Condiciones que afectan Espacio Social en

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McNeil, A. R., Jolley, S. N., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Milunovich, A. J., Chambers, M. C., Simon, A. F. Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (105), e53242, doi:10.3791/53242 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

El ensayo espacio social descrito aquí puede ser utilizado para cuantificar las interacciones sociales de Drosophila melanogaste r - u otros insectos pequeños - en una manera directa. Como ya hemos demostrado 1, en ​​una cámara de dos dimensiones, que las moscas primera fuerza para formar un grupo apretado, posteriormente que les permite tomar su distancia preferida entre sí. Después de que las moscas se han asentado, medimos la distancia al vecino más cercano (o espacio social), el procesamiento de una imagen estática con el software en línea gratis (ImageJ). El análisis de la distancia al vecino más cercano permite a los investigadores para determinar los efectos de los factores genéticos y ambientales en la interacción social, mientras que el control de los posibles factores de confusión. Diversos factores, como la capacidad de escalada, la hora del día, el sexo, y el número de moscas, puede modificar el espaciamiento social de las moscas. Por ello, proponemos una serie de controles experimentales para mitigar estos efectos de confusión. Este ensayo puedeser utilizado para al menos dos propósitos. En primer lugar, los investigadores pueden determinar cómo su turno ambiental favorito (como el aislamiento, la temperatura, el estrés o toxinas) afectará el espaciamiento social de 1,2. En segundo lugar, los investigadores pueden diseccionar las bases genéticas y neuronales de esta forma básica de la conducta social 1,3. En concreto, se utilizó como una herramienta de diagnóstico para estudiar el papel de los genes ortólogos se cree que participan en el comportamiento social en otros organismos, tales como genes candidatos para el autismo en los seres humanos 4.

Introduction

Las interacciones sociales son cruciales para el buen desarrollo y la salud de los individuos dentro de un grupo como un todo, y se pueden observar a través de numerosas especies, desde los seres humanos (Homo sapiens) a organismos más simples como la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) 5,6. Una mosca de la fruta individuo o medios comunes comparten humana para procesar la información sensorial durante estas interacciones, ya sea: auditiva, visual, olfativa, táctil, o gustation. Nosotros y otros la hipótesis de que existe una neurocircuitos potencialmente compartida subyacente respuestas de comportamiento a las interacciones sociales y que las células neuronales y genes implicados podría ser evolutiva conservan 7. Una vez se ha producido la interacción inicial, el espacio social entre los individuos que interactúan ya sea para aumentar (evitación social 8) o disminuir (formación de grupos / agregación 5). Interacciones más complejas, como la agresión o el noviazgo, entonces pueden tener lugar.

Drosophila melanogaster, como se usa en los siguientes estudios 1-4,9. Espacio social se refiere a una medida de la distancia entre una mosca y su vecino más cercano 10. El espacio social es constante para una determinada población de D. melanogaster cuando se conservan las condiciones experimentales (un promedio de aproximadamente dentro de 1-2 cuerpo longitudes), y varía con respecto a la experiencia social de las moscas, lo que aumenta si el individuo se ha mantenido en forma aislada 1. Visión adecuada es necesaria para mantener la distancia social normal, pero no odorantes clásicos o CVA percepción 1. Medida del espacio social puede ser asíutilizado como una herramienta de diagnóstico para analizar las interacciones sociales y cuantificar el comportamiento social en D. melanogaster 1. Se describe aquí en detalle cómo realizar esta cuantificación, y en qué medida las variables experimentales comunes afectan a este comportamiento.

Se demuestra que la orientación de la cámara en la que se realiza el ensayo, así como el número de moscas - en una medida - hacer afecta el espacio social. Se ha demostrado previamente que la geometría de la cámara afecta el movimiento de exploración espontánea de moscas 11,12 y este fenómeno puede en última instancia afectar su decisión de asentarse. Sin embargo, siempre que la densidad de moscas (mosca / cm 2) y la orientación cámara se mantiene la misma, el espacio social de las moscas también permanece constante. La robustez de este ensayo se ilustra por el hecho de que los laboratorios independientes usando diferentes tamaños de cámara, la forma y la orientación se puede replicar el resultado mostrado por mutantes de la whgen ite (que afecta la pigmentación de los ojos), que es un espacio social incremento (triángulo vertical u horizontal en 1 círculo, cuadrado horizontal con el flujo de aire en 3).

Nuestros resultados también indican que el mantenimiento de la hora a la que se realiza el experimento espacio social es crucial para la consistencia de los resultados, como se muestra que los varones, pero no en las mujeres, son más separados por las noches. Sin embargo, las diferencias observadas entre las horas diurnas y nocturnas no se deben a diferencias de actividad de las moscas, y discutimos los argumentos que indican que los niveles de actividad no se correlacionan con el espacio social.

Por último, hay bases genéticas a la determinación del espacio social, como lo indica el mutante blanco ya se ha descrito 1,3, y las diferencias entre diversas cepas puras y silvestres de moscas que aquí presentamos.

Por lo tanto, este ensayo hace una excelente herramienta fo el estudio de los efectos de la genética y los factores ambientales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Equipos y Reactivos Creado Dentro de la casa (Ver Lista de Materiales de los demás)

  1. Preparar un aparato de anestesia frío Drosophila como se describe anteriormente 8.
  2. Preparar un aspirador de mosca como se describió anteriormente 13.
  3. Preparar las cámaras y los titulares de espacios sociales.
    1. Ordenar o hacer cristales y separadores acrílicos para crear las cámaras espaciales sociales. Cada cámara de espacio social consta de dos paneles de vidrio cuadradas (17,6 cm por 17,6 cm, con un espesor de 0,3 cm), dos espaciadores de acrílico triángulo rectángulo (con una altura de 16,5 cm, una base de 8,9 cm, con un espesor de 0,3 cm ), y dos espacios rectangulares (9 cm por 1,5 cm con un espesor de 0,3 cm) (Figura 1a).
    2. Montar el cristal y acrílico cámara de espacio social tal que es idéntica a la cámara en la Figura 1B. Para ello, inicie mediante la colocación de un separador triangular plana en la parte superior de un panel cuadrado de vidrio de tal manera que el ángulo rectodel espaciador triangular está alineado con una de las esquinas de la panel cuadrado. A continuación, coloque el segundo espaciador plana triangular en la parte superior del panel de la plaza, lo que refleja el primer separador triangular.
      NOTA: Asegúrese de usar guantes para no contaminar las piezas con aceites y esencias de sus manos.
    3. Coloque dos pequeños separadores rectangulares planas en la parte superior del panel cuadrado, a lo largo del lado del panel que no está cubierto. Los espaciadores de acrílico en la parte superior del plano cuadrado ahora deben formar una arena triangular.
    4. Coloque un segundo panel cuadrado de vidrio en la parte superior de los separadores acrílicos de tal manera que se alinea sobre el panel original de vidrio abajo.
    5. Utilice cuatro clips de la carpeta para asegurar los paneles y separadores para formar la cámara de espacio social. Colocar un clip cerca de la esquina, sobre el lado largo de cada uno de los espaciadores triangulares, asegurando ellos dentro de los paneles de vidrio. En estos mismos lados, colocar un clip en la esquina adyacente, sobre cada uno de los separadores rectangulares, asegurándolos enlado de los cristales.
    6. Montar un soporte de apoyo y una abrazadera matraz de tal manera que la abrazadera mantendrá la cámara de espacio social en una posición vertical, como la cámara de espacio social descansa sobre su borde en la parte superior de la superficie de trabajo.
    7. Para cada repetición en el experimento, montar una cámara de espacio social y apoyar a ponerse de pie.
  4. Preparar un mecanismo de respuesta ensayo de escalada para comprobar la capacidad de la escalada de las moscas probadas.
    1. Utilice un aparato de contracorriente, como se describió previamente 14,15.
  5. Garantizar condiciones de iluminación homogéneas mediante la realización del experimento en una superficie cubierta con una tapa banquillo blanco y delante de un fondo blanco.

2. Preparación de las moscas antes de que el experimento

  1. Mantener moscas en botellas que contengan estándar de Drosophila vuelan alimentos. Manténgalos en una cámara de incubación a 25 ° C en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo.
  2. Uno o dos días antes de la eXperiment, recoger y sexo vuela bajo anestesia frío, como se describió anteriormente 8.
    1. Enfríe el aparato de anestesia fría a -4 ° C. Lugar vuela en 50 tubos de plástico ml. Sumergir completamente los tubos de plástico que contienen las moscas en el hielo en un cubo de hielo aislados, espere al menos 5 minutos para las moscas a convertirse inmóvil.
    2. Colocar las moscas en la lámina de polietileno del aparato de anestesia frío. A RT, usar un microscopio estereoscópico para separar los machos de las hembras. Mantener las moscas, en grupos, en viales que contienen norma Drosophila alimentos volar, que no exceda de 40 moscas por vial.
  3. Dos horas antes del comienzo del experimento, asegurar que la temperatura de la habitación donde se realizó el experimento es de entre 24-25 de ° C y la humedad es de aproximadamente 50%.
  4. Transfiera las moscas en nuevos viales que contienen los alimentos, y colocarlos durante 2 horas sobre la superficie de trabajo, donde se llevará a cabo el experimento.
    NOTA: Para estos experiments, las cepas de moscas utilizadas fueron las cepas de Drosophila melanogaster: Canton-especiales o de Cantón-S (CS), w 1118 Cs 10 (o W - w 1118 outcrossed 10 veces para Canton-S), Oregon y Samarkand moscas eran todos de nuestro laboratorio stocks 16; Elwood moscas se recolectaron en el otoño de 2011 en el barrio Elwood de Huntington, en Long Island, Nueva York, EE.UU. 8. Además, cuando se especifique lo contrario, se obtuvieron los resultados que se presentan con el Cantón-S vuela (en tonos de rojo).

3. Realización del experimento

  1. Realizar el experimento 24:00-15:00 (hora Zeitgeber - el tiempo en horas después de la aparición de la luz - de ZT 4 a 7).
  2. Prepare la cámara de espacio social para la transferencia de las moscas.
    1. Coloque un piso cámara de espacio social en una superficie de trabajo, con el lado que contiene separadores rectangulares más cercanos a tu cuerpo.
    2. Retire oClip ne más cercana a su cuerpo y deslice un espaciador rectangular hacia el exterior, creando un espacio de aproximadamente 1 cm entre los separadores rectangulares.
    3. El uso de cinta y un marcador, etiquetar la cámara de espacio social en una esquina superior con el sexo, la tensión, y el número de repetición. Tenga cuidado para asegurarse de que la cinta no cubre parte de la arena triangular interior.
  3. Transfiera las moscas en la cámara de espacio social.
    1. Transferencia de pájaro desde su frasco que contiene el alimento en un nuevo vial vacío. Aspirar vuela desde el vial vacío y transferirlos a la cámara de espacio social.
      1. Inhale sacar las moscas en la punta del aspirador. Coloque la punta en el espacio de 1 cm entre los separadores rectangulares de la cámara de espacio social y exhalar a un ritmo constante para forzar las moscas a la arena triangular interior.
      2. Inmediatamente deslice el espaciador rectangular en su lugar, el cierre de la base de la arena triangular interior, y colocar el clip de la carpeta de nuevo.
    2. En una almohadilla palpitante, que se encuentra en diferentes banco que donde el trabajo experimental se lleva a cabo, mantenga la cámara de espacio social en posición vertical de manera que los separadores rectangulares están en la parte inferior. Libra tres veces para asegurar todas las moscas han caído a la parte inferior de la arena.
      NOTA: Debido al espaciador de acrílico que salen de la cámara de tamaño más pequeño (Figura 1D), golpear los codos sobre la superficie de trabajo, manteniendo una sujeción segura en el aparato para asegurarse de que las moscas han caído hasta el fondo.
    3. Iniciar un temporizador.
    4. Coloque la cámara de espacio social en la superficie de trabajo y el uso de la abrazadera soporte de la ayuda y el frasco para mantenerlo en posición vertical. Coloque una regla o una pegatina de longitud conocida plana contra la cámara de espacio social, pero no cubre ninguna parte de la arena triangular interior.
      1. Para los experimentos en posición horizontal, no coloque la cámara de espacio social en el soporte de la ayuda; lugar poner la cámara plana espacio social en la superficie de trabajo.
      2. Cuando las moscas se han establecido, por lo general después de alrededor de 30 minutos, tomar una fotografía de la cámara de espacio social. Asegúrese de que la trama contiene todo el ámbito interno triangular, el gobernante, y la etiqueta.
      3. Repita el experimento para cada genotipo y condición (idealmente 3 repeticiones internas y 3 repeticiones independientes).

      4. Análisis de los datos Espacio Social

      1. Importe las siguientes macros en ImageJ 17
        1. ImageJ está disponible aquí: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
        2. Puede crear un comando "Medir Distancias" en el menú de plugins salvando las macros a continuación en un archivo llamado 'Measure_Distances.txt' en la carpeta ImageJ / plugins, en la subcarpeta macro, y el uso de la Ayuda> comando Actualizar menús.
        3. Copiar en un archivo .txt las macros que se proporcionan en los datos suplementarios y fueron publicados originalmente en 3.
      2. Sube las imágenes a un ordenador y abrir uno picture usando ImageJ.
        1. Crear una escala dibujando una línea desde las 0 cm a 1 cm de marcas en la regla en la imagen, y en la ficha Analizar, seleccione el conjunto de características de escala para establecer una escala de 1 cm para esa distancia (el mismo enfoque para la pegatina de longitud conocida). Elija la opción global antes de aplicar la escala de la imagen.
        2. Recortar la imagen utilizando la función de la cosecha bajo la etiqueta de imagen tal que incluye todas las moscas, mientras se quita como gran parte del resto de la imagen de lo posible.
        3. Haga la imagen en blanco y negro por la elección de 8 bits de la opción Tipo en la ficha Imagen.
        4. Retire todo el ruido de fondo de la imagen, vaya a la función de umbral bajo la opción Ajuste de la ficha Imagen. Arrastre los reguladores para mejorar o eliminar el contraste para que el cuerpo de cada mosca se puede ver claramente y sin cualquier otra marca en la imagen. Si hay marcas que no son moscas, capturarlos con la herramienta rectangular y eliminarlos.
        5. Ajuste elmediciones mediante el uso de la herramienta Medidas Set en la ficha Analizar. Seleccione Area, Centro de la Misa, centroide, y display Label. A continuación, elija las partículas Analizar cuentan en la ficha Analizar para crear una lista numerada de todos los puntos negros representan las moscas.
          1. Cuando se usa Analizar partículas; tamaño del conjunto de 0,01 a 0,1 (no elija la unidad píxel); circularidad 0,00-1,00; muestran contornos; mostrar los resultados, y añadir a la gerente.
          2. Asegúrese de que cada punto negro (cada partícula) es una representación exacta de las moscas que se encuentran en la imagen original, mediante la comparación de la lista numerada a la imagen original.
            NOTA: Si algunas moscas que están muy próximos entre sí se cuentan como una partícula, dibujar manualmente una línea blanca para separar las dos moscas en la imagen binaria.
        6. Mientras esté seleccionada la lista, utilice el vecino más cercano - Lista Distancias macro bajo la segunda opción Macros en la pestaña de Plugins para crear una nueva lista que contiene las distancias, en cm, de each volar a su vecino más cercano.
      3. Copie las distancias de vecinos más cercanos de ImageJ y pegar en una columna de un programa de hoja de cálculo.
        1. Recopilar todos los datos de cada repetición en la misma hoja de cálculo y organizar por el genotipo y el estado.
      4. Realizar análisis de datos utilizando el software estadístico. En este experimento, Graph Pad Prism (versión 6 para MacOSX, GraphPad Software, San Diego California EE.UU., www.graphpad.com) se utilizó para llevar a cabo un modelo lineal, y Análisis de Kruskal-Wallis, Tukey y de post-hoc pruebas de Dunnet.
      5. La distribución de las distancias sigue una distribución no paramétrica 1, y los datos se representan como caja y bigotes de Tukey (para eliminar valores atípicos).

      5. Escalada Ensayo (Comportamiento de control)

      1. Utilice un ensayo de escalada como un control de moscas de la prueba de escalada capacidad 14,15,18.
        1. Utilice el aparato de contracorriente de tal manera que tres ensayos cuna ejecutarse en paralelo.
      2. Transferencia de 50 a 100 moscas ingenuos (moscas que no han sido probados antes) en tres viales de prueba diferentes y complementos ellos en la 1ª, y última ranuras en la parte inferior del aparato de contracorriente, con viales vacíos frescas en los lugares opuestos.
      3. Colocar los viales frescas, vacíos en las ranuras vacías en la parte inferior del aparato.
      4. Pulse la flecha abajo del aparato tres veces, de tal manera que todas las moscas son en la parte inferior de cada tubo, para iniciar el experimento.
      5. Comienza el temporizador de 15 segundos (tiempo suficiente para que ~ 100% de los 3-7 días de edad Canton-S para llegar a la parte superior del vial - ver Figura 3F).
      6. Deslizar la parte superior del aparato de contracorriente, para desplazar los mejores viales por una ranura.
      7. Recoger moscas tocando el aparato hacia abajo, para que todas las moscas en los viales inferiores.
        1. 1 ª y 2 ª tubos (o 3 ° y 4 °, 5 ° y 6º) corresponden respectivamente a las moscas que no alcanzaron al principio y las moscas que alcanzaron el vial superior.
      8. Calcular el Índice de Desempeño (PI).
        1. Cuente el número de moscas en cada vial.
        2. El PI es el porcentaje de moscas capaces de trepar sobre el tubo superior.
        3. Los medios de la PI siguen una distribución normal 1, y los datos se representan como gráficos de columna de error estándar media más o menos a la media (SEM).
          NOTA: Como alternativa, la PI puede ser calculada como el porcentaje de moscas capaces de alcanzar la parte superior del vial inferior (por moscas mayores, 5 seg es el tiempo suficiente para cuantificar una diferencia en la capacidad de subida entre infectado y no infectado 12 días de edad Canton-S cuantificados a partir de una imagen fija: ver resultados). Otros han utilizado diferentes medidas de actuación en geotaxis negativos inducidos sobresalto-, que también son apropiados para cuantificar la capacidad de subida 19-22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La cámara de espacio social se puede utilizar como una herramienta para cuantificar el comportamiento social de Drosophila melanogaster. Espaciadores de acrílico y paneles de vidrio se recortan para formar un espacio triangular interior que proporciona un área de dos dimensiones en el que las moscas pueden formar grupos estables sin la presencia de muchas señales de confusión potenciales. Cuando las moscas se trasladan a la arena vertical, que se asustan al ser golpeado ligeramente hacia abajo, y responden por un comportamiento de escape: geotaxis negativos. Suben al vértice del triángulo recto, forzado en un grupo apretado, y luego se proporcionan tiempo para seguir avanzando formar entre sí, y para explorar la arena. Después de 20 a 40 min, se dejan de moverse, y un grupo estable se forma. La distancia entre cada marcha y su vecino más cercano se mide a partir de una imagen, para proporcionar una cuantificación de su espacio social preferida. Las moscas son considerados como más social cuanto más cerca están de sus vecinos.

Moscadensidad no juega un papel en el espacio social en la cámara hasta el punto de sub-capacidad. Para un gran grupo de 20 a 70 moscas en la cámara más grande orientada verticalmente, espacio social es independiente de la densidad de grupos (Figura 2A, B). Con sólo 10 o 15 moscas en la cámara de espacio social, no hay más probable es que los individuos suficientes para formar un grupo social estable, lo que lleva a un aumento en el espacio social (Figura 2A, B). Sin embargo, la prueba de un gran número de moscas no siempre es conveniente - en ciertas circunstancias en las que el número de individuos mutantes es limitado, los investigadores no pueden ser capaces de reunir grupos de moscas lo suficientemente grandes para el tamaño estándar de la cámara de espacio social. Para facilitar la cuantificación de espacio social mediante pequeños grupos de moscas, los investigadores pueden manipular la cámara de espacio social de tal manera que la zona de la arena de dos dimensiones es menor pero la zona por la mosca se mantiene constante. Se muestra en la Figura 1C, D son dos tipos de socialescámaras espaciales modificados para grupos más pequeños, pero mantienen la misma densidad que la cámara más grande. De esta manera, manteniendo la densidad de moscas, y reduciendo el tamaño de la cámara permite obtener una separación sociales similar (Figura 2C).

Las mismas tendencias generales son válidas para las cámaras espaciales sociales colocados en posición horizontal (Figura 2D). Sin embargo, podemos observar que las moscas tienden a ser más separados en un entorno horizontal, y no conformarse con facilidad 1. Los grupos que tienen sólo 15 y 20 moscas exhiben mayor espacio social de grupos con 40 moscas (F igura 2D).

Para confirmar que el hacinamiento no era responsable de las distancias menores a la del vecino más cercano se ve en grandes grupos de moscas, la distancia de cada vuela a todas las demás moscas se midió, como en 9. La cuantificación de la distancia a todas las moscas, frente a la distancia al vecino más cercano, permite evaluar una behavi grupoo, en lugar del comportamiento de los individuos dentro de un grupo. Como era de esperar, la distancia a todas las moscas aumento como la cantidad de moscas en el grupo fue mayor, un reflejo del propio grupo, no de las moscas individuales. Esta tendencia se observó tanto vertical como horizontalmente posicionados cámaras espaciales sociales (Figura 2E, F). Por lo tanto, las moscas de los grupos más grandes no se vieron obligados a mantener una distancia más cerca de su vecino, debido a restricciones de espacio. En cambio, las moscas forman grupos sociales más estrictas cuando hay más de 15 moscas en la cámara.

En cuanto a otras pruebas de comportamiento, una limitación a la utilización de la cámara de espacio social verticalmente es que requiere moscas sin geotaxis o impedimentos de escalada. Por ejemplo, Canton-S vuela infectada durante una semana con la bacteria Gram-negativa Providencia rettgeri 23 poseen un defecto de escalada y exhiben diferentes resultados de espaciamiento social, dependiendo de la orientación de la separación socialescámaras. Cuando se realizó la prueba en posición vertical, el espacio social de las moscas infectadas fue mayor que el espacio social de los controles, probablemente porque las moscas infectadas no fueron capaces de formar un grupo estable en la parte superior de la cámara (Figura 3A). Cuando las moscas en las mismas condiciones fueron analizadas en las cámaras de espacio social orientados horizontalmente, no hubo diferencias significativas, lo que indica que la capacidad de locomoción es probablemente un factor menos importante para el espacio social en las cámaras espaciales sociales en posición horizontal (Figura 3B). Mientras que las moscas infectadas son visualmente menos capaz de subir que los controles, esto puede ser cuantificada usando el ensayo de escalada (Figura 3C). Después de 5 segundos, aproximadamente el 44% de las moscas de control se subió a la mitad superior del vial inferior y sólo el 32% de las moscas infectadas. Vale la pena destacar que todas las moscas en este ensayo suben mal (que rara vez llegan a la parte superior del vial, sólo la parte superior del vial inferior), lo que puedeexplicarse por el hecho de que son 12 días después de la eclosión, que es cuando las moscas comienzan a exhibir un defecto en la escalada debido al envejecimiento 22.

Sin embargo, para las cepas que no tienen ningún defecto de escalada, ambas orientaciones de las cámaras llevaron a los mismos resultados, como hemos demostrado anteriormente 1. En este experimento, el mismo aumento en el espacio social se observó para Canton-S y W 1118 Cs 10 en el triángulo vertical u horizontal de las cámaras circulares (Figura 3D, E - reanálisis en caja y bigotes de los datos publicados en 1). No hubo diferencias en la capacidad de subida entre Canton-S y W 1118 Cs 10 que indica que no fue un factor de la diferencia en el espacio social entre las cepas en cualquier orientación cámara (15 sec elección - Figura 3F). Si se les da 5 elección seg 17% ± 3.3 del CS y 14% ±2.5 de 1,118 w Cs 10 llegó a vial superior (no estadísticamente diferentes, datos no mostrados).

Los investigadores que utilizan la cámara de espacio social también deben garantizar que repiten sus experimentos en el mismo momento del día. Por tanto Canton-S y W 1118 Cs 10 moscas macho, la hora del día afectado interacciones sociales. En comparación con las horas del día (hora Zeitgeber - el tiempo en horas después de la aparición de la luz - ZT4 a ZT7), las moscas probados por la noche (ZT11 a ZT12 - justo antes de que las luces apagadas) mostró un mayor espacio social para ambos genotipos, aunque se conservó su diferencia espacio relativo - es decir, w 1118 Cs 10 moscas son mucho menos social que Cantón-S vuela en la noche (Figura 4A). Curiosamente, sólo el espacio social de Cantón-S machos, pero no tsombrero de las mujeres aumenta en la noche, aunque hubo una tendencia hacia una mayor variación del espacio social para las moscas hembra en la noche (Figura 4B). Anteriormente hemos hecho de forma independiente las mismas observaciones 24.

Como ya se informó el uso de una línea de Oregon-R para estudiar el efecto del bisfenol A (BPA) 2, la cámara de espacio social también es sensible a los antecedentes genéticos de Drosophila. Aquí, mostramos que Elwood, una línea de tipo salvaje recientemente capturado, había aumentado el espacio social en comparación con el Cantón-S y Samarcanda, pero no de Oregon (Figura 5). Los espacios sociales de Samarcanda y Oregon no fueron significativamente diferentes entre sí pero tanto mayor que el espacio social de Cantón-S (Figura 5). Estos datos muestran que en un entorno determinado, diferentes cepas de tipo salvaje endogámica y tienen un espacio social diferente, lo que indica un componente genético en el comportamiento. También indica que la SEnsitivity de esta prueba por lo tanto requiere que las moscas se outcrossed en bases genéticas apropiadas antes de la experimentación. Esto ayudará para asegurar las diferencias, o por el contrario las similitudes, visto en el espacio social son debido al factor está probando.

Figura 1
Figura 1. El espacio social componentes de la cámara y la disposición. (A) cámaras espaciales Social de varias dimensiones se pueden construir utilizando los mismos paneles de vidrio (17,6 cm por 17,6 cm por 0,3 cm) y espaciadores de acrílico en forma de triángulos rectángulos (con una altura de 16.5 cm, una base de 8,9 cm, y un espesor de 0,3 cm - indicado por una letra pequeña a) y rectángulos (9 cm por 1,5 cm por 0,3 cm -. indicado por una letra minúscula b) (B) La cámara de espacio social más grande, como se describe en 1 es adecuado para 30-40 moscas. Tiene dim interiorensiones de 16,5 cm por 16,5 cm por 14,5 cm, dando una superficie de 86,45 cm 2, y que conduce a un área de 2,16 cm 2 por mosca durante 40 moscas. (C) Un óptimo tamaño de la cámara durante 20 moscas. Tiene unas dimensiones internas de 16,5 cm por 14,5 cm por 5,96 cm, dando un área de 43,25 cm 2, y que conducen a un área de 2,16 cm por 2 mosca. (D) cámara más pequeña, óptimo durante 15 moscas. Tiene unas dimensiones interiores de 10.2 cm por 8.9 cm por 8.9 cm, dando una superficie de 32,45 cm 2, y que conduce a un área de 2,16 cm 2 por mosca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
La Figura 2. Orientación del tamaño de la cámara y de grupo, pero no la densidad, afecta el espacio social. Los datos se representan en una cajay bigote trama de la distancia al vecino más cercano en la cámara, con la caja que representa el 1 er cuartil (25 de por ciento) y el cuartil 3 rd (75º por ciento), la línea en el cuadro que representa la mediana, y los bigotes de Tukey . (AB) datos representativos muestra que el aumento del número de moscas dentro de una cámara del mismo tamaño lleva a mediciones espacio social estables. Grupos de 10 a 70 Canton-S masculinos moscas fueron puestos en la cámara de espacio social vertical más grande y dejaron reposar durante 30 minutos; la distancia al vecino más cercano de cada mosca se registró. Grupos que tienen menos de 15 moscas tenían espacio significativamente más social que los grupos que tienen más de 20 moscas en la gran cámara. (A) Grupos de 10 n = 9, 20 n = 9, 30 n = 8, 40, n = 8, Kruskal -Wallis test, p <0,0001, prueba de comparación múltiple de Dunn: cada letra indica grupos estadísticamente diferentes a # b p <0,0001 (B) <./ STRONG> Grupos de 15 n = 6, 40 n = 8, 50 n = 5, 60 n = 6, 70 n = 5, Kruskal-Wallis test, p <0,0001, a # b p <0,001. (C) cuando la tamaño de la cámara se ajusta para mantener la densidad de mosca (respectivamente 15 en la pequeña, 20 en medio o 40 en gran cámara, cada vez a una densidad de 2,16 cm 2 por mosca, no se observa ninguna diferencia significativa cuando se ensaya verticalmente. (D ) Pero cuando estas cámaras espaciales sociales se colocan horizontalmente grupos que tenían 15 o 20 moscas tenían una mayor distancia al vecino más cercano en comparación con los grupos con 40 moscas (Grupos de 15 n = 3, 20 n = 4, 40 n = 4, Kruskal -Wallis test, p <0,0001, de comparación múltiple de Dunn probar un # b p <0,01) (F-E) La distancia a todas las moscas se midió para grupos de 15, 20 y 40 machos Canton-S moscas colocado en vertical y. orientada horizontalmente cámaras. Cuanto mayor sea la cantidad de moscas en la cámara, mayor es la distancia a todosmoscas ((E): grupos de 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test, p <0,0001, de comparación múltiple de Dunn probar un # b p <0,01; (F): grupos de 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test, p <0,0001, de comparación múltiple de Dunn probar un # b # c p <0,0001). Nota: (A, B y CF) muestran los datos obtenidos en en 3 regiones geográficas diferentes y por lo tanto diferentes entornos de laboratorio (A) Región 1: UCLA, Los Ángeles, CA, (B) de la Región 2:. York College, Nueva York, NY; (CF) Región 3:. Universidad de Western, London, ON Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Orientación of la cámara de espacio social se puede utilizar para control de la confusión geotaxis problemas (A - C):. Grupos de 40 varones Canton-S moscas que o bien fueron infectadas con P. rettgeri durante siete días o inyectado con los medios de comunicación como control se pusieron en una cámara de espacio social, ya sea vertical (A) u horizontal (B) coloca y se deja reposar durante 30 min. La distancia al vecino más cercano de cada mosca se registró. Los datos se representan en una caja y bigote trama de la distancia al vecino más cercano en la cámara, con la caja que representa el 1 er cuartil (25 de por ciento) y el cuartil 3 rd (75º por ciento), la línea en el cuadro que representa la mediana, y los bigotes de Tukey. (A) Datos Representante muestra un aumento en el espacio social para las moscas que están infectados con P. rettgeri y se coloca en una cámara de espacio social en posición vertical,en comparación con la inyección de medios de comunicación (prueba de Wilcoxon-Rank: cada letra indica grupos estadísticamente diferentes p <0,0001, n = 6) (B) Datos Representante muestra el espacio social no se ve afectada por P.. infección rettgeri cuando las moscas se colocan en una cámara de espacio social dispuesta horizontalmente (Wilcoxon-rank test: p> 0,1, n = 5) (C) Un aparato de contracorriente se utilizó para evaluar el comportamiento de escalada de ambos moscas infectadas y de control de los medios de comunicación.. Moscas infectadas suben más mal que sus controles de medios (moscas ~ 12 días de edad, el gráfico representan la media índice de rendimiento ± SEM:% de moscas en medio superior del vial a elección 5 seg; dos colas t-test con corrección de Welch; n = 6 de ~ 60 moscas, cada letra indica grupos estadísticamente diferentes p = 0,08) (D - F):. cámaras verticalmente y horizontalmente, ya sea triangulares o circulares, se utilizaron para comparar el espacio social de Cantón-S (CS) conla de w 1118 Cs 10 (W). Los datos se representan en una caja y bigote trama de la distancia al vecino más cercano en la cámara, con la caja que representa el 1 er cuartil (25 de por ciento) y el cuartil 3 rd (75º por ciento), la línea en el cuadro que representa la mediana, y los bigotes de Tukey. En tanto espacio social orientaciones de cámara y formas, w 1118 Cs 10 tenido un mayor espacio social de Cantón-S ((D), triángulo verticales: prueba de Kruskal-Wallis, cada letra indicar grupos estadísticamente diferentes p <0,0001, (E), círculo horizontal: la prueba de Kruskal-Wallis, cada letra indica grupos estadísticamente diferentes p <0,01). (F)) Un aparato de contracorriente se utilizó para evaluar el comportamiento de escalada de ambos Canton-S y W 1118 Cs 10cepas (moscas de 3-5 días de edad, el gráfico representan la media ± SEM índice de rendimiento:% de moscas en la parte superior del vial en 15 elección seg). No hubo diferencias en la capacidad entre cualquiera de Cantón-S o w 1118 Cs 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
La Figura 4. Se aumenta el espacio social de los varones durante la noche. (A) Datos Representante muestra un aumento del espacio social entre moscas macho durante las horas de la tarde ("tarde" ZT 11-12, antes de luces) en comparación con las horas del medio día ("día "ZT 4-7). Grupos de 40 Canton-S moscas y w 1118 Cs 10moscas se pusieron en una cámara de espacio social en cualquiera de las horas del día o en horas de la tarde y se dejó sedimentar durante 30 minutos. La distancia al vecino más cercano de cada mosca se registró. Para ambos genotipos, moscas aumento de espacio social de la tarde y las diferencias entre las cepas se mantuvieron independientemente de la hora del día (n = 6-7, Kruskal-Wallis test, p <0,0001, prueba de comparación múltiple de Dunn: cada letra indican grupos estadísticamente diferentes p < 0,01). (B) Cuando Canton-S moscas fueron separados por sexo sólo los hombres han mostrado un incremento en el espacio social de la tarde (t p <0,01), a pesar de una tendencia no significativa para la mayor variación interna se ve en las mujeres (Kruskal -Wallis prueba, cada letra indica grupos estadísticamente diferentes p <0,0002). Los datos se representan en una caja y bigote trama de la distancia al vecino más cercano en la cámara, con la caja que representa el 1 er cuartil (25 de por ciento) y la 3cuartil rd (75º por ciento), la línea en el cuadro que representa la mediana, y los bigotes de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
La Figura 5. Antecedentes genéticos de moscas afecta el espacio social. Grupos de 40 Canton-S, Samarcanda, Oregon y Elwood moscas se pusieron en una cámara de espacio social y se deja reposar durante 30 min. Se registró la distancia al vecino más cercano de cada vuelo. Las distribuciones de los grupos son diferentes (prueba de Kruskal-Wallis, p <0,0001), grupos que no comparten una letra común son significativamente diferentes. Los datos se representan en una caja y bigotes pGran parte de la distancia al vecino más cercano en la cámara, con la caja que representa el 1 er cuartil (25 de por ciento) y el cuartil 3 rd (75º por ciento), la línea en el cuadro que representa la mediana, y los bigotes de Tukey (Dunnet de prueba de comparación múltiple, p <0,05 [d], p <0,001 [a, b, c], 3 repeticiones independientes con 1-2 repeticiones internas, de tal manera que para Elwood y Samarcanda n = 3, Oregon y Cantón-S n = 4 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En este protocolo, se describe un procedimiento detallado para la cuantificación del espacio social. Algunos pasos cruciales para asegurar el experimento tiene éxito son: 1) Siempre use guantes al limpiar y configurar el aparato, para mantener sus propios aceites y aromas de la cámara interior del aparato, 2) asegurarse de moscas se recogen al menos un día antes el experimento para reducir los posibles efectos de la anestesia frío, 3) 2 h antes del experimento proporciona nuevos viales que contienen los alimentos frescos para asegurar que las moscas no se morían de hambre, y se han limpiado a sí mismos, 4) Durante estos 2 horas, dejar que las moscas aclimatarse a su nuevo entorno, 5), tenga en cuenta las condiciones de temperatura y humedad al realizar experimentos; tratar de mantenerlos consistente entre 24 a 25 ° C y 50% de humedad, 6) asegurarse de no perturbar las cámaras espaciales sociales mientras se ejecuta el experimento, y 7) realizar el experimento a la misma hora del día, preferentemente entre el tiempo Zeitgeber ZT4 y ZGT7.

El espacio social sólo depende de la densidad de las moscas dentro de la cámara, y no depende del tamaño del grupo, siempre y cuando hay un tamaño mínimo grupo conocido.Las moscas mantendrán la misma separación social entre sí mismos, independientemente de la cantidad de miembros del grupo. Sin embargo, la distancia a todas las moscas en la cámara, como se esperaba, se ve afectada por el tamaño del grupo, así como la orientación de la cámara. Es importante señalar que a pesar de la orientación horizontal de ser difícil de usar (moscas no se conforman con la misma facilidad), y que conduce a la separación reducida entre los genotipos en nuestras manos (Figura 3D en comparación con 3E), Burg et al. 3 utilizado con éxito una horizontal , cámara cuadrada. En sus experimentos, la distancia más cercana a la vecina era más similar a nuestros resultados orientados verticalmente espacio social. Sin embargo, en su habitación, había un flujo de aire continuo que puede haber contribuido a espaciado de los grupos sociales de las moscas es más similar a nuestra cámara vertical en vez de nuestra cámara horizontal. Una limitación al uso de cámaras verticales es la capacidad de probar Drosophila que tienen mobiliimpedimentos ty. La cámara de espacio social requiere las moscas a ser móviles para que puedan elegir a qué distancia de su vecino que desean ser. Si las moscas estaban inmóviles o tenían déficit de alguna manera, es posible que no sean capaces de formar grupos estables correctamente en la cámara. Un remedio potencial para pobres locomoción sería luego usar cámaras horizontales, o para permitir más tiempo para las moscas se asienten antes de tomar la fotografía. Los investigadores también deben evaluar la capacidad de subida y los posibles impedimentos geotáctico de moscas para ver si la cámara de espacio social vertical es apropiado. Si hay déficit en cualquiera de estos, cámaras en posición horizontal se pueden utilizar para evitarlos.

Es de destacar que si la escalada actividad o la resistencia general y la salud de la mosca afectará a la medición del espacio social, se muestra que los niveles de actividad o de locomoción no están correlacionados con el espacio social. En otro estudio, se muestra que un tratamiento que disminuye la locomoción, (alimentación BPA) también disminuyen socialesespacio 2. Pero mutantes de rugoso (una Drosophila ortholog del gen neurobeachin candidato autismo) pantalla hiperactividad y aumento de espacio social 4. Por último, las moscas mutantes blancos muestran un aumento en el espacio social 1,3, sin ningún aumento en la locomoción o geotaxis 18. En resumen, varias combinaciones de nivel de actividad y el espaciamiento social, se han observado hasta el momento, indicando que no hay correlación entre los dos comportamientos. De hecho, el espacio social no necesariamente se correlacionan con otros comportamientos sociales, ya sea, como la evitación social 8,25, lo que sugiere diferentes circuitos neuronales subyacentes. Por ejemplo, los mutantes de pantalla rugosa / neurobeachin aumentaron espacio social y la reducción de evitación social 4; pero el blanco ha aumentado tanto en el espacio social, y muy fuerte evitación social 4.

Como el tiempo de día afecta espacio social, al menos en los hombres, es critical que los investigadores son conscientes de la hora del día cuando sus experimentos se realizan y se hace un esfuerzo para mantener una constante de tiempo para todos los experimentos. Otras consideraciones que deben ser contabilizados incluyen la edad, el sexo y el estado de apareamiento de las moscas. Sabemos que la distancia social es mayor en comparación con virgen individuo acoplado, tanto para hombres y mujeres 1, y que ahora muestran que los hombres son menos estrecha que las mujeres en la noche (Figura 4B). Cuele diferencias sexuales específicas en los niveles de actividad de las moscas individuales durante el día ha sido previamente descrito, proponiendo que los hombres mayores la actividad locomotora en la mañana y por la noche en comparación con el día podría estar relacionado con su comportamiento de cortejo 26,27. Sin embargo, en nuestro caso, los sexos son separados, pero las moscas se agrupan, y para el momento en que medimos su espacio social, las moscas se han asentado. Fujii et al. 27 informe que el ritmo circadiano en parejas de macho mantieneen conjunto tienen un ritmo diario irregular, sin picos claros, cuando el ritmo de pares femeninos se parecen a la de las moscas individuales. Por lo tanto, el aumento de la distancia en los hombres en la noche es, probablemente, no está relacionado con un aumento en el comportamiento de cortejo o aumento específico en la actividad locomotora, y la razón que subyace al dimorfismo sexual de este comportamiento hay que investigar más.

Teniendo esto en cuenta, las moscas siempre deben estar separados por sexo para el experimento por lo que las diferencias en la interacción social entre hombres y mujeres se pueden ver. Finalmente, por el momento no sabemos todavía cómo la edad afecta a las interacciones sociales de moscas. Por lo tanto, se recomienda que los experimentos espaciales sociales se llevan a cabo con las moscas no más de siete días, como diversas actuaciones de comportamiento, incluyendo la actividad de escalada se sabe que se verá afectada de moscas más de una semana de edad 22.

Una consideración final para el espacio social es las variaciones observadas en la medianadistancia social. Mediciones espaciales Sociales fueron tomadas de varios lugares, entre ellos (Los Angeles, CA: Figura 2A; Nueva York, Nueva York: La figura 2B, la figura 3D, la Figura 4, Figura 5; London, ON: Figura 2C-F, Ithaca, Nueva York: Figura 3A, B, todo en el mismo Cantón-S de fondo). Desconocido variables que no eran constantes entre ubicaciones geográficas, o la configuración de laboratorio, afectaron a la distancia social media. Factores posibles incluyen diferentes alimentos, la elevación, la presión atmosférica en sí mismo, y cambios en la presión atmosférica 28. Aunque las medianas no fueron constantes entre los lugares, dentro de una ubicación las medianas son altamente constante y reproducible; y las tendencias y patrones observados en las mediciones espaciales sociales permanecieron iguales entre ubicaciones. Por lo tanto, siempre y cuando los investigadores mantienen constantes las condiciones internamente, que será unable para detectar diferencias en el espacio social.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Jazz-mix Fisher 33545 any other standard drosophila food would work
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
 Sharpie pens
Adhesive Tape
Medium size binder clips Staples to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity
small SupportStands Carolina  707161 to hold the chambers in a vertical orientation
Buret clamps Carolina 707362
Digital Camera Nikon  Coolpix S8000  to take the still pictures
small ruler to be able to scale the picture
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
pounding pad any mouse pad works.
Prism 6 GraphPad Software Inc. Prism 6 for Mac OS X Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila.: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
  2. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on the behavior of Drosophila melanogaster. - Potential use of Drosophila as a model in the study of neurodevelopmental disorders. Behavioural Brain Research. (2015).
  3. Burg, E. D., Langan, S. T., Nash, H. A. Drosophila social clustering is disrupted by anesthetics and in narrow abdomen ion channel mutants. Genes Brain Behav. 12, 338-347 (2013).
  4. Wise, A., et al. The autism candidate gene Neurobeachin (Rugose) mutants in Drosophila exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurosci. 1-9 (2015).
  5. Parrish, J. K., Edelstein-Keshet, L. Complexity, pattern, and evolutionary trade-offs in animal aggregation. Science. 284, 99-101 (1999).
  6. Sokolowski, M. B. Social interactions in ‘‘simple’’ model systems. Neuron. 65, 780-794 (2010).
  7. Rittschof, C. C., Robinson, G. E. Genomics: moving behavioural ecology beyond the phenotypic gambit. Animal Behaviour. 92, 263-270 (2014).
  8. Fernandez, R. W., et al. Straightforward assay for quantification of social avoidance in Drosophila melanogaster. JoVE. (94), e52011 (2014).
  9. Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila. social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
  10. Mogilner, A., Edelstein-Keshet, L., Bent, L., Spiros, A. Mutual interactions, potentials, and individual distance in a social aggregation. J Math Biol. 47, 353-389 (2003).
  11. Liu, L., Davis, R. L., Roman, G. Exploratory activity in Drosophila requires the kurtz nonvisual arrestin. Genetics. 175, 1197-1212 (2007).
  12. Soibam, B., et al. Open-field arena boundary is a primary object of exploration for Drosophila. Brain Behav. 2, 97-108 (2012).
  13. Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology - A laboratory Manual., Ch. Cold Spring Harbor Press. 475-481 (2010).
  14. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
  15. Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 1, 2nd, IRL Press. 265-317 (1998).
  16. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
  17. Rasband, W. S. ImageJ. US National Institutes of Health. Maryland, U.S.A. (1997).
  18. Simon, A. F., et al. Drosophila, vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  19. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila .dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. JoVE. (74), e50339 (2013).
  20. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila. models of neurodegeneration. JoVE. e2504 (2011).
  21. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  22. Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster. with age. Mech Ageing Dev. 127, 647-650 (2006).
  23. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. JoVE. (2015).
  24. Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, Washinton D.C., (2013).
  25. Suh, G. S. B., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  26. Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster.--Sex-specific differences suggest a different quality of activity. J. Biol. Rhythms. 15, 135-154 (2000).
  27. Fujii, S., Krishnan, P., Hardin, P. E., Amrein, H. Nocturnal male sex drive in Drosophila. Curr Biol. 17, 244-251 (2007).
  28. Pellegrino, A. C., et al. Weather forecasting by insects: modified sexual behaviour in response to atmospheric pressure changes. PLoS One. 8, e75004 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics