Caractérisation de leuco-plaquettaire Rich fibrine, un roman biomatériaux

Bioengineering

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Madurantakam, P., Yoganarasimha, S., Hasan, F. K. Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial. J. Vis. Exp. (103), e53221, doi:10.3791/53221 (2015).

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Abstract

Protocol

Toutes les procédures sang dessin doivent être effectués par des professionnels agréés et certifiés. L'utilisation de sujets humains pour la recherche implique l'approbation de l'Institutional Review Board ou toute autre autorité appropriée. Précautions particulières concernant le consentement éclairé et la protection de l'identification des participants doivent être suivies. Toutes les expériences énoncés dans ce Protocole impliquent la manipulation du sang humain et / ou de produits sanguins et de l'équipement de protection individuelle approprié doivent être portés à tout moment. Les déchets doit être considérée comme Biohazard et éliminés conformément aux règlements.

1. ponction veineuse

  1. Identifier le patient / participant et confirmer avec les documents existants. Expliquer l'étude en détail et obtenir un consentement éclairé.
  2. Avoir un plateau mis en place pour chaque patient avec des tubes marqués sur une surface plane et stable.
  3. Expliquer la procédure et de faire le siège du patient confortablement avec le bras soutenu. Informer le patient qu'il ou she vous sentirez une petite pincée et devrait le rester encore pendant toute la procédure.
  4. Fixez l'aiguille à l'adaptateur.
  5. Se laver les mains et porter des gants.
  6. Préparer le pli du coude pour ponction veineuse par un nettoyage avec 70% d'alcool isopropylique en cercles concentriques à partir du centre vers l'extérieur. Autoriser le site sécher à l'air pendant 30 sec.
  7. Identifier la veine appropriée par palpation.
  8. Appliquer le garrot 3-4 au-dessus du site de ponction en vous assurant qu'il est pas trop serré (tout en sentant le pouls radial).
  9. Effectuer la ponction veineuse en insérant le biseau de l'aiguille 15-30 degrés à la peau dans un mouvement fluide. Appuyez sur le tube de collecte de sang à travers l'aiguille et recueillir 9 ml de sang entier.
  10. Retirez le garrot. Enlevez le tube de l'aiguille.
  11. Retirer l'aiguille et appliquer le carré de gaze sur le site de ponction avant le retrait de l'aiguille. Jeter l'aiguille dans un container prévu appropriée.
  12. Demandez au patient de maintenir prEssure au site de ponction.
  13. Etiqueter les tubes
  14. Consultez le site de ponction pour être sûr saignement a cessé.
  15. Appliquer un bandage ou un ruban adhésif sur la place de la gaze, demander si le patient se sent bien (pas de douleur, un gonflement ou des étourdissements)
  16. Merci le patient / participant avant de les rejeter.

2. Préparation de L-PRF

  1. Immédiatement après le prélèvement de sang veineux dans le tube rouge surmonté verre sec, placez-le dans la centrifugeuse.
  2. Centrifuger à 400 g pendant 12 min à température ambiante après avoir placé un contrepoids approprié.
  3. Retirer le tube à la fin du cycle. Remarquez le trois couches: plasma pauvre en plaquettes (PPP), la fibrine riche en plaquettes (L-PRF) et de la base RBC (Figure 1).
  4. Aspirer le PPP à l'aide d'une pipette. L'aide de pincettes tirez doucement sur le L-PRF et placez-le dans un maillage métallique perforée stérile.
  5. Utilisation de scalpel, gratter la majeure partie de la couche de RBC laissant soigneusement le buffcouche intacte y.
  6. Comprimer doucement le caillot L-PRF (en utilisant la plaque de métal stérile, poids approximatif 225 g) pendant 30 secondes. Plasma pauvre en plaquettes sera évincé.
  7. Retirer la plaque et soulevez délicatement la membrane L-PRF. La membrane L-PRF est prêt pour une utilisation dans des expériences 12.

3. Uniaxial Essai de traction

  1. La place membranes L-PRF (n = 6) sur un papier filtre pour la facilité de manipulation et de punch en «os de chien" en utilisant des matrices de métal sur-mesure (2,75 mm de large à son point le plus étroit avec une longueur de jauge de 7,5 mm).
  2. Mesurer l'épaisseur de chaque échantillon en trois points et prendre la moyenne.
  3. Engager avec précaution la membrane L-PRF dans le centre des poignées de la mâchoire du système d'essais uniaxiaux.
  4. Détachez avec soin le support papier de filer pour exposer la membrane L-PRF.
  5. Programme de l'instrument de telle sorte que la tête mobile fonctionne à une vitesse constante (10,0 mm / min) et commencer l'expérience lorsque le L-PRF est encore humide.
  6. Enregistrez le module d'élasticité, de l'énergie à briser, et déformation à la rupture à partir du logiciel accompagnant le système de test uniaxial. Ces valeurs sont calculées automatiquement et aucune entrée définie par l'utilisateur est requise. S'il vous plaît voir la figure 3.

