Condições que afetam Espaço Social em

Neuroscience

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McNeil, A. R., Jolley, S. N., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Milunovich, A. J., Chambers, M. C., Simon, A. F. Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (105), e53242, doi:10.3791/53242 (2015).

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Abstract

O ensaio aqui descrito espaço social pode ser utilizado para quantificar interacções sociais de Drosophila melanogaste R - ou outros insectos pequenas - de uma maneira simples. Como já foi previamente demonstrada 1, numa câmara de bi-dimensional, que primeiro forçar as moscas para formar um grupo compacto, subsequentemente, o que lhes permite levar a sua distância preferida entre si. Depois de ter resolvido as moscas, medimos a distância para o vizinho mais próximo (ou espaço social), o processamento de uma imagem estática com o software on-line gratuito (ImageJ). A análise da distância para o vizinho mais próximo permite aos pesquisadores determinar os efeitos de fatores genéticos e ambientais sobre a interação social, enquanto controlando para possíveis fatores de confusão. Diversos fatores, como capacidade de subida, hora do dia, sexo e número de moscas, pode modificar o espaçamento social das moscas. Nós, assim, propor uma série de controlos experimentais para mitigar esses efeitos de confusão. Este ensaio podeser utilizado para, pelo menos, duas finalidades. Primeiro, os pesquisadores podem determinar a forma como a sua mudança ambiental favorito (como o isolamento, temperatura, estresse ou toxinas) terá impacto social, espaçamento 1,2. Em segundo lugar, os pesquisadores podem dissecar as bases genéticas e neurais desta forma básica de comportamento social 1,3. Especificamente, ele foi usado como uma ferramenta de diagnóstico para estudar o papel de genes ortólogos que estariam envolvidas no comportamento social em outros organismos, tais como genes candidatos para o autismo em humanos 4.

Introduction

As interações sociais são cruciais para o bom desenvolvimento e saúde dos indivíduos dentro de um grupo como um todo, e pode ser observado através de numerosas espécies, a partir de seres humanos (Homo sapiens) para os organismos mais simples, como as moscas da fruta (Drosophila melanogaster) 5,6. Uma mosca da fruta indivíduo ou meios comuns de compartilhamento humano para processar a informação sensorial durante essas interações, quer seja: auditiva, visual, olfativa, tátil, ou gustação. Nós e outros a hipótese de que há uma neurocircuitry potencialmente compartilhada subjacente respostas comportamentais a interações sociais e que as células neuronais e genes envolvidos pode ser conservada evolutiva 7. Uma vez que a interação inicial ocorreu, o espaço social entre os indivíduos que interagem vão quer aumento (evitação social 8) ou diminua (formação de grupos / agregação 5). Interações mais complexas, como agressividade ou namoro, pode então ter lugar.

​​de Drosophila melanogaster, como usado nos seguintes estudos 1-4,9. O espaço social refere-se a uma medida da distância entre uma mosca e seu vizinho mais próximo 10. O espaço social é consistente para uma dada população de D. melanogaster, quando as condições experimentais são preservadas (média de aproximadamente 1-2 comprimentos dentro do corpo), e varia em relação à experiência social das moscas, aumentando, se o indivíduo tenha sido mantidos em isolamento 1. Visão adequada é necessária para manter a distância social normal, mas não odorants clássicos ou CVA percepção 1. Medida do espaço social pode, portanto, serutilizado como uma ferramenta de diagnóstico para analisar as interacções sociais e quantificar o comportamento social em D. melanogaster 1. Nós descrevemos aqui em detalhes como realizar essa quantificação, e em que medida variáveis ​​experimentais comuns afeta este comportamento.

Mostra-se que a orientação da câmara em que o ensaio é realizado, bem como o número de moscas - a uma extensão - fazer afecta espaço social. Foi previamente mostrado que a geometria da câmara afeta o movimento espontâneo exploratório de moscas 11,12, e este fenômeno pode vir a ter impacto sempre que decidam estabelecer. No entanto, desde que a densidade de mosca (mosca / cm 2) e a orientação da câmara é mantida a mesma, o espaço social das moscas também permanece constante. A robustez do presente ensaio é ilustrada pelo facto de que os laboratórios independentes utilizando diferentes tamanhos de câmara, forma e orientação pode replicar o resultado apresentado por mutantes do whgene ite (que afectam a pigmentação dos olhos), que é um espaço social aumento (triângulo vertical ou horizontal em um círculo, quadrado horizontal com o fluxo de ar em 3).

Nossos resultados também indicam que a manutenção do momento em que o experimento espaço social é realizada é fundamental para a consistência dos resultados, como mostramos que machos, mas não fêmeas, são mais distantes à noite. No entanto, as diferenças observadas entre diurnas e noturnas horas não são devidas às diferenças das moscas de atividade, e discutimos argumentos indicando que os níveis de atividade não são correlacionados com o espaço social.

Finalmente, existem bases genéticas para a determinação do espaço social, como indicado pelo mutante branco já descrito 1,3, e as diferenças entre várias estirpes puras e selvagens capturados de moscas que apresentamos aqui.

Por isso, este ensaio é uma excelente ferramenta fou estudando os efeitos da genética, bem como fatores ambientais.

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Protocol

1. Equipamentos e Reagentes Criado In-house (Veja a lista de materiais para outros)

  1. Prepare um aparelho de anestesia frio Drosophila como descrito anteriormente 8.
  2. Preparar um aspirador de mosca como previamente descrito 13.
  3. Prepare câmaras espaço social e titulares.
    1. Ordenar ou fazer painéis de vidro e espaçadores de acrílico para criar as câmaras espaço social. Cada câmara de espaço social consiste em dois painéis de vidro quadrados (17,6 cm por 17,6 cm, com uma espessura de 0,3 cm), dois espaçadores de acrílico triângulo direita (com uma altura de 16,5 cm, uma base de 8,9 cm, com uma espessura de 0,3 cm ), e dois espaços rectangulares (9 cm por 1,5 cm com uma espessura de 0,3 cm) (Figura 1A).
    2. Montar o vidro e a câmara de espaço social acrílico de tal forma que ela é idêntica à câmara na Figura 1B. Para fazê-lo, começar por colocar um espaçador triangular plana no topo de um painel quadrado de vidro de tal modo que o ângulo rectodo espaçador triangular está alinhada com um dos cantos do painel quadrado. Em seguida, coloque o segundo espaçador triangular plana na parte superior do painel quadrado, espelhando o primeiro espaçador triangular.
      NOTA: Certifique-se de usar luvas para não contaminar as peças com óleos e aromas de suas mãos.
    3. Colocar duas pequenas espaçadores rectangular plana no topo do painel quadrada, ao longo do lado do painel que não é coberta. Os espaçadores de acrílico na parte superior do avião quadrado deve agora formar uma arena triangular.
    4. Coloque um segundo painel quadrado de vidro no topo dos espaçadores acrílicos de tal forma que ele está alinhado acima do painel de vidro originais abaixo.
    5. Use quatro grampos da pasta para fixar os painéis e espaçadores em conjunto para formar a câmara de espaço social. Coloque um grampo próximo do canto, sobre o lado mais longo de cada um dos espaçadores triangulares, prendendo-os no interior das chapas de vidro. Em relação a estes mesmos lados, coloque um clipe no canto adjacente, sobre cada um dos espaçadores rectangulares, prendendo-os emno lado as vidraças.
    6. Montar um cavalete de suporte, e um balão de braçadeira de tal modo que o grampo irá manter a câmara de espaço social numa posição vertical, como a câmara de espaço social repousa sobre o seu bordo na parte superior da superfície de trabalho.
    7. Para cada repetição do experimento, montar uma câmara de espaço social e apoio de pé.
  4. Prepare um aparelho de resposta do ensaio escalada para verificar a capacidade de escalada das moscas testados.
    1. Usar um aparelho em contracorrente, como anteriormente descrito 14,15.
  5. Assegurar que as condições de iluminação homogénea, realizando a experiência com uma superfície de trabalho coberto com uma tampa de bancada branca e em frente de um fundo branco.

2. Preparar as moscas antes da Experiência

  1. Manter moscas em frascos contendo padrão mosca Drosophila alimentos. Mantenha-os numa câmara de incubação a 25 ° C num ciclo luz / escuro de 12 horas de luz.
  2. Um a dois dias antes de a eXperiment, recolher e sexo voa sob anestesia frio, como descrito anteriormente 8.
    1. Resfriar o aparelho de anestesia frio de -4 ° C. Lugar voa para 50 ml tubos de plástico. Totalmente submergir os tubos de plástico contendo moscas em gelo em um balde de gelo isolado, aguarde pelo menos 5 minutos para moscas para se tornar imóvel.
    2. Coloque as moscas na folha de polietileno do aparelho de anestesia frio. À TA, utilizar um estereomicroscópio para separar os machos das fêmeas. Manter moscas, em grupos, em frascos contendo padrão mosca Drosophila comida, não superior a 40 moscas por frasco.
  3. Duas horas antes do início da experiência, assegurar que a temperatura da sala onde a experiência é realizada será entre 24-25 ° C e com uma humidade de aproximadamente 50%.
  4. Transferir as moscas em novos frascos contendo comida, e coloque-os durante 2 horas sobre a superfície de trabalho, onde a experiência será executada.
    NOTA: Para estas experiments, as linhagens de moscas utilizados foram estirpes de Drosophila melanogaster: Canton-especiais ou Canton-S (CS), w 1118 Cs 10 (ou W - w 1118 outcrossed 10 vezes a Canton-S), Oregon e Samarkand moscas foram todos do nosso laboratório stocks 16; Elwood moscas foram coletadas no Outono de 2011 no bairro de Elwood de Huntington, em Long Island, Nova York, EUA 8. Além quando especificado em contrário, os resultados apresentados foram obtidos com Canton-S moscas (em tons de vermelho).

3. a realização do experimento

  1. Realizar o experimento doze horas - três horas (tempo Zeitgeber - o tempo em horas após o início da luz - de ZT 4-7).
  2. Prepare a câmara de espaço social para a transferência de moscas.
    1. Coloque um apartamento câmara espaço social em uma superfície de trabalho, com o lado que contém espaçadores rectangulares mais próximos ao seu corpo.
    2. Remover one clipe mais próximo de seu corpo e deslizar um espaçador rectangular para o exterior, criando uma lacuna de cerca de 1 cm entre os espaçadores rectangulares.
    3. Usando fita e um marcador, rotular a câmara de espaço social em um canto superior com o sexo, estirpe, e número de repetição. Tome cuidado para garantir a fita não cobre parte da arena triangular interior.
  3. Transferir as moscas na câmara espaço social.
    1. Transferência voa de seu frasco contendo alimentos em um novo frasco vazio. Aspirar voa do frasco vazio e transferi-los para a câmara de espaço social.
      1. Inalar para desenhar as moscas dentro da ponta do aspirador. Colocar a ponta no 1 cm lacuna entre os espaçadores rectangulares da câmara de espaço social e exalar, a uma taxa consistente para forçar as moscas para a arena triangular interna.
      2. Deslize imediatamente o espaçador rectangular de volta no lugar, fechando a base da arena triangular interior, e coloque o grampo da pasta novamente.
    2. Em uma almofada batendo, que está localizado no banco diferente de onde o trabalho experimental tem lugar, segurar a câmara de espaço social na posição vertical de modo a que os espaçadores são rectangulares na parte inferior. Libra três vezes para assegurar que todas as moscas ter caído para a parte inferior da arena.
      NOTA: Devido ao espaçador acrílico saindo do menor tamanho de câmara (Figura 1D), bang cotovelos na superfície de trabalho, mantendo uma fixação segura no aparelho, para garantir as moscas caíram para o fundo.
    3. Iniciar um temporizador.
    4. Coloque a câmara de espaço social na superfície de trabalho e usar o apoio e suporte de balão braçadeira para mantê-lo na posição vertical. Coloque uma régua ou uma etiqueta de comprimento conhecido plana contra a câmara de espaço social, mas não abrangendo qualquer parte da arena triangular interior.
      1. Para experiências posicionadas horizontalmente, não coloque a câmara de espaço social no stand de apoio; em vez colocar a câmara plana espaço social na superfície de trabalho.
      2. Quando as moscas se instalaram, geralmente após cerca de 30 minutos, tirar uma foto da câmara de espaço social. Certifique-se que o quadro contém toda a arena interior triangular, o governante, eo rótulo.
      3. Repita a experiência de cada genótipo e da condição (idealmente 3 repetições internas e 3 repetições independentes).

      4. Analisando os Dados Espaço Social

      1. Importe os seguintes Macros em ImageJ 17
        1. ImageJ está disponível aqui: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
        2. Você pode criar um comando 'Distâncias Medidas "no menu Plugins, salvando as macros abaixo em um arquivo chamado' Measure_Distances.txt 'na pasta ImageJ / plugins, na subpasta macro, e usando Ajuda> comando Menus Update'.
        3. Cópia em um arquivo .txt as macros que são fornecidos em dados suplementares e foram originalmente publicados em três.
      2. Upload de imagens para um computador, e abra um picture usando ImageJ.
        1. Criar uma escala desenhando uma linha a partir dos 0 cm a 1 cm de marcas na régua na imagem, e sob a guia Analisar, escolha o recurso Escala Definir para definir uma escala de 1 cm para que a distância (mesma abordagem para o adesivo de comprimento conhecido). Escolha a opção global antes de aplicar a escala para a imagem.
        2. Recortar a imagem usando a função Corte sob a guia Imagem de tal forma que inclui todas as moscas, ao remover tanto quanto do resto da imagem possível.
        3. Fazer o retrato preto e branco, escolhendo 8-bit a partir da opção Tipo na guia Imagem.
        4. Remova todo o ruído de fundo da imagem, indo para o recurso Threshold sob a opção de Ajuste da guia Imagem. Arraste as barras deslizantes para melhorar ou remover o contraste para que o corpo de cada mosca pode ser visto claramente, sem quaisquer outras marcações na imagem. Se houver marcas que não são moscas, capturá-los com a ferramenta rectangular e excluí-los.
        5. Colocou omedições usando a ferramenta Definir Medidas sob a guia Analisar. Selecione Area, Centro de Massa, Centroid, e Rótulo de Exibição. Em seguida, escolha as partículas Analisar apresentam sob a guia Analisar para criar uma lista numerada de todos os pontos negros representam moscas.
          1. Ao utilizar partículas Analise; set tamanho 0,01-0,1 (não escolher unidade pixel); circularidade 0,00-1,00; mostrar contornos; apresentar resultados, e adicionar a gerente.
          2. Certifique-se de que cada mancha preta (cada partícula) é uma representação precisa das moscas que estão na imagem original, através da comparação da lista numerada para a imagem original.
            NOTA: Se algumas moscas que estão muito perto em conjunto que está sendo contado como uma partícula, desenhar manualmente uma linha em branco para separar as duas moscas na imagem binária.
        6. Enquanto a lista está seleccionada, utilize o vizinho mais próximo - Lista Distâncias macro sob a segunda opção Macros na aba Plug-ins para criar uma nova lista contendo as distâncias, em centímetros, a partir da EAch voar para o seu vizinho mais próximo.
      3. Copie as distâncias vizinhos mais próximos de ImageJ e colar em uma coluna de um programa de planilha.
        1. Compilar todos os dados de cada repetição na mesma planilha e organizar pelo genótipo e condição.
      4. Executar análise de dados usando o software estatístico. Neste experimento, Graph Pad Prism (versão 6 para MacOSX, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com) foi utilizado para realizar one-way ANOVA e testes de Kruskal-Wallis, Tukey e de post-hoc testes de Dunnet.
      5. A distribuição das distâncias segue uma distribuição não paramétrica 1, e os dados estão representados como a caixa de bigodes e Tukey (para eliminar valores extremos).

      5. Escalada Assay (Comportamento de Controle)

      1. Use um ensaio escalada como um controle para moscas de teste de escalada capacidade 14,15,18.
        1. Use o aparelho em contracorrente de tal forma que três ensaios cum ser executado em paralelo.
      2. Transferência de 50 a 100 moscas virgens de tratamento (moscas que não tenham sido testadas antes) em três frascos de ensaio diferentes, e encaixá-los no 1º, 3º e último ranhuras na parte inferior do aparelho em contracorrente, com frescos frascos vazios nos locais opostos.
      3. Coloque fresco, em frascos vazios os espaços vazios na parte inferior do aparelho.
      4. Toque para baixo do aparelho de três vezes, de modo a que todas as moscas estão na parte inferior de cada tubo, para iniciar a experiência.
      5. Inicie o cronômetro para 15 segundos (tempo suficiente para ~ 100% de 3-7 dias de idade Canton-S para chegar ao topo vial - veja a Figura 3F).
      6. Deslize a porção superior do dispositivo de contra-corrente, para deslocar os melhores frascos por uma ranhura.
      7. Recolha moscas tocando no aparelho para baixo, para trazer todas as moscas nos frascos de fundo.
        1. e 2 tubos nd (ou e 4º, 5º 6º) correspondem, respectivamente, as moscas que não atingiram a parte superior e as moscas que atingiram o topo do frasco.
      8. Calcule o Índice de Desempenho (PI).
        1. Contar o número de moscas em cada frasco.
        2. O PI é a percentagem de moscas capaz de subir no tubo superior.
        3. Os meios de PI seguem uma distribuição normal 1, e os dados são representados como gráficos de coluna de média mais ou menos o erro padrão da média (SEM).
          NOTA: Como alternativa, o PI pode ser calculada como a percentagem de moscas que possam atingir a parte superior do frasco inferior (por moscas mais velhos, 5 segundos é o tempo suficiente para quantificar a diferença na escalada capacidade entre infectado e não infectado 12 dias de idade Canton-S quantificados a partir de uma imagem estática: ver resultados). Outros usaram diferentes medidas de desempenho em geotaxis negativos induzida por sobressalto, que também são apropriados para quantificar escalada capacidade 19-22.

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Representative Results

A câmara de espaço social pode ser usado como uma ferramenta para quantificar o comportamento social de Drosophila melanogaster. Espaçadores acrílico e chapas de vidro são cortadas em conjunto para formar uma arena triangular interna que proporciona uma área bidimensional em que voa podem formar grupos estáveis ​​sem a presença de diversos estímulos potencialmente de confusão. Quando as moscas são transferidos para a arena vertical, eles são surpreendidos por ser batido para baixo, e eles respondem por um comportamento de fuga: geotaxis negativos. Eles subir para o vértice do triângulo na vertical, forçado a um grupo apertado, e, em seguida, são proporcionados para movimentar ainda mais tempo formar uns aos outros, e para explorar a arena. Após 20 a 40 min, eles param de se mover, e um grupo estável é formado. A distância entre cada mosca e seu vizinho mais próximo pode ser medido a partir de uma foto, para fornecer uma quantificação de seu espaço social preferida. As moscas são considerados como sendo mais social quanto mais perto estão os seus vizinhos.

Moscadensidade não desempenha um papel no espaço social na câmara até que o ponto de sub-capacidade. Para um grande grupo de 20 a 70 moscas na câmara verticalmente orientada para o maior, o espaço social é independente da densidade grupo (Figura 2A, B). Com apenas 10 ou 15 moscas na câmara de espaço social, não é mais provável indivíduos suficientes para formar um grupo social estável, levando a um aumento no espaço social (Figura 2A, B). No entanto, a testar um grande número de moscas nem sempre é conveniente - em certas circunstâncias em que o número de indivíduos mutantes é limitado, os pesquisadores podem não ser capaz de coletar grupos de moscas grandes o suficiente para o tamanho padrão da câmara de espaço social. Para facilitar a quantificação espaço social usando pequenos grupos de moscas, os pesquisadores podem manipular a câmara espaço social de tal forma que a área da arena bidimensional é menor, mas a área por mosca permanece constante. Mostrado na Figura 1C, D são dois tipos de sociaiscâmaras espaciais modificado para grupos menores, mas manter a mesma densidade que a câmara maior. Desta maneira, mantendo-se a densidade da mosca, e reduzir o tamanho da câmara permite obter um afastamento social semelhante (Figura 2C).

As mesmas tendências gerais são verdadeiras para câmaras espaço social colocados na posição horizontal (Figura 2D). No entanto, podemos observar que as moscas tendem a ser ainda mais distante de tal cenário horizontal, e eles não se contentar com facilidade 1. Grupos que têm apenas 15 e 20 moscas exibem maior espaço social de grupos com 40 moscas (F IGURA 2D).

Para confirmar que a superlotação não foi responsável pelas distâncias menores para o vizinho mais próximo visto em grupos maiores de moscas, a distância a cada voar para todas as outras moscas foi medido, como em nove. Quantificar a distância de todas as moscas, em função da distância ao vizinho mais próximo, permite avaliar um grupo behaviou, em vez de o comportamento de indivíduos dentro de um grupo. Como esperado, a distância de todas as moscas aumentados como a quantidade de moscas do grupo era maior, uma reflexão do próprio grupo, não das moscas individuais. Esta tendência foi observada para ambas as câmaras espaço social vertical e horizontalmente posicionado (Figura 2E, F). Portanto, as moscas de grupos maiores não foram forçados a manter uma distância mais perto de seu vizinho devido a restrições de espaço. Em vez disso, as moscas formar grupos sociais mais apertados quando existem mais do que 15 moscas na câmara.

Como para outros testes comportamentais, uma limitação ao uso da câmara de espaço social verticalmente é que ele requer moscas sem geotaxis ou deficiências de escalada. Por exemplo, Canton-S moscas infectadas durante uma semana com a bactéria Gram-negativa Providencia rettgeri 23 possuem um defeito escalada e exibem diferentes resultados de espaçamento social, dependendo da orientação do espaçamento sociaisChambers. Quando o ensaio foi realizado verticalmente, o espaço social das moscas infectadas foi maior do que o espaço social dos controles, provavelmente porque as moscas infectadas não foram capazes de formar um grupo estável na parte superior da câmara (Figura 3A). Quando as moscas sob as mesmas condições foram então testados nas câmaras espaço social orientadas horizontalmente, não houve diferenças significativas, indicando que a capacidade de locomoção é provavelmente menos de um factor para o espaço social nas câmaras espaço social posicionado horizontalmente (Figura 3B). Enquanto as moscas são infectadas visualmente menos capaz de subir do que os controlos, este pode ser quantificada utilizando o ensaio de escalada (Figura 3C). Depois de 5 segundos, a cerca de 44% das moscas de controlo subiu para a metade superior do frasco inferior e apenas 32% das moscas infectadas. É interessante notar que todas as moscas neste ensaio escalar mal (eles raramente alcançam a parte superior do frasco, somente a parte superior do frasco inferior), que podeser explicado pelo facto de que eles são de 12 dias pós-eclosão, o que é, quando começam a moscas exibem um defeito na escalada devido ao envelhecimento 22.

No entanto, para as estirpes que não têm nenhum defeito escalada, ambas as orientações das secções conduziu ao mesmo resultado, como mostrámos previamente 1. Neste experimento, o mesmo aumento no espaço social foi visto para Canton-S e 1118 w Cs 10 no triângulo vertical ou as câmaras circulares horizontais (Figura 3D, E - reanálise na caixa e suiça dos dados publicados em 1). Não houve diferença na escalada capacidade entre Canton-S e 1118 w Cs 10, indicando que não foi um fator para a diferença no espaço social entre as linhagens em qualquer orientação câmara (15 seg escolha - Figura 3F). Se lhe for dada 5 seg escolha de 17% ± 3.3 do CS e 14% ±2,5 de W 1118 Cs 10 atingiu a parte superior do frasco (não estatisticamente diferentes, dados não mostrados).

Os investigadores que usam a câmara de espaço social também devem garantir que eles repetem suas experiências ao mesmo tempo do dia. Para tanto Canton-S e w 1118 Cs 10 moscas macho, a hora do dia afectada interacções sociais. Quando comparado com as horas do dia (hora Zeitgeber - o tempo em horas após o início da luz - ZT4 para ZT7), as moscas testadas à noite (ZT11 a ZT12 - pouco antes de as luzes apagadas) apresentaram um maior espaço social para ambos os genótipos, apesar de sua diferença em relação espaço foi preservado - ou seja, w 1118 Cs 10 moscas ainda são menos social do que Canton-S voa à noite (Figura 4A). Curiosamente, apenas o espaço social da Canton-S machos, mas não tchapéu de fêmeas aumenta à noite, embora tenha havido uma tendência de maior variação do espaço social para as moscas fêmeas à noite (Figura 4B). Temos anteriormente feita de forma independente as mesmas observações 24.

Como já relatado anteriormente, utilizando uma linha de Oregon-R para estudar o efeito de bisfenol A (BPA) 2, a câmara de espaço social também é sensível ao fundo genético de Drosophila. Aqui, mostramos que Elwood, uma linha de tipo selvagem recentemente capturado, tinha aumentado o espaço social em relação a Canton-S e Samarkand, mas não Oregon (Figura 5). Os espaços sociais de Samarcanda Oregon e não foram significativamente diferentes um do outro, mas ambos maiores do que o espaço social de Canton-S (Figura 5). Estes dados mostram que, num dado ambiente, diferentes estirpes de tipo selvagem puras e ter um espaço social diferente, indicando um componente genético para o comportamento. Ele também indica que o SEnsitivity deste teste requer, portanto, que as moscas ser outcrossed em fundos genéticos apropriados antes de experimentar. Isso ajudará a garantir as diferenças, ou, inversamente, as semelhanças, visto no espaço social são devido ao fator que está sendo testado.

figura 1
Figura 1. Espaço social componentes da câmara e arranjo. (A) câmaras espaço social de várias dimensões podem ser construídos usando as mesmas placas de vidro (17,6 cm por 17,6 cm por 0,3 centímetros) e espaçadores de acrílico em forma de triângulos retângulos (com uma altura de 16,5 cm, uma base de 8,9 cm, e uma espessura de 0,3 cm - indicado por uma letra minúscula a) e rectângulos (9 cm por 1,5 cm por 0,3 cm -. indicado por uma letra minúscula b) (B) A maior câmara espaço social, como descrito em 1 é adequado para 30-40 moscas. Tem dim internaensões de 16,5 cm por 16,5 cm por 14,5 cm, dando uma área de 86,45 centímetros 2, e que levam a uma área de 2,16 cm 2 por voar por 40 moscas. (C) um tamanho ideal de câmara para 20 moscas. Ele tem dimensões interiores de 16,5 cm por 14,5 cm por 5,96 cm, dando uma área de 43,25 cm2, e que conduzem a uma área de 2,16 cm2 por mosca. (D) câmara menor, óptima para moscas 15. Tem dimensões internas de 10,2 cm por 8,9 cm por 8,9 cm, dando uma área de 32,45 centímetros 2, e levando a uma área de 2,16 cm 2 por mosca. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Orientação do tamanho da câmara de grupo, mas não densidade, afectar espaço social. Os dados são representados numa caixae suiça enredo da distância para o vizinho mais próximo da câmara, com a caixa que representa o quartil (25 th por cento) e do 3º quartil (75 th por cento), a linha na caixa representando a mediana, e bigodes de Tukey . (AB) Os dados representativos mostram que aumentando o número de moscas dentro de uma câmara do mesmo tamanho leva a medições espaço social estáveis. Grupos de 10 a 70 Canton-S moscas machos foram colocados na câmara de maior espaço social vertical e deixada em repouso durante 30 min; a distância para o vizinho mais próximo de cada mosca foi gravado. Grupos possuindo menos de 15 moscas tinha espaço significativamente mais sociáveis ​​do que os grupos que têm mais de 20 moscas na câmara grande. (A) Grupos de 10 N = 9, 20, N = 9, 30, N = 8, 40, n = 8, Kruskal -Wallis teste p <0,0001, teste de comparação múltipla de Dunn: cada letra indicam grupos estatisticamente diferentes a # b p <0,0001 (B) <./ strong> Grupos de 15 n = 6, 40 n = 8, 50 n = 5, 60 n = 6, 70 n = 5, Kruskal-Wallis p <0,0001, a # b p <0,001. (c) quando a tamanho da câmara é ajustado para manter a densidade da mosca (respectivamente 15 na pequena, 20 em forma ou 40 em grande câmara, de cada vez a uma densidade de 2,16 cm 2 por mosca, não se observa diferença significativa quando testados na vertical. (D ) Mas quando estas câmaras espaço social são colocadas horizontalmente grupos que tinham 15 ou 20 moscas tinham uma distância maior para o vizinho mais próximo em relação a grupos com 40 moscas (Grupos de 15 n = 3, 20 n = 4, 40 n = 4, Kruskal -Wallis teste de p <0,0001, de comparação múltipla de Dunn testar a # b p <0,01). (E-F) A distância de todas as moscas foi medida para os grupos de 15, 20, e 40 do sexo masculino Canton-S moscas colocado na vertical e orientada horizontalmente câmaras. Quanto maior for a quantidade de moscas da câmara, quanto maior for a distância de todosmoscas ((E): grupos de 15 N = 6, 20, N = 6, 40 N = 3, de Kruskal-Wallis p <0,0001, de comparação múltipla de Dunn testar a # b p <0,01; (F): grupos de 15 N = 6, 20, N = 6, 40 n = 3, teste de Kruskal-Wallis, p <0,0001, de comparação múltipla de Dunn testar a # b # c p <0,0001). Nota: (A, B e CF) mostram dados obtidos em 3 regiões geográficas diferentes e, portanto, diferentes configurações de laboratório (A) Região 1: UCLA, Los Angeles, CA; (B) Região 2:. York College, Nova Iorque, NY; (CF) Região 3:. Western University, London, ON Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. O Orientaçãof a câmara de espaço social pode ser usado para controlar a confusão geotaxis problemas (A - C):. Grupos de 40 machos Canton-S moscas que foram ou infectados com P. rettgeri por sete dias ou injetados com a mídia como um controle foram colocados em uma câmara de espaço social, quer na vertical (A) ou horizontalmente (B) posicionado e deixada em repouso durante 30 minutos. A distância para o vizinho mais próximo de cada mosca foi gravado. Os dados são representados em um gráfico de caixa e suiça da distância para o vizinho mais próximo da câmara, com a caixa que representa o quartil (25 th por cento) e no quartil (75 th por cento), a linha na caixa representando a mediana, e bigodes Tukey. (A) Representante dados mostra um aumento no espaço social para as moscas que estão infectados com P. rettgeri e colocada numa câmara de espaço social posicionada verticalmente,em comparação com a injecção com meios (de Wilcoxon-Rank: cada carta indicam grupos estatisticamente diferente p <0,0001, n = 6) (B) mostra dados representativos espaço social não é afectada por p. infecção rettgeri quando as moscas são colocadas em uma câmara de espaço social posicionado horizontalmente (Wilcoxon-Rank test: p> 0,1, n = 5) (C) Um aparelho em contracorrente foi utilizado para avaliar o comportamento de escalada de ambas as moscas infectadas e de controle de mídia.. Moscas infectadas subir mais mal do que seus controles de mídia (voa ~ 12 dias de idade, gráfico representam o índice médio de desempenho ± SEM:% de moscas na metade superior do frasco em 5 seg escolha; bicaudal teste t com correção de Welch; n = 6 de ~ 60 moscas, cada carta indicam grupos estatisticamente diferente p = 0,08) (D - F):. câmaras posicionado verticalmente e horizontalmente, quer circulares ou triangulares, foram usados ​​para comparar o espaço social de Canton-S (CS) comque de w 1118 Cs 10 (W). Os dados são representados em um gráfico de caixa e suiça da distância para o vizinho mais próximo da câmara, com a caixa que representa o quartil (25 th por cento) e no quartil (75 th por cento), a linha na caixa representando a mediana, e bigodes de Tukey. Em ambas espaço social orientações e formas de câmara, w 1118 Cs 10 teve um maior espaço social de Canton-S ((D), triângulo vertical: teste de Kruskal-Wallis, cada letra indicam grupos estatisticamente diferentes p <0,0001, (E), círculo horizontal: teste de Kruskal-Wallis, cada letra indicam grupos estatisticamente diferentes p <0,01). (F)) Um aparelho em contracorrente foi utilizado para avaliar o comportamento de escalada de ambos Canton-S e W Cs 1118 10cepas (voa 3-5 dias de idade, gráfico representam a média do índice de desempenho ± SEM:% de moscas em cima frasco a 15 seg escolha). Não houve diferença na capacidade entre ambos Canton-S ou w 1118 Cs 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Espaço social de machos é aumentado durante a noite. (A) Representante dados mostra um aumento do espaço social entre macho voa durante a noite ("noite" ZT 11-12, antes de luzes apagadas) em comparação com horas do meio-dia ("dia "ZT 4-7). Grupos de 40 moscas Canton-S e 1118 w Cs 10moscas foram colocados em uma câmara de espaço social durante tanto horas do dia ou horas da noite e deixada em repouso durante 30 minutos. A distância para o vizinho mais próximo de cada mosca foi gravado. Para ambos os genótipos, moscas aumento espaço social à noite e diferenças entre cepas foram mantidas, independentemente da hora do dia (n = 6-7, Kruskal-Wallis p <0,0001, teste de comparação múltipla de Dunn: cada letra indicam grupos estatisticamente diferentes p < 0,01). (B) Quando Canton-S moscas foram separados por sexo somente os machos têm mostrado um aumento no espaço social à noite (t p <0,01), apesar de uma tendência não significativa para ampliar a variação interna é visto em mulheres (Kruskal -Wallis teste, cada letra indicam grupos estatisticamente diferentes p <0,0002). Os dados são representados em um gráfico de caixa e suiça da distância para o vizinho mais próximo da câmara, com a caixa que representa o quartil (25 th por cento) e os 3rd quartil (75 th por cento), a linha na caixa representando a mediana, e bigodes de Tukey. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Background genético de moscas afeta o espaço social. Grupos de 40 Canton-S, Samarkand, Oregon, e moscas Elwood foram colocados em uma câmara de espaço social e deixada em repouso durante 30 minutos. A distância para o vizinho mais próximo de cada mosca foi gravado. As distribuições dos grupos são diferentes (teste de Kruskal-Wallis, p <0,0001), grupos que não partilham uma carta comum são significativamente diferentes. Os dados são representados numa caixa e p suiçamuito a distância para o vizinho mais próximo da câmara, com a caixa que representa o quartil (25 th por cento) e do 3º quartil (75 th por cento), a linha na caixa representando a mediana, e bigodes de Tukey (Dunnet de teste de comparação múltipla, p <0,05 [d], p <0,001 [a, b, c], 3 repetições independentes com 1-2 repetições internas, tais que, para Elwood Samarcanda e n = 3, Oregon e Canton S-N = 4 ). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste protocolo, um procedimento detalhado para a quantificação do espaço social foi descrita. Alguns passos cruciais para garantir o experimento for bem-sucedida são: 1) usar sempre luvas durante a limpeza e configuração do aparelho, para manter seus próprios óleos e aromas fora da câmara interna do aparelho, 2) garantir moscas são coletadas, pelo menos, um dia antes o experimento para reduzir os efeitos potenciais da anestesia frio, 3) 2 horas antes do experimento fornecer novos frascos contendo alimentos frescos para garantir as moscas não estão famintos, e têm-se limpo, 4) Durante estes 2 horas, deixe as moscas aclimatar ao seu novo ambiente, 5) observar as condições de temperatura e umidade, quando a realização de experimentos; tentar mantê-los consistente entre 24-25 ° C e umidade de 50%, 6) certifique-se de não perturbar as câmaras espaço social durante a execução do experimento, e 7) a realização do experimento, ao mesmo tempo do dia, de preferência entre Zeitgeber tempo ZT4 e ZGT7.

O espaço social é somente dependente da densidade de moscas dentro da câmara, e não depende do tamanho do grupo, enquanto que existe um tamanho mínimo grupo met.Moscas vai manter o mesmo espaçamento entre si social, independentemente da quantidade de membros do grupo. No entanto, a distância de todas as moscas na câmara, como esperado, é afectada pelo tamanho de grupo, bem como a orientação da câmara. É importante notar que, apesar da orientação horizontal sendo difícil de usar (moscas não se contentar tão facilmente), e levando a separação reduzida entre genótipos nas nossas mãos (Figura 3D em comparação com 3E), Burg et al. 3 utilizado com sucesso uma horizontal , câmara quadrada. Em seus experimentos, a distância para o vizinho mais próximo era mais semelhante aos nossos resultados espaço social orientados verticalmente. No entanto, na sua câmara, não havia um fluxo de ar contínuo que pode ter contribuído para o espaçamento do grupo social das moscas sendo mais semelhante ao nosso câmara vertical, em vez de a câmara horizontal. A limitação ao uso de câmaras verticais é a capacidade de testar Drosophila que têm mobiliimparidades ty. A câmara de espaço social exige que as moscas de ser móvel para que eles possam escolher a que distância de seu vizinho eles desejam ser. Se moscas estavam imóveis ou tiveram déficits de alguma forma, eles podem não ser capazes de formar grupos estáveis ​​correctamente na câmara. Um remédio potencial para pobres locomoção seria, então, usar câmaras horizontais, ou para permitir mais tempo para as moscas para resolver antes de tirar a foto. Os investigadores também devem avaliar a capacidade de escalada e possíveis deficiências geotactic de moscas para ver se a câmara de espaço social vertical é apropriada. Se existem défices de qualquer um destes, câmaras posicionadas horizontalmente podem ser usadas para evitá-los.

De nota, se a atividade ou resistência geral e da saúde escalada da mosca irá afectar a medição do espaço social, mostramos que os níveis de atividade ou de locomoção não estão correlacionadas com o espaço social. Em outro estudo, mostra-se que um tratamento que reduz a locomoção, a (alimentação BPA) também diminuem sociaisespaço 2. Mas mutantes de rugosa (um ortholog Drosophila do neurobeachin gene candidato autismo) visor hiperatividade e aumento do espaço social 4. Finalmente, moscas mutantes brancas exibir um aumento no espaço social 1,3, sem qualquer aumento na locomoção ou geotaxis 18. Em resumo, várias combinações de nível de actividade e espaçamento social têm sido observado até agora, indicando que não há correlação entre as duas condutas. Na verdade, o espaço social não necessariamente correlacionar a outros comportamentos sociais tanto, tais como evitação social 8,25, sugerindo circuito neural subjacente diferente. Por exemplo, os mutantes de exibição rugosa / neurobeachin aumento do espaço social e evitação social reduzida 4; mas o branco tem aumentado tanto espaço social, e muito forte evitação social 4.

Como o tempo de dia afecta espaço social, pelo menos em homens, é critical investigadores que são conhecedores da hora do dia quando as suas experiências são realizadas e esforço é feito para manter uma constante de tempo para todas as experiências. Outras considerações que devem ser contabilizados incluem idade, sexo e estado de acasalamento das moscas. Sabemos que a distância social é maior em relação ao indivíduo virgem acasalado, tanto para machos e fêmeas 1, e nós agora mostram que os homens são menos perto do que as fêmeas, à noite (Figura 4B). Diferenças sexuais específicos tensão em níveis de moscas individuais durante o dia de atividades foi descrito anteriormente, propondo que os machos maior atividade locomotora de manhã e à noite em comparação com o dia pode estar relacionado ao seu comportamento de corte 26,27. No entanto, no nosso caso, os sexos são separados, mas as moscas são agrupados, e pelo tempo que medir o seu espaço social, as moscas se instalaram. 27 relatório Fujii et al., Que o ritmo circadiano em pares de macho mantidojuntos têm um ritmo diário errático, sem picos claros, quando o ritmo de pares femininos assemelham a de moscas individuais. Assim, o aumento do espaçamento nos machos à noite provavelmente não está relacionado a um aumento no comportamento de corte ou aumento específico na atividade locomotora, ea razão subjacente ao dimorfismo sexual desse comportamento precisa ser mais investigada.

Com isto em consideração, moscas devem ser sempre separados por sexo para o experimento assim diferenças na interação social entre homens e mulheres pode ser visto. Finalmente, no momento não sabemos ainda como a idade afeta as interações sociais de moscas. Portanto, recomendamos que as experiências espaciais sociais são realizados com moscas não mais de sete dias, como várias performances de comportamento, incluindo a atividade de escalada são conhecidos por ser afetados em moscas de mais de uma semana de idade 22.

Uma consideração final para o espaço social é as variações observadas na medianadistância social. Medições espaço social foram retirados de vários locais, incluindo (Los Angeles, CA: Figura 2A; Nova York, NY: Figura 2B, figura 3D, Figura 4, Figura 5; Londres, ON: Figura 2C-F, Ithaca, NY: Figura 3A, B, todos no mesmo Canton-S fundo). Variáveis ​​desconhecidas que não eram constante entre localizações geográficas, ou configurações de laboratório, afetou a distância social mediano. Possíveis fatores incluem diferentes alimentos, elevação da pressão atmosférica em si mesmo, e mudança na pressão atmosférica 28. Embora as medianas não foram constantes entre os locais, dentro de um local as medianas são altamente constante e reprodutível; e as tendências e padrões vistos nas medições espaço social permaneceu o mesmo entre locais. Por conseguinte, desde que os investigadores manter as condições constantes internamente, que irá ser umble para detectar diferenças no espaço social.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Jazz-mix Fisher 33545 any other standard drosophila food would work
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
 Sharpie pens
Adhesive Tape
Medium size binder clips Staples to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity
small SupportStands Carolina  707161 to hold the chambers in a vertical orientation
Buret clamps Carolina 707362
Digital Camera Nikon  Coolpix S8000  to take the still pictures
small ruler to be able to scale the picture
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
pounding pad any mouse pad works.
Prism 6 GraphPad Software Inc. Prism 6 for Mac OS X Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work

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References

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