Condizioni che influiscono spazio sociale in
1Department of Biology, University of Western Ontario, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Entomology, Cornell University

Neuroscience

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McNeil, A. R., Jolley, S. N., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Milunovich, A. J., Chambers, M. C., Simon, A. F. Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (105), e53242, doi:10.3791/53242 (2015).

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Abstract

Il test spazio sociale qui descritto può essere utilizzato per quantificare le interazioni sociali di Drosophila melanogaste r - o di altri piccoli insetti - in modo semplice. Come abbiamo precedentemente dimostrato 1, in una camera a due dimensioni, abbiamo prima forza linea per formare un gruppo compatto, successivamente consentendo loro di loro distanza preferito l'uno dall'altro. Dopo che le mosche si sono stabiliti, si misura la distanza dal vicino più prossimo (o spazio sociale), l'elaborazione di un quadro statico con il software online gratuito (ImageJ). L'analisi della distanza del vicino più prossimo permette ai ricercatori di determinare gli effetti di fattori genetici e ambientali sulla interazione sociale, mentre il controllo di potenziali fattori di confondimento. Diversi fattori quali la capacità di arrampicata, l'ora del giorno, il sesso, e il numero di mosche, possono modificare la spaziatura sociale di mosche. Ci proponiamo quindi una serie di controlli sperimentali per mitigare questi effetti confondenti. Questo test puòessere utilizzato per almeno due scopi. In primo luogo, i ricercatori possono determinare in che modo il loro turno ambientale preferito (come l'isolamento, la temperatura, lo stress o tossine) avrà un impatto sociale, spaziatura 1,2. In secondo luogo, i ricercatori possono sezionare le basi genetiche e neurali di questa forma di base del comportamento sociale 1,3. In particolare, abbiamo usato come uno strumento diagnostico per studiare il ruolo dei geni ortologhi si ritiene siano coinvolti nel comportamento sociale in altri organismi, come i geni candidati per l'autismo negli esseri umani 4.

Introduction

Le interazioni sociali sono fondamentali per il corretto sviluppo e la salute degli individui all'interno di un gruppo nel suo insieme, e possono essere osservati tra le numerose specie, dagli esseri umani (Homo sapiens) a organismi più semplici come i moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) 5,6. Un individuo moscerino della frutta o di condivisione umana mezzi comuni per elaborare le informazioni sensoriali durante queste interazioni, che si tratti di: uditiva, visiva, olfattiva, tattile o gustation. Noi e gli altri ipotizzare che ci sia un neurocircuitry potenzialmente condivisa sottostante risposte comportamentali alle interazioni sociali, e che le cellule neuronali e geni coinvolti potrebbe essere evolutivo conservati 7. Una volta che si è verificato l'interazione iniziale, lo spazio sociale tra gli individui interagenti sarà o aumento (evitamento sociale 8) o diminuire (formazione di gruppi / aggregazione 5). Interazioni più complesse, come l'aggressività o di corteggiamento, possono quindi prendere posto.

Drosophila melanogaster, usati nei seguenti studi 1-4,9. Spazio sociale si riferisce ad una misura della distanza tra una mosca e il suo vicino più vicino 10. Spazio sociale è coerente per una data popolazione di D. melanogaster quando le condizioni sperimentali sono conservati (in media circa in 1-2 lunghezze corpo), e varia rispetto alla esperienza sociale di linea, aumentando se l'individuo è stato tenuto in isolamento 1. La corretta visione è necessario per mantenere normale la distanza sociale, ma non odoranti classiche o percezione CVA 1. Misura dello spazio sociale può quindi essereutilizzato come strumento diagnostico per analizzare le interazioni sociali e quantificare il comportamento sociale in D. melanogaster 1. Descriviamo qui in dettaglio come eseguire questa quantificazione, e in che misura variabili sperimentali comuni influenzano questo comportamento.

Si dimostra che l'orientamento della camera in cui viene eseguito il test, così come il numero di mosche - in misura - fare colpisce spazio sociale. E 'stato precedentemente dimostrato che la geometria della camera colpisce spontaneo movimento esplorativo di mosche 11,12, e questo fenomeno potrebbe in ultima analisi, avere un impatto in cui decidono di stabilirsi. Tuttavia, finché la densità mosca (fly / cm 2) e l'orientamento della camera è mantenuta la stessa, lo spazio sociale della linea rimane costante. La robustezza di questo test è illustrata dal fatto che laboratori indipendenti utilizzando diverse dimensioni della camera, la forma e l'orientamento in grado di replicare il risultato visualizzato dal mutanti del whgene ite (che colpisce pigmentazione dell'occhio), che è uno spazio sociale incremento (triangolo verticale o cerchio orizzontale in 1, piazza orizzontale con flusso d'aria in 3).

I nostri risultati indicano anche che mantenere il momento in cui viene eseguito l'esperimento spazio sociale è fondamentale per la coerenza dei risultati, come abbiamo dimostrato che i maschi, ma non le femmine, sono più distanti la sera. Tuttavia, le differenze tra le viste diurne e serali ore non sono dovute a differenze di attività di linea, e discutiamo argomenti che indicano che i livelli di attività non sono correlati con lo spazio sociale.

Infine, ci sono basi genetiche alla determinazione dello spazio sociale, come indicato dal mutante bianco già descritto 1,3, e le differenze tra i vari ceppi inbred e catturati in natura di mosche che vi presentiamo qui.

Pertanto, questo test rappresenta un eccellente strumento fo studiare gli effetti della genetica e fattori ambientali.

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Protocol

1. Attrezzature e reagenti creato in casa (vedi elenco dei materiali per gli Altri)

  1. Preparare un apparato di anestesia fredda Drosophila come descritto in precedenza 8.
  2. Preparare un aspiratore mosca come descritto in precedenza 13.
  3. Preparare camere spazio sociale e titolari.
    1. Ordinare o fare lastre di vetro e distanziali acrilico per creare le camere di spazio sociale. Ogni camera di spazio sociale è costituito da due lastre di vetro quadrati (17,6 cm per 17,6 cm, con uno spessore di 0,3 cm), due giusti distanziali triangolo acrilico (con un'altezza di 16,5 cm, una base di 8,9 cm, con uno spessore di 0,3 cm ), e due spazi rettangolari (9 cm per 1,5 cm con uno spessore di 0,3 cm) (Figura 1A).
    2. Montare il vetro e acrilico camera spazio sociale tale che è identica alla camera in Figura 1B. Per fare ciò, iniziare inserendo un distanziale triangolare piatta sulla parte superiore di un pannello quadrato di vetro in modo che l'angolo rettodel distanziale triangolare è allineato con uno degli angoli del riquadro quadrato. Successivamente, posizionare il secondo distanziale piatto triangolare sulla parte superiore del pannello piazza, rispecchiando il primo distanziale triangolare.
      NOTA: Assicurarsi di indossare i guanti per non contaminare i pezzi con oli e profumi dalle vostre mani.
    3. Inserire due piccoli distanziatori rettangolari piane sopra il riquadro piazza, lungo il lato del pannello che non è coperto. I distanziatori acrilico sulla parte superiore del piano piazza ora dovrebbero formare un'arena triangolare.
    4. Posizionare un secondo pannello quadrato di vetro sulla parte superiore dei distanziali acrilici tale che sia allineato sopra il riquadro originale di vetro inferiore.
    5. Utilizzare quattro clip legante per fissare i vetri e distanziali insieme per formare la camera di spazio sociale. Inserire una clip vicino all'angolo, sul lato lungo ciascuno dei distanziatori triangolari, fissandoli all'interno delle lastre di vetro. Su questi stessi lati, inserire una clip in un angolo adiacente, su ciascuno dei distanziatori rettangolari, fissandoli inlato i vetri.
    6. Assemblare un cavalletto di sostegno ed un morsetto matraccio tale che il morsetto manterrà la camera spazio sociale in posizione verticale, come la camera di spazio sociale poggia sul suo bordo sulla parte superiore della superficie di lavoro.
    7. Per ogni ripetizione nell'esperimento, assemblare una camera di spazio sociale e sostenere stare.
  4. Preparare un apparato di risposta test arrampicata per verificare la capacità di salita delle mosche testati.
    1. Utilizzare un apparato in controcorrente, come precedentemente descritto 14,15.
  5. Garantire un'illuminazione omogenee eseguendo l'esperimento su una superficie di lavoro coperto con un coperchio panchina bianca e di fronte a uno sfondo bianco.

2. Preparazione delle mosche prima dell'esperimento

  1. Mantenere mosche in flaconi contenenti standard di Drosophila volare cibo. Tenerli in una camera di incubazione a 25 ° C su una luce 12 hr / buio ciclo.
  2. Uno o due giorni prima della postaXperiment, raccogliere e sesso vola in anestesia freddo, come descritto in precedenza 8.
    1. Raffreddare l'apparecchio di anestesia freddo a -4 ° C. Luogo vola in 50 ml provette di plastica. Immergere completamente le provette di plastica contenenti mosche in ghiaccio in un secchio di ghiaccio isolato, attendere almeno 5 minuti per le mosche di diventare immobile.
    2. Posizionare linea sul foglio di polietilene dell'apparato anestesia fredda. A RT, utilizzare uno stereomicroscopio per separare i maschi dalle femmine. Mantenere le mosche, in gruppo, in flaconi contenenti norma Drosophila volare cibo, non supera i 40 mosche per flaconcino.
  3. Due ore prima dell'inizio dell'esperimento, assicurarsi che la temperatura della stanza in cui verrà eseguita l'esperimento è compresa tra 24-25 ° C e l'umidità è circa il 50%.
  4. Trasferire le mosche in nuove fiale contenenti cibo, e metterli per 2 ore sul piano di lavoro in cui verrà eseguita l'esperimento.
    NOTA: Per questi speriments, i ceppi mosca utilizzati sono stati Drosophila ceppi melanogaster: Cantone-speciali o Canton-S (CS), w 1118 Cs 10 (o W - w 1118 outcrossed 10 volte di Canton-S), Oregon e Samarcanda mosche erano tutti dal nostro laboratorio 16 titoli; Mosche Elwood sono stati raccolti in autunno 2011 nel quartiere Elwood di Huntington, a Long Island, New York, Stati Uniti d'America 8. A parte quando diversamente specificato, i risultati presentati sono stati ottenuti con Canton-S mosche (nei toni del rosso).

3. Esecuzione dell'esperimento

  1. Eseguire l'esperimento 12:00-03:00 (ora Zeitgeber - il tempo in ore dopo l'insorgenza di luce - di ZT 4-7).
  2. Preparare la camera di spazio sociale per il trasferimento di mosche.
    1. Posizionare una TV camera di spazio sociale su un piano di lavoro, con il lato contenente distanziatori rettangolari più vicini al vostro corpo.
    2. Rimuovere one fermaglio più vicino il vostro corpo e far scorrere un distanziale rettangolare verso l'esterno, creando un gap di circa 1 cm tra i distanziatori rettangolari.
    3. Con del nastro e un pennarello, etichettare la camera di spazio sociale in un angolo superiore con il sesso, lo sforzo, e il numero di ripetizione. Fare attenzione al fine di garantire il nastro non copre parte dell'arena triangolare interno.
  3. Trasferire le mosche nella camera di spazio sociale.
    1. Trasferimento vola da loro flacone contenente cibo in un nuovo, fiala vuota. Aspirare aria dal fiala vuota e trasferirli nella camera di spazio sociale.
      1. Inspirate per disegnare le mosche nella punta dell'aspiratore. Posizionare la punta nella fessura 1 cm tra i distanziatori rettangolari della camera di spazio sociale ed espirare a un ritmo costante per forzare linea nell'arena triangolare interno.
      2. Immediatamente far scorrere il distanziatore rettangolare al suo posto, chiudendo la base dell'arena triangolari interiore, e posizionare la clip legante indietro.
    2. Su un pad martellamento, che si trova sul banco diverso da quello in cui il lavoro sperimentale avviene, tenere la camera spazio sociale montante tale che i distanziatori rettangolari sono sul lato inferiore. Pound tre volte per garantire tutte le mosche sono caduti sul fondo dell'arena.
      NOTA: A causa del distanziale in acrilico che esce la più piccola dimensione della camera (Figura 1D), battere i gomiti sul piano di lavoro, pur mantenendo una presa sicura su apparati per garantire le mosche sono caduti sul fondo.
    3. Avviare un timer.
    4. Posizionare la camera spazio sociale sul piano di lavoro e utilizzando il cavalletto pallone di supporto e morsetto per tenerlo in posizione verticale. Posizionare un righello o un adesivo di lunghezza nota piatto contro la camera di spazio sociale, ma non a copertura di qualsiasi parte dell'arena triangolare interno.
      1. Per gli esperimenti in posizione orizzontale, non posizionare la camera di spazio sociale nel cavalletto di sostegno; invece porre l'appartamento camera di spazio sociale sul piano di lavoro.
      2. Quando le mosche si sono stabiliti, di solito dopo circa 30 minuti, scattare una foto della camera di spazio sociale. Assicurarsi che il telaio contiene l'intera arena interna triangolare, il sovrano, e l'etichetta.
      3. Ripetere l'esperimento per ogni genotipo e condizione (idealmente 3 repliche interne e 3 ripetizioni indipendenti).

      4. Analizzare lo spazio dati sociale

      1. Importare i seguenti macro in ImageJ 17
        1. ImageJ è disponibile qui: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
        2. È possibile creare un comando 'misurare le distanze "nel menu Plugin salvando le macro di seguito in un file chiamato' Measure_Distances.txt 'nella cartella di ImageJ / plugins, nella sottocartella macro, e con il comando Aiuto> comando Update Menu'.
        3. Copia in un file .txt le macro che sono forniti in dati supplementari e sono stati originariamente pubblicati in 3.
      2. Caricare le foto su un computer, e aprire uno picture utilizzando ImageJ.
        1. Creare una scala tracciando una linea da 0 cm a 1 cm segni sul righello nella foto, e sotto la scheda Analizza, scegli la funzione Imposta Scala per impostare una scala di 1 cm per quella distanza (stesso approccio per la vignetta di lunghezza nota). Scegliere l'opzione globale prima di applicare la scala per l'immagine.
        2. Ritagliare l'immagine utilizzando la funzione Ritaglia nella scheda Immagine tale che include tutte le mosche, mentre la rimozione come gran parte del resto del quadro il più possibile.
        3. Rendere l'immagine in bianco e nero, scegliendo a 8 bit dall'opzione Tipo nella scheda Immagine.
        4. Rimuovere tutti i rumori di fondo dal quadro andando alla funzione Soglia sotto l'opzione Regola della scheda Immagine. Trascinare i cursori per aumentare o rimuovere il contrasto in modo che il corpo di ciascun volo può essere visto chiaramente senza altre marcature nell'immagine. Se ci sono segni che non sono le mosche, li cattura con lo strumento rettangolare ed eliminarli.
        5. Impostare ille misurazioni utilizzando lo strumento Misure Imposta nella scheda Analisi. Selezionare Area, Centro della Messa, Centroid, e Etichetta visualizzata. Quindi, scegliere il Particelle Analizza presentano nella scheda Analizza per creare un elenco numerato di tutte le macchie nere che rappresentano mosche.
          1. Quando si utilizza Analizzare le particelle; Dimensioni set 0,01-0,1 (non scegliere unità pixel); circolarità 0,00-1,00; mostrare contorni; visualizzare i risultati, e aggiungere al responsabile.
          2. Assicurarsi che ogni macchia nera (ogni particella) è una rappresentazione accurata delle mosche che sono nell'immagine originale, confrontando l'elenco numerato per l'immagine originale.
            NOTA: Se alcune mosche che sono molto vicine tra loro contati come una particella, disegnare manualmente una linea bianca per separare le due mosche sull'immagine binaria.
        6. Mentre è selezionato nell'elenco, utilizzare il vicino più vicino - Lista distanze macro sotto la seconda opzione Macro nella scheda Plugin per creare un nuovo elenco contenente le distanze, in cm, da EAch volare a loro vicino più prossimo.
      3. Copiare i più vicini distanze vicine da ImageJ e incollarlo in una colonna di un foglio di calcolo.
        1. Compilare tutti i dati di ogni ripetizione sullo stesso foglio di calcolo e di organizzare per il genotipo e condizione.
      4. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software statistico. In questo esperimento, Grafico Pad Prism (versione 6 per MacOSX, GraphPad Software, San Diego California, www.graphpad.com) è stato utilizzato per condurre un ANOVA e test Kruskal-Wallis, Tukey e post-hoc test di Dunnet.
      5. La distribuzione delle distanze segue una distribuzione non parametrica 1, ei dati sono rappresentati come scatola e baffi di Tukey (per eliminare outliers).

      5. Arrampicata Assay (comportamento di controllo)

      1. Utilizzare un test di arrampicata come un controllo di mosche di prova di salita 14,15,18.
        1. Utilizzare l'apparato controcorrente tale che tre prove cun essere eseguito in parallelo.
      2. Trasferire 50 a 100 mosche ingenui (mosche, che non sono stati testati in precedenza) in tre fiale di test differenti, e li scattare in 1 °, 3 ° e l'ultimo slot nella parte inferiore di apparecchi controcorrente, con le fiale freschi vuoti nelle posizioni opposte.
      3. Luogo fresco, i flaconi vuoti negli slot vuoti nella parte inferiore dell'apparecchiatura.
      4. Premere giù dell'apparecchiatura tre volte, in modo che tutte le mosche sono in fondo di ogni tubo, per iniziare l'esperimento.
      5. Avviare il timer per 15 secondi (tempo sufficiente per ~ 100% di 3-7 giorni di età Canton-S per raggiungere la fiala superiore - vedi figura 3F).
      6. Far scorrere la parte superiore dell'apparecchiatura controcorrente, per spostare i primi flaconi di uno slot.
      7. Raccogliere mosche toccando l'apparecchio verso il basso, per portare tutte le mosche nei flaconcini di fondo.
        1. 1 ° e 2 tubi nd (o 3 ° e 4 °, 5 ° 6 °) corrispondono rispettivamente alle mosche che non hanno raggiunto verso l'alto e le mosche che hanno raggiunto la fiala superiore.
      8. Calcolare il Performance Index (PI).
        1. Contare il numero di mosche in ogni fiala.
        2. Il PI è la percentuale di mosche in grado di salire sul tubo superiore.
        3. I mezzi di PI seguono una distribuzione normale 1, ei dati sono rappresentati come grafici delle colonne di media più o meno l'errore standard a media (SEM).
          NOTA: In alternativa, il PI può essere calcolata come la percentuale di mosche in grado di raggiungere la parte superiore della fiala inferiore (per le mosche anziani, 5 sec è il tempo sufficiente per quantificare una differenza in salita tra infette e non infette 12 giorni Canton-S quantificati da un fermo immagine: vedere i risultati). Altri hanno usato diverse misure di performance geotassi negativi improvvisi indotto, che sono anche opportuno quantificare salita 19-22.

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Representative Results

La camera di spazio sociale può essere utilizzato come strumento per quantificare il comportamento sociale di Drosophila melanogaster. Distanziatori acrilico e vetri sono ritagliati insieme per formare un'arena triangolare interno che fornisce una superficie a due dimensioni in cui vola può formare gruppi stabili senza la presenza di molti spunti potenzialmente confondenti. Quando le mosche sono trasferiti per l'arena verticale, vengono sorpresi da essere sfruttato in giù, e rispondono con un comportamento di fuga: geotassi negativi. Salgono al vertice del triangolo retto, costretto in un gruppo compatto, e quindi sono previsti il ​​momento di passare ulteriormente formare l'un l'altro, e di esplorare l'arena. Dopo 20 a 40 min, si fermano in movimento, e un gruppo stabile è formato. La distanza tra ogni mosca e il suo vicino più prossimo può essere misurata da una foto, per fornire una quantificazione del loro spazio sociale preferita. Le mosche sono considerati più sociale più sono vicini ai loro vicini.

VolareDensità non gioca un ruolo nella spazio sociale nella camera fino al punto di sotto-capacità. Per un grande gruppo di 20 a 70 mosche nella grande camera verticale orientato, spazio sociale è indipendente dalla densità di gruppo (Figura 2A, B). Con solo 10 o 15 mosche nella camera di spazio sociale, non vi è più probabile popolazione sufficiente per formare un gruppo sociale stabile, portando ad un aumento di spazio sociale (Figura 2A, B). Tuttavia, la prova di un gran numero di mosche non è sempre conveniente - in determinate circostanze, quando il numero di individui mutanti è limitato, i ricercatori possono non essere in grado di raccogliere gruppi di mosche abbastanza grande per la dimensione standard della camera spazio sociale. Per facilitare la quantificazione spazio sociale con piccoli gruppi di mosche, i ricercatori possono manipolare la camera di spazio sociale tale che l'area dell'arena due dimensioni è più piccola ma la zona per volare rimane costante. Mostrato nella Figura 1C, D sono due tipi di socialecamere spaziali modificate per gruppi più piccoli ma mantengono la stessa densità camera più grande. In questo modo, mantenendo la densità mosca, e riducendo la dimensione della camera consente di ottenere un simile spaziatura sociale (Figura 2C).

Le stesse tendenze generali valgono per le camere spazio sociale poste in posizione orizzontale (Figura 2D). Tuttavia, possiamo osservare che le mosche tendono ad essere più distanti, in un ambiente del genere orizzontali, e non accontentarsi facilmente 1. I gruppi che hanno solo 15 e 20 mosche mostrano maggiore spazio sociale di gruppi con 40 mosche (F IGURA 2D).

Per confermare che il sovraffollamento non era responsabile per le distanze minori al vicino più prossimo visto in grandi gruppi di mosche, la distanza da ogni vola a tutte le altre mosche è stato misurato, come in 9. Quantificare la distanza da tutte le mosche, in funzione della distanza per il vicino più prossimo, consente la valutazione di un gruppo di behavio, anziché il comportamento degli individui all'interno di un gruppo. Come previsto, la distanza di tutte le mosche aumentata come la quantità di mosche nel gruppo era maggiore, un riflesso del gruppo stesso, non di singoli mosche. Questa tendenza è stata osservata per entrambe le camere spazi sociali posizionati verticalmente e orizzontalmente (Figura 2E, F). Pertanto, in linea di gruppi più grandi non sono stati costretti a mantenere una distanza più vicina al prossimo a causa di restrizioni di spazio. Invece, le mosche si formano i gruppi sociali più severe quando ci sono più di 15 mosche in camera.

Per quanto riguarda gli altri test comportamentali, un limite all'utilizzo della camera di spazio sociale è in verticale che non richiede le mosche senza geotassi o menomazioni arrampicata. Ad esempio, Canton-S vola infetto per una settimana con il batterio Gram-negativo Providencia rettgeri 23 possiedono un difetto arrampicata e esibiscono risultati diversi spaziatura sociale a seconda dell'orientamento della spaziatura socialiCamere. Quando il test è stato eseguito in verticale, lo spazio sociale delle mosche infettate era maggiore dello spazio sociale dei controlli, probabilmente perché le mosche infetti non erano in grado di formare un gruppo stabile nella parte superiore della camera (Figura 3A). Quando in linea alle stesse condizioni sono stati poi testati nelle camere di spazio sociale orientati orizzontalmente, non vi erano differenze significative, a indicare che la capacità locomozione è probabilmente meno di un fattore di spazio sociale nelle camere spazio sociale posizionati orizzontalmente (Figura 3B). Mentre le mosche infette sono visivamente meno in grado di salire rispetto ai controlli, questo può essere quantificato usando il saggio arrampicata (Figura 3C). Dopo 5 sec, circa il 44% di mosche controllo arrampicò fino alla metà superiore del flaconcino inferiore e solo il 32% di mosche infette. È opportuno notare che tutte le mosche in questo saggio salgono male (raramente raggiungono al flaconcino all'inizio, solo la parte superiore della fiala inferiore), che puòessere spiegato con il fatto che essi sono 12 giorni post-eclosion, che è quando le mosche iniziano a mostrare un difetto nella scalata dovuta all'invecchiamento 22.

Tuttavia, per i ceppi che non hanno difetti arrampicata, entrambi gli orientamenti delle camere portato agli stessi risultati, come abbiamo precedentemente dimostrato 1. In questo esperimento, lo stesso aumento di spazio sociale è stato osservato per Canton-S e 1118 w Cs 10 nel triangolo verticale o le camere circolari orizzontali (Figura 3D, E - rianalisi in scatola e basette dei dati pubblicati in 1). Non c'era differenza nella salita tra Canton-S e 1118 w Cs 10 indica che non è stato un fattore per la differenza di spazio sociale tra i ceppi in entrambi gli orientamenti camera (15 sec scelta - figura 3F). Se data 5 sec scelta il 17% ± 3,3 di CS e il 14% ±2.5 di w 1.118 Cs 10 raggiunto alla fiala superiore (statisticamente non differenti, dati non mostrati).

Ricercatori utilizzando la camera di spazio sociale devono anche garantire che ripetono loro esperimenti allo stesso tempo del giorno. Sia per Canton-S e w 1118 Cs 10 maschi vola, il tempo del giorno interessato interazioni sociali. Rispetto a ore diurne (tempo Zeitgeber - il tempo in ore dopo l'inizio della luce - ZT4 a ZT7), in linea testati in serata (ZT11 a ZT12 - appena le luci prima di fuori) ha mostrato una maggiore spazio sociale per entrambi i genotipi, anche se la loro differenza spazio relativo è stato conservato - vale a dire, w 1118 Cs 10 mosche sono ancora meno sociale di Canton-S vola in serata (figura 4A). È interessante notare che, solo lo spazio sociale dei maschi Canton-S, ma non tcappello delle donne aumenta in serata, anche se c'era una tendenza verso più ampia variazione dello spazio sociale per le mosche di sesso femminile la sera (Figura 4B). Abbiamo già fatto in modo indipendente le stesse osservazioni 24.

Come abbiamo riportato in precedenza utilizzando una linea di Oregon-R per studiare l'effetto del bisfenolo A (BPA) 2, la camera di spazio sociale è anche sensibile al background genetico di Drosophila. Qui, dimostriamo che Elwood, una linea di wild-type di recente catturato, era aumentato spazio sociale rispetto a Canton-S e Samarcanda, ma non Oregon (Figura 5). Gli spazi sociali di Samarcanda e Oregon non erano significativamente differenti fra loro ma sia maggiore dello spazio sociale Canton-S (Figura 5). Questi dati mostrano che in un dato ambiente, diversi ceppi inbred e wild-type hanno uno spazio sociale diverso, indicando una componente genetica al comportamento. Esso indica inoltre che il sénsitivity di questo test richiede in tal modo che le mosche si outcrossed in appositi background genetico prima di sperimentare. Ciò contribuirà a garantire le differenze, o al contrario le somiglianze, visto in spazio sociale sono dovute al fattore in fase di test.

Figura 1
Figura 1. Lo spazio sociale componenti della camera e la disposizione. (A) camere spazio sociale di varie dimensioni possono essere costruiti utilizzando gli stessi vetri (17,6 cm per 17,6 cm per 0,3 cm) e distanziali acriliche a forma di triangoli rettangoli (con un'altezza di 16,5 cm, una base di 8,9 cm, e uno spessore di 0,3 cm - indicato da un piccolo lettera a) e rettangoli (9 cm per 1,5 cm per 0,3 cm -. indicata da una piccola lettera b) (B) Il più grande camera spazio sociale, come descritto in 1 è adatto per 30-40 mosche. Ha dim internoensioni di 16,5 cm per 16,5 cm per 14,5 cm, dando una superficie di 86,45 centimetri 2, e che portano a una superficie di 2,16 centimetri 2 per volare per 40 mosche. (C) Una dimensione ottimale della camera per 20 mosche. Ha dimensioni interne di 16,5 cm per 14,5 cm per 5,96 cm, dando un'area di 43.25 cm 2, e che portano a una superficie di 2.16 cm 2 per mosca. (D) camera piccola, ottimale per 15 mosche. Ha dimensioni interne di 10,2 cm per 8,9 cm per 8,9 cm, dando una superficie di 32,45 centimetri 2, e portando a una superficie di 2,16 centimetri 2 per volare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Orientamento delle dimensioni della camera e il gruppo, ma non la densità, influenzano spazio sociale. I dati sono rappresentati in una scatolae baffo trama del distanza dal vicino più prossimo nella camera, con la casella che rappresenta il 1 ° quartile (25 per cento) e nel quartile 3 ° (75 ° per cento), la riga nella casella che rappresenta la mediana, e baffi di Tukey . (AB) dati rappresentativa mostra che l'aumento del numero di mosche all'interno di una camera della stessa dimensione porta a misurazioni spaziali sociali stabili. Gruppi da 10 a 70 le mosche maschio Canton-S sono stati messi in verticale camera di spazio sociale più grande e lasciati depositare per 30 minuti; la distanza dal vicino più prossimo di ogni volo è stato registrato. Gruppi che hanno meno di 15 mosche avevano spazio significativamente più sociale rispetto ai gruppi con più di 20 mosche nella grande camera di. (A) Gruppi di 10 n = 9, 20 n = 9, 30 n = 8, 40, n = 8, Kruskal -Wallis prova p <0,0001, test di confronto multiplo di Dunn: ogni lettera indica i gruppi statisticamente diverso un # b p <0.0001 (B) <./ strong> Gruppi di 15 n = 6, 40 n = 8, 50 n = 5, 60 n = 6, 70 n = 5, Kruskal-Wallis test di p <0,0001, un # b p <0.001. (C) Quando il dimensioni della camera è regolata per mantenere la densità fly (rispettivamente 15 nel piccolo, 20 in media o 40 in un'ampia camera, ogni volta con una densità di 2.16 cm 2 per fly, nessuna differenza significativa si osserva quando testato verticalmente. (D ) Ma quando queste camere spazio sociale sono posti orizzontalmente gruppi che avevano 15 o 20 mosche avevano una maggiore distanza per il vicino più prossimo rispetto a gruppi con 40 mosche (Gruppi di 15 n = 3, 20 n = 4, 40 n = 4, Kruskal -Wallis prova p <0,0001, confronto multiplo di Dunn testare un # b p <0,01). (E-F) La distanza tutte le mosche è stata misurata per gruppi di 15, 20, e 40 maschi mosche Canton-S collocato in sia verticalmente orientato orizzontalmente camere. Maggiore è la quantità di mosche nella camera, maggiore è la distanza a tuttimosche ((E): gruppi di 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test di p <0,0001, confronto multiplo di Dunn testare un # b p <0.01; (F): gruppi di 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test di p <0,0001, confronto multiplo di Dunn testare un # b # c p <0,0001). Nota: (A, B e CF) mostrano i dati ottenuti in in 3 diverse regioni geografiche e quindi diverse impostazioni di laboratorio (A) Regione 1: UCLA, Los Angeles, CA, (B) Regione 2:. York College, NY, NY; (CF) Regione 3:. Western University, London, ON Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Orientamento of la camera di spazio sociale può essere utilizzato per controllare per confondere geotassi problemi (A - C):. Gruppi di 40 maschi mosche Canton-S che sono stati infettati o con P. rettgeri per sette giorni o iniettata con i media come controllo hanno messo in una camera di spazio sociale sia verticalmente (A) o in orizzontale (B) posizionata e lasciata sedimentare per 30 minuti. La distanza dal vicino più prossimo di ogni volo è stato registrato. I dati sono rappresentati in una scatola e baffo trama del distanza dal vicino più prossimo nella camera, con la casella che rappresenta il 1 ° quartile (25 per cento) e nel quartile 3 ° (75 ° per cento), la riga nella casella che rappresenta la mediana, e baffi Tukey. (A) i dati Rappresentante mostra un aumento di spazio sociale per le mosche che sono infettati con P. rettgeri e posto in una camera spazio sociale disposto verticalmente,rispetto a iniezione con i media (test di Wilcoxon-Rank: ogni lettera indica gruppi statisticamente differenti p <0,0001, n = 6) (B) i dati Rappresentante mostra lo spazio sociale non è influenzata da P.. infezione rettgeri quando le mosche sono posti in una camera di spazio sociale in posizione orizzontale (test di Wilcoxon-Rank: p> 0.1, n = 5) (C) A controcorrente Apparecchiatura stato utilizzato per valutare arrampicata comportamento delle due mosche infette e controllo multimediale.. Mosche infette salire più male rispetto ai loro controlli multimediali (mosche ~ 12 giorni di età, grafico rappresenta significare indice di prestazione ± SEM:% di mosche in metà superiore del flaconcino a 5 sec scelta; a due code t-test con correzione di Welch; n = 6 di ~ 60 mosche, ogni lettera indica gruppi statisticamente diverso p = 0,08) (D - F):. camere di verticale e orizzontale posizionate, sia triangolari o circolari, sono stati usati per confrontare lo spazio sociale di Canton-S (CS) conquella di w 1118 Cs 10 (W). I dati sono rappresentati in una scatola e baffo trama del distanza dal vicino più prossimo nella camera, con la casella che rappresenta il 1 ° quartile (25 per cento) e nel quartile 3 ° (75 ° per cento), la riga nella casella che rappresenta la mediana, e baffi di Tukey. In entrambi spazio sociale orientamenti e forme da camera, w 1118 Cs 10 avuto un maggiore spazio sociale di Canton-S ((D), triangolo verticale: test di Kruskal-Wallis, ogni lettera indicare gruppi statisticamente differenti p <0,0001, (E), cerchio orizzontale: test di Kruskal-Wallis, ogni lettera indica gruppi statisticamente differenti p <0.01). (F)) Apparecchiatura controcorrente stato utilizzato per valutare il comportamento di arrampicata sia Canton-S e w 1118 Cs 10(ceppi vola 3-5 giorni di età, grafico rappresentano medio indice di prestazione ± SEM:% di mosche in cima flacone a 15 secondi a scelta). Non c'era differenza nella capacità tra una Canton-S o w 1118 Cs 10. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Spazio sociale dei maschi aumenta durante la serata. (A) Dati Rappresentante mostra un maggiore spazio sociale tra maschile vola durante le ore serali ("sera" ZT 11-12, prima di luci spente) rispetto alle ore di metà giornata ("giorno "ZT 4-7). Gruppi di 40 mosche Canton-S e W 1118 Cs 10mosche sono stati messi in una camera di spazio sociale durante le ore diurne sia o ore serali e lasciati depositare per 30 minuti. La distanza dal vicino più prossimo di ogni volo è stato registrato. Per entrambi i genotipi, vola maggiore spazio sociale la sera e le differenze tra i ceppi sono stati mantenuti indipendentemente dal momento della giornata (n = 6-7, Kruskal-Wallis test di p <0,0001, test di confronto multiplo di Dunn: ogni lettera indicano gruppi statisticamente differenti p < 0.01). (B) Quando mosche Canton-S erano separati da soli sesso maschi hanno mostrato un aumento di spazio sociale la sera (t p <0,01), anche se una tendenza non significativa per grande variazione interna è visto nelle femmine (Kruskal -Wallis prova, ogni lettera indica gruppi statisticamente differenti p <0,0002). I dati sono rappresentati in una scatola e baffo trama del distanza dal vicino più prossimo nella camera, con la casella che rappresenta il 1 ° quartile (25 per cento) e la 3rd quartile (75 ° per cento), la riga nella casella che rappresenta la mediana, e baffi di Tukey. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Background genetico di mosche colpisce spazio sociale. I gruppi di 40 Canton-S, Samarcanda, Oregon, e le mosche Elwood sono stati messi in una camera di spazio sociale e lasciato decantare per 30 minuti. La distanza dal vicino più prossimo di ogni volo è stato registrato. Le distribuzioni dei gruppi sono diversi (test di Kruskal-Wallis, p <0,0001), gruppi che non condividono una lettera comune, sono significativamente differenti. I dati sono rappresentati in una scatola e baffo pmolta la distanza dal vicino più prossimo nella camera, con la casella che rappresenta il 1 ° quartile (25 per cento) e nel quartile 3 ° (75 ° per cento), la riga nella casella che rappresenta la mediana, e baffi di Tukey (Dunnet di Test per confronti multipli, p <0,05 [d], p <0,001 [a, b, c], 3 ripetizioni indipendenti con 1-2 repliche interni, tale che per Elwood e Samarcanda n = 3, Oregon e Canton-S n = 4 ). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo protocollo, una procedura dettagliata per la quantificazione dello spazio sociale è stato descritto. Alcuni passi cruciali per garantire l'esperimento è successo sono: 1) usare sempre i guanti durante la pulizia e messa in opera dell'apparecchiatura, per mantenere i propri oli e profumi fuori dalla camera interna dell'apparato, 2) garantire le mosche sono raccolti almeno un giorno prima l'esperimento per ridurre gli effetti potenziali di anestesia freddo, 3) 2 ore prima dell'esperimento fornire nuove fiale contenenti il ​​cibo fresco per garantire le mosche non sono affamati, e si sono puliti, 4) Durante questi 2 ore, lasciare che le mosche acclimatarsi alla loro nuovo ambiente, 5) prendere nota delle condizioni di temperatura e umidità durante l'esecuzione di esperimenti; cercare di tenerli coerente tra 24-25 ° C e 50% di umidità, 6) fare in modo di non disturbare le camere spazio sociale durante l'esecuzione dell'esperimento, e 7) eseguire l'esperimento alla stessa ora del giorno, preferibilmente tra tempo Zeitgeber ZT4 e ZGT7.

Lo spazio sociale dipende solo dalla densità delle mosche all'interno della camera, e non dipende dalle dimensioni del gruppo, a patto che vi è una dimensione minima del gruppo riunito.Mosche manterranno la stessa spaziatura sociale tra loro indipendentemente dalla quantità dei membri del gruppo. Tuttavia, a distanza di tutte le mosche nella camera, come previsto, è influenzata dalla dimensione del gruppo, così come l'orientamento della camera. È importante notare che, nonostante l'orientamento orizzontale essendo difficile da usare (mosche non si depositano facilmente), e che porta alla separazione ridotto tra genotipi nelle nostre mani (Figura 3D rispetto a 3E), Burg et al. 3 con successo usato orizzontale , camera quadrata. Nei loro esperimenti, la distanza più vicina il vicino era più simile ai nostri risultati spazio sociale orientati verticalmente. Tuttavia, nella loro camera, c'era un flusso d'aria continuo che può aver contribuito alla spaziatura gruppo sociale in linea 'essere più simile alla nostra camera verticale invece del nostro camera orizzontale. Una limitazione all'utilizzo camere verticali è la possibilità di verificare che Drosophila hanno mobilimenomazioni ty. La camera di spazio sociale richiede le mosche per essere mobile in modo da poter scegliere a quale distanza dal loro vicino di casa che desiderano essere. Se mosche immobile o aveva deficit in qualche modo, essi potrebbero non essere in grado di formare gruppi stabili correttamente nella camera. Un rimedio potenziale per il povero locomozione sarebbe quindi utilizzare per camere orizzontali, o per consentire più tempo per le mosche per stabilirsi prima di scattare la foto. I ricercatori devono anche valutare di salita e possibili svalutazioni geotactic di mosche per vedere se la camera verticale spazio sociale è appropriato. Se vi sono carenze in uno di questi, camere posizionate orizzontalmente possono essere utilizzati per evitarli.

Da segnalare, se rampicante o la resistenza generale e la salute della mosca influenzerà la misura dello spazio sociale, si dimostra che l'attività o locomozione livelli non sono correlati con lo spazio sociale. In un altro studio, abbiamo dimostrato che un trattamento che riduce la locomozione, (alimentazione BPA) diminuisce anche socialespazio 2. Ma mutanti di rugose (un ortologo Drosophila del gene neurobeachin autismo candidato) Display iperattività e maggiore spazio sociale 4. Infine, mosche mutanti bianchi mostrano un aumento di spazio sociale 1,3, senza alcun aumento di locomozione o geotassi 18. In breve, sono stati osservati finora diverse combinazioni di livello di attività e la spaziatura sociale, indicando l'assenza di correlazione tra i due comportamenti. In realtà, lo spazio sociale non corrisponde necessariamente ad altri comportamenti sociali sia, come l'evitamento sociale 8,25, suggerendo differenti circuiti neurali sottostanti. Ad esempio, i mutanti di visualizzazione rugose / neurobeachin aumentate spazio sociale e ridotti evitamento sociale 4; ma il bianco è aumentato sia spazio sociale, e molto forte evitamento sociale 4.

Come ora del giorno influisce spazio sociale, almeno nei maschi, è critical che i ricercatori sono consapevoli del momento del giorno in cui i loro esperimenti vengono eseguiti ed è fatto sforzo per mantenere una costante di tempo per tutti gli esperimenti. Altre considerazioni che dovrebbero essere contabilizzati comprendono l'età, il sesso, e lo stato di accoppiamento delle mosche. Sappiamo che la distanza sociale è aumentata in vergine rispetto a singoli accoppiati, sia per i maschi e femmine 1, e noi ora dimostrare che i maschi sono meno vicini rispetto alle femmine la sera (Figura 4B). Ceppo specifico le differenze di sesso nei livelli di attività dei singoli mosche durante il giorno è stato descritto in precedenza, proponendo che i maschi attività locomotoria superiore al mattino e alla sera rispetto al tempo di giorno potrebbe essere in relazione al loro comportamento di corteggiamento 26,27. Tuttavia, nel nostro caso, i sessi sono separati, ma le mosche sono raggruppati, e per il momento si misura il loro spazio sociale, in linea si sono stabiliti. Fujii et al. 27 rapporto che il ritmo circadiano in coppie di sesso maschile mantenutoinsieme hanno un ritmo quotidiano irregolare, senza picchi chiari, quando il ritmo di coppie di sesso femminile assomiglia a quella di singoli mosche. Quindi, la spaziatura maggiore nei maschi la sera non è relativo ad un aumento corteggiamento o specifico aumento dell'attività locomotoria e correlato l'dimorfismo sessuale di questo comportamento deve essere ulteriormente approfondito.

Con questo in considerazione, mosche devono sempre essere separati da sesso per l'esperimento in modo differenze di interazione sociale tra uomini e donne può essere visto. Infine, al momento non sappiamo ancora come l'età colpisce le interazioni sociali di mosche. Pertanto, si consiglia di esperimenti spaziali sociali vengono eseguite con le mosche non più vecchie di sette giorni, come vari spettacoli di comportamento, compresa l'attività di arrampicata sono noti per essere colpiti nelle mosche più di una settimana di vita 22.

Una considerazione finale per lo spazio sociale è alle variazioni riscontrate in medianadistanza sociale. Misurazioni spazio sociale sono state prese da varie località tra cui (Los Angeles, CA: Figura 2A, New-York, NY: Figura 2B, Figura 3D, figura 4, figura 5, London, ON: Figura 2C-F, Ithaca, NY: Figura 3A, B, tutti nello stesso sfondo Canton-S). Incognite che non erano costanti tra aree geografiche, o le impostazioni di laboratorio, colpite la distanza sociale mediana. Possibili fattori includono diversi alimenti, elevazione, la pressione atmosferica in sé, e il cambiamento della pressione atmosferica 28. Anche se le mediane non erano costanti tra luoghi, in una posizione mediane sono molto costanti e riproducibili; e le tendenze e modelli visti nelle misure spaziali sociali sono rimasti gli stessi tra posizioni. Pertanto, finché ricercatori sostengono condizioni internamente costanti, saranno unBLE per rilevare le differenze di spazio sociale.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Jazz-mix Fisher 33545 any other standard drosophila food would work
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
 Sharpie pens
Adhesive Tape
Medium size binder clips Staples to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity
small SupportStands Carolina  707161 to hold the chambers in a vertical orientation
Buret clamps Carolina 707362
Digital Camera Nikon  Coolpix S8000  to take the still pictures
small ruler to be able to scale the picture
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
pounding pad any mouse pad works.
Prism 6 GraphPad Software Inc. Prism 6 for Mac OS X Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work

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References

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