백혈구 - 혈소판 풍부한 섬유소, 소설 생체 재료의 특성

Bioengineering

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Madurantakam, P., Yoganarasimha, S., Hasan, F. K. Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial. J. Vis. Exp. (103), e53221, doi:10.3791/53221 (2015).

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Abstract

Protocol

모든 혈액 그리기 절차는 허가 및 인증 전문가에 의해 수행되어야합니다. 연구를위한 인체의 사용은 임상 시험 심사위원회 또는 기타 적절한 권한 승인을 포함한다. 동의서에 관한 및 참가자 식별을 보호하는 특별주의 사항을 따라야합니다. 이 프로토콜에 나와있는 모든 실험은 인간의 혈액 및 / 또는 혈액 제품과 적절한 개인 보호 장비의 처리는 항상 착용해야합니다 포함한다. 폐기물은 생물로 간주 규정에 따라 처리해야한다.

1. 정맥 천자

  1. 환자 / 참가자를 확인하고 기존의 기록을 확인합니다. 세부 연구를 설명하고 동의를 얻을.
  2. 평평하고 안정된 표면에 표시 튜브와 개별 환자에 대한 설정 트레이가 있습니다.
  3. 절차를 설명하고 지원 팔을 편안하게 환자 좌석을 확인합니다. 환자 자신 또는 SH 알리전자는 작은 핀치를 느낄 것이다 및 절차 전반에 걸쳐 여전히 남아 있어야한다.
  4. 어댑터에 바늘을 연결합니다.
  5. 손을 씻고 장갑을 착용하십시오.
  6. 바깥쪽으로 중심에서 동심원 70 % 이소 프로필 알코올로 청소하여 정맥 천자에 대한 전주 포사를 준비합니다. 30 초 동안 자연 건조 사이트를 허용합니다.
  7. 촉진하여 적절한 정맥을 확인합니다.
  8. (아직 반경 펄스를 느끼면서) 너무 꽉 있는지 만드는 천자 사이트 위의 지혈대 3-4을 적용합니다.
  9. 하나의 부드러운 동작으로 피부에 바늘 15 ~ 30 도의 경사를 삽입하여 정맥 천자를 수행합니다. 바늘을 통해 혈관을 누르고 전체 혈액의 9 ml의를 수집합니다.
  10. 지혈대를 제거합니다. 바늘에서 튜브를 제거합니다.
  11. 바늘을 철회하고 바늘을 제거하기 전에 천자 부위에 거즈 광장을 적용합니다. 적절한 생물 학적 용기에 바늘을 폐기​​하십시오.
  12. 홍보 유지하기 위해 환자에게 문의펑크 사이트에서 essure.
  13. 튜브 레이블
  14. 출혈이 중지 확인하기 위해 천자 사이트를 확인하십시오.
  15. 환자가 (통증이 팽창하거나 빛 머리가) 확실히 느끼고 있는지 물어, 거즈 광장을 통해 접착 붕대 나 테이프를 적용
  16. 배출하기 전에 환자 / 참가자 감사합니다.

2. L-PRF 준비

  1. 바로 붉은 얹어 건조 유리 튜브에 정맥 채혈 한 후, 원심 분리기에 넣습니다.
  2. 적절한 카운터 밸런스를 배치 한 후 실온에서 12 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
  3. 주기의 끝에서 튜브를 제거한다. 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP), 혈소판 풍부 피브린 (L-PRF) 및 적혈구베이스 (그림 1) : 세 개의 층을 확인할 수 있습니다.
  4. 피펫을 사용하여 PPP를 대기음. 사용 핀셋 부드럽게 L-PRF를 당겨 멸균, 천공 금속 메쉬에 넣습니다.
  5. 외과 용 메스를 사용하여 조심스럽게 버프 떠나는 RBC 층의 벌크를 긁어Y 코트 그대로.
  6. 부드럽게 30 초 동안 (멸균 금속 플레이트, 대략적인 무게 225g 사용) L-PRF 응고를 압축. 혈소판 가난한 플라즈마는 압착된다.
  7. 플레이트를 제거하고 부드럽게 L-PRF 막을 올립니다. L-PRF 막은 실험 12에서 사용하기위한 준비가되어있다.

3. 일축 인장 시험

  1. 취급의 용이성을 위해 여과지에 놓고 L-PRF 막 (N = 6)과 (7.5 mm의 게이지 길이 자신의 좁은 지점에 폭 2.75 mm)를 주문 제작 금속이 죽었을 사용하여 "개 뼈"에 펀치.
  2. 세 지점에서 각 샘플의 두께를 측정하고 평균을 취.
  3. 신중 축성 테스트 시스템의 턱 그립의 중앙에 L-PRF 막 결합.
  4. 조심스럽게 L-PRF 막을 노출 파일러 용지 지원을 찢어.
  5. 프로그램 장비 가동 헤드가 일정한 속도 (10.0 mm / 분)로 작동되도록 할 때 L- 실험을 시작할PRF는 아직 젖어있다.
  6. 단축 테스트 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어의 휴식, 휴식 에너지​​ 및 변형을 탄성 계수를 기록합니다. 이 값은 자동으로 계산하며 사용자 정의 입력이 필요하지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오.

4. 봉합 유지 강도

  1. 장소 L-PRF 처리의 용이성을 위해 여과지에 멤브레인 (N = 3)과 수술 메스를 사용하여 측정 시료의 직사각형 (10mm X 25mm)로 잘라.
  2. 각 시료 ((3)의 평균)의 두께를 측정한다.
  3. 스테인리스 교정 결찰 와이어 (지름 220 μm의)을 사용하여 시료의 중심에 핀홀을 만든다.
  4. 루프를 형성하고, 인장 시험기에 그것을 해결하기 위해 핀홀을 통해 합자 와이어를 전달합니다. 아래턱 그립 (13)에 L-PRF 멤브레인의 가장자리를 놓습니다.
  5. 이동 헤드가 일정한 속도 (10mm / 분) 시작에서 작동되도록 기기를 프로그래밍실험.
  6. 단축 테스트 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어의 휴식, 휴식 에너지​​ 및 변형을 탄성 계수를 기록합니다. 이 값은 자동으로 계산하며 사용자 정의 입력이 필요하지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오.

5. 형태 학적 검사

  1. 10mm 피부 생검 펀치를 사용하여 현미경 검사의 L-PRF 샘플을 준비하고 24 웰 플레이트에 배치합니다.
  2. PBS로 샘플을 씻고 20 분 (PBS)에 2.5 % 글루 타르 알데하이드로 고정한다.
  3. 순차적으로 5 분마다의 에탄올 농도 (50 %, 70 %, 80 %, 90 % 및 100 %) 증가에 침지하여 시험편 탈수.
  4. 5 분 동안 100 % HMDS (헥사 메틸 디 실라 잔) 0.5 ㎖로 처리한다. HMDS (14) 초과 제거 O / N을 공급하십시오.
  5. 양면 테이프를 이용하여 스터브에 마운트 샘플은 70 초 동안 백금 스퍼터 코팅 및 가속 작동 주사 전자 현미경으로 검사또한 알고리즘 20 kV의 전압 (또는 적절한 설정).

