VDJ-SEQ : B 세포 림프종의 클론 진화 패턴을 나타 내기 위해 재 배열 면역 글로불린 무거운 체인 유전자의 깊은 시퀀싱 분석

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, Y., Nie, K., Redmond, D., Melnick, A. M., Tam, W., Elemento, O. VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma. J. Vis. Exp. (106), e53215, doi:10.3791/53215 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

이해 clonality 종양은 종양 및 질병 진행에 관련된 메카니즘을 이해하는 데 중요하다. 또한, 특정 미세 환경 또는 치료에 응답 종양 내에 발생 클론 조성 변화를 이해하는 것은 종양 세포를 근절보다 정교하고 효과적인 접근 방법의 설계로 이어질 수있다. 그러나 트래킹 서브 종양 클론 개체군 인해 구별 마커의 부족으로 인해 도전되고있다. 이 문제를 해결하기 위해, VDJ-SEQ 프로토콜은 VDJ 재조합 및 체세포과 돌연변이 (SHM), B 세포 림프종의 두 고유의 기능을 이용하여 확산 큰 B 세포 림프종 (DLBCL) 재발의 클론 진화 패턴을 추적하기 위해 만들어졌습니다.

이 프로토콜에서, 인덱싱 가능성을 가진 차세대 시퀀싱 (NGS) 라이브러리는 기본 진단 및 재발 DLBCL의 S​​AMP 쌍에서 증폭 재 배열 면역 글로불린 중쇄 (IGH) VDJ 지역에서 건설되었다레. 샘플 당 평균 이상 만 절반 이상 VDJ 서열은 VDJ 재배치와 SHM 정보를 모두 포함 시퀀싱, 후 얻었다에. 또한, 사용자 정의 생물 정보학 파이프 라인은 완전히 이러한 샘플 내 IGH-VDJ 레퍼토리의 특성에 대한 서열 정보를 이용하기 위해 개발되었다. 또한, 파이프 라인은 재건 및 진단 종양 진단 및 재발 종양 쌍 사이 클론 진화 패턴 공제 내의 클론 이질성의 시험을 가능 개별 종양 클론 구조의 비교를 허용한다. 여러 진단 - 재발 쌍에이 분석을 적용 할 때, 우리는 여러 독특한 종양 진화 패턴 DLBCL 재발로 이어질 수 있다는 키 증거를 발견. 또한,이 방법은 최소 잔존 질환의 식별, 진행 및 재발 치료 반응을 모니터링하고, 면역 repertoir 조사 등의 다른 임상 적 형태로 확장 될 수있다비 림프종 상황에서 에스.

Introduction

암은 클론 질환이다. 30 년 전에는 피터 C. Nowell는 암 클론 진화 모델 1을 제안 언제부터, 많은 연구는 종양 샘플에서 클론 인구를 해부하고, 종양 발생 과정 (2)를 기초 클론 확장과 진화 패턴을 재구성하기 위해 노력했다. 최근 전체 게놈 시퀀싱은 클론 이질성과 진화 3,4에 깊은 살펴보고 수사를 가능하게했다. 그러나, 다수의 세포 유형에서 취급 용이 마커의 부족으로 인해, 그것은 정확한 클론 아키텍처 진화 경로를 추정하는 것은 곤란하다. 다행히 DLBCL 등 많은 림프 악성 종양이, 유래하는 성숙 B 세포에서 자연 clonality 마커가있다. 항원 자극에 반응하여 이들의 세그먼트 큰 풀에서 함께 세그먼트를 각각 B 세포는 V의 H (가변), D (다이버 시티)을 접합하여 하나의 생산성 IGH VDJ 서열을 형성 할 수 있고, J H는 (결합). 이 홍보 중ocess 원래 서열의 작은 부분이 삭제 될 수 있고, 추가로 비 - 템플릿 뉴클레오티드 고유 VDJ 재 배열을 만들기 위해 첨가 될 수있다. 이 특정 VDJ 재배치 따라서 개인의 성숙 B 세포와 그 자손 (5) 태그,이 B 세포의 모든 자손에 상속 할 수 있습니다. 또한, SHM는 항체의 풀 팽창 및 항체 친 화성 (6)의 향상을위한 추가의 돌연변이를 도입하기 위해 후속 배 중심 (GC) 반응에서 VDJ 재조합 서열에서 일어난다. 따라서, 이러한 비교 과정을 거친 시료 림프종 및 VDJ SHM 패턴을 대조함으로써, 종양 내부의 이질성이 서술 될 수 있고, 질병의 클론 진화 경로가 추론 될 수있다.

이전 VDJ 재 배열 및 SHM은 서열 정보를 얻기 위해 PCR 제품,이어서 생거 시퀀싱 클로닝, 재결합 영역을 PCR 증폭에 의해 식별 될 수있다. 이 방법의 난VDJ 재조합 전체 레퍼토리의 매우 작은 부분을 검색하고, 주어진 샘플 내에 클론 집단의 전체 표현의 특성을 방해 낮은 처리량과 낮은 수율이야. 수정 된 접근 방식은 VDJ PCR 제품에서 NGS 색인 시퀀싱 라이브러리를 생성하고 샘플 당 50 만 재결합 VDJ 시퀀스를 얻기 위해 PE × 150의 BP 시퀀싱을 수행하여 만들어졌습니다. 또한, 사용자 정의 파이프 라인 필터 VDJ 서열은 각 읽기의 재배 열과 SHMS을 식별하고, 각 샘플의 클론 아키텍처 계통 분석을 수행하기 위해 판독, 품질 관리 (QC)를 수행 정렬하기 위해 개발되었다. 또한, 새로운 방법은 또한 다양한 질병의 단계에서 수집 된 샘플 클론 진화 패턴을 특성화하기 위해 설립되었다.

우리는 DLBCL 환자 샘플에이 기술을 적용했습니다. DLBCL 최대 1 일에 자주 재발과 비호 지킨 림프종의 공격적인 형태환자 7 IRD. 일부 5 년 8 이후에 발생하는 않지만 DLBCL 재발은 일반적으로 초기 진단 2 ~ 3 년 내에, 초기 발생합니다. 재발 환자에 대한 예후는 10 %로 인해 제한된 치료 옵션에 삼년 무 진행 생존 달성과 함께, 좋지 않습니다. 이 DLBCL 재발 9,10을 치료하는 새로운 접근 방식에 대한 긴급한 필요에 기초가된다. 그러나, DLBCL 재발과 관련된 분자 메커니즘은 아직 크게 알려져 있지 않다. 특히, DLBCL 재발 개발하는 동안 진단과 클론 진화에 클론 이질성의 역할은, 현재지지 않은 있습니다 어려운 재발을 예측할 수있는 정확하고 유용한 바이오 마커를 정의 할 수있다. 이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 일치 차 진단 - 재발 DLBCL 샘플 쌍의 여러 쌍 우리의 VDJ 시퀀싱 방식을 적용했다. 재발의 두 가지 별개의 클론 진화 시나리오는 진단과 재발 SAMP의 클론 아키텍처의 비교에서 등장여러 분자 메커니즘을 제안 레는 DLBCL 재발에 관여 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. VDJ 증폭

종양 샘플에서 1.1) DNA 추출

  1. 냉동 10월 임베디드 정상 또는 악성 조직의 얇은 부분 (10 ~ 20 μm의)에서 DNA를 추출합니다.
    1. 테 K와 (0.5 ㎎ / ㎖, 최종 농도 4 ml의 핵산 용해 버퍼 (; 0.3 M의 NaCl 0.002 M 나 2 EDTA 0.0075 M 트리스 염산, pH를 8.2)에 그라 이오 스탯 마이크로톰로 절단 포함 된 조직의 10 ~ 30 얇은 섹션 다이제스트 )와 하룻밤 37 ° C의 물을 욕조에 15 ㎖의 원심 분리 관에 0.625 % SDS.
    2. 소화 혼합물에 포화 염화나트륨 (5 M)의 1 ML을 추가하고 15 초 동안 격렬하게 흔들어.
    3. 실온에서 15 분 동안 1,100 XG 원심 분리기.
    4. 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송하고 100 % 에탄올의 두 볼륨을 추가합니다.
    5. 튜브에게 6-8 번 반전 섞는다. 4 ° C에서 60 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기는 침전 된 DNA를 수집합니다.
    6. 70 % 에탄올로 두 번 DNA 펠렛을 세척 하였다. 하기 Centr15 분 펠렛을 수집 할 때마다 5,000 XG에 ifuge.
    7. 셰이커 하룻밤에 실온에서 100-400 μL TE 버퍼 DNA를 녹여. DNA 수율은 조직의 크기에 따라 5~200 μg의 (50-500 NG / l 사이의 최종 농도) 인
  2. 포르말린 고정, 파라핀 포함 (FFPE) 정상 또는 악성 조직의 얇은 부분 (10 ~ 20 μm의)에서 DNA를 추출합니다.
    1. 회 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 10 분간 각각의 시간 동안 실온에서 디 paraffinize 크실렌을 1 ㎖의 파라핀 섹션을 인큐베이션. 실온에서 5 분 동안 13,000 XG에서 회전하여 조직 절편을 수집한다.
    2. 실온에서, 10 분 잔류 크실렌을 제거하는 각각의 시간에 1 회 ml의 100 % 에탄올을 부화 섹션. 실온에서 5 분 동안 13,000 XG에서 회전하여 조직 절편을 수집한다. 파라핀은이 시점에서 완전히 용해시키고, 단지 조직 절편은 남아있다.
    3. 객실 테에서 섹션을 공기 - 건조10 ~ 15 분 동안 mperature.
    4. (뉴 클레아없는 물과 10 배 PCR 버퍼에서 희석) 1X PCR 버퍼와 0.5 ㎎ / ㎖ 프로 테 K 솔루션을합니다. 50 ~ 100 μL의 최종 부피에 샘플 테 K 솔루션을 추가하고 밤새 37 ° C를 품어.
    5. 테 K. 불활 10 분간 95 ℃에서 시료를 가열
      주 :이 단계에서, 샘플 DNA는 PCR 버퍼에 용해하고 직접 단계 1.2 및 1.3에서 사용될 수있다. DNA 수율은 조직의 크기에 따라서 0.5 내지 20 μg의 (10-200 NG / l 사이의 최종 농도)이다.

1.2) DNA 품질 평가

  1. PCR 튜브에서 상업적 사다리 키트에서의 마스터 믹스를 45 ㎕의 0.25 μL의 Taq DNA 중합 효소를 혼합한다.
  2. PCR 튜브에 1.1.1.7 또는 1.1.2.5에서 준비 5 μL DNA를 추가하고 최소 5 회까지 피펫 팅에 의해 아래로 잘 섞는다.
  3. 95 ° C의 : DNA를 증폭하기 위해 다음과 같은 조건을 사용하여7 분; 95 ° C, 60 ° C에서 45 초, 72 ℃에서 90 초에서 45 초로 35 회 반복; 다음 10 분 동안 72 ° C와 15 ° C에서 개최.
  4. TBE (트리스 / 붕산염 / EDTA)에서 2 % 아가 로스 겔을 제조.
  5. 4 μL 6X 로딩 염료와 함께 20 ㎕의 PCR 반응을 혼합하고, 2 % 아가 로스 겔에 로딩.
  6. 0.5 μg의 / ㎖에 티듐 브로마이드 용액을 아가로 오스 겔을 겔 염색 및 영상화 시스템으로 PCR 산물을 검출한다. 주 : 100, 200, 300, 400, 및 600 bp의 5의 크기의 PCR 산물을 수득 샘플 VDJ 증폭 물을 생성하는 것을 계속한다.
    주의 : 에티 디움 브로마이드 강력한 돌연변이입니다. 보호 기어, 장갑을 착용하여 극도의주의를 처리하고 기관의 지침에 따라 특정 용기에 폐기하십시오.

