, en estas preparaciones, las células endoteliales mantienen sus propiedades metabólicas 15, funcionalidad transportador 16 y 17 de polarización. A continuación, describimos en detalle este protocolo y demostrar, además, que los vasos aislados conservan la mayor parte de sus estructuras en situ. Las células endoteliales se mantienen unidos por uniones estrechas y rodeado por una lámina basal continua. Pericitos y células musculares lisas de permanecer unidos a la capa endotelial, así como de astrocitos perivasculares membranas. Sin embargo, se eliminan astrocitos, células microgliales, neuronas y oligodendrocitos. Por último, se describe un procedimiento para llevar a cabo la inmunotinción en vasos cerebrales aisladas. Hasta ahora la mayoría de los estudios moleculares y celulares en relación con el sistema cerebrovascular se han realizado en células de los vasos cerebrales purificados disociados por la célula de clasificación utilizando cepas reportero ratón específicos de células o procedimientos basados ​​en inmunotinción 18,19. Aunque estas técnicas permite el aislamiento de las poblaciones de células cerebrovasculares casi puros, células aisladas pierden por completo su in situ morfología y las interacciones, que a su vez, afecta en gran medida sus propiedades moleculares y celulares. El protocolo descrito aquí, lo que permite el aislamiento de fragmentos cerebrovasculares enteros sin necesidad de anticuerpos específicos o manchas de ratones transgénicos, ofrece una buena alternativa como la estructura general de los vasos cerebrales aisladas se conserva, por lo tanto, disminuyendo repercusiones sobre sus propiedades moleculares. Vasos aislados podrían entonces ser utilizados para el estudio de la actividad genética, la síntesis de proteínas y la regulación de la acreditación como se ha descrito recientemente 20,21 22,23 del presente protocolo es barato, fácil de realizar y rápidamente adaptables a cualquier laboratorio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Soluciones y Materiales

  1. Preparar soluciones de los vasos de aislamiento: B1, añadir 1,5 ml de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, añadir 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, añadir 1 g de BSA a 100 ml de B1.
  2. Modificar el soporte del filtro mediante la reducción de la parte inferior de la parte superior de atornillado.
  3. Preparar soluciones de inmunotinción: solución de fijación, 4% de paraformaldehído en PBS pH 7,4; Permeabilización / solución de bloqueo, diluir suero de cabra al 5% y Triton X100 al 0,25% en PBS pH 7,4.
    Nota: La fijación depende del tipo de anticuerpos primarios utilizados.

2. Disección

Nota: No se requieren condiciones estériles, a menos que los buques se utilizan para fines de cultivo celular.

  1. Preparar un vaso de precipitados de 150 ml con 20 ml de B1. Mantenga en hielo y cubrir con parafilm para evitar la contaminación del aire.
  2. Profundamente anestesiar el ratón bajo una campana con una pequeña toalla de papel empapado en 1 ml de isoflurano pura que se añade into la jaula. La anestesia se verifica por la falta de reacción a una pizca dedo del pie. Matar el ratón por dislocación cervical.
    NOTA: Estos pasos se llevan a cabo de conformidad con las normas nacionales e institucionales.
  3. Opcional: Realice la perfusión intracardíaca con 20 ml de PBS 1x para eliminar el contenido de sangre 24.
  4. Sección de la piel con un bisturí desde el cuello hasta la nariz y tirar a la basura. Retire todos los pelos que contaminan con PBS 1x.
  5. Para abrir el cráneo, primero insertar tijeras anteriormente hasta el bulbo olfatorio, y abrir las tijeras para romper el cráneo en dos partes.
  6. Retire con cuidado el cerebro usando una espátula de cerebro. Diseccionar el plexo coroideo de los ventrículos laterales, ya que contaminarían la preparación de los vasos sanguíneos 38.
    NOTA: Opcional: La preparación final contendrá los vasos del parénquima y meninges. Si no se desea, meninges puede despegarse siguiendo el procedimiento descrito por 38.
  7. Transfer el cerebro en el vaso de precipitados que contiene la solución B1 en hielo. Hasta 8 cerebros pueden tratarse juntos.

3. Cerebro Tejido Homogeneización

  1. El uso de dos escalpelos, manualmente y vigorosamente vencieron el cerebro en la solución B1 posteriormente la obtención de pequeñas piezas de aproximadamente 2 mm.
  2. Homogeneizar la preparación con un homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 golpes a 400 rpm. Asegúrese de que el tubo de vidrio se mantiene en hielo y que la parte superior de la douncer está en solución cuando se mueve arriba y abajo, a fin de evitar la formación de bolsas de aire. Si se preparan varias muestras, se lava la douncer con agua desionizada entre cada homogeneización.

Purificación 4. Recipiente

  1. Transferir el homogeneizado en un tubo de plástico de 50 ml y proceder a la centrifugación a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Una gran interfaz blanco (en su mayoría de mielina) se forma en la parte superior de la pastilla recipiente (rojo si no se realizó la perfusión).
  2. Eliminar el sobrenadante. El sedimento de buque y la interfaz blanco permanecerá unida juntos. Añadir 20 ml de solución B2 enfriado con hielo y agitar el tubo de forma manual y vigorosamente durante 1 min.
  3. Proceder a la segunda centrifugación a 4400 g durante 15 min a 4 ° C. La mielina ahora formará una capa blanca densa en la superficie del sobrenadante.
  4. Separar con cuidado la capa de mielina de las paredes del tubo manteniendo el tubo y lentamente girar para permitir que el sobrenadante a pasar a lo largo de las paredes. Desechar la mielina con el sobrenadante. El sedimento que contiene los vasos permanece unido en la parte inferior del tubo.
  5. Seque la pared interior del tubo con un papel absorbente envuelto alrededor de una pipeta de plástico 5 ml y eliminar todos los fluidos residuales, evite tocar el pellet buque. Mantenga el tubo boca abajo sobre un papel absorbente para drenar cualquier líquido restante.
  6. Suspender el sedimento en 1 ml de solución B3 helada pipeteando arriba y abajo con las puntas de baja unión, keeping el tubo en hielo, a continuación, añadir otros 5 ml de solución B3. Asegúrese de que los buques se dispersan tanto como sea posible y no forman agregados.

5. Filtración

  1. Preparar un vaso de precipitados sobre hielo con 30 ml de solución de B3 enfriado con hielo. Cubra con parafilm para evitar la contaminación del aire.
  2. Colocar un filtro de 20 micras de malla en un soporte de filtro modificado en la parte superior de un matraz de Becker y equilibrar mediante la aplicación de 10 ml de solución B3 enfriado con hielo.
  3. Verter la preparación recipiente en el filtro y enjuagar los vasos con 40 ml de solución de B3 enfriado con hielo.
  4. Recuperar el filtro utilizando pinzas limpias e inmediatamente sumerja en el vaso que contiene la solución B3. Separe los buques del filtro sacudiéndolo suavemente.
  5. Verter el contenido vaso de precipitados en un tubo de plástico 50 ml y centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.
  6. Nota: Como alternativa, la suspensión de los vasos cerebrales 'desde el paso 4.6 se puede filtrar sobre un filtro de 100 micras de malla.En este caso, los buques más grandes se retienen preferentemente en el filtro, mientras que el flujo a través de los microvasos (principalmente contiene capilares), que luego se filtró en un filtro de 20 micras de malla como anteriormente.
  7. Resuspender el sedimento de microvasos en 1 ml de solución B3 enfriado con hielo y transferirlo pipeteando en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar a 2000 g durante 5 min a 4 ° C.

6. La fijación, permeabilización y el bloqueo

  1. Vasos de transferencia transfiriendo al vaso 0,2 ml tubos de PCR que contienen PBS utilizando una punta de unión de baja de 1,0 ml. Tener cuidado de no tocar los vasos, ya que pueden adherirse a la parte exterior de la punta. Realice todos los siguientes pasos bajo un microscopio binocular.
  2. Para cada uno de los siguientes cambios de medio, deje los tubos en hielo hasta que los barcos han llegado a la parte inferior, y la pipeta a cabo la mayor parte de los líquidos utilizando largas y cosa puntas de pipeta de gel de carga.
  3. Retire la mayor parte del PBS y añadir 200 l de solución de fijación.Suspender los vasos agitando suavemente y se incuba durante 20 min a TA.
  4. Pipetear la solución de fijación y reemplazarlo con 200 l de PBS 1x (primer lavado), se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y repita este paso 3 veces. Cada vez, compruebe que los barcos se han hundido correctamente a la parte inferior de los tubos y la pipeta fuera 1x PBS, asegurando los buques no se tocan.
  5. Después del último lavado, reemplace 1x PBS por la solución de permeabilización / bloqueo y se incuba 1 hora a RT, la resuspensión de los vasos agitando suavemente de vez en cuando.

7. La inmunotinción

  1. Vuelva a colocar la solución de permeabilización / bloqueo con la mezcla de anticuerpos primarios (véanse las referencias de los anticuerpos utilizados aquí y diluciones en la tabla de plantilla de Materiales) diluido en la solución de permeabilización / bloqueo, y se incuba a 4 ° CO / N.
  2. Después de 3 lavados en PBS a temperatura ambiente, se incuban los vasos con la mezcla de anticuerpos secundarios diluido en PBS durante 2 horasa TA.
  3. Nota: le recomendamos realizar la tinción nuclear con Hoechst (1: 2000) o DAPI (1: 2000) con el fin de distinguir los vasos de posibles contaminantes pelos o polvo en el microscopio.
  4. Después de 3 lavados en PBS, resuspender los vasos en 50 l de PBS.

8. Montaje y Observación

  1. Preparar una punta con un capilar de vidrio siliconado: cortar una punta de pipeta P200 utilizando un bisturí y ajustar el capilar interior. El volumen aproximado del capilar es de 40 l.
  2. La transferencia de los buques a un portaobjetos de vidrio utilizando el capilar de vidrio siliconado y retirar con cuidado el líquido con un trozo de papel absorbente.
  3. Aplique una gota de medio de montaje en los vasos y mantenga un cubreobjetos a 45º permitiendo la caída se extienda a lo largo del borde de la hoja. Deje que se apaga el cubreobjetos y deje a medio y se extendió lentamente. Deje que se seca O / N a temperatura ambiente con la protección de la luz. Los buques se pueden observar bajo un colgmicroscopio confocal ent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aquí se describe un protocolo que permite el aislamiento mecánico de los vasos cerebrales 14. Figura 1 resume las principales etapas de esta técnica. La arquitectura de los vasos cerebrales es compleja e incluye varios tipos de células, es decir, células endoteliales sellados por uniones estrechas y rodeados por pericitos, células musculares lisas, y procesos de pie 9 de astrocitos. Por lo tanto, después del aislamiento de los vasos cerebrales, que tuvo como objetivo caracterizar la estructura de los vasos purificados por inmunotinción como se describe en la segunda parte de nuestro protocolo. Agrin, un componente de la lámina basal endotelial fue etiquetada de forma continua y homogénea en la superficie endotelial (Figura 2A). Zona occludens-1 (ZO-1), uno de los componentes de las uniones estrechas endoteliales se inmunotiñó sin discontinuidad aparente, lo que sugiere que las uniones estrechas endoteliales fueron conservados (Figura 2B). La cobertura endotelial pericitos, etiquetacado por NG2, apareció casi continua a lo descrito previamente 25 (Figura 2C). Por último, el etiquetado actina de músculo liso reveló la presencia de una densa capa de células del músculo liso en las superficies de los grandes vasos purificados (Figura 2D). Estos resultados mostraron que el general in situ estructura de los vasos del cerebro se conserva en los fragmentos de los vasos aislados.

Los astrocitos se han demostrado para enviar grandes procesos, o 'endfeet' a la superficie de los vasos, envainando casi en su totalidad el sistema cerebrovascular 8. Su interacción estrecha con los vasos y su papel en el mantenimiento y la regulación de diversas funciones cerebrovasculares, ellos designan como una parte crucial de la unidad neurovascular 9. Asimismo, analizaron la cobertura vascular astrocito de los vasos cerebrales aisladas. Immunolabelling del filamento intermedio astrocytic GFAP, presente normalmente en todo el astrocitos (Figura 3A), was sólo parcialmente presentes en los vasos purificadas que muestran algunas fibras cortas en la superficie endotelial (Figura 3B-C). En contraste, la conexina 43, una proteína de unión brecha altamente enriquecido en las membranas astroglial perivasculares 26, fue altamente detecta en la superficie de los vasos grandes purificadas (Figura 3D) y capilares (Figura 3E). Del mismo modo, immunolabelling de Aquaporin-4 (AQP4), un miembro de la familia de canales de agua expresada en gran medida a nivel de las membranas de astrocitos que enfrentan los vasos 27, 26, destacando las paredes de los vasos aislados (Figura 3F-G). Aunque los astrocitos no se co-purifican con vasos, sus membranas endfeet perivasculares permanecieron unidas durante el procedimiento mecánico de aislamiento buque cerebro.

Por último, se analizó la posible contaminación de nuestras preparaciones por otros tipos de células neuronales. Immunolabelling de filamentos intermedios neuronales (NFM) (Hornung et al, 1999) reveló la presencia de pocas fibras restantes conectados a los vasos, lo que indica una posible co-purificación de un par de terminales neuronales (Figura 4A-B). La microglía, etiquetado por Iba1 (Figura 4C-D) y oligodendrocitos, etiquetado por Olig2 (Figura 4E-F) no se detectaron en vasos aislados. Por lo tanto, las neuronas, oligodendrocitos y microglia no fueron co-purifican con los vasos cerebrales.

Juntos, estos resultados indican que el protocolo descrito permite la purificación de fragmentos de vasijas cerebrales estructuralmente conservados, sobre la cual las membranas astrocíticos perivasculares permanecen unidos.

Figura 1
Figura 1. Esquema Resumen del Protocolo de Purificación Embarcaciones cerebro. Se presentan los principales pasos. Este bosquejo indica los tres posibles fracciones de los vasos que se pueden obtener dependiendo de la fi filtros utilizados (20 ó 100 micras de malla). S1: microvasos y grandes vasos, S2: grandes vasos y S3:. Microvasos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Los buques aislados conservan la mayor parte de Su Estructura En Situ. Proyecciones de imagen confocal de los vasos cerebrales aisladas ratón immunostained. (A) lámina basal immunolabelled para Agrin (rojo). (B) de las células endoteliales uniones estrechas immunolabelled para zonula occludens (ZO-1 ) (rojo). (C) Los pericitos immunolabelled para NG2 (rojo). (D) Las células musculares lisas immunolabelled de músculo liso actina (SMA) (rojo). Los núcleos se tiñen con Hoechst (azul).pg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. astrocitos endfeet Membranas permanecer unidos a los buques purificadas. Proyecciones de imagen confocal. (A) Imagen de una sección del cerebro que muestra un recipiente cortical immunostained para endotelial Pecam (blanco), astrocitos GFAP (rojo) y conexina 43 (Cx43) (verde ). (B, C) ​​immunolabelling GFAP (verde) en la superficie de un capilar aislado etiquetado por isolectina B4 (blanco) (B) o de un gran vaso etiquetado para actina del músculo liso (SMA) (rojo) (C). (C) es una impresión-Re con el permiso de 20 (D, E) Cx43 immunolabelling (verde) en la superficie de un capilar aislado etiquetado por isolectina B4 (blanco) (D) o de un gran vaso etiquetado para actina del músculo liso (SMA) (rojo) (F, G) Aquaporin 4 (AQP4) immunolabelling (verde) en la superficie de un capilar aislado etiquetado por isolectina B4 (blanco) (F) o de un gran vaso etiquetado para músculo liso actina (SMA) (rojo) (G). Los núcleos se tiñen con Hoechst (azul). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:.. Las neuronas, microglía y oligodendrocitos son no co-purifican con vasos cerebrales proyecciones de imagen confocal (A, B) Neurofilamentos (NFM) inmunotinción sobre una rebanada de 20 micras de espesor del hipocampo (rojo) (A) y los vasos cerebrales purificados ( B). (C, B) Microglial Iba1 inmunotinción en una rebanada cortical 20 micras de espesor (red) (C) y los vasos cerebrales purificados (D). (E, F) Oligodendrocyte Olig2 inmunotinción en un 20 micras de espesor rebanada cortical (rojo) (E) y los vasos cerebrales purificados (F). Los núcleos se tiñen por Hoechst (blanco ), endotelio por Isolectine b4 (IB4) (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La barrera sangre-cerebro regula el paso de sustancias fisiológicas dentro y fuera del SNC y lo protege contra sustancias potencialmente nocivas presentes en la sangre. Está implicado en varias patologías del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 2 y 28 tumores cerebrales. La muy baja permeabilidad de la BHE también dificulta el paso de agentes terapéuticos dirigidos células neuronales y el desarrollo de métodos que tengan la intención de abrir de forma reversible la BHE sin consecuencias perjudiciales para el cerebro es un campo de investigación muy activa 3. Se han hecho muchos esfuerzos para desarrollar modelos valiosos y técnicas que permiten investigaciones celulares, moleculares y farmacológicos de la BBB, y, en particular, los protocolos para el aislamiento de los vasos del cerebro de roedores. Los primeros intentos simplemente recogieron microvasos desde el tejido cerebral disociado mecánicamente utilizando mallas de poros de tamaño variable para descartar contaminación de las células del parénquima cerebral 13, 29, 30, 31. Gradiente de densidad de centrifugación se introdujo más tarde asociado a la filtración de los vasos cerebrales en mallas de nylon o en perlas de vidrio columnas 32, 33, 15. En estos procedimientos, cuentas de vidrio contra la filtración de malla de nylon pareció mejorar los rendimientos y alta frente centrifugación a baja velocidad, la pureza de los microvasos, aunque centrifugación de alta velocidad induce también esfuerzo de corte que afecta a la expresión del gen 15, 32. Un paso adicional de la digestión enzimática se introdujo también en algunos protocolos después de la etapa de disociación 34 con el objetivo de separar las neuronas y astrocitos adherentes para aumentar la pureza de los microvasos 35. Sin embargo, un exceso de pre-digestión también podría perturbar la integridad microcapilar 36, 37. Más recientemente, la microdisección de captura de inmuno-láser (inmuno-LCM) se ha demostrado para permitir la recuperación de los vasos o incluso de poblaciones celulares distintas en vessels, para examinar los cambios en la expresión génica BBB, aunque la cantidad de material obtenido por esta técnica es muy limitada 23.

A continuación, presentamos un procedimiento para un aislamiento mecánico de los vasos cerebrales inicialmente elaborado por Yousif et al 14. Ofrece la posibilidad de obtener los vasos cerebrales puros, y separarlos según su diámetro. Este protocolo no pretende permitir la purificación de todo el compartimento vascular cerebral, y que no se puede comparar su eficacia con los protocolos publicados anteriores. Sin embargo, la ausencia de gradiente, columnas específicas y etapas de centrifugación de alta velocidad hace que el procedimiento en general muy fácil y barato. Es importante destacar que es muy recomendable para eliminar el plexo coroideo como se describe por 38 antes de la homogeneización del cerebro, ya que hemos tenido como una posible fuente de contaminación. Otras recomendaciones importantes son: 1) el uso de plástico mater "de unión de baja"ial (en particular, las puntas de pipeta), ya que los vasos se adhieren de forma natural a los plásticos no tratados. La omisión de este punto daría lugar a la pérdida de la mayoría de los vasos; 2) el equilibrado cuidadoso de filtros de nylon antes de la filtración (paso 5.2); 3) La resuspensión del sedimento en la medida en tampón como sea posible antes de la filtración para mejorar la pureza de la muestra; 3) Si es necesario, las células sanguíneas y las proteínas atrapadas en los vasos purificados se pueden lavar a cabo por perfusión intracardíaca con PBS antes de la disección del cerebro; 4) El rendimiento de los vasos purificados podría mejorarse mediante la repetición de la separación de la mielina en dextrano dos o tres veces (paso 4.2) 39,40. Por inmunoticción, le recomendamos que: 1) para realizar un etiquetado nuclear con el fin de distinguir los buques contaminen pelos y polvo para la que los anticuerpos tienen gran afinidad no específica; 2) para evitar la recogida de los vasos por centrifugación antes de cada cambio de medio, ya que puede resultar en la formación de una bola inextricable de material.

La purificación de los vasos cerebrales intactas presenta grandes ventajas para estudiar las características moleculares de la acreditación. Aunque los genes y las vías endoteliales y pericitos específicos o enriquecidos han sido identificados por los estudios de transcriptómica y proteómica en tipos de células individuales 18,19, es bien sabido que las técnicas de disociación y de clasificación de células conducen a la pérdida de la polaridad celular y la morfología, así como interconexión entre tipos de células, las cuales impactan fuertemente sus perfiles moleculares. En este contexto, manteniendo todo el compartimiento vascular intacta como se describe aquí, con la excepción de los astrocitos, podría representar una gran ventaja. Por otra parte, en comparación con la clasificación de células, purificación de los vasos cerebrales no requiere el uso de cepas específicas de ratón transgénico reportero o largos procedimientos basados ​​en la inmunotinción. Otra ventaja de la utilización de los vasos cerebrales es la posibilidad de adaptar el protocolo de purificación a otras especies como ya se ha demostrado para murine14, Bovine13, así como en los seres humanos 41,42. Finalmente, un desarrollo adicional de la presente técnica sería el cultivo in vitro de fragmentos de vasos cerebrales. Co-cultivo de los vasos purificados con las neuronas y astrocitos primarios células microgliales podría ayudar a volver a montar la unidad neurovascular en una forma precisa que los sistemas multicelulares 3-dimensionales complejas de cultivo donde las células se primera aislado y purificado antes de ser vuelto a montar 43. De este modo la purificación de los vasos cerebrales intactas podría ser de gran ayuda para el desarrollo de cualquier tipo de ensayos in vitro para el estudio de la acreditación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Labex MemoLife y por el ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
10x PBS Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77, (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12, (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468, (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508, (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58, (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7, (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14, (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468, (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10, (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185, (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276, ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166, (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192, (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5, (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34, (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35, (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9, (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14, (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23, (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17, (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44, (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207, (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17, (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24, (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94, (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70, (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics