사회적 공간에 영향을 미치는 조건

Neuroscience

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McNeil, A. R., Jolley, S. N., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Milunovich, A. J., Chambers, M. C., Simon, A. F. Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (105), e53242, doi:10.3791/53242 (2015).

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Abstract

또는 다른 작은 곤충 - - 간단한 방식으로 기재되어있는 사회적 공간 분석은 초파리 melanogaste 연구 사회적 상호 작용을 정량화하는데 사용될 수있다. 우리는 이전에 1 있듯이, 이차원 챔버에서는 먼저, 꽉기를 형성 파리 강제이어서 이들을 서로 그들의 바람직한 거리를 취하도록 허용한다. 파리에 정착 한 후, 우리는 무료 온라인 소프트웨어 (ImageJ에)와 정지 화면을 처리하는, 가장 가까운 이웃 (사회 공간)까지의 거리를 측정한다. 잠재적 교란 요인 제어하면서 가장 가까운 이웃 거리의 분석은 연구자들이 사회적 상호 작용에 대한 유전 적 및 환경 적 요인의 영향을 결정하도록 허용한다. 이러한 등반 능력, 일, 섹스의 시간, 파리의 수와 같은 다양한 요인, 파리의 사회적 간격을 수정할 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 교란 효과를 완화하기 위해 실험 컨트롤 시리즈을 제안한다. 이 분석 할 수적어도 두 가지 목적으로 이용 될 수있다. 첫째, 연구자들은 (예 : 분리, 온도, 스트레스 나 독소 등) 자신이 좋아하는 환경 변화가 사회 간격 1,2에 영향을 줄 방법을 결정할 수 있습니다. 둘째, 연구자들은 사회적 행동 1,3의 기본적인 형태의 유전 적, 신경 토대를 해부 할 수 있습니다. 구체적으로, 우리는 인간 4 자폐증 후보 유전자와 같은 다른 생물체에 사회적 행동에 관여하는 것으로 생각 orthologous 유전자의 역할을 연구하기 위해 진단 도구로 사용된다.

Introduction

사회적 상호 작용은 전체적으로 그룹 내의 개인의 적절한 발달과 건강에 매우 중요하며, 이러한 초파리 (Drosophila의 melanogaster의) 5,6- 같은 단순한 유기체 인간 (호모 사피엔스)에서, 다수의 종에 걸쳐 관찰 될 수있다. 청각, 시각, 후각, 촉각, 또는 맛보기 : 개별 초파리 또는 인간 공유 일반적인 방법은 감각이다는 이러한 상호 작용 동안 정보를 처리합니다. 우리와 다른 사람은 사회적 상호 작용에 진화 될 수 관련된 신경 세포 및 유전자 (7)을 보존하는 행동 반응의 기초가 잠재적으로 공유 neurocircuitry이 있다는 가설. 초기 상호 작용이 발생되면, 상호 작용하는 개인들 사이의 사회적 공간 것 중 하나 증가 (사회 회피 8) 또는 감소 (그룹 형성 / 통합 5). 더 복잡한 상호 작용은 침략 또는 구애처럼, 다음 자리를 차지할 수 있습니다.

1-4,9에서 사용초파리 melanogaster의 안정적 그룹 사회적 상호 작용을 평가하기 위해, 간 비행 거리, 또는 사회적 공간을 정량화 간단한 프로토콜을 설명한다. 사회적 공간 플라이 가장 가까운 인접 사이의 거리의 측정 값을 의미한다. 사회 공간은 D의 특정 인구에 대한 일치 실험 조건 (약 1-2 본체 내의 길이를 평균) 보존, 및 개별 분리가 1로 유지되고있는 경우 증가 파리의 소셜 체험에 대하여 변화된다 melanogaster의. 적당한 비전 고전 취기 또는 CVA 인식 정상적인 사회 거리를 유지하기 위해 필요한 것이 아니라. 사회적 공간의 측정은 이렇게 될 수 있습니다사회적 상호 작용을 분석 및 D의 사회적 행동을 정량화 할 수있는 진단 도구로 사용 melanogaster의 1. 우리는이 정량을 수행하고, 어느 정도 공통의 실험 변수는이 동작에 영향을 미치는 방법에 대한 자세한 여기에 대해 설명합니다.

범위 - - 수행 사회적 공간에 영향을 우리는 상기 분석이 수행되는 챔버뿐만 아니라 초파리의 수의 방향을 보여준다. 그것은 이전에 실 형상은 파리 11, 12의 자발적인 탐구 운동에 영향을 미치는 것으로 나타났다, 그들이 정착하기로 결정 곳이 현상은 궁극적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 긴 비행 밀도 (플라이 / ㎠) 및 챔버 방향으로 동일하게 유지되어, 파리의 사회적 공간은 일정하게 유지된다. 이 분석의 견고성은 독립된 실험실 WH의 돌연변이에 의해 표시된 결과를 복제 할 수있는 다른 챔버 크기, 형상을 이용하여, 자세는 사실에 의해 설명된다증가, 사회적 공간이다 ITE 유전자 (눈의 색소 침착에 영향을 미치는), (1 수직 삼각형 또는 수평 원을, 3의 공기 흐름과 수평 광장).

우리 수컷, 암컷은 아니지만, 상기 이격 밤인지를 보여 우리의 결과는 또한, 사회적 공간 실험이 수행되는 시간을 유지하는 결과의 일관성에 결정적임을 나타낸다. 그러나, 낮과 저녁 시간 사이에 보이는 차이는 파리의 활동의 차이에 기인하지 않고, 우리는 사회적 공간과 관련되지 않은 활동 수준을 나타내는 인수에 대해 설명합니다.

마지막으로, 거기에 흰색 돌연변이로 표시된 바와 같이 사회적 공간의 결정에 유전 적 토대는 이미 1,3를 설명하고, 우리가 여기서 제시 파리의 여러 근친 및 자연산 균주의 차이.

따라서, 이러한 분석은 우수한 공구 F를 만든다또는 유전의 효과뿐만 아니라 환경 적 요인을 연구.

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Protocol

사내 만든 1. 장비 및 시약 (다른 사람을위한 재료의 목록을 참조하십시오)

  1. 이전 8 설명한 바와 같이 초파리 차가운 마취 장치를 준비합니다.
  2. 이전 13 설명 ​​된대로 플라이 흡인기를 준비합니다.
  3. 사회적 공간 챔버와 홀더를 준비합니다.
    1. 주문 또는 사회적 공간 실을 만드는 데 유리 창 아크릴 스페이서를 확인합니다. 각 사회 공간 챔버는 0.3 cm의 두께로, 16.5 cm, 8.9 cm의 염기의 높이, 두 직각 삼각형 아크릴 스페이서 ((0.3 cm의 두께로, 17.6 cm하여 17.6 cm) 개의 사각형 유리창 이루어져 ) 및 2 개의 직사각형 구역 (0.3 cm의 1.5 cm 두께 의한 9cm) (도 1a).
    2. 이도 1b에 챔버와 동일하도록 유리 및 아크릴 사회적 공간 챔버를 조립한다. 이렇게하려면하도록 유리의 한 광장 창 상단에 하나의 삼각형 스페이서 평면 배치하여 시작 직각삼각형 스페이서의 사각형 패널의 모서리 중 하나에 정렬됩니다. 다음으로, 제 1 삼각형 스페이서를 미러링, 광장 창의 상단에있는 두 번째 삼각형 스페이서 평면을 배치합니다.
      참고 : 당신의 손에서 오일과 향기와 조각을 오염되지 않도록 장갑을 착용해야합니다.
    3. 이 적용되지 않습니다 창의 측면을 따라 광장 창의 상단에 평평한 두 개의 작은 사각형 스페이서를 놓습니다. 정사각형 평면 위에 아크릴 스페이서는 이제 삼각형 경기장을 형성한다.
    4. 이 아래 유리의 원래 창 위에 정렬되도록 아크릴 스페이서의 상단에 유리의 두 번째 사각형 창을 배치합니다.
    5. 사회적 공간 챔버를 형성하기 위해 함께 창 및 스페이서를 확보하기 위해 네 개의 바인더 클립을 사용합니다. 유리 창 내부를 확보, 삼각형 스페이서의 각각의 긴 측면을 통해, 코너 근처에 하나의 클립을 놓습니다. 이 같은 측면에서, 그들을 확보, 직사각형 스페이서의 각을 통해, 인접한 모서리에 클립을 배치유리 창쪽으로.
    6. 지원 스탠드와 사회적 공간 챔버는 작업 표면 위에 가장자리에 달려있다 클램프, 수직 위치에서 사회적 공간 챔버를 유지하도록 플라스크 클램프를 조립합니다.
    7. 실험에서 각각의 반복은, 사회적 공간 챔버를 조립하고 서 지원합니다.
  4. 테스트 파리의 등반 능력을 확인하는 등반 분석 응답 장치를 준비합니다.
    1. 이전에 14,15을 설명한 바와 같이, 역류 장치를 사용합니다.
  5. 흰색 벤치 커버 및 흰색 배경 앞에 덮여 작업 표면에서 실험을 수행하여 균일 한 조명 조건을 확인하십시오.

2. 실험 전에 파리를 준비

  1. 표준 초파리 들어있는 병에 파리가 음식을 비행 유지한다. 12 시간 빛 / 어둠주기에 25 ° C에서 배양 챔버에 보관하십시오.
  2. 전자에 한 2 일 전xperiment, 수집 및 이전 8 설명한 바와 같이 섹스, 차가운 마취 파리.
    1. 에서 추위 마취 장치를 진정 -4 ° C ~. 장소는 50 ㎖의 플라스틱 튜브로 날아갑니다. 완전 파리가 움직이지 될 때까지 적어도 5 분 정도 기다린 절연 얼음 양동이에 얼음에 파리가 들어있는 플라스틱 튜브 잠수함.
    2. 추위 마취 장치의 폴리에틸렌 시트에 파리를 놓습니다. 실온에서, 여성에서 남성을 분리 실체 현미경을 사용합니다. 표준 초파리를 포함하는 유리 병에, 그룹, 파리를 유지는 바이알 당 40 파리를 초과하지 않는 음식을 비행.
  3. 두 시간 실험 시작 전에 실험이 수행 될 실내의 온도가 24 ~ 25 ° C 사이이고 습도가 약 50 %임을 확인.
  4. 음식을 포함하는 새로운 유리 병에 파리를 전송하고, 실험이 수행 될 작업 표면에 2 시간 동안 배치합니다.
    참고 :이 experimen 들어TS, 사용 된 플라이 균주 초파리 균주했다 : 1118 와트, 고사 10 (또는 W - 광저우 - S에 10 회 outcrossed 1118 원) 광저우 - 특수 또는 광저우-S (CS), 오레곤과 사마르 칸트 파리는 우리의 실험실에서 모든했다 주식 (16); 엘우드 파리는 롱 아일랜드, 뉴욕, 미국 8, 헌팅턴의 엘우드 인근에서 2011 년 가을에 수집되었다. 달리 규정하는 경우 외에, 제시된 결과는 광저우-S는 (빨간색의 그늘에서) (으)로 운항하는 항공사로 얻었다.

3. 실험 수행

  1. (- 빛의 발병 후 시간의 시간 - Zeitgeber 시간 ZT 4의 7) 오후 12시부터 ​​오후 3시까지 실험을 수행합니다.
  2. 파리의 전송을위한 사회적 공간 챔버를 준비합니다.
    1. 당신의 몸에 가장 가까운 직사각형 스페이서를 포함하는면, 작업 표면에 사회적 공간 실 평면을 배치합니다.
    2. O 제거네브라스카의 몸 가까운 클립은 직사각형 스페이서 사이에 약 1cm의 간격을 생성, 바깥쪽으로 한 직사각형 스페이서를 밀어 넣습니다.
    3. 테이프 및 마커를 사용하여, 성별, 변형, 반복 번호 상단 모서리에있는 사회적 공간 챔버 레이블을 붙입니다. 내부 삼각형 경기장의 일부를 커버하지 않는 테이프를 보장하기 위해주의하십시오.
  3. 사회적 공간 챔버에 파리를 전송합니다.
    1. 전송 새, 빈 유리 병에 음식을 포함하는 자신의 병에서 파리. 대기음은 빈 유리 병에서 날아와 사회적 공간 챔버로 전송합니다.
      1. 흡입기의 끝으로 파리를 그려 흡입. 사회적 공간 챔버의 직사각형 스페이서 사이에 1cm 간격으로 팁을 놓고 내부 삼각형 무대로 파리를 강제로 일정한 속도로 숨을 내쉬고.
      2. 즉시 내부 삼각형 분야의 기반을 폐쇄, 제자리에 다시 직사각형 스페이서를 밀어 다시에 바인더 클립을 배치합니다.
    2. 실험 일이 일어나는 경우는 다른 벤치에있는 두근 두근 패드에서 직사각형 스페이서가 바닥면에이되도록 직립 사회적 공간 챔버를 개최합니다. 모든 파리를 보장하기 위해 파운드 세 번 경기장의 바닥에 떨어졌다.
      참고 : 파리는 바닥에 떨어진하기 위해 장치의 보안 유지를 유지하면서 작은 챔버 크기 (그림 1D)의 바깥으로 튀어 나와 아크릴 스페이서, 작업 표면에 팔꿈치를 세게 인해.
    3. 타이머를 시작합니다.
    4. 작업 표면에 사회적 공간 챔버를 놓고 수직을 유지하기 위해 지원 스탠드와 플라스크 클램프를 사용합니다. 내부 삼각형 경기장의 모든 부분을 커버하는 자 또는 사회적 공간 챔버에 평평하게 알려진 길이의 스티커가 아닌 놓습니다.
      1. 수평 위치 실험을 위해, 지지대의 사회적 공간 실을 배치하지 마십시오; 대신 작업 표면에 사회적 공간 실 평면을 배치.
      2. 파리이 정착되면, 일반적으로 약 30 분 후, 사회적 공간 챔버의 사진을 촬영. 프레임이 전체 내부 삼각형 경기장, 통치자, 및 레이블이 포함되어 있는지 확인합니다.
      3. 각각의 유전자형과 조건 (이상적으로 3 내부 복제 및 3 독립적 인 반복)에 대한 실험을 반복합니다.

      4. 사회 공간 데이터를 분석

      1. ImageJ에 17에서 다음과 같은 매크로를 가져옵니다
        1. ImageJ에 여기에 있습니다 : http://rsbweb.nih.gov/ij/.
        2. 당신은 매크로 하위 폴더에, 이름을 'Measure_Distances.txt'ImageJ에 / 플러그인 폴더에 파일에 아래의 매크로를 저장하고, 도움말> 업데이트 메뉴 명령을 사용하여 플러그인 메뉴에서 '측정 거리'명령을 만들 수 있습니다. '
        3. .txt를 복사 보충 데이터를 제공하고, 원래 3 년에 출판 된 매크로 파일.
      2. 컴퓨터에 사진을 업로드 한 pictu을 엽니 다ImageJ에를 사용하고.
        1. 의 스티커를 위해 (동일한 방법을 그림에 눈금자 1cm 마크에 0cm에서 선을 그려 규모를 생성하고 분석 탭에서, 그 거리를 1cm의 규모를 설정하는 설정 스케일 기능을 선택 알려진 길이). 사진에 스케일을 적용하기 전에 글로벌 옵션을 선택합니다.
        2. 가능한 한 그림의 나머지 부분만큼을 제거하는 동안, 그것은 파리 모두 포함하도록 이미지 탭에서 자르기 기능을 사용하여 사진을 자릅니다.
        3. 이미지 탭에서 유형 옵션에서 8 비트를 선택하여 사진이 흑백으로합니다.
        4. 이미지 탭의 조정 옵션에 임계 값 기능으로 이동하여 사진의 모든 배경 잡음을 제거합니다. 강화 또는 각각의 플라이의 본체 명확 화상의 다른 표시없이 볼 수 있도록 대비를 제거하는 슬라이더를 끌어. 되지 파리 아르 표시가있는 경우, 직사각형 도구들을 캡처하고이를 삭제.
        5. 설정분석 탭에서 설정 측정 도구를 사용하여 측정. 지역, 질량, 무게 중심의 센터 및 표시 라벨을 선택합니다. 다음으로, 분석 입자가 파리를 대표하는 모든 검은 반점의 번호 매기기 목록을 만들 분석 탭에서 기능을 선택합니다.
          1. 때 입자를 분석하여, 세트 크기 0.01-0.1 (픽셀 단위를 선택하지 마십시오) 원형 0.00-1.00; 쇼 윤곽; 결과를 표시하고 관리자로 추가 할 수 있습니다.
          2. 각각의 검은 점 (각 입자가) 원래 사진에 번호 매기기 목록을 비교하여, 원본 사진에있는 파리의 정확한 표현이 있는지 확인합니다.
            참고 : 함께 매우 가까운 일부 파리는 하나의 입자로 간주되는 경우, 수동으로 바이너리 이미지에있는 두 개의 파리를 분리하는 흰색 선을 그립니다.
        6. EA에서, CM에, 거리를 포함하는 새로운리스트를 생성하기 위해 플러그인 탭에서 두 번째 매크로 옵션 아래 목록 거리 매크로 -리스트를 선택한 상태에서, 가장 가까운 이웃를 사용채널 자신의 가장 가까운 이웃에 도착.
      3. ImageJ에에서 가장 가까운 이웃 거리를 복사하여 스프레드 시트 프로그램의 컬럼에 붙여 넣습니다.
        1. 같은 스프레드 시트에 각 반복에서 모든 데이터를 컴파일하고 유전자형과 조건에 의해 구성 할 수 있습니다.
      4. 통계 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행한다. 이 실험에서, 그래프 패드 프리즘 (에서라도의 버전 6, 그래프 패드 소프트웨어, 샌디에고 캘리포니아 미국, www.graphpad.com)는 일원 분산 분석하고, 크루스 칼 - 월리스 테스트, Tukey에의 및 둔넷 (Dunnet) 사후 검사를 실시 하였다.
      5. 거리의 분포 비 파라 메트릭 분포 한 다음, 데이터는 상자와 Tukey에 수염 (특이점을 제거하기 위해)으로 표현된다.

      5. 등반 분석 (제어 동작)

      1. 능력 14,15,18 등반 테스트 파리에 대조군으로 등반 분석을 사용합니다.
        1. 역류 장치를 사용되도록 세 가지 시험의 C병렬로 실행.
      2. 반대 위치에 신선한 빈 유리 병으로 역류 장치의 맨 아래에있는 1 차, 3 차에 100 순진한 파리 세 가지 테스트 튜브에 (이전에 테스트되지 않은 파리), 그 스냅로 전송 (50)와 마지막 슬롯.
      3. 장치의 맨 아래에있는 빈 슬롯에 신선한, 빈 유리 병을 놓습니다.
      4. 실험을 개시하기 위해, 모든 파리는 각 튜브의 아래쪽이되도록, 상기 장치를 세 번 눌러 내려.
      5. 15 초 동안 타이머 시작 (상단 유리 병에 도달 3-7 일 이전 광저우-S의 ~ 100 % 충분한 시간을 - 그림 3F 참조).
      6. 하나의 슬롯에 의해 상부 튜브를 변위, 역류 장치의 상부 부분을 밀어.
      7. 바닥 유리 병에있는 모든 파리를 가지고, 아래로 장치를 활용하여 파리를 수집합니다.
        1. 1 차 및 2 차 튜브 (또는 3 번째, 4 번째, 5 번째 일)까지 상단에 도달하지 않은 파리와 상단 유리 병에 도달 파리에 각각 해당합니다.
      8. 성능 지수 (PI)를 계산합니다.
        1. 각각의 유리 병에 파리의 수를 계산합니다.
        2. PI는 상부 튜브에 오를 수 파리의 비율입니다.
        3. PI의 수단은 정규 분포 (1)를 수행하고, 데이터는 평균 (SEM)에 평균 플러스 또는 마이너스 표준 오차의 열 그래프로 표시됩니다.
          주 : 또는, PI는 이전 파리위한 하부 바이알 (의 상부에 도달 할 수 파리의 비율로 계산 될 수는, 5 초 12 일 이전에 감염된 감염된 비 사이 능력 등반 차이를 정량화하기에 충분한 시간이다 스틸 사진에서 정량화 광저우-S : 결과를 참조). 다른 사람들은 또한 능력 19-22 등반 정량화하기 적합한 놀라게 유발 부정 geotaxis 성능의 다른 조치를 사용하고 있습니다.

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Representative Results

사회적 공간 챔버는 초파리의 사회적 행동을 정량화하는 도구로 사용될 수있다. 아크릴 스페이서 및 유리 창은 많은 잠재적 혼동 큐의 존재없이 안정한기를 형성 할 수 날아간 이차원 영역을 제공 경기장 내부 삼각형을 형성하도록 함께 클립핑된다. 파리는 수직 분야로 전송되면, 그들은 아래로 도청 됨으로써 깜짝, 그들은 탈출 동작으로 응답되어 부정적인 geotaxis. 그들은 꽉 그룹으로 강제 직립 삼각형의 정점에 올라 다음 더 이동 서로를 형성하고, 경기장을 탐구하는 시간을 제공한다. 20 내지 40 분 후, 움직임이 정지 한 안정한기를 형성한다. 각 플라이 사이의 최근 접 거리를 선호하는 사회적 공간의 정량화를 제공하기 위해 사진에서 측정 할 수있다. 파리는 가까운 그들이 그들의 이웃에 더 사회적으로 간주됩니다.

파리밀도 하에서 용량의 점까지 챔버에서 사회적 공간에서 역할을하지 않는다. 더 큰 수직 지향 챔버에 20-70 파리의 큰 그룹의 경우, 사회적 공간은 그룹 밀도 (그림 2A, B)의 독립적입니다. 사회적 공간 챔버에서 10 또는 15으로 파리, 사회적 공간의 증가로 이어지는 대부분 안정된 사회 집단을 형성하기에 충분한 개인이 없다 (도 2A, B). 그러나, 파리의 다수를 테스트하는 것은 항상 편리하지 - 돌연변이 개체의 수에 제한이 특정 상황에서, 연구자들은 사회적 공간 챔버의 표준 크기만큼 큰 파리의 그룹을 수집 할 수 없을 수도있다. 파리의 소그룹을 사용하여 사회적 공간을 정량화 촉진하기 위하여 연구자들은 이차원 경기장의 면적이 작아 지도록 사회적 공간 챔버를 조작 할 수 있지만, 플라이 당 면적은 일정하게 유지된다. 사회의 두 가지 유형, D도 1c에 도시챔버 공간은 더 작은 그룹에 대한 수정되었지만 더 큰 챔버와 동일한 밀도를 유지한다. 이러한 방식으로, 플라이 밀도를 유지하고, 챔버의 크기가 비슷한 사회적 간격 (도 2c)를 얻는있게 감소시킨다.

같은 전반적인 경향은 수평 위치 (그림 2D)에 배치 사회적 공간 챔버에 대한 진정한 보유. 그러나 초파리는 수평으로 간격을 추가로 설정되는 경향이 있음을 관찰 할 수 있고, 이들은 1 쉽게 해결되지 않는다. 15, 20 파리가 그룹 (40) 파리 (F의 igure 2 차원)와 그룹보다 더 큰 사회적 공간을 나타낸다.

그 혼잡은 파리의 큰 그룹에서 볼 수있는 가장 가까운 이웃에게 작은 거리에 대한 책임을지지 않습니다했다 확인하기 위해 각과의 거리가 다른 모든 파리에 도착하는 9에서와 같이 측정 하였다. 가장 가까운 이웃 거리에 비해 모든 파리의 거리를 정량화하는 것은 그룹 be​​havi을 평가 할 수 있습니다또는 대신에 그룹 내의 개인의 행동. 예상 한 바와 같이, 그룹의 파리의 양이 증가 된 모든 파리의 거리가 아닌 개별 파리 기 자체의 반사 컸다. 이러한 경향은 세로 및 가로 방향에 위치 사회적 공간 챔버 (도 2E, F)에 대해 관찰 하였다. 따라서, 더 큰 그룹의 파리 때문에 공간의 제약을 위해서 자신의 이웃에 가까운 거리를 유지하도록 강요하지 않았다. 챔버에서 15 개 이상의 파리가있을 때 대신, 파리는 엄격한 사회 집단을 형성한다.

다른 행동 검사 용으로서, 사회적 공간 챔버를 이용하여 하나의 제한은 세로로 더 geotaxis 또는 등반 장애가있는 파리를 필요로한다는 것이다. 예를 들어, S-캔톤에 Providencia은 23은 사회적 간격의 방향에 따라 서로 다른 간격 사회적 결과 등반 결함을 가지고 전시 레트 게리 그람 음성 박테리아와 1 주일 감염된 날아간챔버. 테스트가 수직을 수행 할 때, 감염된 초파리의 사회적 공간 감염된 초파리 챔버 (도 3a)의 상단에 안정한기를 형성 할 수 없었다 아마 때문에, 컨트롤의 사회적 공간보다 더 컸다. 동일한 조건에서 파리 다음 가로 방향 사회적 공간 챔버에서 테스트했을 때, 운동 능력이 수평 위치 사회적 공간 챔버 (그림 3B)의 사회 공간에 대한 요인의 아마 작다는 것을 나타내는 유의 한 차이가 없었다. 감염된 파리 시각적 컨트롤보다 오를 덜 수 있지만,이 등반 분석 (그림 3C)를 사용하여 정량화 할 수있다. 5 초 후, 제어 파리의 약 44 %가 정상보다 낮은 유리 병의 절반에 감염된 파리의 32 %까지 올라 갔다. 그것은 어떤 수,이 분석의 모든 파리가 제대로 (그들은 거의 상단 유리 병, 낮은 유리 병의 상부에 도달하지) 올라 있음을 주목할 필요가있다그들은 파리 22 노화에 의한 상승에 결함을 나타낼 시작할 때이다 이후 우화 12 시대는 사실에 의해 설명한다.

우리는 이전에 (1)를 도시 한 바와 같이 그러나, 등산 결함이없는 균주, 챔버의 두 방향은, 동일한 결과가되었다. 이 실험에서는, 소셜 공간에서 동일한 상승 삼각형 수직 또는 수평 원형 챔버 (- 1에 게재 된 데이터의 박스 휘스커 재분석 및도 3d, E)에 세슘 캔톤 10-S과 1,118 와트 보였다. (- 그림 3 층 15 초 선택)이 중 실 방향으로 변형 사이의 사회적 공간의 차이에 대한 요인이 아니었다 나타내는 고사 10 캔톤-S 사이에 1118 능력을 등반 차이가 없었다. CS 3.3 14 % ± ± 17 % 5 초 선택 주어진 경우1,118 고사 (10)가 상부 바이알에 도달 (W)의 2.5 (통계적으로 차이가, 데이터는 도시하지 않음).

사회적 공간 챔버를 이용한 연구자들은 또한 하루 동시에 자신의 실험을 반복되도록한다. 고사 두 광저우 - S 및 1118 와트 (10) 남성, 사회적 상호 작용의 영향을받는 하루의 시간을 날아. (ZT11 ZT12에 - 직전 소등) 저녁에 시험 파리 (- - 빛의 발병 후 시간의 시간 ZT7에 ZT4가 Zeitgeber 시간) 낮 시간에 비해 모두 유전자형에 대한 훨씬 더 큰 사회적 공간을 보여 주었다, 상대적 공간의 차이가 유지되었지만 - 즉, 1,118 와트 고사 (10) 파리는 여전히 광저우-S는 저녁 (그림 4A)에서 파리보다 작은 사회입니다. 흥미롭게도, 단지 사회적 캔톤-S 남성의 공간이 아니라 t저녁 (그림 4B) 여성 파리 사회 공간의 큰 변화 경향이 있었지만 여성의 모자, 저녁에 증가한다. 우리는 이전에 독립적으로 동일한 관찰 (24)을 만들었습니다.

우리가 이전에 비스페놀 A (BPA) 2의 효과를 연구하기 위해 오레곤-R 라인을 사용하여 보도 된 바와 같이, 사회적 공간 챔버는 초파리의 유전 적 배경에 민감합니다. 여기서 우리는 엘우드, 최근에 잡은 야생 형 라인, 광저우-S와 사마르 칸트가 아니라 오레곤 (그림 5)에 비해 사회적 공간을 증가했다고 보여줍니다. 사마르 칸트와 오레곤의 사회적 공간이 크게 상이하지만 광저우-S (그림 5)의 사회적 공간보다 모두 큰 아니었다. 이러한 데이터는 소정의 환경에서, 다른 근친 및 야생형 균주 동작시키는 유전 성분을 나타내는, 다른 사회적 공간을 가지고 있음을 보여준다. 또한 자체 나타냅니다이 테스트의 nsitivity 따라서 파리 전에 실험에 적합한 유전 적 배경에 outcrossed해야합니다. 이 차이를 확인하는 데 도움이 될 것입니다, 또는 반대로 사회적 공간에서 볼 수있는 유사성은 요소가 테스트되고 때문이다.

그림 1
그림 1. 사회 공간 챔버 부품 및 배치. (A) 다양한 사이즈의 사회 공간 챔버 16.5 cm의 높이 (오른쪽 삼각형의 모양과 아크릴 스페이서 (17.6 0.3 cm 의해 cm에서 17.6 cm) 같은 판유리를 이용하여 구성 할 수 있고, 8.9 cm의 기지 0.3 cm의 두께 - 소문자) 및 사각형 (0.3 cm 1.5 cm 의해 9cm 의해 지시 -. 작은 문자 B로 표시) (B)에서 가장 큰 사회적 공간 실, 1에 기재된 바와 같이 적합 30 ~ 40 파리. 그것은 내면의 어두운이86.45 cm (2)의 영역을주고, 40 파리위한 플라이 당 2.16 cm 2의 영역에 이르는 14.5 cm 16.5 cm 16.5 cm의 ensions. (C) 20 파리 용 챔버 크기 최적. 그것은 43.25 cm (2)의 영역을 제공하고, 플라이 당 2.16 cm 2의 영역에 이르는 5.96 cm 14.5 cm 16.5 cm의 내부 치수를 갖는다. (D)보다 작은 챔버 (15)에 대한 최적의 파리. 그것은 32.45 cm 2의 영역을 제공하고, 비행 당 2.16 cm 2의 면적에 이르는 8.9 cm로 8.9 cm 10.2 cm의 내부 크기를 가지고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 챔버 및 그룹 크기가 아니라 밀도의 동향, 사회적 공간에 영향을 미칩니다. 데이터 상자에 표시됩니다그리고 1 차 분위수 (25 번째 퍼센트)를 나타내는 상자와 3 차 분위수 (75 번째 퍼센트), 중간을 나타내는 상자의 라인, 그리고 Tukey에의 수염을 가진 챔버의 가장 가까운 이웃까지의 거리의 수염 플롯 . (AB) 대표 데이터가 동일한 크기의 챔버 내에서 파리의 수를 증가하는 것은 안정적인 사회적 공간 측정 리드 것을 보여준다. 10-70 광저우-S 남성 파리의 그룹은 더 큰 수직 사회적 공간 챔버에 넣고 30 분 동안 정착시켰다; 각 플라이의 최근 접 거리에 기록 하였다. 15 개 미만의 파리를 가진 그룹은 큰 챔버에서 20 개 이상의 파리를 갖는 그룹보다 훨씬 더 사회적 공간을했다. (A) 그룹 (10) N = 9의 20 N = 9, 30, N = 8, 40, N = 8, 크루스 칼을 -Wallis 테스트 P <0.0001, 던의 다중 비교 시험 : 각 문자 그룹을 통계적으로 다른 # B 형 P <0.0001을 표시 (B) <./ 15 N = 6, 40, N = 8, 50, N = 5, 60, N = 6, 70, N = 5, 크루스 칼 - 월리스 테스트, P <0.0001, # B 형 P <0.001의 강한> 그룹. (C) 때 챔버의 크기는 플라이 밀도 (라지 챔버 각각 매질 작은 15, 20, 40, 플라이 당 2.16 cm (2)의 밀도마다 유지하도록 조정되어 수직 시험했을 때, 유의 한 차이가 관찰되지 않는다. (D )하지만 이러한 사회적 공간 챔버가 수평으로 배치하는 경우 15 또는 20 파리 40 파리 (15 N 그룹 = 3, 20, N = 4, 40, N = 4, 크루스 칼과 그룹에 비해 가장 가까운 이웃에게 더 큰 거리를했습니다 그룹 -Wallis 테스트 p <0.0001, 던의 다중 비교는 # B 형 p <0.01)를 테스트한다. (E는 - F) 모든 파리의 거리 (15)의 그룹 (20)을 측정하고, 40 남성 캔톤-S 파리 수직 모두에 넣고 가로 배향 된 챔버. 챔버 파리 큰 양, 더 거리 모든파리 ((E) : 그룹 15 N = 6, 20, N = 6, 40, N = 3, 크루스 칼 - 월리스 테스트 P <0.0001, 던의 다중 비교는 # B 형 P <0.01 테스트 (F) : 15 N의 그룹을 = 6, 20, N = 6, 40, N = 3, 크루스 칼 - 월리스 테스트 P <0.0001, 던의 다중 비교 # 2 B # C 형 P <0.0001을 테스트). 참고 : 3 지리적으로 다른 지역에 따라서 다른 실험실 설정에서 얻어진 (A, B와 CF) 쇼 데이터를 (A) 지역 1 : UCLA, 로스 앤젤레스, 캘리포니아 (B) 지역 2 :. 뉴욕 대학, 뉴욕, 뉴욕; (CF) 지역 3 :. 웨스턴 대학, 런던, ON 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 방향 OF 사회적 공간 챔버는 geotaxis 문제를 교란하기위한 제어 할 수 있습니다 (A - C).(P)에 감염된 40 남성 광저우-S 파리의 그룹 이레 동안 레트 게리 또는 제어 어느 수직 (A) 사회적 공간 챔버에 넣어 수평 또는 (B)에 배치하고, 30 분 동안 정치시켰다 같은 매체를 주입. 각 플라이의 최근 접 거리에 기록 하였다. 데이터는 1 차 분위수 (25 번째 퍼센트)를 나타내는 상자와 3 차 분위수 (75 번째 퍼센트), 상자에서 선으로, 챔버의 가장 가까운 이웃 거리의 상자와 수염 플롯으로 표시됩니다 중앙값과 Tukey에 휘스커를 나타내는. (A)를 대표 데이터 같게 P. 감염된 초파리 사회 공간의 증대 레트 게리 및 수직 위치 사회적 공간 챔버에 넣고,미디어 주입에 비해 (윌 콕슨 순위 테스트 : 각 문자는 그룹이 통계적으로 다른 P <0.0001를 표시, N = 6) (B)는 대표적인 데이터는 P.에 의해 영향을받지 않는 사회적 공간을 보여줍니다. (: p> 0.1, N = 5는 Wilcoxon 랭크 테스트) (C)의 역류 장치가 모두 감염 및 미디어 제어 날아 오르는 동작을 평가하는 데 사용 하였다. 파리가 수평 위치 사회적 공간 챔버 내에 배치 레트 게리 감염. 두 웰치의 보정 t-test를 꼬리; N = 6 5 초 선택에서 유리 병의 상단 절반에 파리 % : 감염된 파리 그래프 성과 지표 ± SEM 의미 표현, 자신의 미디어 컨트롤 (파리 ~보다 더 가난하게 십이일 오래된 상승 60 파리 ~의, 각 문자는 그룹 통계적으로 다른 P = 0.08)를 나타냅니다 (D - F). 삼각형 또는 원형 중 하나를 수직 및 수평 위치 챔버,과) 광저우-S (CS의 사회적 공간을 비교하는 데 사용되었다그 1118 승 고사 10 (W)의. 데이터는 1 차 분위수 (25 번째 퍼센트)를 나타내는 상자와 3 차 분위수 (75 번째 퍼센트), 상자에서 선으로, 챔버의 가장 가까운 이웃 거리의 상자와 수염 플롯으로 표시됩니다 중간을 대표하고, Tukey에의 수염. 모두 사회적 공간 챔버 방향과 모양, 1118 W 고사 (10) 광저우-S ((D), 수직 삼각형보다 더 큰 사회적 공간이 있었다 : 크루스 칼 - 월리스 테스트를, 각 문자는 통계적으로 다른 그룹 P <0.0001, (E), 수평 원을 나타냅니다 크루스 칼 - 월리스 테스트를, 각 문자는 그룹이 통계적으로 다른 표시 p <0.01). (F))는 역류 장치가 고사 (10) 모두 캔톤-S 및 1,118 w 등반 행동을 평가하기 위해 사용 된균주 (3-5일 오래된 파리, 그래프는 평균 성과 지표 ± SEM을 나타냅니다 상단 유리 병에 파리 %를 15 초 선택에서). 고사 10 중 광저우-S 사이 또는 1118 능력에 차이가 없었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 남성의 사회 공간이 저녁 동안 증가한다. (A) 대표 데이터는 "하루에 남성 사이의 증가, 사회적 공간이 저녁 시간 동안 정오 시간에 비해 (이전에 해제 등을"저녁 "ZT 11-12) (파리 표시 "ZT 4-7). 고사 10 40 광저우-S 파리와 1118 W 그룹파리는 낮 시간이나 저녁 시간 중 동안 사회적 공간 챔버에 넣고 30 분 동안 정착시켰다. 각 플라이의 최근 접 거리에 기록 하였다. 모두 유전자형의 경우, 저녁에 증가 된 사회적 공간을 날아 균주 사이의 차이 (N = 6 ~ 7가, 크루스 칼 - 월리스 테스트 P <0.0001, 던의 다중 비교 테스트에 관계없이 하루 중 시간을 유지했다 : 각 문자는 그룹이 통계적으로 다른 페이지를 표시 < 더 큰 내부 변화에 대한 유의하지 않은 경향이 여성에서 볼 수 있지만, 0.01). (B) 광저우-S 파리가 섹스 만 남성에 의해 분리 크루스 칼 (저녁 (T는 P <0.01)의 사회 공간의 증가를 보여 주었다 -Wallis 테스트는, 각 문자는 그룹이 통계적으로 다른 P <0.0002)을 나타냅니다. 데이터는 1 차 분위수 (25 번째 퍼센트)를 나타내는 박스 (3)와, 챔버에 가장 가까운 이웃 거리의 박스 휘스커 플롯으로 표시되는RD의 분위수 (75 번째 퍼센트), 중간을 나타내는 상자의 라인, 그리고 Tukey에의 수염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 파리의 유전 적 배경은 (40) 광저우-S, 사마르 칸트, 오레곤 그룹. 사회적 공간 영향을 미치며, 엘우드 파리는 사회적 공간 챔버에 넣고 30 분 동안 정착시켰다. 각 비행의 가장 가까운 이웃까지의 거리가 기록되었다. 그룹의 분포가 다른 (크루스 칼 - 월리스 시험, p <0.0001), 공통의 문자를 공유하지 않는 그룹이 크게 다르다. 데이터 박스 및 위스커 (P)으로 표현되는1 차 분위수 (25 번째 퍼센트)를 나타내는 상자와 3 차 분위수 (75 번째 퍼센트), 중간 값을 나타내는 상자의 라인, 그리고 Tukey에의 수염을 가진 챔버의 가장 가까운 이웃의 거리, 많은 (둔넷 (Dunnet) 여러 비교 테스트, P <0.05 [D], ​​P <0.001 [A, B, C, 등이 1-2 내부 복제와 3 독립적 인 반복, 엘우드와 사마르 칸트 N = 3, 오레곤과 광저우-S N = 4 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜에서, 사회적 공간의 정량화에 대한 자세한 절차는 설명했다. 실험을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계는 성공 : 1) 청소 및 2) 파리 전에 적어도 일일를 수집하고 확인 장치의 내부 챔버 떨어져 자신의 오일과 향을 유지하기 위해, 장치를 설정할 때 항상 장갑을 사용 실험이 차가운 마취 미치는 영향을 줄이기 위해, 3) 실험 전에 2 시간이 파리 굶어되지 않고, 자신을 청소 한 보장하기 위해 신선한 음식을 포함하는 새로운 튜브를 제공, 4)이 2 시간 동안하자 파리에 순응 자신의 실험을 수행 할 때 새로운 환경, 5)의 온도 및 습도 조건을주의; 6) 실험을 실행하는 동안 사회적 공간 챔버를 방해하지 있는지 확인 24 ~ 25 ° C와 50 %의 습도 사이의 일관성을 유지하려고 7) 바람직 Zeitgeber 시간 ZT4 사이에, 하루 중 같은 시간에 실험을 수행 및 ZGT7.

사회적 공간만큼 충족 최소 그룹 크기가 같은, 챔버 내에서 파리의 밀도에만 의존하고, 그룹의 크기에 의존하지 않는 것이다.파리없이 그룹 구성원의 양 상호간 같은 사회적 간격을 유지한다. 그러나, 예상대로 챔버 내의 모든 파리, 거리가 그룹 크기뿐만 아니라 챔버 배향에 의해 영향을 받는다. 그것은 (그림 3D는 3E에 비해) 수평 방향에도 불구하고 (파리가 쉽게 정착하지 않습니다)를 사용하는 도전 인, 우리의 손에 유전자형 사이에 감소 분리로 이어지는 것이 중요합니다, 버크는 등. 3 성공적으로 수평을 사용 , 사각 챔버. 이들 실험에서 가장 가까운 이웃과의 거리가 우리 사회 수직 배향 공간 결과와 가장 유사했다. 그러나, 자신의 챔버에, 파리 '사회 집단의 간격이 우리의 수직 챔버 대신에 우리의 수평 챔버 가장 유사한 것에 기여 할 수 있습니다 지속적인 공기 흐름이 있었다. 수직 실 사용에 제한이 MOBILI 초파리를 테스트 할 수있는 능력이다타이 장애. 사회적 공간 챔버는 모바일로 파리를 필요 그래서 그들은 그들이 할 수하고자하는 그들의 이웃에서 어떤 거리를 선택할 수 있습니다. 파리가 움직였다 또는 어떤 방법으로 적자를 가지고 있다면, 그들은 챔버에서 제대로 안정적인 그룹을 형성하지 못할 수 있습니다. 가난한 운동에 대한 잠재적 인 치료는 수평 챔버를 사용하거나, 파리 사진을 촬영하기 전에 해결하기 위해 더 많은 시간을 허용하는 것입니다. 연구원은 또한 수직 사회적 공간 챔버는 적절한 있는지 등반 능력과 파리의 가능한 geotactic 손상을 평가해야합니다. 이들 중 하나의 결핍이있는 경우, 가로 배치 챔버들을 피하기 위해 사용될 수있다.

파리의 활동이나 전반적인 체력과 건강을 등반하는 사회적 공간의 측정에 영향을 미칠 경우 참고로, 우리는 활동이나 운동 수준이 사회적 공간과 관련되지 않은 것으로 나타났다. 또 다른 연구에서는 운동을 감소시키는 치료 (BPA를 공급하는) 사회적 감소 것을 보여공간 2. 그러나 주름이의 돌연변이 (자폐증 후보 유전자 neurobeachin의 초파리 ortholog) 디스플레이 과잉 행동 증가, 사회적 공간 (4). 마지막으로, 흰색 돌연변이 파리는 운동의 증가없이, 사회적 공간 1,3의 증가를 표시하거나 18 geotaxis. 즉, 활동 레벨 간격 및 사회의 여러 조합이 두 동작 간의 상관 관계를 나타내는없고, 지금까지 관찰되었다. 사실, 사회적 공간은 반드시 다른 기본 신경 회로를 제안, 사회적 회피 8,25와 같은 하나 다른 사회적 행동에 상관하지 않습니다. 예를 들어, 주름이 / neurobeachin 디스플레이의 돌연변이는 사회적 공간을 증가, 사회적 회피 (4) 감소; 하지만 흰색은 사회 공간을 증가, 매우 강한 사회적 회피 (4)했다 모두.

하루의 시간이 사회적 공간에 영향을 미치는 것처럼, 남성 적어도, 그것은 비판적이다이들 실험이 수행과 노력을 모든 실험에 일정한 시간을 유지하려고 할 때 연구자 일의 시간을 인식 L이다. 를 차지한다 기타 고려 사항은 연령, 성별, 파리의 결합 상태를 포함한다. 우리는 사회적 거리가 모두 남성과 여성 1 두, 성관계 개인에 비해 처녀 증가되는 것을 알고 있고, 우리는 이제 남성 저녁 (그림 4B)에서 여성보다 가까이 있음을 보여준다. 하루 동안 단일 초파리의 활동 수준에 특정 균주 성차 이전에 그 자신 구애 동작 (26, 27)에 관련 될 수있는 낮 시간에 비해 아침 저녁으로 높은 운동 활성을 수컷 제안, 설명되었다. 그러나 우리의 경우, 남녀가 분리되어 있지만, 파리 그룹화되고, 우리는 사회적 공간을 측정하는 시간에 의해, 파리 정착했다. 남성 쌍의 일주기 리듬을 유지하는 것이 후지이 등. (27) 보고서여성 쌍의 리듬이 하나의 파리의 유사 할 때 함께, 분명 피크 않고, 엉뚱한 일상 리듬을 가지고있다. 따라서, 저녁 수컷 증가 간격은 아마 구애 행동이나 운동 활성의 특정 증가와 관련된 증가하고,이 행동의 성적 이형성 근본적인 이유는 추가적인 조사가 필요하지 않는다.

수컷과 암컷들 사이의 사회적 상호 작용의 차이를 알 수 있도록 고려하여두고, 파리 항상 실험 성별로 구분한다. 나이는 파리의 사회적 상호 작용에 미치는 영향 마지막으로, 우리는 현재 아직 모른다. 따라서, 우리는 사회적 공간 실험은 22 개 이상의 주 이전 파리에 영향을받는 것으로 알려져있다 등반 활동 등 다양한 동작을 공연으로, 칠일보다 더 오래된 파리로 수행하는 것이 좋습니다.

사회적 공간에 대한 마지막 고려 사항은 중간에서 관찰 된 변화입니다사회적 거리. 사회 공간의 측정은 (로스 앤젤레스, 캘리포니아 등 다양한 위치에서 찍은 : 그림 2A를, 뉴욕, NY : 그림 2B, 그림 3D, 그림 4, 그림 5, 런던, ON : 그림 2C-F, 이타카, 뉴욕 : 그림 3A, B, 같은 캔톤-S의 배경에있는 모든). 지리적 위치, 또는 실험실 설정 간의 일정한 없었다 미지 변수, 중앙값 사회적 거리에 영향을 미쳤다. 가능한 요인은 다른 음식, 고도, 그 자체로 대기 압력, 대기압 (28)의 변화를 포함한다. 중간 값은 위치 사이에 일정하지했지만, 중앙값이 매우 일정하고 재현성있는 위치 내에서; 및 소셜 공간 측정에서 본 동향 및 패턴 중 동일한 위치에 남아 있었다. 따라서, 한 연구자들이 내부적으로 일정한 조건을 유지, 그들은 것사회적 공간에서의 차이를 검출 BLE.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Jazz-mix Fisher 33545 any other standard drosophila food would work
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
 Sharpie pens
Adhesive Tape
Medium size binder clips Staples to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity
small SupportStands Carolina  707161 to hold the chambers in a vertical orientation
Buret clamps Carolina 707362
Digital Camera Nikon  Coolpix S8000  to take the still pictures
small ruler to be able to scale the picture
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
pounding pad any mouse pad works.
Prism 6 GraphPad Software Inc. Prism 6 for Mac OS X Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work

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References

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