4. Suture force de rétention

  1. La place membranes L-PRF (n = 3) sur un papier filtre pour faciliter la manipulation et les couper en échantillons rectangulaires mesure (10 mm x 25 mm) à l'aide d'un scalpel.
  2. Mesurer l'épaisseur de chaque échantillon (moyenne de trois).
  3. Ajouter un trou d'épingle dans le centre de l'échantillon en utilisant la ligature orthodontique fil en acier inoxydable (220 um de diamètre).
  4. Passez le fil de ligature à travers le trou d'épingle pour former une boucle et la fixer à la machine d'essai de traction. Placer le bord de la membrane L-PRF à la poignée inférieure 13 de la mâchoire.
  5. Programmer l'instrument de telle sorte que la tête mobile fonctionne à une vitesse constante (10 mm / min) et le démarragel'expérience.
  6. Enregistrez le module d'élasticité, de l'énergie à briser, et déformation à la rupture à partir du logiciel accompagnant le système de test uniaxial. Ces valeurs sont calculées automatiquement et aucune entrée définie par l'utilisateur est requise. S'il vous plaît voir la figure 3.

5. Examen morphologique

  1. Préparer les échantillons L-PRF pour examen au MEB en utilisant un 10 mm cutanée biopsie punch et de les placer dans une plaque de 24 puits.
  2. Laver les échantillons avec du PBS et fixer avec 2,5% de glutaraldéhyde (dans du PBS) pendant 20 min.
  3. Déshydrater les échantillons par immersion dans l'augmentation des concentrations d'éthanol de façon séquentielle (50%, 70%, 80%, 90% et 100%) pendant 5 minutes chacun.
  4. Traiter avec 0,5 ml de 100% de l'hexaméthyldisilazane (HMDS) pendant 5 min. Aérer O / N pour éliminer l'excès de HMDS 14.
  5. Échantillons de montage sur les talons à l'aide d'un ruban adhésif double face, pulvérisation manteau platine pour 70 secondes et d'examiner dans un microscope électronique à balayage fonctionnant à une accélérationtension de ration de 20 kV (ou le réglage approprié).

6. génipine réticulation de la L-PRF, la trypsine et la sensibilité Ninhydrine Assay

  1. Pour préparer génipine réticulé L-PRF, rincer les membranes avec du PBS et laisser tremper dans 4 ml de solution de génipine 1% (à 70% d'éthanol) pendant 48 h. Rincer avec du PBS avant expériences pour enlever l'excès génipine 15, 16.
  2. Évaluer la stabilité de la réticulation de la génipine L-PRF par sa résistance à la dégradation par la trypsine. Lieu membrane L-PRF (n = 3) et la génipine réticulé L-PRF dans 500 ul de 0,01% de trypsine et on incube à 37 ° C pendant 3 jours avec un changement journalière de trypsine.
    1. Peser les échantillons au jour 1 avant enzyme exposition et au jour 3. La différence de début et de fin de poids représente la dégradation enzymatique 17.
  3. Quantifier la quantité de réticulation dans génipine traité L-PRF (G-PRF) par ninhydrine dosage. Préparer d'abord la norme curve utilisant la glycine (mm 1 mm-0,031) courbe d'établir la relation entre la concentration de l'acide aminé libre (FAA) et l'absorbance.
    1. PRF échantillons de chaleur avec 1 ml de 2% (p / v) de ninhydrine pour 15 minutes à 100 ° C.
    2. Laisser la solution refroidir à température ambiante et ajouter 1,5 ml d'éthanol à 50%.
    3. Analyser l'absorbance à 570 nm en utilisant un spectrophotomètre approprié.
    4. Déterminer le pourcentage de réticulation en utilisant la formule ci-dessous 15

Equation 1

7. MTS prolifération cellulaire Assay

  1. Cultiver MC3T3 (préostéoblastes de la voûte crânienne de souris) dans de modification -alpha Minimum Essential Medium (aMEM) dans des flacons T-75 jusqu'à ce qu'une monocouche confluente de 80% est obtenu.
  2. Préparer membrane L-PRF frais, stérile (ouvrir le tube L-PRF intérieur de la hotte de culture de cellules) et transférer la membrane sur une nouvelle boîte de culture cellulaire.
  3. Support d'Aspirer à partir de la fiole et rincer la monocouche avec du PBS, ajouter 5 ml de trypsine à 0,05% et placer le ballon dans la 37 o C incubateur pendant 5 min, une pipette le contenu du ballon dans un tube de centrifugation et centrifuger à 400 g pendant 5 min.
  4. Décanter le surnageant, tapotez doucement le tube de briser le culot de cellules et remettre en suspension avec 4 ml d'α MEM frais, distribuer un mélange de suspension de cellules (50 pi) et bleu trypan (50 pi) dans le hémocytomètre et compter le nombre de cellules
  5. Graine 4x10 5 cellules à l'intérieur 10 mm des anneaux de clonage en verre placés au-dessus des membranes L-PRF pour retenir les cellules dans les membranes (bagues peuvent être retirées après 24 h).
  6. Au jour 4, rincer constructions avec PBS trois fois pendant 10 min.
  7. Ajouter 1 ml de milieu sans sérum et 200 ul réactif MTS pour chaque puits et incuber pendant 2 heures à 37 ° C.
  8. Mesurer l'absorbance de 200 aliquotes à 490 nm.

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Representative Results

L'image de microscopie électronique à balayage du caillot L-PRF à différentes sections (haut, milieu et bas) couche est illustrée à la figure 2. Comme on le voit, la partie supérieure est composé majoritairement de réseau de fibrine sans cellules. La couche du milieu est enrichi en plaquettes avec la preuve de leur activation et la dégranulation. La couche inférieure a un mélange de leucocytes et les globules rouges piégées dans une matrice de fibrine.

Les propriétés mécaniques ont été évaluées dans deux modes: essai de traction uniaxiale et essai de résistance de maintien de suture. Les résultats démontrent un comportement viscoélastique de la L-PRF. Même si le module d'élasticité est faible (0,47 MPa), la membrane est difficile (d'énergie pour casser, 5 N · mm) et est capable de subir une déformation importante (217%, Figure 3). Les données des essais de rétention de la suture, un indicateur de la capacité de la membrane à être suturées aux tissus, a suggéré une manière significative une durnd matériau déformable (module-0,2 MPa, souche 140% et de l'énergie à l'effraction 3.2 N.mm) à L-PRF (Figure 4).

Une des limites de produits de fibrine en médecine régénérative est sa durée de vie biologique courte. Fabriqué à partir de fibrine endogène, L-PRF est sensible à la dégradation enzymatique et subit la fibrinolyse. Afin d'évaluer la résistance à la L-PRF à la dégradation à médiation par une enzyme, la L-PRF frais a été soumis à un traitement à la trypsine (0,01%) et incubée à 37 o C. Nous avons observé une dégradation complète de la L-PRF dans les trois jours. Réticulation génipine des membranes L-PRF diminué la dégradation de près de 60% ​​(Figure 5).

La capacité des membranes L-PRF pour soutenir la croissance cellulaire a été évaluée par mise en culture d'ostéoblastes de la voûte crânienne de souris sur des membranes réticulées et non réticulées. Caillots non réticulées ont subi la dégradation de différents niveaux tandis que les génipine réticulé membranes ont conservé leur structure et soutenus cell croissance (Figure 6).

Figure 1
Figure 1. Les étapes de la production de L-PRF. (A) après centrifugation du sang total dans un tube de verre, trois couches seront visibles. (B) Après décantation du PPP, le L-PRF est retiré en utilisant une pince à épiler stériles . (C) La base de globules rouges est raclé à l'aide d'un scalpel et déposées sur un plateau métallique perforé (D). Après la compression douce, le PPP est évincé et une membrane L-PRF cabinet est formé. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
SEM image de différentes couches de frais L-PRF (A) représente la couche de fibrine riche;. (B) est une zone de plaquettes enrichi de divers degré d'activation; (C) est la couche leucocytaire avec de nombreux leucocytes et (D) est la base de globules rouges. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Courbes contrainte-déformation mécanique après chargement de la L-PRF en mode uniaxial d'essai de traction (A) et la force de rétention de suture (B). Le schéma de chargement de chaque échantillon est représentée dans une couleur différente. Les données d'essai de traction uniaxial (A) indiquent un faible module, une grande déformation élastique et un échec rapide. Sur la distension par un fil de suture (B), L-PRF représente une membrane qui est difficile (aire sous la courbe) ainsi que extensible. Bon regroupement des données suggère une variation minimale entre les échantillons. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Les photographies de défaillance réelle dans les tests suture rétention de résistance. A 220 um d'épaisseur fil de ligature orthodontique en acier inoxydable a été adoptée par le milieu de L-PRF et attaché à l'élément de mâchoire supérieure de la machine d'essai de traction. L'autre extrémité est fixée à la poignée inférieure et étiré à une vitesse constante. Notez l'allongement de la membrane et sa résistance à la déchirure, ce qui indique une excellente résistance de la L-PRF.om / files / ftp_upload / 53221 / 53221fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. La dégradation des membranes L-PRF après incubation dans la trypsine 0,01%. Toutes les membranes L-PRF désintégré complètement dans la trypsine dans les 3 jours tout en génipine réticulé L-PRF étaient 60% plus stable. Cela montre que la reticulation chimique peut être une stratégie viable pour améliorer la longévité des membranes L-PRF lorsqu'il est placé in vivo.

Figure 6
Figure 6. Effet de la L-PRF réticulation sur la viabilité cellulaire. Images représentatifs de culture de 4 jours de cellules MC3T3 non réticulé sur L-PRF (A), la génipine-L-PRF réticulé (B) unnd culture de tissu en plastique (C). Non réticulé L-PRF dégradé dans la culture à mesure variable et a montré une activité cellulaire similaire au plastique. Génipine réticulé L-PRF maintenu leur structure et soutenu la survie cellulaire robuste. Pour le droit est de données chiffrées (+ SD) à partir d'expériences indépendantes avec trois répétitions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Concentrés plaquettaires autologues sont prometteurs dans le domaine de la médecine régénérative 18 en raison de l'abondance de facteurs de croissance. Cependant, ces préparations manquaient souvent une structure définie qui rend la manipulation chirurgicale très difficile. Plusieurs fois, les suspensions et les gels ne sont pas conservées efficacement au niveau du site de livraison, ce qui entraîne des résultats imprévisibles. L-PRF représente un énorme progrès dans l'évolution de concentrés de plaquettes en ce qu'il est essentiellement une membrane de fibrine ferme avec plaquettes piégées. Ces membranes solides possèdent d'excellentes caractéristiques de manipulation, et peuvent être solidement suturées à un emplacement anatomiquement souhaité lors d'interventions chirurgicales ouvertes. Cependant, ses propriétés physiques et biologiques sont relativement inconnu.

La L-PRF former systématiquement lorsque les étapes décrites ci-dessus sont strictement respectées (Figure 1). Un des facteurs importants dans la génération d'un bon membrane L-PRF est le timoi délai entre le prélèvement de sang et centrifugation. Le succès de la technique L-PRF dépend entièrement de la vitesse de collecte de sang et le transfert immédiat à la centrifugeuse 19, habituellement dans un délai d'une minute. Il est impossible de générer un caillot L-PRF bien structuré (avec son contenu de la cellule, l'architecture de la matrice et la libération du facteur de croissance profil spécifique), si la récolte de sang est prolongée et pas homogène; un petit incohérente, la masse friable de la fibrine avec un contenu inconnu est formé à la place.

Il a été accepté que les interactions entre les cellules et mécanobiologique matrice extracellulaire (MEC) ont une influence déterminante dans tous les aspects du comportement cellulaire, y compris la migration, prolifération et la différenciation 20,21. L-PRF, un type unique de caillot de sang, est formé dans des circonstances spécifiques et se compose de réseau complexe et ramifié de fibrine. Fonctions L-PRF comme un ECM provisoire qui est retournée dans le tissu fonctionnel pendant la guérison. Être soumise à la mécaniques forces, les résultats de guérison réussies dépendent de l'intégrité structurale de la L-PRF et donc élucider leurs propriétés physiques est importante. Nous avons effectué des essais de traction uniaxiale (pour identifier les propriétés intrinsèques des matériaux) et les tests de rétention de suture (pour identifier les caractéristiques de défaillance) sur frais L-PRF. Contrairement gel PRP ou de sang coagulé qui ne possède pas un structures définies, L-PRF ressemble à un tissu conjonctif dense avec des caractéristiques de manipulation supérieures. Nous rapportons un module d'élasticité de 0,470 MPa (SD = 0,107) pour les membranes L-PRF et étirement deux fois sa longueur initiale avant la panne (souche de 215%). Ce match de données avec la littérature publiée 22,23 qui a signalé une faible rigidité (1-10 MPa) et haute tension (jusqu'à 150%) avant de tomber. La différence dans les valeurs peuvent être dues à l'utilisation du réseau de fibrine par rapport à l'utilisation de l'analyse AFM de fibre unique de la fibrine dans les études mentionnées ci-dessus.

La force de rétention de suture chirurgicale est unparamètre important de matériaux de greffe et elle est définie comme la force nécessaire pour tirer un fil de suture de la greffe ou de causer la paroi de la greffe à l'échec. Nos expériences utilisés droite dans la procédure (tel que défini par la norme ANSI 24). La force nécessaire pour la tirer sur le fil de ligature par la L-PRF de 3,23 N.mm (SD = 0,329). Dans l'ensemble, nous avons trouvé le L-PRF soit mécaniquement solide, capable de supporter des charges et la capacité d'étirer deux fois plus sur la tension et conserve sutures assez bien (se déforme de manière significative avant de déchirer).

Le manque de stabilité et l'intégrité structurelle de la L-PRF dans les milieux biologiques est un obstacle majeur à son utilisation dans le génie tissulaire. Nous avons cherché à résoudre ce problème par réticulation chimiquement L-PRF utilisant génipine. Contrairement glutaraldéhyde qui est associée à la toxicité, la génipine est une molécule biodégradable d'origine naturelle avec une faible cytotoxicité. Après le traitement génipine, les membranes étaient significativement stable dans la trypsine et supported prolifération cellulaire sur 4 jours. Cependant, seulement 20% de L-PRF est réticulé avec la génipine (déterminé par dosage à la ninhydrine). Ces données suggèrent que, bien que la réticulation chimique est une stratégie viable, d'autres solutions doivent être explorées.

Basé sur ces résultats, il est clair que la L-PRF est un roman biomatériau avec des attributs uniques: préparation prévisible à partir du sang autologue, simplicité de protocole, architecture définie, impressionnantes propriétés mécaniques et l'abondance des facteurs de croissance à partir de plaquettes activées. On laisse le sang à coaguler dans des conditions physiologiques sans exposition aux anti-coagulants, la thrombine exogène et le chlorure de calcium. Toutes ces caractéristiques font de L-PRF promettant biomatériau pour des applications en médecine régénérative.

L'un des problèmes cliniques pour traiter l'application de L-PRF est l'hétérogénéité de la qualité des plaquettes et des composants sanguins. À l'heure actuelle, très peu est entendu à proposL-PRF générée à partir de patients atteints de troubles de la coagulation ou les patients qui prennent des médicaments qui affectent la coagulation du sang (l'héparine, la warfarine ou les inhibiteurs plaquettaires). Les réponses à ces questions seront sans aucun doute améliorer notre compréhension de la guérison ainsi que de contribuer à faire progresser le domaine de la médecine personnalisée.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à divulguer et confirment qu'il n'y a pas de conflits d'intérêts connus associés à cette publication.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Needle 19G BD 305186
Needle Disposal Container Fisherbrand 14-827-122
Red-Topped Glass Collection Tube BD 8020129
Gauze Pads Tyco 5750
Bandage Johnson & Johnson 5005989
Surshield Terumo SV*S19BL Safety winged infusion set
Blood Collection Assembly BD 303380
Tourniquets BD 367203
Brand Luer Adapter Vacutainer L42179
Intra-Spin System  Intra-Lock International ISS110 Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit 
Pipettes (Serological & Micro) Corning
Scalpel Exelint 29552
MTS Bionix 200 MTS Systems Corporation Material testing systems
MTS Test Works 4 MTS Systems Corporation
Whatman Filter Paper Whatman 1004 070
SS Orthodontic ligature wire Patterson Dental 628-4228
200 Proof Ethanol Koptec V1001
Hexamethyldisilazane (HMDS) Aldrich 440191
Aluminium Mounting Stubs Ted Pella 16324
Double Sided Carbon Tape PELCO Tabs 16084-1
Scanning Electron Microscope JEOL LV 5610
Trypsin HyClone SH30042.01
Cell Culture Incubator Thermo Fisher Scientific Inc 51026282
Antibiotic-Antimicotic Gibco 15240-062
Genipin Wako 078-03021
Cell Culture Media Gibco 12000-022 Minimum Essential Medium-Alpha
MTS Reagent Promega G1118
PMS Reagent Sigma P9625
Spectrophotometer BioTek Epoch Spectrophotometer
10mm Glass Cloning Rings Corning 3166-10
T-75 Flask Corning 430641
DPBS Corning 55-031-PB
Ninhydrin 98% Aldrich 454044
24 Well Plate Corning 3987
Biopsy Punch Acu Punch P1025
Digital Micrometer Pittsburgh 68305
Glutaraldehyde Sigma G6257
12 Well Plate Corning 3336
96 Well Plate Corning 3596

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References

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