Conditions affectant espace social

Neuroscience

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McNeil, A. R., Jolley, S. N., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Milunovich, A. J., Chambers, M. C., Simon, A. F. Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (105), e53242, doi:10.3791/53242 (2015).

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Abstract

Le dosage de l'espace social décrit ici peut être utilisé pour quantifier les interactions sociales de Drosophila melanogaste r - ou d'autres petits insectes - d'une manière directe. Comme nous l'avons démontré précédemment 1, dans une chambre à deux dimensions, nous forçons premier vol pour former un groupe serré, permettant ensuite à prendre leur distance préférée de l'autre. Après les mouches se sont installés, nous mesurons la distance au plus proche voisin (ou l'espace social), le traitement d'une image statique avec le logiciel gratuit en ligne (ImageJ). L'analyse de la distance du plus proche voisin permet aux chercheurs de déterminer les effets des facteurs génétiques et environnementaux sur l'interaction sociale, tout en contrôlant les facteurs de confusion potentiels. Divers facteurs tels que la capacité d'escalade, moment de la journée, le sexe, et le nombre de mouches, peuvent modifier l'espacement sociale de mouches. Nous proposons donc une série de contrôles expérimentaux pour atténuer ces effets confondants. Ce test peutêtre utilisé pour au moins deux raisons. Tout d'abord, les chercheurs peuvent déterminer comment leur virage environnemental préférée (comme l'isolement, de la température, de stress ou de toxines) aura une incidence sur l'espacement sociale 1,2. Deuxièmement, les chercheurs peuvent disséquer les fondements génétiques et neuronales de cette forme de base du comportement social 1,3. Plus précisément, nous avons utilisé comme un outil de diagnostic pour étudier le rôle des gènes orthologues pensé pour être impliqués dans le comportement social dans d'autres organismes, tels que les gènes candidats pour l'autisme chez les humains 4.

Introduction

Les interactions sociales sont essentielles pour le bon développement et la santé des individus au sein d'un groupe dans son ensemble, et peuvent être observées dans de nombreuses espèces, des humains (Homo sapiens) à des organismes plus simples comme les mouches de fruits (Drosophila melanogaster) 5,6. Une mouche à fruit individu ou des moyens communs d'actions humaine pour traiter les informations sensorielles au cours de ces interactions, que ce soit: auditif, visuel, olfactif, tactile, ou la gustation. Nous émettons l'hypothèse que d'autres et il ya un neurocircuitry potentiellement partagée qui sous-tend les réactions comportementales aux interactions sociales et que les cellules neuronales et les gènes impliqués pourraient être évolutif conservées 7. Une fois l'interaction initiale a eu lieu, l'espace social entre les individus en interaction va soit augmenter (d'évitement sociale 8) ou une diminution (formation de groupe / agrégation 5). Interactions plus complexes, comme l'agression ou la cour, peuvent alors avoir lieu.

Drosophila melanogaster, tel qu'il est utilisé dans les études 1-4,9 suivantes. L'espace social se réfère à une mesure de la distance entre la mouche et son plus proche voisin 10. L'espace social est conforme pour une population donnée de D. melanogaster lorsque les conditions expérimentales sont conservées (en moyenne environ dans 1-2 longueurs corps), et varie par rapport à l'expérience sociale de vol, ce qui augmente si l'individu a été maintenu en isolement 1. Une bonne vision est nécessaire pour maintenir la distance sociale normale, mais pas odorants classiques ou CVA perception 1. Mesure de l'espace social peut donc êtreutilisé comme un outil de diagnostic pour analyser les interactions sociales et de quantifier le comportement social dans D. melanogaster 1. Nous décrivons ici en détail comment effectuer cette quantification, et dans quelle mesure les variables expérimentales communes affecte ce comportement.

Nous montrons que l'orientation de la chambre dans laquelle le dosage est effectué, ainsi que le nombre de mouches - dans une certaine mesure - faire affecte l'espace social. Il a déjà été démontré que la géométrie de la chambre affecte mouvement exploratoire spontanée de mouches 11,12, et ce phénomène pourrait finalement avoir un impact là où ils décident de s'installer. Cependant, tant que la densité de mouche (mouche / cm 2) et l'orientation de la chambre est maintenue même, l'espace social de vol reste également constante. La robustesse de ce test est illustré par le fait que des laboratoires indépendants en utilisant différentes tailles de chambre, de la forme et l'orientation peut reproduire le résultat affiché par les mutants de la whgène ite (affectant la pigmentation des yeux), qui est un espace social de hausse (triangle vertical ou horizontal dans le cercle 1, carré horizontal air de circuler dans 3).

Nos résultats indiquent également que le maintien de l'heure à laquelle l'expérience de l'espace social est effectuée est essentielle à la cohérence des résultats, comme nous le montrons que les hommes, mais non chez les femmes, sont plus éloignées dans les soirées. Cependant, les différences observées entre jour et de soir heures ne sont pas dues à l'activité différences de vol, et nous discutons arguments indiquant que les niveaux d'activité ne sont pas corrélés avec l'espace social.

Enfin, il ya des fondements génétiques à la détermination de l'espace social, comme indiqué par le mutant blanc déjà décrite 1,3, et les différences entre les diverses souches consanguines et sauvages pêchés de mouches que nous présentons ici.

Par conséquent, cet essai constitue un excellent outil fou d'étudier les effets de la génétique ainsi que les facteurs environnementaux.

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Protocol

1. Matériel et réactifs Créé interne (Voir Liste des Matériaux pour les autres)

  1. Préparer un appareil d'anesthésie froid Drosophila comme décrit précédemment 8.
  2. Préparer un aspirateur à la mouche comme décrit précédemment 13.
  3. Préparer des chambres et les détenteurs de l'espace social.
    1. Commandez ou faire des vitres et des entretoises acryliques pour créer les chambres de l'espace social. Chaque chambre de l'espace social se compose de deux panneaux de verre carrés (17,6 cm x 17,6 cm, avec une épaisseur de 0,3 cm), deux bonnes entretoises acryliques de triangle (avec une hauteur de 16,5 cm, une base de 8,9 cm, avec une épaisseur de 0,3 cm ), et deux espaces rectangulaires (9 cm par 1,5 cm avec une épaisseur de 0,3 cm) (Figure 1A).
    2. Assembler le verre et la chambre de l'espace social acrylique tel qu'il est identique à la chambre de la figure 1B. Pour ce faire, commencez par placer une entretoise triangulaire plat sur le dessus d'un panneau carré de verre de telle sorte que l'angle droitde l'entretoise triangulaire est aligné avec l'un des coins du panneau carré. Ensuite, placez la deuxième entretoise plate triangulaire sur le dessus du panneau carré, miroir de la première entretoise triangulaire.
      REMARQUE: Assurez-vous de porter des gants pour ne pas contaminer les morceaux avec des huiles et des parfums de vos mains.
    3. Placez deux petites entretoises rectangulaires plats sur le dessus du panneau carré, le long de la côté de la vitre qui ne sont pas couverts. Les entretoises acryliques sur le dessus du plan carré doivent maintenant former une arène triangulaire.
    4. Placer un deuxième panneau carré de verre au-dessus des entretoises acryliques tels que il est aligné au-dessus du panneau de verre d'origine ci-dessous.
    5. Utilisez quatre clips liant pour fixer les vitres et les entretoises pour former la chambre de l'espace social. Placez un clip près du coin, sur le long côté de chacune des entretoises triangulaires, les fixant à l'intérieur des vitres. Sur ces mêmes côtés, placez un clip dans le coin adjacent, sur chacune des entretoises rectangulaires, les sécuriser dansl'autre les panneaux de verre.
    6. Assembler un pied de support et une pince de ballon de telle sorte que la pince maintient la chambre de l'espace social dans une position verticale, comme la chambre de l'espace social repose sur son bord au-dessus de la surface de travail.
    7. Pour chaque répétition dans l'expérience, assembler une chambre de l'espace social et soutenir tenir.
  4. Préparer un appareil de réponse de dosage d'escalade pour vérifier la capacité d'escalade de vol testés.
    1. Utiliser un appareil à contre-courant, comme décrit précédemment 14,15.
  5. Assurer des conditions d'éclairage homogènes en effectuant l'expérience sur une surface de travail recouvert d'une couverture de banc blanc et devant un fond blanc.

2. Préparer les mouches avant l'expérience

  1. Maintenir mouches dans des bouteilles contenant norme Drosophila volent la nourriture. Gardez-les dans une chambre d'incubation à 25 ° C sur un cycle de 12 heures de lumière / obscurité.
  2. Un ou deux jours avant l'eXperiment, la collecte et le sexe vole sous anesthésie froid, comme décrit précédemment 8.
    1. Refroidir l'appareil d'anesthésie froid à -4 ° C. Lieu vole dans 50 ml tubes en plastique. Immerger entièrement les tubes en plastique contenant des mouches dans la glace dans un seau à glace isolé, attendez au moins 5 minutes pour les mouches à devenir immobile.
    2. Placer vol sur la feuille de polyethylene de l'appareil d'anesthésie froid. A RT, utiliser une loupe binoculaire pour séparer les mâles des femelles. Maintenir les mouches, en groupes, dans des flacons contenant norme mouche drosophile alimentaire, ne dépassant pas 40 mouches par flacon.
  3. Deux heures avant le début de l'expérience, en sorte que la température de la salle où l'expérience sera effectuée est comprise entre 24-25 ° C et l'humidité est d'environ 50%.
  4. Transférer les mouches dans de nouveaux flacons contenant de la nourriture, et de les placer pendant 2 heures sur la surface de travail où l'expérience sera effectuée.
    NOTE: Pour ces expérits, les souches de mouches utilisées étaient Drosophila souches melanogaster: Canton-spéciales ou Canton-S (CS), w 1 118 Cs 10 (ou W - w 1 118 par croisement 10 fois à Canton-S), de l'Oregon et Samarkand mouches étaient tous de notre laboratoire les stocks 16; Elwood mouches ont été recueillies à l'automne 2011 dans le quartier Elwood de Huntington, à Long Island, New York, États-Unis 8. Outre mention contraire, les résultats présentés ont été obtenus avec Canton-S vole (dans les tons de rouge).

3. réalisation de l'expérience

  1. Effectuer l'expérience 12 heures-15 heures (heure de Zeitgeber - le temps en heures après l'apparition de la lumière - de ZT 4 à 7).
  2. Préparer la chambre de l'espace social pour le transfert de mouches.
    1. Placez un plat de la chambre de l'espace social sur une surface de travail, avec le côté contenant entretoises rectangulaires les plus proches de votre corps.
    2. Retirer one pince plus proche de votre corps et faites glisser une entretoise rectangulaire vers l'extérieur, la création d'un espace d'environ 1 cm entre les entretoises rectangulaires.
    3. Avec du ruban et un marqueur, l'étiquette de la chambre de l'espace social dans un coin supérieur avec le sexe, la souche, et le nombre de répétition. Prenez soin de veiller à la bande ne couvre pas partie de l'arène triangulaire intérieure.
  3. Transférer les mouches dans la chambre de l'espace social.
    1. Transfert d'oiseau de leur flacon contenant de la nourriture dans un nouveau flacon vide. Aspirer d'oiseau de la fiole vide et de les transférer dans la chambre de l'espace social.
      1. Inspirez à attirer les mouches dans la pointe de l'aspirateur. Placez le bout dans la fente de 1 cm entre les entretoises rectangulaires de la chambre de l'espace social et expirez à un taux uniforme de forcer les mouches dans l'arène intérieure triangulaire.
      2. Immédiatement glisser l'entretoise rectangulaire en place, la fermeture de la base de l'arène intérieure triangulaire, et placez le clip de liant de retour sur.
    2. Sur un pad battant, qui est situé sur le banc différent de celui où le travail expérimental a lieu, maintenez la chambre de l'espace social verticale tels que les entretoises rectangulaires sont sur le bas côté. Pound trois fois pour assurer toutes les mouches ont tombé au fond de l'arène.
      NOTE: En raison de l'entretoise acrylique qui sortait de la plus petite taille de la chambre (figure 1D), bang coudes sur la surface de travail tout en conservant un maintien sûr sur des appareils pour assurer les mouches ont tombé au fond.
    3. Lancer une minuterie.
    4. Placez la chambre de l'espace social sur la surface de travail et utiliser le support de soutien et flacon pince pour le maintenir en position verticale. Placez une règle ou un autocollant de longueur connue à plat contre la chambre de l'espace social, mais ne couvrant pas toute partie de l'arène triangulaire intérieure.
      1. Pour les expériences placées horizontalement, ne placez pas la chambre de l'espace social dans le stand de soutien; au lieu de jeter les plats de la chambre de l'espace social sur la surface de travail.
      2. Quand les mouches se sont installés, généralement après environ 30 min, prendre une photo de la chambre de l'espace social. Assurez-vous que la trame contient toute l'arène intérieure triangulaire, la règle, et l'étiquette.
      3. Répétez l'expérience pour chaque génotype et l'état (idéalement 3 répétitions internes et 3 répétitions indépendants).

      4. Analyser les données de l'espace social

      1. Importez les macros suivantes dans ImageJ 17
        1. ImageJ est disponible ici: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
        2. Vous pouvez créer une commande "Distances de mesure» dans le menu Plugins en sauvegardant les macros ci-dessous dans un fichier nommé 'Measure_Distances.txt' dans le dossier ImageJ / plugins, dans le sous-dossier macro, et en utilisant le menu Aide> Mise à jour de la commande des menus ».
        3. Copier dans un fichier .txt les macros qui sont fournis dans les données complémentaires et ont été publiés à l'origine dans 3.
      2. Téléchargez les photos sur un ordinateur, et ouvrir un picture en utilisant ImageJ.
        1. Créer une échelle en traçant une ligne des 0 cm à 1 cm marques sur la règle dans l'image, et sous l'onglet Analyser, choisir la fonction Echelle Set pour définir une échelle de 1 cm pour cette distance (même approche pour l'autocollant de longueur connue). Choisissez l'option globale avant d'appliquer l'échelle de l'image.
        2. Recadrer l'image en utilisant la fonction des cultures sous l'onglet Image telle qu'elle comprend toutes les mouches, tout en retirant autant du reste de l'image que possible.
        3. Une photo en noir et blanc en choisissant 8 bits à partir de l'option Type sous l'onglet Image.
        4. Retirez tout bruit de fond de l'image en allant à la fonction de seuil sous l'option Ajuster de l'onglet Image. Faites glisser les curseurs pour améliorer ou retirer le contraste afin que le corps de chaque volée peut être clairement vu sans autres marques dans l'image. Si il ya des marques qui ne sont pas les mouches, les capturer avec l'outil rectangulaire et les supprimer.
        5. Met lemesures à l'aide de l'Outil de mesures Set sous l'onglet Analyser. Choisissez Région, centre de masse, Centroid et Etiquette d'affichage. Ensuite, choisissez les particules Analyser disposent sous l'onglet Analyser pour créer une liste numérotée de tous les points noirs représentant les mouches.
          1. Lors de l'utilisation analyser des particules; taille de l'ensemble 0,01-0,1 (Ne pas choisir unité de pixel); circularité de 0,00 à 1,00; Voir les contours; afficher les résultats, et ajouter à gestion.
          2. Veiller à ce que chaque point noir (chaque particule) est une représentation précise des mouches qui sont dans l'image originale, en comparant la liste numérotée à l'image originale.
            NOTE: Si des mouches qui sont très proches les unes étant comptés comme une particule, dessiner manuellement une ligne blanche pour séparer les deux mouches sur l'image binaire.
        6. Alors que la liste est sélectionné, utiliser le plus proche voisin - Liste distances macro sous la deuxième option macros dans l'onglet Plugins pour créer une nouvelle liste contenant les distances, en cm, d'EAch voler à leur plus proche voisin.
      3. Copiez les plus proches des distances voisines de ImageJ et coller dans une colonne d'un programme de feuille de calcul.
        1. Compiler toutes les données de chaque répétition sur la même feuille de calcul et d'organiser par le génotype et l'état.
      4. Effectuer l'analyse des données en utilisant un logiciel statistique. Dans cette expérience, Graph Pad Prism (version 6 pour MacOSX, GraphPad Software, San Diego Californie, www.graphpad.com) a été utilisé pour effectuer une analyse de la variance, et Tests de Kruskal-Wallis, Tukey et post-hoc tests de Dunnet.
      5. La distribution des distances en résulte une distribution non paramétrique 1, et les données sont représentées en tant que boîte et moustaches de Tukey pour éliminer les valeurs aberrantes ().

      5. Escalade Assay (Comportement de contrôle)

      1. Utilisez un test d'escalade comme un contrôle à vol d'essai capacité à monter 14,15,18.
        1. Utilisez l'appareil à contre-courant de telle sorte que trois essais cun être exécuté en parallèle.
      2. Transfert de 50 à 100 mouches naïfs (mouches qui n'a pas été testé avant) dans trois fioles de test différents, et enclenchez-les 1 er, 3 e et dernier fentes au bas de l'appareil à contre-courant, avec des flacons frais vides dans les emplacements opposés.
      3. Place, flacons vides fraîches dans les emplacements vides au bas de l'appareil.
      4. Appuyez sur le bas de l'appareil trois fois, de telle sorte que toutes les mouches sont au fond de chaque tube, à initier l'expérience.
      5. Démarrer la minuterie pour 15 secondes (temps suffisant pour ~ 100% de 3-7 jours anciens Canton-S pour atteindre le flacon haut - voir figure 3F).
      6. Faites glisser la partie supérieure de l'appareil à contre-courant, à déplacer les flacons haut par une fente.
      7. Recueillir les mouches en tapotant l'appareil vers le bas, pour mettre toutes les mouches dans les flacons de fond.
        1. 1 ère et 2 ème tubes (ou 3 ème et 4 ème, 5 ème 6 e) correspondent respectivement aux mouches qui ne sont pas arrivés en haut et les mouches qui ont atteint le flacon dessus.
      8. Calculer l'indice de performance (PI).
        1. Comptez le nombre de mouches dans chaque flacon.
        2. Le PI est le pourcentage de mouches en mesure de monter sur le tube supérieur.
        3. Les moyens de la PI suivent une distribution normale 1, et les données sont représentées comme des graphes en colonnes de l'erreur standard moyenne plus ou moins à la moyenne (SEM).
          REMARQUE: Sinon, la PI peut être calculée comme le pourcentage de mouches capables d'atteindre la partie supérieure du flacon inférieur (pour les mouches âgées, 5 sec est le temps suffisant pour quantifier une différence dans capacité à monter entre infectés et non infectés de 12 jours Canton-S quantifiés à partir d'une image fixe: voir résultats). D'autres ont utilisé différentes mesures de performance dans géotaxie induite sursaut-négatives, qui sont également appropriés pour quantifier capacité à monter 19-22.

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Representative Results

La chambre de l'espace social peut être utilisé comme un outil pour quantifier le comportement social de Drosophila melanogaster. Entretoises acryliques et les vitres sont clipsés pour former une arène triangulaire intérieure qui offre un espace à deux dimensions dans lequel les mouches peuvent former des groupes stables sans la présence de nombreux indices potentiellement confondants. Quand les mouches sont transférés à l'arène verticale, ils sont surpris en étant tassé, et ils répondent par un comportement de fuite: géotaxie négatifs. Ils grimpent au sommet du triangle debout, forcé dans un groupe serré, puis sont fournies de temps pour aller plus loin former l'autre, et d'explorer l'arène. Après 20 à 40 min, ils cessent de se déplacer, et un groupe stable est formée. La distance entre chaque volée et son voisin le plus proche peut être mesurée à partir d'une image, de fournir une quantification de leur espace social préféré. Les mouches sont considérés comme plus sociale, plus ils sont à leurs voisins.

Mouchela densité ne joue pas un rôle dans l'espace social dans la chambre jusqu'à ce que le point de sous-capacité. Pour un grand groupe de 20 à 70 vol dans la chambre orienté verticalement plus grand, l'espace social est indépendante de la densité de groupe (figure 2A, B). Avec seulement 10 ou 15 mouches dans la chambre de l'espace social, il n'y a probablement pas suffisamment de personnes pour former un groupe social stable, conduisant à une augmentation dans l'espace social (figure 2A, B). Cependant, tester un grand nombre de mouches est pas toujours commode - dans certaines circonstances où le nombre d'individus mutants est limitée, les chercheurs peuvent ne pas être en mesure de collecter des groupes de mouches assez grand pour le format standard de la chambre de l'espace social. Pour faciliter la quantification de l'espace social à l'aide de petits groupes de mouches, les chercheurs peuvent manipuler la chambre de l'espace social de telle sorte que la zone de l'arène à deux dimensions est plus petit, mais la surface par la mouche reste constante. Représenté sur la figure 1C, D existe deux types de socialedes chambres modifiées d'espace pour les petits groupes, mais conservent la même densité que la chambre plus grande. De cette manière, en maintenant la densité de mouche, et la réduction de la taille de la chambre permet d'obtenir un espacement similaire sociale (figure 2C).

Les mêmes tendances générales sont valables pour les chambres de l'espace social placés dans une position horizontale (figure 2D). Cependant, nous pouvons observer que les mouches ont tendance à être plus espacés dans un tel cadre horizontal, et ils ne se contentent pas facilement 1. Les groupes qui ont seulement 15 et 20 mouches présentent une plus grande espace social que les groupes avec 40 mouches (F igure 2D).

Pour confirmer que la surpopulation était pas responsable pour les distances inférieures à la plus proche voisin vu dans de plus grands groupes de mouches, la distance de chaque mouche à tous les autres mouches a été mesurée, comme dans 9. Quantifier la distance à toutes les mouches, fonction de la distance au plus proche voisin, permet d'évaluer un behavi de groupeou, à la place du comportement des individus au sein d'un groupe. Comme prévu, la distance à toutes les mouches augmenté la quantité de mouches dans le groupe était plus grande, une réflexion du groupe lui-même, pas de vol individuels. Cette tendance a été observée pour les deux chambres de l'espace social verticalement et horizontalement positionnés (Figure 2E, F). Par conséquent, les mouches de grands groupes ne soient pas obligés de garder une distance plus proche de leur voisin en raison des restrictions d'espace. Au lieu de cela, les mouches forment des groupes sociaux plus strictes quand il ya plus de 15 mouches dans la chambre.

Comme pour les autres tests de comportement, une limite à l'utilisation de la chambre de l'espace social est à la verticale qu'il nécessite mouches avec aucun géotaxie ou les dépréciations d'escalade. Par exemple, Canton-S vole infectée pendant une semaine avec la bactérie à Gram négatif Providencia rettgeri 23 possèdent un défaut d'escalade et présentent des résultats différents d'espacement sociale en fonction de l'orientation de l'espacement socialechambres. Lorsque le test a été effectué à la verticale, l'espace social des mouches infectées était plus grande que l'espace social des contrôles, probablement parce que les mouches infectées ne sont pas en mesure de former un groupe stable au sommet de la chambre (figure 3A). Quand les mouches dans les mêmes conditions ont ensuite été testés dans les chambres de l'espace social orientées horizontalement, il n'y avait pas de différences significatives, ce qui indique que la capacité de locomotion est probablement un facteur moins important pour l'espace social dans les chambres de l'espace social positionnés horizontalement (figure 3B). Bien que les mouches infectées sont visuellement moins en mesure de monter que les témoins, ce qui peut être quantifiée en utilisant le test d'escalade (figure 3C). Après 5 sec, environ 44% des mouches de contrôle a grimpé jusqu'à la moitié supérieure du flacon inférieur et seulement 32% des mouches infectées. Il est intéressant de noter que toutes les mouches dans cet essai grimper mal (ils atteignent rarement en haut du flacon, seule la partie supérieure du flacon inférieur), qui peutêtre expliqués par le fait qu'ils sont 12 jours post-éclosion, qui est lorsque les mouches commencent à présenter un défaut de grimper en raison du vieillissement 22.

Toutefois, pour les souches qui ont aucun défaut d'escalade, les deux orientations des chambres ont conduit aux mêmes résultats, comme nous l'avons montré précédemment 1. Dans cette expérience, la même augmentation dans l'espace social a été vu pour Canton-S et W 1118 Cs 10 dans le triangle vertical ou les chambres circulaires horizontales (Figure 3D, E - réanalyse dans la boîte et moustaches des données publiées en 1). Il n'y avait aucune différence dans la capacité à monter entre Canton-S et W 1118 Cs 10 indiquant qu'il n'a pas été un facteur de la différence dans l'espace social entre les souches que soit l'orientation de la chambre (15 sec choix - Figure 3F). Si on leur donne le choix de 5 sec 17% ± 3.3 de CS et 14% ±2,5 w de 1118 à Cs 10 atteint flacon supérieur (statistiquement pas différents, données non présentées).

Les chercheurs qui utilisent la chambre de l'espace social doivent également veiller à ce qu'ils répètent leurs expériences dans le même temps de la journée. Pour les deux Canton-S et W 1118 Cs 10 mâle vole, le temps de la journée affecté les interactions sociales. Par rapport aux heures de la journée (heure Zeitgeber - le temps en heures après l'apparition de la lumière - ZT4 à ZT7), les mouches testés dans la soirée (ZT11 à ZT12 - juste lumières avant off) a montré un espace social beaucoup plus grande pour les deux génotypes, bien que leur différence relative de l'espace a été préservée - c.-à-w 1118 CS 10 mouches sont encore moins social que Canton-S vole dans la soirée (figure 4A). Fait intéressant, seulement l'espace social de Canton-S mâles, mais pas Tchapeau de femmes augmente dans la soirée, mais il y avait une tendance vers une plus grande variation de l'espace social pour les mouches femelles dans la soirée (figure 4B). Nous avons déjà fait indépendamment les mêmes observations 24.

Comme nous l'avons indiqué précédemment en utilisant une ligne Oregon-R à étudier l'effet du bisphénol A (BPA) 2, la chambre de l'espace social est également sensible à l'arrière-plan génétique de la drosophile. Ici, nous montrons que Elwood, une ligne de type sauvage a récemment pris, avait augmenté l'espace social par rapport à Canton-S et Samarkand, mais pas de l'Oregon (Figure 5). Les espaces sociaux de Samarkand et de l'Oregon ne sont pas significativement différents les uns des autres, mais à la fois plus grand que l'espace social de Canton-S (Figure 5). Ces données montrent que dans un environnement donné, différentes souches de type sauvage consanguine et disposent d'un espace social différent, indiquant une composante génétique du comportement. Il indique également que la soinsitivity de ce test exige donc que les mouches soient par croisement en fonds génétiques appropriés avant l'expérimentation. Cela aidera à assurer que les différences, les similitudes ou inversement, vu dans l'espace social sont dus au facteur testé.

Figure 1
Figure 1. L'espace social des composants de la chambre et l'arrangement. (A) des chambres de l'espace social de différentes dimensions peuvent être construits en utilisant les mêmes plaques de verre (17,6 cm par 17,6 cm par 0,3 cm) et les entretoises acryliques en forme de triangles rectangles (d'une hauteur de 16,5 cm, une base de 8,9 cm, et une épaisseur de 0,3 cm - indiqué par une lettre minuscule a) et rectangles (9 cm par 1,5 cm par 0,3 cm. - indiqué par une lettre minuscule b) (B) La plus grande chambre de l'espace social, comme décrit dans 1 est adapté pour 30-40 vol. Il a dim intérieureensions de 16,5 cm par 16,5 cm par 14,5 cm, donnant une superficie de 86,45 cm 2, et conduisant à une zone de 2,16 cm 2 par volée pour 40 vol. (c) une taille chambre optimales pour 20 mouches. Il a des dimensions intérieures de 16,5 cm par 14,5 cm par 5,96 cm, donnant une superficie de 43,25 cm 2, et conduisant à une zone de 2,16 cm 2 par volée. (D) plus petite chambre, optimal pour 15 mouches. Il a des dimensions intérieures de 10,2 cm par 8,9 cm par 8,9 cm, ce qui donne une superficie de 32,45 cm 2, et conduisant à une zone de 2,16 cm 2 par la mouche. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Orientation de la chambre et la taille du groupe, mais pas la densité, affecte l'espace social. Les données sont représentées dans une boîteà moustaches de la distance du plus proche voisin dans la chambre, avec la boîte représentant le 1 er quartile (25 e pour cent) et la 3 e quartile (75 e pour cent), la ligne dans la boîte représentant la médiane, et les moustaches de Tukey . (AB) représentatif des données montre que l'augmentation du nombre de mouches dans une chambre de la même taille conduit à des mesures spatiales sociale stables. Groupes de 10 à 70 mâles Canton-S mouches ont été mis dans la chambre plus grande de l'espace social vertical et laisse décanter pendant 30 min; la distance au voisin le plus proche de chaque volée a été enregistré. Groupes ayant moins de 15 mouches avaient l'espace beaucoup plus sociale que les groupes ayant plus de 20 mouches dans la grande chambre. (A) des groupes de 10 n = 9, 20 n = 9, 30 n = 8, 40, n = 8, Kruskal -Wallis essai p <0,0001, test de comparaison multiple de Dunn: chaque lettre indique groupes statistiquement différent d'un # b p <0,0001 (B) <./ strong> Groupes de 15 n = 6, 40 n = 8, 50 n = 5, 60 n = 6, 70 n = 5, Kruskal-Wallis essai p <0,0001, un # b p <0,001. (c) lorsque le taille de la chambre est ajustée pour maintenir la densité de mouche (respectivement 15 dans le petit 20 dans le milieu ou 40 dans une grande chambre, à chaque fois à une densité de 2,16 cm 2 pour mouche, aucune différence significative est observée lors de l'essai à la verticale. (D ) Mais quand ces chambres spatiales sociales sont placés horizontalement les groupes qui avaient 15 ou 20 mouches ont une plus grande distance de la voisine la plus proche par rapport à des groupes ayant de 40 vol (groupes de 15 n = 3, 20 n = 4, 40 N = 4, Kruskal -Wallis essai p <0,0001, comparaison multiple de Dunn tester un # b p <0,01). (E-F) La distance à toutes les mouches a été mesurée pour les groupes de 15, 20, et 40 mâles Canton-S mouches placé à la fois verticalement et orienté horizontalement chambres. Plus la quantité de mouches dans la chambre, plus la distance à tousmouches ((E): les groupes de 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis essai p <0,0001, comparaison multiple de Dunn tester un # b p <0,01; (F): les groupes de 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis essai p <0,0001, comparaison multiple de Dunn tester un # b # c p <0,0001). Note: (A, B et CF) montrent des données obtenues dans dans 3 régions géographiques différentes et des paramètres de laboratoire ainsi différents (A) Région 1: UCLA, Los Angeles, CA; (B) Région 2:. Collège York, NY, NY; (CF) Région 3:. Université Western, London, ON S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. o Orientationf la chambre de l'espace social peut être utilisé pour contrôler les facteurs de confusion géotaxie problèmes (A - C):. Des groupes de 40 mâles Canton-S mouches qui ont été soit infectés par P. rettgeri pendant sept jours ou injecté avec les médias en tant que contrôle ont été mis dans une chambre de l'espace social soit verticalement (A) ou horizontalement (B) positionné et laisse décanter pendant 30 min. La distance au voisin le plus proche de chaque volée a été enregistré. Les données sont représentées dans une parcelle de la distance au voisin le plus proche dans la chambre boîte et moustache, avec la boîte représentant le 1 er quartile (25 e pour cent) et la 3 e quartile (75 e pour cent), la ligne dans la boîte représentant la médiane, et les moustaches de Tukey. (A) des données représentatives montre une augmentation dans l'espace social pour les mouches qui sont infectés avec P. rettgeri et placé dans une chambre de l'espace social positionné verticalement,comparé à l'injection avec les médias (test de Wilcoxon-Rang: chaque lettre indique groupes p statistiquement différent <0,0001, n = 6) (B) montre les données représentant l'espace social est pas affectée par P.. infection rettgeri lorsque les mouches sont placés dans une chambre de l'espace social positionné horizontalement (test de Wilcoxon-Rang: p> 0,1, n = 5) (C) A contre-courant l'appareil a été utilisé pour évaluer le comportement d'escalade de deux mouches infectées et de contrôle des médias.. Mouches infectées grimpent plus mal que leurs commandes multimédias (mouches ~ âgé de 12 jours, le graphique représente l'indice moyen des performances ± SEM:% de mouches dans la moitié supérieure de la fiole au choix 5 sec; deux test t bilatéral avec correction de Welch; n = 6 de ~ 60 mouches, chaque lettre indique p groupes statistiquement différent = 0,08) (D - F):. chambres verticalement et horizontalement positionnés, soit triangulaires ou circulaires, ont été utilisés pour comparer l'espace social de Canton-S (CS) aveccelui de 1118 w Cs 10 (W). Les données sont représentées dans une parcelle de la distance au voisin le plus proche dans la chambre boîte et moustache, avec la boîte représentant le 1 er quartile (25 e pour cent) et la 3 e quartile (75 e pour cent), la ligne dans la boîte représentant la médiane, et les moustaches de Tukey. Dans les deux l'espace social des orientations et des formes chambre, w 1 118 Cs 10 eu un espace social supérieur à Canton-S ((D), triangle vertical: test de Kruskal-Wallis, chaque lettre indiquant les groupes statistiquement différents p <0,0001, (E), cercle horizontal: test de Kruskal-Wallis, chaque lettre indique groupes statistiquement différent p <0,01). (F)) Un appareil à contre-courant a été utilisé pour évaluer le comportement d'escalade à la fois de Canton-S et W 1118 CS 10souches (mouches vieux 3-5 jours, le graphique représentent la moyenne indice de performance ± SEM:% de mouches dans le top 15 choix au flacon sec). Il n'y avait pas de différence dans la capacité entre soit Canton-S ou 1118 w CS 10. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. L'espace social des hommes est augmenté au cours de la soirée. (A) des données représentatives montre un espace social augmenté entre mâle vole pendant les heures de la soirée ("soir" ZT 11-12, avant de lumières) par rapport aux heures de la mi-journée («jour "ZT 4-7). Groupes de 40 Canton-S mouches et w 1 118 Cs 10mouches ont été mis dans une chambre de l'espace social soit pendant heures de la journée ou de soirée et laisse décanter pendant 30 min. La distance au voisin le plus proche de chaque volée a été enregistré. Pour les deux génotypes, les mouches accrue espace social dans la soirée et les différences entre les souches ont été maintenus quel que soit l'heure du jour (n = 6-7, Kruskal-Wallis essai p <0,0001, test de comparaison multiple de Dunn: chaque lettre indiquent les groupes statistiquement différent p < 0,01). (B) Lorsque Canton-S mouches ont été séparés par sexe seuls les hommes ont montré une augmentation dans l'espace social dans la soirée (t p <0,01), même si une tendance non significative pour la variation interne plus grand est chez les femelles (Kruskal -Wallis test, chaque lettre indique groupes p statistiquement différent <0,0002). Les données sont représentées dans une parcelle de la distance au voisin le plus proche dans la chambre boîte et moustache, avec la boîte représentant le 1 er quartile (25 e pour cent) et le 3e quartile (75 e pour cent), la ligne dans la boîte représentant la médiane, et les moustaches de Tukey. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Fond génétique des mouches affecte l'espace social. Groupes de 40 Canton-S, Samarkand, Oregon, et Elwood mouches ont été mis dans une chambre de l'espace social et laisse décanter pendant 30 min. La distance au voisin le plus proche de chaque volée a été enregistré. Distributions des groupes sont différents (test de Kruskal-Wallis, p <0,0001), les groupes ne partageant pas une lettre commune sont significativement différentes. Les données sont représentées dans une boîte et moustache pbeaucoup de la distance au voisin le plus proche dans la chambre, avec la boîte représentant le 1 er quartile (25 e pour cent) et la 3 e quartile (75 e pour cent), la ligne dans la boîte représentant la médiane, et les moustaches de Tukey (Dunnet de comparaison multiple test, p <0,05 [d], p <0,001 [a, b, c], 3 répétitions indépendantes avec 1-2 répétitions internes, telles que pour Elwood et Samarkand n = 3, l'Oregon et Canton-S n = 4 ). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, une procédure détaillée pour la quantification de l'espace social a été décrit. Certaines étapes cruciales pour assurer l'expérience est réussie sont: 1) utilisez toujours des gants lors du nettoyage et mise en place de l'appareil, de garder vos propres huiles et parfums au large de la chambre intérieure de l'appareil, 2) assurer mouches sont prélevés au moins un jour avant l'expérience afin de réduire les effets potentiels de l'anesthésie froid, 3) 2 h avant l'expérience de fournir de nouveaux flacons contenant des aliments frais pour assurer les mouches ne sont pas affamés, et se sont nettoyés, 4) Au cours de ces 2 heures, laisser les mouches acclimater à leur nouvel environnement, 5) noter les conditions de température et d'humidité lors de l'exécution des expériences; essayer de garder leur cohérence entre 24-25 ° C et 50% d'humidité, 6), veillez à ne pas déranger les chambres de l'espace social lors de l'exécution de l'expérience, et 7) réaliser l'expérience au même moment de la journée, de préférence entre temps Zeitgeber ZT4 et ZGT7.

Espace social ne dépend que de la densité de vol à l'intérieur de la chambre, et ne dépend pas de la taille du groupe, dans la mesure où il existe une taille minimale de groupe remplies.Les mouches vont maintenir le même espacement sociale entre eux, indépendamment de la quantité de membres du groupe. Toutefois, la distance à tous les mouches dans la chambre, comme prévu, est affectée par la taille du groupe, ainsi que l'orientation de la chambre. Il est important de noter que, malgré l'orientation horizontale étant difficile à utiliser (vol ne se déposent pas facilement), et conduisant à la séparation réduite entre les génotypes en main (figure 3D par rapport à 3E), Burg et al. 3 utilisé avec succès un horizontal , chambre carrée. Dans leurs expériences, la distance à plus proche voisin était plus semblable à nos résultats de l'espace social orientées verticalement. Cependant, dans leur chambre, il y avait un flux d'air continu qui peuvent avoir contribué à espacement d'un groupe social de vol étant plus semblable à notre chambre verticale à la place de notre chambre horizontale. Une limitation à l'utilisation de chambres verticales est la capacité à tester et ayant des Drosophila mobilidéficiences ty. La chambre de l'espace social exige vol pour être mobile afin qu'ils puissent choisir à quelle distance de leur voisin, ils veulent être. Si les mouches étaient immobiles ou avait des déficits d'une certaine façon, ils peuvent ne pas être en mesure de former des groupes stables correctement dans la chambre. Un remède potentiel de mauvaise locomotion serait d'utiliser ensuite chambres horizontales, ou de permettre plus de temps pour les mouches à régler avant de prendre la photo. Les chercheurs doivent également évaluer et capacité à monter possibles dépréciations geotactic de mouches pour voir si la chambre de l'espace social vertical est approprié. Si il y a des déficits dans l'un de ceux-ci, positionnés horizontalement chambres peuvent être utilisées pour les éviter.

Fait à noter, si l'escalade activité ou de l'endurance et de la santé globale de la mouche aura une incidence sur la mesure de l'espace social, nous montrons que les niveaux d'activité ou de locomotion ne sont pas corrélés avec l'espace social. Dans une autre étude, nous montrons que un traitement qui diminue la locomotion, (alimentation BPA) diminuent également socialeSpace 2. Mais mutants de rugueux (un orthologue drosophile du gène neurobeachin autisme candidat) affichage hyperactivité et augmenté l'espace social 4. Enfin, mouches mutantes blancs affichent une augmentation de 1,3 dans l'espace social, sans aucune augmentation de la locomotion ou géotaxie 18. En bref, plusieurs combinaisons de niveau d'activité et de l'espacement sociale ont été observées jusqu'ici, indiquant l'absence de corrélation entre les deux comportements. En fait, l'espace social ne correspond pas nécessairement à d'autres comportements sociaux soit, comme l'évitement sociale 8,25, suggérant différents circuits neuronaux sous-jacent. Par exemple, des mutants de rugueux affichage / de neurobeachin augmenté espace social et réduit évitement social 4; mais blanc a augmenté à la fois l'espace social, et très fort évitement social 4.

Comme le temps de la journée affecte l'espace social, au moins chez les hommes, il est Critical que les chercheurs sont conscients du temps de la journée où leurs expériences sont réalisées et d'efforts sont faits pour maintenir une constante de temps pour toutes les expériences. Autres considérations qui devraient être pris en compte comprennent l'âge, le sexe, et l'état de l'accouplement des mouches. Nous savons que la distance sociale est augmentée dans vierge par rapport à l'individu accouplés, à la fois pour les hommes et les femmes 1, et nous montrons maintenant que les hommes sont moins proches que les femmes dans la soirée (figure 4B). Strain différences sexuelles spécifiques dans les niveaux de vol simples pendant la journée d'activités a été décrit précédemment, en proposant que les hommes de l'activité locomotrice plus élevé dans le matin et le soir par rapport au temps de la journée pourrait être liée à leur comportement de cour 26,27. Cependant, dans notre cas, les sexes sont séparés, mais les mouches sont regroupés, et au moment où nous mesurons leur espace social, les mouches se sont installés. Fujii et al. 27 rapport que le rythme circadien dans des paires de mâles gardéont ensemble un rythme quotidien erratique, sans pointes claires, lorsque le rythme de paires féminines ressemble à celle des mouches simples. Ainsi, l'augmentation de l'espacement des mâles dans la soirée est probablement pas lié à une augmentation des comportements de cour ou augmentation spécifique de l'activité locomotrice, et la raison qui sous-tend le dimorphisme sexuel de ce comportement doit être davantage étudié.

Dans cette étude, les mouches doivent toujours être séparés par sexe pour l'expérience si les différences dans les interactions sociales entre les hommes et les femmes peuvent être vus. Enfin, nous avons actuellement ne savons pas encore comment l'âge affecte les interactions sociales de mouches. Par conséquent, nous recommandons que les expériences spatiales sociaux sont effectuées avec des mouches pas âgés de plus de sept jours, divers spectacles de comportement, y compris l'activité d'escalade sont connus pour être affectés dans les mouches plus d'une semaine 22.

Un examen final pour l'espace social est les variations observées dans la médianedistance sociale. Des mesures de l'espace social ont été prélevés à divers endroits, y compris (Los Angeles, CA: Figure 2A; New-York, NY: Figure 2B, la figure 3D, la figure 4, la figure 5; London, ON: Figure 2C-F, Ithaca, NY: Figure 3A, B, tous dans le même arrière-plan Canton-S). Variables inconnues qui ne sont pas constante entre zones géographiques, ou les paramètres de laboratoire, ont affecté la distance sociale médiane. Facteurs possibles incluent différents aliments, l'altitude, la pression atmosphérique en elle-même, et le changement de la pression atmosphérique 28. Bien que les médianes étaient pas constante entre les lieux, dans un endroit les médianes sont très constante et reproductible; et les tendances et les tendances observées dans les mesures de l'espace social est resté le même entre les sites. Par conséquent, aussi longtemps que les chercheurs maintenir des conditions constantes interne, ils seront unble pour détecter des différences dans l'espace social.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Jazz-mix Fisher 33545 any other standard drosophila food would work
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
 Sharpie pens
Adhesive Tape
Medium size binder clips Staples to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity
small SupportStands Carolina  707161 to hold the chambers in a vertical orientation
Buret clamps Carolina 707362
Digital Camera Nikon  Coolpix S8000  to take the still pictures
small ruler to be able to scale the picture
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
pounding pad any mouse pad works.
Prism 6 GraphPad Software Inc. Prism 6 for Mac OS X Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work

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References

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