L-PRF, 트립신 감수성과 닌히 드린 분석 6. Genipin 가교

  1. genipin 가교 L-PRF를 준비하려면, PBS로 세포막을 씻어 48 시간 동안 (70 % 에탄올) 1 % genipin 용액 4 mL에 흠뻑 젖어. 초과 genipin (15), (16)를 제거하기 전에 실험에 PBS로 씻어.
  2. 트립신 분해에의 저항에 의해 L-PRF의 genipin 가교의 안정성을 평가합니다. 장소 L-PRF 막 (N = 3), 0.01 % 트립신 500 μL에 가교 L-PRF genipin 트립신의 일일 변화로 3 일 동안 37 ℃에서 배양 하였다.
    1. 시작에 노출 하루 3에서 차이를 효소와 무게는 효소 분해 (17)를 나타냅니다 종료 1 일 이전에 샘플의 무게를 측정.
  3. 닌히 드린 시험을하여 처리 genipin L-PRF (G-PRF)로 가교 결합의 양을 정량화. 먼저 표준 CURV를 준비E 글리신을 사용하여 (1 ㎜의 0.031 mM)을 곡선은 유리 아미노산 농도 (FAA)와 흡광도 사이의 관계를 수립한다.
    1. 2 % 1 ㎖와 샘플 열 PRF (w / v)의 100 ℃에서 15 분 동안 닌히 드린.
    2. 용액을 실온으로 냉각하고 50 % 에탄올 1.5 mL를 추가 할 수 있습니다.
    3. 적합한 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 분석한다.
    4. (15) 아래의 식을 이용하여 가교 결합 백분율을 결정

식 (1)

7. MTS 세포 증식 분석

  1. 80 %의 합류 단층을 얻을 때까지 T-75 플라스크에 최소 필수 중간 - 알파 수정 (αMEM)에서 MC3T3 (마우스 두개골 preosteoblasts)을 성장.
  2. 신선한 멸균 L-PRF 막 (세포 배양 후드 안쪽 L-PRF 튜브를 열)를 준비하고 새로운 세포 배양 접시에 막 전송.
  3. 대기음 플라스크에서 미디어와, PBS와 단층 린스 5 ml의 0.05 % 트립신을 추가 5 분 동안 37 C 배양기에 플라스크를 놓고, 5, 400 XG에서 원심 분리 튜브에서 원심 분리에 플라스크의 내용물을 피펫 분.
  4. 부드럽게, 뜨는을 가만히 따르다 세포 펠렛을 깰 튜브를 누르고 신선한 α의 (MEM)의 4 ㎖로 다시 중단, 혈구에 세포 현탁액 (50 μL)와 트리 판 블루 (50 μL)의 혼합물을 분배하고의 수를 계산 세포
  5. 시드 막 내에 세포를 유지하기 위해 L-PRF 막 위에 배치 10mm 유리 클로닝 고리 내에 4 × 5 셀 (링 24 시간 후에 제거 될 수있다).
  6. 4 일에, 10 분 동안 PBS의 세 번에 구조를 씻어.
  7. 각 웰에 혈청이없는 배지 200 ㎕를 MTS 시약 1 ML을 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어.
  8. 490 nm에서 200 μL 씩에서 흡광도를 측정한다.

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Representative Results

(상부, 중간 및 하부) 층이도 2에 도시 된 다른 섹션에서 L-PRF 응고의 주사 전자 현미경 이미지. 알 수있는 바와 같이, 상기 상부는 더 세포 주로 섬유소 네트워크로 구성된다. 중간 층은 자신의 활성화 및 탈과립의 증거와 혈소판 풍부하다. 하층은 백혈구 및 피브린 매트릭스 내에 포획 적혈구의 혼합물을 갖는다.

단축 인장 시험 및 봉합 고정 강도 시험 : 기계적 특성은 두 가지 모드에서 평가 하였다. 결과는 L-PRF의 점탄성 동작을 보여줍니다. 탄성률 (0.47 MPa의) 낮은 경우에도, 막 터프 (5 N · mm 휴식 에너지)이며 심각한 변형 (217퍼센트,도 3)을 견딜 수있다. 봉합 유지 테스트로부터의 데이터가, 멤브레인의 능력의 지표가 조직에 봉합하는, 상당히 힘든 제안차 변형 가능한 재료 (계수-0.2 MPa의, 변형 140 %, 에너지는 브레이크 3.2 N.mm) L-PRF에 (그림 4).

재생 의학의 섬유소 제품의 한계 중 하나는 짧은 생물학적 생명이다. 내인성 섬유소로 만든, L-PRF는 분해 효소에 민감하고 섬유소 용해를 겪는다. L-PRF의 저항을 평가하기 위해 분해를 매개하는 효소, L-PRF 신선한 37 O C.에서 트립신 처리 (0.01 %)을 실시하고 인큐베이션했다 우리는 3 일 이내에 L-PRF의 완전한 분해를 관찰했다. L-PRF 막의 Genipin 가교 거의 60 % (그림 5)에 의해 분해 감소했다.

세포의 성장을 지원하기 위해 L-PRF 막의 기능은 가교 및 비가 교 막의 마우스 두개골에 골아 세포를 배양하여 평가 하였다. genipin 가교 막은 그 구조를 유지하고 C를 지원하면서 미가 교 혈전 다양한 수준으로 저하를 시행엘 성장 (그림 6).

그림 1
L-PRF의 생성에도 1의 단계. (A) 유리관에서 전혈을 원심 분리 한 후, 세 개의 층이 표시된다. (B)는 PPP을 경사 분리 한 후, L-PRF는 무균 핀셋을 사용하여 제거되고 . (C) 적혈구베이스 메스를 사용하여 긁어 및 천공 금속 트레이 (D)에 배치되고있다. 부드러운 압축 한 후, PPP는 압착하고 회사 L-PRF 막을 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
SEM 신선한 L-PRF의 다른 층의 화상 (A)이 피브린 리치 층 나타내는 2]. (B) 활성의 다양한 정도 농축 혈소판의 영역 인, (C)는 다양한 백혈구과 버피 코트는 및 (D)는 적혈구 기지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 단축 인장 시험 모드 (A)과 봉합 고정 강도 (B)에서 L-PRF의 기계적 하중 3. 다음의 응력 - 변형 곡선. 각 샘플의 로딩 패턴은 다른 색으로 표시된다. 단축 인장 시험 데이터 (A)가 저 탄성률을 나타내는, 큰 탄성 변형 및 신속한 오류가 발생했습니다. 봉합사 (B)에 의해 팽창하면, L-PRF는 힘든 막 (곡선 아래 영역)과 팽창성을 나타냅니다. 데이터의 좋은 클러스터링은 샘플 사이에 최소한의 변화를 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 봉합 고정 강도 시험에서 실제 실패 4. 사진. 220 μm의 두께 스테인리스 교정 결찰 와이어 L-PRF의 중앙을 통과하고, 인장 시험기의 상부 조오 부재에 연결 하였다. 타단은 하부 그립에 부착하고 일정한 속도로 연신 하였다. L-PRF의 우수한 복원력을 제안, 막과 찢어 저항의 신장을 알 수 있습니다.OM / 파일 / ftp_upload / 53221 / 53221fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
genipin 교 L-PRF는 60 % 더 안정 동안 0.01 % 트립신에서 배양 한 다음 L-PRF 막 그림 5. 저하. 모든 L-PRF 막은 후 3 일 이내에 트립신 완전히 붕괴. 이것은 생체 내에서 배치되는 경우 화학 가교 L-PRF 막의 수명을 향상시키기 가능한 전략이 될 수 있음을 보여준다.

그림 6
세포 생존에 L-PRF 가교 그림 6. 효과. 비가 교 L-PRF (A)에 MC3T3 세포, genipin - 가교 L-PRF (b)는 4 일 문화의 대표 이미지ND 조직 배양 플라스틱 (C). 미가 교 L-PRF 가변 정도 배양 열화 및 플라스틱과 유사한 세포 활성을 보였다. Genipin 가교 L-PRF는 구조를 유지하고 강력한 세포 생존을 지원했다. 권리 세 복제와 독립적 인 실험에서 정량화 된 데이터 (+ SD)입니다합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

자가 혈소판 농축 때문에 성장 인자의 풍부 (18)의 재생 의료 분야에서 유망. 그러나, 이러한 제제는 종종 외과 적 조작이 매우 곤란하게 정의 구조 부족. 여러 번, 현탁액 젤은 예측할 수없는 결과를 초래, 배달의 현장에서 효과적으로 유지되지 않습니다. L-PRF는 혈소판의 발전에 큰 사전이 본질적으로 내포 된 혈소판과 회사 섬유소 막 인 것을 집중 나타냅니다. 이 고체 막은 우수한 핸들링 특성을 가지고, 안전하게 개방 수술 중 해부학 적으로 원하는 위치에 봉합 될 수있다. 그러나, 물리적 및 생물학적 특성은 상대적으로 알려져 있지 않다.

위에서 설명한 단계를 엄격하게 (그림 1)에 부착 할 때 L-PRF는 지속적으로 형성 할 것이다. 좋은 L-PRF 막 생성에 중요한 고려 사항 중 하나 인 TI나 채혈 및 원심 분리 사이에 지연. L-PRF 기술의 성공은 전적으로 통상적 분 이내에 원심 분리기 (19)에 채혈 즉시 전송 속도에 의존한다. 그것은 혈액 채취가 장기간 균질하지 않은 경우, (해당 특정 세포 함량 매트릭스 아키텍처 및 성장 인자의 방출 프로파일) 잘 구조화 L-PRF 응괴를 생성하는 것은 불가능하다; 알 콘텐츠 피브린 작은 간섭 무른 질량 대신에 형성된다.

이것은 세포와 세포 외 기질 (ECM) 간 상호 작용 mechanobiological 이주, 증식 및 분화 (20, 21)를 포함 셀 동작의 모든 측면에서 중요한 영향을 미치는 것이 허용되었다. L-PRF, 혈병의 고유 형태는, 특정 상황에서 형성되고, 피브린의 복잡한 지형 네트워크로 구성된다. 치료하는 동안 기능 조직으로 뒤집어 임시 ECM으로 L-PRF 기능. M을 실시 되echanical 힘은, 성공적인 치료 결과는 L-PRF 따라서 자신의 물리적 특성을 해명의 구조적 무결성에 의존하는 것이 중요하다. 우리는 단축 인장 시험 (고유의 소재를 확인하는)와 신선한 L-PRF에 봉합 보존 시험 (장애 특성을 파악하기 위해) 수행. PRP 젤 또는 정의 된 구조를 가지고 있지 않습니다 응고 혈액과는 달리, L-PRF는 뛰어난 핸들링 특성을 가진 조밀 한 결합 조직과 유사합니다. 우리는 L-PRF 막에 대한 0.470 MPa로 (SD = 0.107)의 탄성 계수를보고하고 실패 (2백15퍼센트의 변형) 전에 두 번 초기 길이를 늘릴. 파괴하기 전에 낮은 강성 (1 ~ 10 MPa의)과 (150 %까지) 높은 균주를보고 출판 문학 (22, 23)와 이러한 데이터 일치합니다. 값의 차이는 전술 한 연구에서 단일 피브린 섬유의 AFM 분석의 사용에 비해 피브린 네트워크의 사용에 기인 할 수있다.

봉합 고정 강도는 수술이며중요한 이식 재료의 매개 변수 그리고 그것은 이식에서 봉합사를 당기거나 이식의 벽이 실패 할 수하는 데 필요한 힘으로 정의된다. 우리의 실험 과정에 걸쳐 직선 (ANSI (24)에 의해 정의 된 바와 같이) 사용. 에 필요한 힘은 3.23 N.mm (SD = 0.329)의 L-PRF를 통해 합자 와이어를 잡아 당깁니다. 전체적으로, 우리는 L-PRF는로드 및 장력에 더 배 신장하는 기능을 지원할 수있는 기계적 어려운 것으로 밝혀 꽤 잘 봉합을 유지 (찢어 전에 상당히 변형).

안정성과 생물학적 환경에서 L-PRF의 구조적 무결성의 부족은 조직 공학에서의 사용의 주요 제한 사항입니다. 우리는 화학적으로 genipin를 사용하여 L-PRF을 가교하여이 문제를 해결하기 위해 노력했다. 독성과 연관된 글루 테르 알데히드 달리 genipin 낮은 세포 독성을 가진 천연 생분해 성 분자이다. genipin 처리 후, 멤브레인은 트립신 및 suppo에서 상당히 안정사일을 통해 세포 증식을 rted. 그러나, L-PRF의 20 %가 genipin으로 가교 된 (닌히 드린 분석에 의해 결정). 이 데이터는 화학적 가교 결합이 가능한 전략 동안, 다른 대안이 모색 될 필요가 있음을 시사한다.

자가 혈액 제제로부터 예측 프로토콜을 간단히 정의 구조 인상적 기계적 특성 및 활성화 된 혈소판으로부터 성장 인자 풍부 이러한 발견에 기초하여, L-PRF는 독특한 특성을 가진 신규 한 생체 재료 인 것이 분명하다. 혈액 항응고제, 외인성 트롬빈과 염화칼슘에 노출되지 생리적 조건 하에서 응고시킨다. 이러한 특성은 모두 L-PRF는 재생 의학에 응용 프로그램에 대한 생체 재료를 약속합니다.

L-PRF의 응용 프로그램에서 처리하는 임상 문제 중 하나는 혈소판 및 혈액 성분의 품질 이질성이다. 현재, 거의가에 대한 이해L-PRF 혈액 응고 (헤파린, 와파린 또는 혈소판 억제제)에 영향을 약물에 대한 혈액 응고 장애 또는 환자와 환자에서 발생. 이러한 질문에 대한 답변은 의심 할 여지없이 치유에 대한 우리의 이해를 향상시킬뿐만 아니라 맞춤 의학 분야의 발전에 기여할 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어 그리고이 책과 관련된 관심의 알려진 충돌이 없는지 확인합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Needle 19G BD 305186
Needle Disposal Container Fisherbrand 14-827-122
Red-Topped Glass Collection Tube BD 8020129
Gauze Pads Tyco 5750
Bandage Johnson & Johnson 5005989
Surshield Terumo SV*S19BL Safety winged infusion set
Blood Collection Assembly BD 303380
Tourniquets BD 367203
Brand Luer Adapter Vacutainer L42179
Intra-Spin System  Intra-Lock International ISS110 Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit 
Pipettes (Serological & Micro) Corning
Scalpel Exelint 29552
MTS Bionix 200 MTS Systems Corporation Material testing systems
MTS Test Works 4 MTS Systems Corporation
Whatman Filter Paper Whatman 1004 070
SS Orthodontic ligature wire Patterson Dental 628-4228
200 Proof Ethanol Koptec V1001
Hexamethyldisilazane (HMDS) Aldrich 440191
Aluminium Mounting Stubs Ted Pella 16324
Double Sided Carbon Tape PELCO Tabs 16084-1
Scanning Electron Microscope JEOL LV 5610
Trypsin HyClone SH30042.01
Cell Culture Incubator Thermo Fisher Scientific Inc 51026282
Antibiotic-Antimicotic Gibco 15240-062
Genipin Wako 078-03021
Cell Culture Media Gibco 12000-022 Minimum Essential Medium-Alpha
MTS Reagent Promega G1118
PMS Reagent Sigma P9625
Spectrophotometer BioTek Epoch Spectrophotometer
10mm Glass Cloning Rings Corning 3166-10
T-75 Flask Corning 430641
DPBS Corning 55-031-PB
Ninhydrin 98% Aldrich 454044
24 Well Plate Corning 3987
Biopsy Punch Acu Punch P1025
Digital Micrometer Pittsburgh 68305
Glutaraldehyde Sigma G6257
12 Well Plate Corning 3336
96 Well Plate Corning 3596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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