1.3) VDJ PCR

1.3.1) 프레임 워크 1 지역에서 증폭 재결합 IGH VDJ 세그먼트 (IgVHFR1)

  1. 튜브 라벨에서 45 μL 마스터 믹스 믹스ED 상업적 체세포과 돌연변이 IGH 정량법 젤 검출 용 키트 "믹스 2"의 Taq DNA 폴리머 라제 0.25 μL 및 PCR 튜브에 1.1.1.7 또는 1.1.2.5로부터 제조 5 μL 샘플 DNA 등.
  2. DNA를 증폭하기 위해 다음과 같은 조건을 사용하여 7 분 95 ° C를, 95 ° C, 60 ° C에서 45 초, 72 ℃에서 90 초에서 45 초로 35 회 반복; 다음 10 분 동안 72 ° C와 15 ° C에서 개최.
  3. 전기 영동에 의한 2 % 아가 로스 젤에서 전체 PCR 생성물을 해결.
  4. 0.5 μg의 / ㎖에 티듐 브로마이드 용액을 아가로 오스 겔을 겔 염색 및 이미징 시스템으로 PCR 산물을 검출한다. 앰플 리콘은 모노클 3백10부터 3백80까지 BP의 크기 범위로 예상된다.
  5. 3백10부터 3백80까지 BP 사이 모노클 앰플 리콘을 포함하는 젤 부분을 절제.
  6. 제조 업체의 프로토콜에 따라 표준 젤 추출 키트를 사용하여 적출 젤에서 DNA를 정화. 주 : FR1 단편을 얻을 수 있었다 샘플, IGV를 충분히 할 필요가 없다HFR2 및 IgVHFR3.

1.3.2) 프레임 워크 2 지역에서 증폭 재결합 IGH VDJ 세그먼트 (IgVHFR2)

  1. PCR 튜브에 1.1.1.7 또는 1.1.2.5로부터 제조 젤 검출 키트 상업적 IGH 유전자 Clonality 분석의 "튜브 B"의 Taq DNA 중합 효소 μL 0.25, 5 μL 샘플 DNA로 표지 된 튜브에서 45 μL 마스터 믹스 믹스 .
  2. DNA를 증폭하기 위해 다음과 같은 조건을 사용하여 7 분 95 ° C를, 95 ° C, 60 ° C에서 45 초, 72 ℃에서 90 초에서 45 초로 35 회 반복; 다음 10 분 동안 72 ° C와 15 ° C에서 둡니다.
  3. 전기 영동에 의한 2 % 아가 로스 젤에서 전체 PCR 생성물을 해결.
  4. 0.5 μg의 / ㎖의에 티듐 브로마이드 염색에 의해 PCR 생성물 (들)을 가시화. 단클론 앰플 리콘은 2백50부터 2백95까지 BP의 크기 범위 내에서 관찰 할 수있다.
  5. 2백50에서 2백95까지 BP 사이 모노클 앰플 리콘을 포함하는 젤 부분을 절제.
  6. 표준 젤 추출물을 사용하여 적출 젤에서 DNA를 정화제조 업체의 프로토콜에 따라 이온 키트.

1.4) 최적화 VDJ PCR

  1. 7 분, 60 초, 60 초 동안 60 ° C, 95 ° C, 40 사이클, 90 초간 72 ℃에서 최종 연장 95 ℃ : IgVHFR1 및 IgVHFR2가 차선 DNA를 사용하여 증폭 다음 변성 PCR 조건을 사용하여 10 분 동안 72 ℃로.

2. VDJ 앰플 리콘 라이브러리 준비 및 시퀀싱

2.1) 라이브러리 준비

2.1.1) 최종 수리

  1. PCR 튜브에 1.3에서 VDJ PCR 제품을 전송하고 60 μL에 볼륨을 가지고 DNA 샘플 준비 키트 부유 버퍼를 추가합니다.
  2. DNA 샘플 준비 키트에서 최종 수리 믹스의 40 μl를 추가하고 철저하게 섞는다.
  3. 100 ℃에서 예열 된 뚜껑 예열 된 열 순환기 (30 ℃)에서 30 분간 30 ℃에서 반응을 배양한다.
  4. 136 μL 자석 구슬 24 μl의 PCR G 믹스rade 물은 먼저 1.5 ㎖의 튜브에 다음, 1.5 ㎖의 튜브에 2.1.1.3에서 전체 최종 수리 반응 옮기고 비드 용액과 잘 혼합한다.
  5. 2 분 동안 자기 스탠드에 배치 튜브 용액으로부터 구슬의 분리를 허용합니다. 뜨는을 대기음, 튜브는 자기 스탠드에있는 동안 두 번 80 % 신선한 준비 EtOH로 구슬을 씻는다.
  6. 완전히 에탄올 용액을 흡인하고 15 분 동안 실온에서 15 분 동안 공기 건조시킨 비드를 허용한다.
  7. 17.5 μL 부유 버퍼에 자기 스탠드에 resuspend 구슬 오프 튜브를 타고.
  8. 다시 재 부유 버퍼에서 별도의 구슬 2 분 동안 자기 스탠드 위에 놓고 튜브. 깨끗한 PCR 튜브에 재현 탁 버퍼 (최종 수리 제품이 현재 재현 탁 완충액된다) 제거한다.

2.1.2) - 미행

  1. 최종 수리 생성물을 함유하는 PCR 튜브에 12.5 μL A-테일링 믹스를 첨가하고 잘 혼합한다. 100 ℃에서 예열 뚜껑 예열 된 열 순환기 (37 ℃)에서 30 분 동안 37 ° C에서 PCR 튜브를 배양한다.

2.1.3) 어댑터 내고

  1. - 미행 반응에 2.5 μL 부유 버퍼, 2.5 μL 내고 믹스, 2.5 μL DNA 어댑터 인덱스를 추가합니다.
  2. 100 ℃에서 예열 된 뚜껑 예열 된 열 순환기 (30 ° C)에서 30 minl 30 ℃에서 반응을 배양한다.
  3. 각 반응에 5 μL 정지 내고 버퍼를 추가하고 철저하게 섞는다.
  4. 2.1.1.5 2.1.1.8에 단계에 따라 반응을 청소하는 42.5 μL 잘 혼합 된 자석 구슬을 섞는다. 어댑터 결찰 제품을 용출 50 μL 부유 버퍼를 추가합니다.
  5. 50 μl를 잘 혼합 AMPure XP 비즈를 사용하여 두 번째로 어댑터 라이 게이션 생성물을 청소하고 깨끗한 PCR 튜브에 25 ㎕의 완충액에 재현 탁 생성물을 용리.

2.1.4) 증폭 된 DNA 단편

  1. 어댑터 결찰 제품을 포함하는 PCR 튜브에 5 μL PCR 프라이머 칵테일 25 μL PCR 마스터 믹스를 추가하고 철저하게 섞는다.
  2. 다음과 같은 조건으로 미리 프로그램 된 열 순환기에 증폭을 수행 : 30 초 동안 98 ° C; 10 초 동안 98 ° C의 10주기, 30 초, 60 ℃, 30 초, 72 ° C; 다음 5 분 동안 72 ° C와 10 ° C에서 개최.
  3. 50 μl를 잘 혼합 된 자성 비드를 이용하여 반응을 정리하고, 30 μL에 재현 탁 버퍼 최종 생성물을 용리시킨다.

2.1.5) 라이브러리 확인

  1. 제조사의 프로토콜에 의한 형광으로 최종 생성물을 정량화. 라이브러리 최종 농도는 2.5-20 NG / l 사이이다.
  2. 제조사의 프로토콜에 따라 고감도 DNA 칩 분석 기기를 사용하여 최종 제품의 품질을 평가. IGVHFR1, IGVHFR2 또는 IGVHFR3 중 하나에 대한 예상 크기의 단일 밴드를 기대합니다. 너를라이브러리 생성물 xpected 크기 원고 VDJ 증폭 물을 더한 크기의 어댑터 (~ 125 염기쌍)의 크기가 동일하다.

2.2) VDJ-PCR 도서관 풀링 및 시퀀싱

  1. 다음 식을 이용하여 각각의 라이브러리 분획의 몰 농도를 계산한다 nM 내지 = [(NG / 1,000) / BP * 660] NG 단계 2.1.5.1 측정 VDJ-PCR 라이브러리의 농도 인 109을 X 및 혈압 피크 VDJ-PCR 라이브러리의 크기는 단계 2.1.5.2 측정.
  2. DNase의없는 물 2 nm의 (10 μL 총)에 대한 라이브러리를 희석.
  3. 함께 1.5 ML 튜브로 희석 2 nM의 라이브러리의 10 μl를 결합합니다.
  4. 1.5 ML 튜브에 PhiX의 스파이크에 제어의 동일한 볼륨을 추가합니다.
  5. flowcell에 오후 7시 농도에서 풀을 넣습니다.
  6. 제조사의 프로토콜에 따라 한 쌍의 엔드 150 사이클 시퀀서를 사용하여 라이브러리의 시퀀스.

3. 데이터 분석

참고 : 써머을이 절에서 사용되는 생물 정보학 스크립트의 진은 보조 코드 파일로 찾을 수 있습니다.

3.1) 정렬 및 품질 관리

  1. 지도 쌍 엔드 시퀀싱 인간 IGH의 V에 대해 읽기, 2의 격차 열린 처벌, 1의 간격 연장 페널티 NCBI에서 제공 'BLASTN'에 따라 적응 염기 폭발 알고리즘을 사용하여 IMGT 웹 사이트 (11)에서 다운로드 D와 J 지역 데이터베이스, 7의 단어 길이 및 10-4의 전자 임계 값. IGH (V)과 J 영역에 모두 매핑되지 않는 읽기 쌍을 폐기하십시오.
  2. 모든 샘플에 시퀀싱 실행에서 얻은 쌍을 읽기를 통해 VJ 조합을 일치의 주파수를 얻기 위해 IGH V와 J 매핑이 나머지 읽기 쌍을 계산합니다. 이 IGH의 V 및 J 유전자에 모두 매핑 된 경우 읽기 쌍을 카운트하고 VJ 특정 조합에 대응하는 수의 대립 유전자에 추가.
  3. 높은에서 3.1.2에서 얻은 각각의 재결합 VDJ 영역의 수를 순위가장 낮은 EST. VDJ 영역은 가장 높은 계수가 큰 재정렬 조합으로서 정의된다 판독 갖는다.
  4. 3.1.3에서 식별 도메인 주요한 재 배열 35 % 미만을 커버 정렬 순서를 버린다.

3.2) SHM 프로필 확인

  1. 이 단계 3.1.3에서 읽는 걸쳐 모든 SHM 패턴을 계산합니다. 서브 클론 각 SHM 패턴을 정의합니다.
  2. 다른 고유 SHM 패턴에 대응되는 서브 클론의 수, 및 개별 서브 클론에 매핑되는 읽기 횟수를 카운트.

결과 3.3) 그래픽 표현

  1. 제조사의 프로토콜에 따라 R 패키지 "영장류"에서 접합 방법을 사용하여 이웃 대응 SHM 패턴을 사용하여 서브 클론에 계통 학적 분석을 수행한다. V의 배선 서열에 뿌리 서브 클론의 계통을 다시 각각의 고유 한 정렬으로부터의 거리 행렬을 계산각 쌍 샘플 세트에 대한 질문에 J 조합.
  2. 문자 벡터로서 각 서브 클론의 염기 서열을 사용하여 두 선형 사이의 거리 (D)의 X, Y에 의해 주어진다 수학적 진단 Levenshtein 거리 측정 값을 이용하여 해당 재발 샘플 모두 주요 VJ 재 배열에서 모든 서브 클론 간의 근사 스트링 거리를 계산 (I, J) (D)의 X, Y (I, J) = 1을 난 J ≠ 0, 그렇지 않으면 다음 서열 i와 j 뉴클레오티드에 대응하는 문자열의 길이를 통해이 기능을 요약하면한다.
  3. 그래픽으로 다음 두 가지 방법으로 서브 클론 거리 및 해당 서브 클론 카운트의 결과를 표시 매트릭스 :
    1. R 패키지를 사용하여 "질량"제조 업체의 프로토콜에 따른 서브 클론 거리 행렬에 다차원 스케일링을 적용하고 두 차원 원칙을 생성하기 위해 다음 로그와 함께 플롯지도, 좌표원의 반지름으로 subclonal 카운트.
    2. 정점의 주요 VJ 재 배열에서 발생하는 각각의 별개의 서브 클론에 해당하는 Levenshtein 거리에 따라 무향 그래프를 구축합니다.
      참고 한 후, 이들 두 꼭지점 사이의 에지가 존재하는 두 개의 별개의 클론 사이의 거리가 동일한 경우. 거리가 1보다 큰 경우, 그것들을 연결하는 어떤 에지는 없다.
    3. 제조사의 프로토콜에 따라 Kamada 가와이 레이아웃 "iGraph"R 패키지 tkplot 함수를 사용 3.3.3.2의 그래프를 그린다. 정점의 반경은 매핑 클론의 총 개수의 제곱 루트에 비례하고 음영 하나가 진단 (청) 또는 재발 (적색) 샘플에 속하는 클론의 비율을 표시하는 적색 및 청색 범위를 사용 .

3.4) 이질성 (엔트로피) 측정

  1. 의 번호와 서브 클론 수를 검사각각의 주요 VJ 재 배열에서 발생하는 체세포과 돌연변이의 개별 패턴 샘플 세트 페어링.
  2. 표준 히스토그램 엔트로피 기반 추정을 사용하여 각 샘플의 고유 클론의 수를 조정 경험적​​ 엔트로피 잔류 경험적 엔트로피를 계산한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA 추출을 포함 VDJ 서열 (VDJ-SEQ)의 전반적인 절차는, 처리 및 계통 발생 분석을 판독 VDJ 영역 증폭 및 정제, 서열 라이브러리 구성을 재결합,도 1에 표시된다. 일상적 5-200 μg의의 DNA로부터 검색 될 수있다 냉동 고체 조직 섹션 또는 포르말린 고정 파라핀 조직 절편에서 0.5 ~ 20 μg의 DNA를. 품질, 재 배열 패턴 및 개별 샘플 SHM 정도에 따라 다른 샘플로부터 VDJ 증폭 산물의 다양성을 얻을 수 있었다 (도 2), IGVHFR1 (3백10부터 3백80까지 BP), FR2 (2백50부터 2백95까지 BP)를 포함 FR3 (70-120 BP). 단지 FR3 VDJ 단편 PCR로부터 획득 될 수있는 샘플 인해 하류 데이터 분석 목적 서열 정보의 충분한 양을 제공하지 않는 짧은 제품에 나머지 연구에서 제외 하였다. 주요 FR1 또는 FR2 PCR 생성물 번째에 가시화 될 수있는 단지 샘플예를 아가로 스겔은 시퀀싱 라이브러리를 생성하기 위해 처리된다. 겔 정제 후에 주요 PCR 생성물의 수율은 10 내지 50 ng의 총 범위이다.

전체 정제 된 PCR 생성물을 서열 라이브러리에 대한 후속의 라이브러리의 구축을 위해 사용 하였다. 어댑터 결찰 한 후, 각각의 샘플은 자신의 고유 인덱스를 가져옵니다. 도서관 증폭하는 동안, PCR의 10주기는 최종 라이브러리 제품과 같은 30 개 이상의 NG를 얻을 수있는 수행 하였다. 라이브러리 품질 bioanalyzer에 액세스되었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, ~ 125 bp의 크기의 편이와 라이브러리 시료 하나 제품이 어댑터의 추가를 나타내는 오리지널 VDJ PCR 증폭 물 생성물을 형성하다. 각 시퀀싱 실행의 경우, 5 ~ 10 라이브러리는 7 μm의 함께 풀링했다. 또한, 인해 VDJ PCR 제품 간의 높은 서열 유사성을, 라이브러리 풀이 PhiX 50 %의 혼합하고 스파이크의 실행과 염기의 정확한 식별을 보장하기 위해 복잡성각 시퀀싱 사이클 후 추가. 라이브러리 DNA 단편 FR1 프래그먼트 VD와 접합 DJ 걸친 서열 정보의 충분한 양의 검색을 허용 양단에 150 bp의에 대한 염기 서열 및 계통 발생 분석을위한 SHM 돌연변이 패턴 하였다.

이전에, 우리는 12 위에서 설명한 조건을 사용하여 (여러 환자가 여러 샘플 진단 또는 재발 단계 중 하나에서 수집 한) 14 명에서 진단 및 재발에 수집 된 32 DLBCL 샘플에 VDJ 서열 분석을 수행 하였다. 한 쌍의 샘플, "조기 발산"과 DLBCL 재발과 관련된 클론 진화의 "- 늦은 발산"모드 사이의 주요 V H DJ H 재 배열의 SHM 프로파일의 계통 발생 학적 분석을 수행함으로써 (12)를 확인 하였다. 여기서, 동일한 방법은 새로 수집 DLBCL 진단 및 재발 쌍에 적용 하였다. FR1 영역은 P 전후의 샘플을 얻었다CR 증폭. (bioanalyzer 의해 측정 된) 약 344 bp의 크기와 주요 PCR 생성물을 진단 및 재발 모두 샘플로부터 수득 하였다. (0.38- 시퀀싱 한 결과, 0.70 백만 쌍의 엔드 총 진단 샘플을 얻었다 판독하고 0,730,000 쌍의 엔드는 이전 연구에서 샘플 당 수득 읽기 수의 범위 내에 있었다 재발 샘플에 대해 읽 0.75 ± 0,260,000 평균 1,420,000) (12). 매핑 쌍 엔드 IMGT 데이터베이스에 대해 읽어 후, 세 V에서 안타를하지 않아도 읽고, D와 J 영역은 폐기되었다. V H DJ H 배열은 각 쌍 엔드 읽기에 할당되었다. 0,640,000 및 0,670,000 V H H DJ 접합부의 총 90 % 이상의 배향 율을 나타내는 각각 진단 및 재발 샘플에서 확인되었다. 얼마나 많은 시간을 계산하여 V H DJ H의 각 조합은 각각의 샘플에서 발견되었다, 808 뚜렷한 V의 H </ 서브는> DJ H 접합은 진단 샘플과 재발 샘플에서 581 별개의 V H DJ H 접합에서 발견되었다. 두 샘플에서 지배적 인 V H DJ H 접합은 클론 적 관련있는 것을 확인, IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2입니다. 이 지배적 V H H DJ 접합 매핑 V H H DJ 접합 진단 및 재발 샘플 샘플 모두 판독 전체의 97 %를 차지한다.

이 DLBCL 재발 케이스의 클론 진화를 추적하려면, 진단 및 재발 샘플이 쌍 사이의 주요 V H DJ H 재 배열의 SHM 프로파일의 계통 발생 학적 분석을 실시 하였다. 우리는이 한 쌍의 클론 진화 패턴은, "늦게 발산"경로 (그림 4) 다음과 같은 것을 관찰 계통의 같은 지점에 모여 진단과 재발 종양, 그리고 지배적에서 서브 클론진단 서브 클론과 몇 가지 추가 돌연변이와 비슷한 SHM 패턴을 공유 지배적 재발의 서브 클론 재발 서브 클론 발생했습니다. 이러한 결과는 잠재적 중 화학 - 저항이었다 또는 치료에서 탈출하고 결국 재발 종양으로 개발 된 진단 종양의 서브 클론 있다는 것을 시사한다.

상기 특성화 및 재발 과정에서 각 샘플 및 클론 진화 패턴 클론 구조를 시각화하는 새로운 두 분석이 개발되었다. 이러한 분석에서, 각각의 샘플에서 주요 VJ 재 배열의 서브 클론의 전체 세트는 SHM들의 패턴에 의해 정의 된 모든 서브 클론 간의 쌍대 문자열 거리를 계산하는데 사용되었다. 이어서 다차원 스케일링 (도 5A, 5B)을 사용하여 또는 데이터 분석에 기재된 무향 그래프 (도 5C, 5D)를 구축하여, 서브 클론의 분포 및 이질성을 나타내는 그래프가 작성되었다. 같이그림 4, MDS 플롯은 초기 발산 경우 (그림 5B)에 비해 후반 분기하는 경우 (그림 5A)의 주요 서브 클론 사이에 훨씬 적은 순서 다양성을 나타낸다. 또한, 초기 발산 경우 진단 샘플의 서브 클론 및 재발 샘플의 서브 클론들은 동일한 VDJ 재 배열을 수행하였으나 이러한 종양 사이 SHM 패턴의 유사성의 부족을 나타내는, 서로 완전히 분리 . 마찬가지로, (그림 5C) (그림 5D)의 방향성 그래프는 후반 분기하는 경우 (그림 5C)에 서브 클론 카운트의 분포가 초기 발산 (그림 5D)와 다른 것으로 나타났다. 후자는 진단에서 재발로 더 유명하지만, 유 전적으로 다양한 주요 클론을 가지고있다. 또한, 주요 진단 및 재발 클론 사이의 에지들의 부족과 작은 서브 클론 연결초기 분기하는 경우 (그림 5D), 초기 발산 재발 케이스의 순서 다이버 시티 특성을 보여줍니다.

그림 1
그림 1 :.. VDJ-서열 접근의 단계 흐름도에 의해 단계 VDJ 서열의 전체 과정이 표시됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : VDJ의 PCR의 증폭 제품의 대표 이미지. 대표 IGVH-FR1 (왼쪽 패널) 및 IGVH-FR2 (오른쪽 패널) 림프종 환자 샘플에서 추출 된 DNA로부터 PCR 제품을 보여주는 젤 이미지. PCR 생성물은 아마도 어느 낮은 샘플 5에서 얻을 수 없었다PCR 반응을 손상 프라이머 사이트에서 샘플 DNA 품질이나 SHM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. bioanalyzer로 VDJ PCR 증폭 물과 이후의 시퀀싱 라이브러리의 품질 관리는 대표 Bioanalyzer 라이브러리 구성 (상단 패널) 전 라이브러리 건설 (아래 패널) 후 같은 VDJ의 앰플 리콘의 추적합니다. 어댑터의 추가를 나타내는 459 BP 334 BP의 크기 변화를합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : DLBCL 진단 및 재발 샘플 쌍의 클론 진화 분석. "늦게 발산"클론 진화 모드를 나타내는 진단 - 재발 DLBCL 샘플 쌍의 계통 학적 분석. 색상 시세가 돌연변이 상태를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 5
그림 5 : 새로운 그래픽 방법은 클론 진화 패턴을 시각화 (A, B)를 보여주는 SHM 프로필 및 샘플 쌍 후반 발산 재발 모드 (A)를 보여주는 샘플 쌍 (B)의 서브 클론 수를 통합 다차원 스케일링 플롯 초기 발산 재발 모드. (B). 원의 반경 subcl의 카운트를 나타낸다특정 SHM 프로파일에 해당하는 사람 및 진단 (파란색) 샘플 또는 재발 (적색) 샘플에 해당하는 색상. X 축 및 Y 축이 MDA의 상위 2 구성 요소를 나타낸다. (C, D) 샘플 쌍의 초기 발산 재발 모드 (D)를 보여주는 후반 발산 재발 모드 (C) 및 샘플 쌍 B를 보여주는 방향성이 그래프. 가장자리가 하나의 문자 분리의 캐릭터 거리를 갖는 2 개의 SHM 프로파일에 해당 및 음영을 진단 (빨간색) 샘플 또는 재발에 해당하는 특정 SHM 프로필에 시퀀스 매핑의 비율을 나타내는 (컬러 스케일 바)를 졸업 (노란색) 샘플. 를 클릭하십시오 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

때문에 인간 B 세포 IGH 유전자좌 VDJ 재 배열 및 SHM에서 부호화 순서 정보의 반복 거의 무제한, 높은 처리량 깊은 시퀀싱하여 전체 IGH 레퍼토리 검사 클론 서술하는 효율적이고 광범위한 방법 입증 및 서브 클론 B 세포 집단. 더욱이, 이러한 전략은 질환의 다양한 단계를 따라 수집 된 환자 샘플의 클론과 서브 클론 구조를 비교하여 B 세포 종양 발생, 경감 및 재발 클론 진화 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다. 기본 샘플 DNA에서 재 배열 된 VDJ 서열의 증폭을 용이하게 시판되는 프라이머를 사용하여 실험실 환경에서 수행되지만, 증폭 효율이 샘플 DNA의 품질에 크게 의존한다. 특히, FFPE 시료에서 추출한 DNA는 낮은 증폭 효율을 발휘하고, 종종 작은 FR3 단편으로부터 성공적으로 증폭 될 수있다샘플을 후속 분석을 위해 그들을 적합하지 않다. 여기에 설명 된 우리의 연구는 하나 또는 여러 개의 주요 클론은 전체 종양을 지배와 클론 질환으로 B 세포 림프종의 clonality을 이해하기 위해 설계 되었기 때문에, 우리는 수집하고 주요 VDJ-PCR 제품을 시퀀싱. 예를 들어, 전체 B 세포 클론 인구 카탈로그에 관심이있는 연구, 말초 혈액를 들어, 여러 VDJ-PCR 제품 (다중 대역 또는 겔에 얼룩)가 포함 된 젤의 더 큰 부분은 절제 염기 서열을 할 수있다. 그러나, 그것은 소정 SHM 어디 프라이머 대상에서 발생하고 이러한 VDJs의 증폭을 저해 할 수 있기 때문에, 전체 재 배열 IGH 레퍼토리를 캡처 할 수 없다는 점을 지적하는 것이 중요하다. 또한, 최근에, 상업적 분석법이 직접 결합 IGH 재배치 증폭 MiSeq 시퀀싱 도입되었다. 본 분석은 시료 준비 과정을 간소화. 그러나, 이후 모든 종양 샘플은 장군 수있을 것입니다FR1 단편 테, 여전히 시퀀싱 풀링하기 전에 샘플을 PCR 반응의 생성물을 확인 겔 전기 이동 단계를 포함하는 추천.

1) 300 bp의 염기 서열은, FR1 및 전체 FR2 단편의 대부분을 커버 VDJ 재 배열을 식별하기위한 충분한 서열 정보를 제공하고있다 : VDJ 단편 (300 bp의 시퀀스 정보의 총)의 양단의 시퀀싱 150 BP는 다음과 같은 장점을 갖는다 체세포 하이퍼 돌연변이; 2) 플랫폼은 48 시간에서 VDJ 시퀀싱의 전체 300 사이클을 완료 빠른 순서 턴 - 주위에 시간을 제공; 3) 각 실행 12 샘플 멀티플렉싱을 허용하고 여전히 주위 백만 쌍 엔드 샘플 출력 당 읽고 달성한다. 특히 B 세포 림프종 샘플에서, 같은 VDJ 재배치를 들고 클론 사이의 높은 서열의 유사성, 그것은 스파이크에 할 20-50% PhiX 시퀀싱 실행하는 동안 수 있도록하는 것이 중요하기 때문에 정확하게 매트릭스를 호출베이스를 정의합니다. 최근 MiSeq소프트웨어는이 문제를 해결하기 위해 업데이트되었습니다. 그것은 낮은 복잡도 라이브러리 시퀀싱 적은 5 %에​​ PhiX 스파이크 기능을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리의 순서화 기능은 낮은 복잡도의 시퀀싱 결과를 절충 제조업체에서 제공 PhiX 스파이크 제어 된 DNA의 농도가 일관성을 경험하고있다. 따라서, 현재의 관행에, 우리는 여전히 VDJ 시퀀싱 10 내지 20 %의 PhiX 스파이크를-에 사용합니다. 일반적으로 다른 VDJ 배열 많이 포함 전체 말초 혈액 B 세포 레퍼토리의 시퀀싱, 그것은 PhiX 스파이크 기능의 양을 감소시킬 수있다. 각 시료의 식별 복제 및 서브 클론의 수를 적극적으로 짝 엔드 백만 샘플 당 읽기에 순차 읽기의 수를 절반으로 상관 관계가 있지만 다른에서 수집 된 샘플 사이 클론 진화 패턴을 샘플 사이 클론 구조를 비교하고 추론하기에 충분하다 같은 환자 (12)의 질병 단계. 그것은가능한 PE 150 bp의 염기 서열은 그 긴 FR1 조각 (예 : 350-380 BP)의 충분한 커버리지를 달성 할 수 있음. 어떤 경우에는, D 세그먼트의 시퀀스 정보가 수집되지 않거나 SHMS 서브 클론에 의해 차별화 V 세그먼트에 충분한 서열 정보가 없을 수도있다. 그러나, 시퀀싱 기술의 발전과 함께, 그것은 긴 서열 및 전체 FR1 증폭 물을 커버하는 것이 가능하게되었다.

B 세포의 IGH 레퍼토리의 시퀀싱을 통해 개별 B 세포 클론의 팽창을 추적하고 재발 진단에서 걸쳐 진화 클론을 유추 할 수 있었다. SHM 패턴에 의해 생성 된 서브 클론의 인구에 대한 분석의 사용을 통해, 우리는 그들의 계통을 검사하여 재발에 암 진행의 두 가지 모드를 구별 할 수 있었다. 상기 Levenshtein 거리에 기초 다차원 스케일링 플롯과 무향 그래프를 사용하여 최신의 그래픽 표현 알로우리가) 각 종양 subclonal 조성물 1을 이해 w, 2)이 서로, 그리고 (3)에 관련되는 방식을 개별 서브 클론) 각 서브 클론은 질병 진행 동안 진화 방법. 또한, 통계 분석은 이러한 계통 구조가 명확하게 다른과 subclonal 인구가 이성에 관해서는 차이가 있다는 것으로 나타났다. 마지막 VDJ 시퀀싱하여 얻어진 클론 진화 궤도 아니라 유전 진화와 상관 및 하나 엑솜 특징으로 또는 시퀀싱 (12)를 대상으로 할 수있다. 따라서,이 두 가지 접근법을 조합하는 것은 lymphomagenesis 림프종 및 재발시 드라이버 돌연변이를 식별 할 가능성이있다

림프종 진행 클론 진화 B 세포 IGH 레퍼토리를 정의 및 추적뿐만 아니라, VDJ-SEQ 접근법은 잠재적으로, 최소 잔여 질병을 추적 치료법 종양 반응을 모니터링하고, 잠재적으로 존재를 식별하기위한 고도로 민감한 방법으로 사용될 수있다약제 내성 클론. 유사한 접근 방식은 또한 T 세포 수용체 레퍼토리를 매핑하는 T 세포에 적용 할 수 있으며, 암, 면역 응답 감시를 탐지하는 데 이용 될 수있다. 또한, VDJ-SEQ도 한나 동부 알 문의 프라이머를 사용한 뮤린 모델에서 수행 될 수있다.도 13은 향후 몇 년이 방법을 통해 수집 된 정보가 종양 발달의 역학 이해 초래할뿐만 아니라 수 예견 면역 체계에 대한 우리의 지식과 종양의 침략으로부터 우리 몸을 방어에서의 역할을 확장합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 89125-170 200 proof, for molecular biology
TE buffer Life Technologies 12090-015 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes VWR EM-XX0055-6 500 ml
Proteinase K  Life Technonogies 25530-015 100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix Promega U1515 10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer  Roche 11699105001 Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 Life Technonogies 4311806 50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder Invivoscribe Technologies  2-096-0020 33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection Invivoscribe Technologies  5-101-0030 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection Invivoscribe Technologies  1-101-0020 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8291 20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Corning (cellgro) 46-011-CM 6x1 L
50x TAE BUFFER   VWR 101414-298 1 L
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
25 bp DNA Ladder Life Technologies 10597011 1 µg/µl
100 bp DNA Ladder Life Technologies 15628-019 1 µg/µl
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 500 g
40% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad Laboratories 1610144 500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 50 columns
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
MiSeq Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Magnetic stand Life Technologies 4457858
Gel imaging system Bio-Rad Laboratories 170-8370

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194, (4260), 23-28 (1976).
  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481, (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481, (7382), 506-510 (2012).
  4. Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
  5. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11, (4), 251-263 (2011).
  6. Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354, (6352), 389-392 (1991).
  7. Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346, (4), 235-242 (2002).
  8. Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28, (12), 2094-2100 (2010).
  9. Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
  10. Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28, (27), 4184-4190 (2010).
  11. Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40, (1), 101-111 (2008).
  12. Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15, (8), 432 (2014).
  13. Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133, (2), 250-264 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics