Forhold, der påvirker sociale rum i
1Department of Biology, University of Western Ontario, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Entomology, Cornell University

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McNeil, A. R., Jolley, S. N., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Milunovich, A. J., Chambers, M. C., Simon, A. F. Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (105), e53242, doi:10.3791/53242 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det sociale rum analysen beskrevet her, kan anvendes til at kvantificere sociale interaktioner af Drosophila melanogaste r - eller andre små insekter - på en ligefrem måde. Som vi tidligere vist 1, i et todimensionalt rum, vi først tvinge fluerne til dannelse af en tæt gruppe, efterfølgende at tillade dem at tage deres foretrukne afstand fra hinanden. Efter fluerne har afgjort, måler vi afstanden til nærmeste nabo (eller sociale rum), behandling af et statisk billede med gratis online software (ImageJ). Analysen af ​​afstanden til den nærmeste nabo tillader forskerne at bestemme virkningerne af genetiske og miljømæssige faktorer på social interaktion, samtidig med at kontrollere for potentielle forstyrrende faktorer. Forskellige faktorer såsom klatring evne, tidspunkt på dagen, køn og antal fluer, kan ændre sociale afstand af fluer. Vi foreslår derfor en række eksperimentelle kontrol for at afbøde disse forstyrrende effekter. Dette assay kananvendes i mindst to formål. For det første kan forskerne bestemme, hvordan deres foretrukne miljømæssige shift (såsom isolering, temperatur, stress eller toksiner) vil påvirke den sociale afstand 1,2. For det andet, kan forskerne dissekere de genetiske og neurale fundament for denne grundlæggende form for social adfærd 1,3. Konkret vi brugte det som et diagnostisk værktøj til at studere den rolle, ortologe gener menes at være involveret i social adfærd i andre organismer, såsom kandidatgener for autisme hos mennesker 4.

Introduction

Sociale interaktioner er afgørende for den rette udvikling og sundhed for personer i en gruppe som helhed og kan observeres på tværs af mange arter, fra mennesker (Homo sapiens) til simplere organismer som bananfluer (Drosophila melanogaster) 5,6. En individuel frugtflue eller human deler fælles midler til at behandle sensoriske oplysninger under disse interaktioner, hvad enten det er: auditive, visuelle, olfaktoriske, taktile eller gustation. Vi og andre hypotesen, at der er en potentielt delt neurocircuitry underliggende adfærdsmæssige reaktioner på sociale interaktioner, og at de neuronale celler og gener involveret kan være evolutionær bevaret 7. Når den første interaktion har fundet sted, sociale rum mellem de interagerende individer vil enten stigning (social undgåelse 8) eller fald (gruppedannelse / sammenlægning 5). Mere komplicerede samspil, ligesom aggression eller frieri, kan derefter finde sted.

Drosophila melanogaster, som anvendes i de følgende undersøgelser 1-4,9. Sociale rum refererer til et mål for afstanden mellem en flue og dens nærmeste nabo 10. Sociale rum er konsistent for en given population af D. melanogaster når eksperimentelle betingelser er bevaret (i gennemsnit ca. indenfor 1-2 krop længder), og varierer med hensyn til den sociale oplevelse af fluerne, stigende hvis den enkelte har været holdt i isolation 1. Korrekt vision er nødvendig for at opretholde en normal social afstand, men ikke klassiske lugtstoffer eller CVA opfattelsen 1. Måling af det sociale rum kan således væreanvendes som et diagnostisk værktøj til at analysere sociale interaktioner og kvantificere social adfærd i D. melanogaster 1. Vi beskriver her i detaljer, hvordan du udfører denne kvantificering, og i hvilket omfang fælles eksperimentelle variabler påvirker denne adfærd.

Vi viser, at orienteringen af ​​det kammer, hvor assayet udføres, samt antallet af fluer - på en måde, - gør påvirker sociale rum. Det blev tidligere vist, at kammeret geometri påvirker spontan sonderende bevægelse af fluer 11,12, og dette fænomen kan i sidste ende påvirke, hvis de beslutter at bosætte sig. Men så længe fluen densitet (flue / cm2) og kammeret orientering holdes den samme, det sociale rum af fluerne også forbliver konstant. Robustheden af dette assay er illustreret ved, at uafhængige laboratorier ved hjælp af forskellige størrelser kammer, form og orientering kan replikere vises ved mutanter af WH resultatite gen (påvirker øjet pigmentering), hvilket er en stigning sociale rum (lodret trekant eller vandret cirkel i en vandret firkant med luftstrøm i 3).

Vores resultater viser også, at opretholde det tidspunkt, hvor det sociale rum forsøget udføres er afgørende for sammenhængen i resultaterne, som vi viser, at mænd, men ikke kvinder, er længere fra hinanden om aftenen. Men forskellene ses mellem dag- og aftentimerne ikke skyldes aktivitet forskelle i fluer, og vi diskuterer argumenter indikerer, at aktivitetsniveauet er ikke korreleret med det sociale rum.

Endelig er der genetiske fundament for fastlæggelsen af sociale rum, som angivet af den hvide mutant allerede beskrevne 1,3, og forskellene mellem forskellige indavlede og vilde-fanget stammer af fluer, vi præsenterer her.

Derfor er denne analyse gør et fremragende værktøj feller studere virkningerne af genetiske såvel som miljømæssige faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udstyr og reagenser Oprettet In-house (se liste over materialer for andre)

  1. Forbered en Drosophila kold anæstesi apparater som tidligere beskrevet 8.
  2. Forbered en flue aspirator som tidligere beskrevet 13.
  3. Forbered sociale rum kamre og holdere.
    1. Bestil eller gøre ruder og akryl afstandsstykker til at skabe det sociale rum kamre. Hver sociale rum kammer består af to kvadratiske glasruder (17,6 cm 17,6 cm, med en tykkelse på 0,3 cm), to højre trekant akryl afstandsstykker (med en højde på 16,5 cm, en base af 8,9 cm, med en tykkelse på 0,3 cm ), og to rektangulære rum (9 cm med 1,5 cm med en tykkelse på 0,3 cm) (figur 1A).
    2. Saml glasset og akryl sociale rum kammeret, således at det er identisk med kammeret i figur 1B. For at gøre dette, skal du starte ved at placere en trekantet spacer fladt på toppen af ​​en firkantet rude af glas, således at den rette vinkelaf den trekantede spacer flugter med et af hjørnerne af kvadratet rude. Næste, skal du placere den anden trekantede spacer fladt på toppen af ​​pladsen rude spejling den første trekantede afstandsstykke.
      BEMÆRK: Sørg for at bære handsker, så de ikke forurener stykkerne med olier og dufte fra dine hænder.
    3. Placer to små rektangulære afstandsstykker fladt på toppen af ​​pladsen rude langs siden af ​​ruden, der ikke er dækket. De akryl afstandsstykker oven på pladsen flyet skulle nu danne en trekantet arena.
    4. Placer en anden firkantet rude af glas på toppen af ​​akryl afstandsstykker således at den er på linje over den oprindelige glasrude nedenfor.
    5. Brug fire bindemiddel klip til at sikre ruderne og afstandsstykker sammen for at danne det sociale rum kammer. Placer et klip nær hjørnet over den lange side af hver af de trekantede afstandsstykker, fastgøre dem inde glasruderne. På de samme sider, placere et klip i det tilstødende hjørne, i hvert af de rektangulære afstandsstykker, fastgøre dem iside glasruderne.
    6. Saml en støtte stativ og en kolbe klemme, således at klemmen vil opretholde det sociale rum kammer i opretstående stilling, som det sociale rum kammer hviler på sin kant på toppen af ​​bordpladen.
    7. For hver gentagelse i eksperimentet, samle et socialt rum kammer og støtte stå.
  4. Forbered en apparat assay svar klatring at kontrollere klatring evne af de testede fluer.
    1. Brug en modstrømsapparat, som tidligere beskrevet 14,15.
  5. Sørg for homogene lysforhold ved at udføre eksperimentet på et arbejde overflade dækket med en hvid bænk dæksel og foran en hvid baggrund.

2. Forberedelse af Fluer før forsøget

  1. Oprethold fluer i flasker, der indeholder standard Drosophila flyve mad. Holde dem i en inkubation kammer ved 25 ° C på en 12 timers lys / mørke-cyklus.
  2. En til to dage forud for eXperiment, indsamle og køn flyver under koldt anæstesi, som tidligere beskrevet 8.
    1. Chill den kolde anæstesi apparat ved -4 ° C. Sted flyver i 50 ml plastrør. Fuldt oversvømme de plastrør indeholdende fluer til is i en isoleret isspand, vente mindst 5 min for fluer til at blive immobile.
    2. Placer fluerne på polyethylen ark af kolde anæstesi apparatet. Ved RT, skal du bruge et stereomikroskop til at adskille hanner fra hunner. Vedligehold fluer, i grupper, i hætteglas indeholdende standard Drosophila flyve mad, der ikke overstiger 40 fluer pr hætteglas.
  3. To timer før forsøgets begyndelse, at temperaturen i det rum, hvor forsøget vil blive udført mellem 24-25 ° C og fugtigheden er ca. 50%.
  4. Overfør fluerne i nye hætteglas indeholdende mad, og placere dem i 2 timer på arbejdsfladen, hvor forsøget vil blive udført.
    BEMÆRK: For disse eksperimenterendets, flyve stammer bruges var Drosophila melanogaster stammer: Canton-Særlige eller Canton-S (CS), w 1118 Cs 10 (eller W - w 1118 udkrydsede 10 gange til Canton-S), Oregon og Samarkand fluer var alle fra vores laboratorium lagre 16; Elwood fluer blev indsamlet i efteråret 2011 i den Elwood kvarter i Huntington, på Long Island, New York, USA 8. Fra hinanden, når andet er angivet, blev resultaterne præsenteret opnået med Canton-S fluer (i nuancer af rødt).

3. Udførelse af eksperiment

  1. Udfør eksperimentet fra 12:00 til 03:00 (zeitgeber tid - den tid i timer efter udbrud af lys - af ZT 4 til 7).
  2. Forbered det sociale rum kammer til overførsel af fluer.
    1. Placer et socialt rum kammer fladt på en arbejdsflade, med den side, der indeholder rektangulære afstandsstykker tættest på din krop.
    2. Fjern one klip nærmest din krop og skub en rektangulær spacer udad, hvilket skaber et mellemrum på ca. 1 cm mellem de rektangulære afstandsstykker.
    3. Ved hjælp af tape og en markør, mærke det sociale rum kammer i et øvre hjørne med sex, stamme, og gentag nummer. Sørg for, at båndet ikke dækker en del af den indre trekantede arena.
  3. Overfør fluerne ind i det sociale rum kammer.
    1. Overførsel flyver fra deres hætteglas indeholdende mad ind i en ny, tom hætteglas. Aspirer flyver fra den tomme hætteglas og overføre dem ind i det sociale rum kammer.
      1. Inhale at trække fluer ind i spidsen i sugeindretningen. Placér spidsen ind i mellemrummet 1 cm mellem de rektangulære afstandsstykker i det sociale rum kammeret og udånder på en konsekvent kurs til at tvinge fluerne ind i den indre trekantede arena.
      2. Glide straks den rektangulære spacer tilbage på plads, lukker bunden af ​​den indre trekantede arena, og placer bindemiddel klip igen.
    2. På en dunkende pad, som er placeret på forskellige bænk, end hvor det eksperimentelle arbejde foregår, skal du holde det sociale rum kammer oprejst sådan, at de rektangulære afstandsstykker er på undersiden. Pund tre gange for at sikre alle fluer er faldet til bunden af ​​arenaen.
      BEMÆRK: På grund af akryl spacer stikker ud af den mindste kammerets størrelse (figur 1D), bang albuer på arbejde overflade og samtidig opretholde et sikkert greb om apparatur for at sikre fluerne er faldet til bunds.
    3. Start en timer.
    4. Placer det sociale rum kammer på arbejdsfladen og bruge støtteben og kolbe klemme til at holde det oprejst. Placer en lineal eller et klistermærke af kendt længde fladt mod det sociale rum kammer, men ikke dækker nogen del af den indre trekantede arena.
      1. For vandret placerede eksperimenter, du ikke placere det sociale rum kammer i understøtningsstativet; i stedet lægge det sociale rum kammer fladt på arbejdsfladen.
      2. Når fluerne har slået sig ned, som regel efter ca. 30 min, tage et billede af det sociale rum kammer. Sørg for, at rammen indeholder hele den indre trekantede arena, herskeren, og etiketten.
      3. Gentag forsøget for hver genotype og tilstand (ideelt 3 interne gentagelser og 3 uafhængige gentagelser).

      4. Analyse af sociale rum data

      1. Importere følgende makroer i ImageJ 17
        1. ImageJ er tilgængelig her: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
        2. Du kan oprette en "måle afstande 'kommando i menuen plugins ved at gemme makroerne nedenfor i en fil med navnet" Measure_Distances.txt «i mappen ImageJ / plugins, i makroen undermappe, og bruge Hjælp> kommandoen Opdater menuer.«
        3. Kopiering i en .txt fil makroer, der leveres i supplerende data og blev oprindeligt udgivet i 3.
      2. Upload billederne til en computer, og åbn en picture brug af ImageJ.
        1. Opret en skala ved at tegne en linje fra de 0 cm til 1 cm mærker på linealen i billedet, og under fanen Analyser, vælg Set Scale funktion til at angive en skala fra 1 cm til denne afstand (samme fremgangsmåde for mærkaten af kendt længde). Vælg den globale indstilling før anvendelse af skalaen til billedet.
        2. Beskære billedet ved hjælp af Crop funktionen under fanen Billedkvalitet, således at det omfatter alle de fluer, mens du fjerner så meget af resten af ​​billedet som muligt.
        3. Gøre billedet sort og hvid ved at vælge 8-bit fra type indstilling under fanen Billedkvalitet.
        4. Fjern al baggrundsstøj fra billedet ved at gå til Threshold funktionen under Juster mulighed for fanen Billedkvalitet. Træk skyderne for at forbedre eller fjerne kontrasten så kroppen af ​​hver flue kan tydeligt ses uden andre markeringer i billedet. Hvis der er markeringer, som ikke er fluer, fange dem med rektangulære værktøj og slette dem.
        5. Indstilmålinger ved at bruge Set Målinger værktøjet under fanen Analyser. Vælg område, Center of Mass, Centroid og Display Label. Dernæst vælger Analyser Partikler funktionen under fanen Analyser til at oprette en nummereret liste over alle de sorte pletter, der repræsenterer fluer.
          1. Når du bruger Analyser partikler; sæt størrelse 0,01-0,1 (ikke vælger pixel enhed); cirkularitet 0,00-1,00; Vis skitserer; vise resultater, og tilføje til manager.
          2. Sikre, at hver sort plet (hver partikel) er en nøjagtig gengivelse af de fluer, der er i det oprindelige billede, ved at sammenligne den nummererede liste til det oprindelige billede.
            BEMÆRK: Hvis nogle fluer, der er meget tæt på hinanden at blive regnet som en partikel, manuelt trække en hvid linje for at adskille de to fluer på det binære billede.
        6. Mens listen er valgt, skal du bruge nærmeste nabo - List Afstande makro under anden makroer under fanen Plugins at oprette en ny liste med afstande, i cm, fra EAch flyve til deres nærmeste nabo.
      3. Kopier nærmeste nabo afstande fra ImageJ og indsætte i en kolonne i et regnearksprogram.
        1. Kompilere alle data fra hver gentagelse på samme regneark og organisere efter genotype og tilstand.
      4. Udføre dataanalyse ved hjælp af statistisk software. I dette forsøg blev Graph Pad Prism (version 6 til MacOSX, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com), der anvendes til at foretage envejs ANOVA og Kruskal-Wallis Tests, Tukeys og Dunnets post-hoc tests.
      5. Fordelingen af afstandene følger en ikke parametrisk fordeling 1, og data er repræsenteret som boksen og Tukeys whiskers (for at eliminere afvigende værdier).

      5. Klatring Assay (Kontrol Behavior)

      1. Brug en klatring assay som en kontrol til test fluer klatring evne 14,15,18.
        1. Brug modstrømsapparat, således at tre forsøg cen køres parallelt.
      2. Overførsel 50 til 100 naive fluer (fluer, der ikke er testet før) i tre forskellige test hætteglas, og snap dem i 1., 3. og sidste slots nederst modstrømsapparat, med friske tomme hætteglas i den modsatte steder.
      3. Placer friske, tomme hætteglas i de tomme pladser i bunden af ​​apparatet.
      4. Tryk ned apparatet tre gange, således at alle fluer er i bunden af ​​hvert rør, at indlede eksperimentet.
      5. Start timeren til 15 sek (tid tilstrækkeligt til ~ 100% af 3-7 dage gamle Canton-S for at nå toppen hætteglas - se figur 3F).
      6. Skub den øvre del af modstrøm apparatet, at forskyde de øverste hætteglas med en slot.
      7. Saml fluer ved at trykke på apparatet ned, at bringe alle fluer i de nederste hætteglas.
        1. 1. og 2. rør (eller 3. og 4., 5 th th) svarer til henholdsvis de fluer, der ikke nåede til toppen, og de ​​fluer, der nåede toppen hætteglas.
      8. Beregn Performance Index (PI).
        1. Tæl antallet af fluer i hvert hætteglas.
        2. PI er den procentdel af fluer i stand til at klatre på det øvre rør.
        3. Midlerne til PI følger en normalfordeling 1, og data er repræsenteret som kolonne grafer af middelværdien plus eller minus standardfejl til middelværdien (SEM).
          BEMÆRK: Alternativt kan PI beregnes som den procentdel af fluer, der kan nå den øvre del af den nedre hætteglas (for ældre fluer, 5 sek er tilstrækkelig tid til at kvantificere en forskel i klatring evne mellem inficerede og ikke-inficerede 12 dage gamle Canton-S kvantificeres fra et stillbillede: se resultater). Andre har brugt forskellige mål for præstationer i forskrækkelseskasser-induceret negative geotaxis, der er også hensigtsmæssigt at kvantificere klatring evne 19-22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det sociale rum kammer kan bruges som et værktøj til at kvantificere sociale adfærd Drosophila melanogaster. Akryl afstandsstykker og ruder er klippet sammen til dannelse af en indre trekantede arena, der giver en todimensional område, hvor fluer kan danne stabile grupper uden tilstedeværelse af mange potentielt forstyrrende signaler. Når fluer overføres til den lodrette arena, bliver de overraskede ved at blive tappet ned, og de reagerer ved en flugt adfærd: negative geotaxis. De klatre op til toppunktet af det opretstående trekant, tvunget ind i en stram gruppe, og derefter leveres tid til at bevæge sig yderligere danne hinanden, og til at udforske arenaen. Efter 20 til 40 minutter, de stopper, og en stabil gruppe dannes. Kan måles afstanden mellem hver flue og nærmeste nabo fra et billede, for at give en kvantificering af deres foretrukne sociale rum. Fluer anses for at være mere social jo tættere de er på deres naboer.

Flyvtæthed ikke spiller en rolle i det sociale rum i kammeret, indtil det punkt, under-kapacitet. For en stor gruppe af 20 til 70 fluer i større lodret orienterede kammer, sociale rum er uafhængig af gruppen densitet (figur 2A, B). Med kun 10 eller 15 fluer i det sociale rum kammer, er der højst sandsynligt ikke nok personer til at danne en stabil social gruppe, hvilket fører til en stigning i det sociale rum (figur 2A, B). Men at teste et stort antal fluer er ikke altid praktisk - i visse tilfælde, hvor antallet af mutant individer begrænset, kan forskerne ikke kunne indsamle grupper af fluer er store nok til standardstørrelsen af ​​sociale rum kammeret. For at lette kvantificering sociale rum ved hjælp af små grupper af fluer, kan forskerne manipulere sociale rum kammeret, således at arealet af den todimensionale arena er mindre, men areal pr flue forbliver konstant. Vist i figur 1C, D er to typer af socialeplads kamre modificeret til mindre grupper, men opretholde den samme tæthed som det større kammer. På denne måde holder fluen densitet og reduktion af kammeret størrelse tillader at opnå en lignende social afstand (figur 2C).

De samme overordnede tendenser holder stik for sociale rum kamre placeret i en vandret position (figur 2D). Men vi kan konstatere, at fluerne tendens til at være længere fra hinanden i sådan en horisontal indstilling, og de ​​ikke afregne let 1. Grupper, der har kun 15 og 20 fluer udvise større social plads end grupper med 40 fluer (F igur 2D).

At bekræfte, at overbelægning ikke var ansvarlig for de mindre afstande til nærmeste nabo ses i større grupper af fluer, afstanden fra hver flyver til alle andre fluer blev målt, som i 9. Kvantificering af afstand til alle fluer, versus afstanden til nærmeste nabo, tillader vurdering af en gruppe behavieller i stedet for adfærd individer inden for en gruppe. Som forventet afstand til alle fluer steg som mængden af ​​fluer i gruppen var større, en afspejling af gruppen selv, ikke af de enkelte fluer. Denne tendens blev observeret for både vertikalt og horisontalt placerede sociale rum kamre (figur 2E, F). Derfor blev fluerne fra større grupper ikke er tvunget til at holde en tættere afstand til deres nabo på grund af pladsbegrænsninger. I stedet fluer danner strammere sociale grupper, når der er mere end 15 fluer i kammeret.

Som for andre adfærdsmæssige test, en begrænsning til at bruge det sociale rum kammer lodret, er, at det kræver fluer uden geotaxis eller klatring nedskrivninger. For eksempel, Canton-S flyver inficeret i en uge med Gram-negativ bakterie Providencia rettgeri 23 har en klatring defekt og udvise forskellige sociale afstandselementer resultater afhængigt af orienteringen af den sociale afstandkamre. Når prøven er udført lodret, det sociale rum af inficerede fluer var større end det sociale rum af kontrollerne, sandsynligvis fordi de inficerede fluer var ikke i stand til at danne en stabil gruppe ved toppen af kammeret (figur 3A). Når fluerne under de samme betingelser blev derefter testet i de vandret orienterede sociale rum kamre, var der ingen signifikante forskelle, hvilket indikerer, at bevægelse evne er sandsynligvis mindre af en faktor for social plads i vandret placerede sociale rum kamre (figur 3B). Mens de inficerede fluer er visuelt mindre i stand til at forcere end kontroller, kan dette kvantificeres ved hjælp af klatring assay (figur 3C). Efter 5 sek, ca. 44% af kontrol fluer klatrede op til den øverste halvdel af den nedre hætteglasset og kun 32% af inficerede fluer. Det er værd at bemærke, at alle fluer i dette assay klatre dårligt (de sjældent nå til toppen hætteglas, kun den øverste del af den nedre hætteglas), som kanforklares ved det faktum, at de er 12 dage efter eclosion, der er, når fluerne begynder at udvise en defekt i klatring som følge af ældning 22.

Men for stammer, der ikke har nogen klatring defekt, begge orienteringer af kamrene ført til de samme resultater, som vi tidligere har vist 1. I dette forsøg blev den samme stigning i sociale rum ses for Canton-S og w 1118 Cs 10 i den lodrette trekant eller horisontale cirkulære kamre (figur 3D, E - reanalyse i boksen og knurhår af data offentliggjort i 1). Der var ingen forskel i klatring evne mellem Canton-S og w 1118 Cs 10 angiver det ikke var en faktor for forskellen i det sociale rum mellem stammer i enten kammer orientering (15 sek valg - Figur 3F). Hvis de får 5 sek valg 17% ± 3,3 af CS og 14% ±2.5 af w 1118 Cs 10 nåede til øverste hætteglas (statistisk ikke forskellige, data ikke vist).

Forskere ved hjælp af sociale rum kammer skal også sikre, at de gentager deres eksperimenter på samme tidspunkt af dagen. For både Canton-S og W 1118 Cs 10 mandlige fluer, tidspunktet på dagen påvirket sociale interaktioner. Sammenlignet med dagtimerne (zeitgeber tid - tiden i timer efter udbrud af lys - ZT4 til ZT7), de testede om aftenen fluer (ZT11 til ZT12 - lige før lyser ud) viste en langt større social plads til både genotyper, selv om deres relative plads forskel blev bevaret - dvs w 1118 Cs 10 fluer stadig mindre social end Canton-S flyver i aften (figur 4A). Interessant, kun det sociale rum i Canton-S-hanner, men ikke that af kvinder stiger i aften, selv om der var en tendens til større variation af sociale rum for kvindelige fluer i aften (figur 4B). Vi har tidligere uafhængigt gjort de samme observationer 24.

Som vi tidligere rapporteret ved anvendelse af en Oregon-R line at undersøge virkningen af bisphenol A (BPA) 2, det sociale rum kammeret er også følsomme over for den genetiske baggrund af Drosophila. Her viser vi, at Elwood, et nyligt fanget vildtype linje, havde øget sociale rum i forhold til Canton-S og Samarkand, men ikke Oregon (figur 5). De sociale rum i Samarkand og Oregon var ikke signifikant forskellige fra hinanden, men begge er større end det sociale rum i Canton-S (figur 5). Disse data viser, at i et givet miljø, forskellige indavlede og vildtypestammer har en anden socialt rum, hvilket indikerer en genetisk komponent til adfærden. Det indikerer også, at sensitivity af denne test kræver således, at fluer kan udkrydsede i passende genetiske baggrunde før eksperimentere. Dette vil medvirke til at sikre forskellene eller omvendt ligheder, set i sociale rum skyldes den faktor, der testes.

Figur 1
Figur 1. Sociale rum kammer komponenter og arrangement. (A) socialt rum kamre i forskellige dimensioner kan konstrueres ved hjælp af de samme ruder (17,6 cm 17,6 cm 0,3 cm) og akryl afstandsstykker i form af rette trekanter (med en højde på 16,5 cm, en base af 8,9 cm, og en tykkelse på 0,3 cm - angives med et lille et bogstav), og rektangler (9 cm 1,5 cm 0,3 cm -. angivet med et lille bogstav b) (B) Den største sociale rum kammer, som beskrevet i 1 er egnet til 30-40 fluer. Det har indvendige dimension på 16,5 cm 16,5 cm 14,5 cm, hvilket giver et areal på 86,45 cm2, og som fører til et areal på 2,16 cm 2 pr flue i 40 fluer. (C) Et kammer størrelse optimale i 20 fluer. Det har indre dimensioner af 16,5 cm med 14,5 cm x 5,96 cm, hvilket giver et areal på 43,25 cm2 og fører til et areal på 2,16 cm2 pr flue. (D) mindre kammer, optimal for 15 fluer. Det har indre dimensioner på 10,2 cm med 8,9 cm med 8,9 cm, hvilket giver et areal på 32,45 cm2, og som fører til et areal på 2,16 cm 2 pr flue. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Orientering af kammeret og gruppens størrelse, men ikke tæthed, påvirker sociale rum. Dataene er repræsenteret i en kasseog whisker plot af afstanden til den nærmeste nabo i kammeret, med boksen repræsenterer den 1. kvartil (25 th procent) og 3. kvartil (75 th procent), linjen i boksen repræsenterer medianen, og Tukeys whiskers . (AB) Repræsentant data viser, at øge antallet af fluer i et kammer af samme størrelse fører til stabile sociale rum målinger. Grupper på 10 til 70 Canton-S mandlige fluer blev sat i den større vertikale sociale rum kammer og tilladt at nøjes med 30 min; afstanden til nærmeste nabo af hver flue blev registreret. Grupper med mindre end 15 fluer havde betydeligt mere social plads end grupper med mere end 20 fluer i den store kammer. (A) Grupper af 10 n = 9, 20 n = 9, 30 n = 8, 40, n = 8, Kruskal -Wallis test p <0,0001, Dunns multiple sammenligningstest: hvert bogstav angiver grupper statistisk forskellig en # b p <0,0001 (B) <./ strong> Grupper på 15 n = 6, 40 n = 8, 50 n = 5, 60 n = 6, 70 n = 5, Kruskal-Wallis test p <0,0001, en ​​# b p <0,001. (C) Når størrelsen af kammeret er indstillet til at opretholde fluen densitet (henholdsvis 15 i den lille, 20 i medium eller 40 i stort kammer, hver gang ved en densitet på 2,16 cm2 pr flue, observeres ingen signifikant forskel, når det afprøves lodret. (D ) Men når disse sociale rum kamre er placeret vandret grupper, der havde 15 eller 20 fluer havde en større afstand til nærmeste nabo i forhold til grupper med 40 fluer (grupper af 15 n = 3, 20 n = 4, 40 n = 4, Kruskal -Wallis test p <0,0001, Dunns multiple sammenligningstest en # b p <0,01). (E-F) Afstanden til alle fluer blev målt til grupper af 15, 20 og 40 mandlige Canton-S fluer placeret i både lodret og vandret orienteret kamre. Jo større mængden af ​​fluer i kammeret, jo større afstand til allefluer ((E): grupper af 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test p <0,0001, Dunns multiple sammenligningstest en # b p <0,01 (F): grupper af 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis test p <0,0001, Dunns multiple sammenligningstest en # # b c p <0,0001). Bemærk: (A, B og CF) viser data fra i 3 forskellige geografiske regioner og dermed forskellige laboratorie-indstillinger (A) Region 1: UCLA, Los Angeles, CA, (B) Region 2:. York College, NY, NY; (CF) Region 3:. Western University, London, ON Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Orientering of det sociale rum kammeret kan bruges til at styre for confounding geotaxis problemer (A - C):. Grupper på 40 mandlige Canton-S fluer, der enten var inficeret med P. rettgeri i syv dage eller injiceres med medierne som en kontrol blev sat i et socialt rum kammer enten lodret (A) eller vandret (B) placeret og tilladt at nøjes med 30 min. Afstanden til den nærmeste nabo for hver flue blev registreret. Dataene er repræsenteret i en kasse og whisker plot af afstanden til den nærmeste nabo i kammeret, med boksen repræsenterer den 1. kvartil (25 th procent) og 3. kvartil (75 th procent), linjen i boksen repræsenterer medianen, og Tukey knurhår. (A) repræsentative data viser en stigning i det sociale rum for fluer, der er smittet med P. rettgeri og anbragt i en lodret placeret sociale rum kammer,sammenlignet med injektion med medier (Wilcoxon-rank test: hvert bogstav angiver grupper statistisk forskellig p <0,0001, n = 6) (B) repræsentative data viser sociale rum påvirkes ikke af P.. rettgeri infektion, når fluerne anbringes i en vandret sociale rum kammer (Wilcoxon-rank test: p> 0,1, n = 5) (C) En modstrøms Apparatet blev anvendt til at vurdere klatring adfærd både inficerede og mediekontroltaster fluer.. Inficerede fluer klatre mere dårligt end deres medier kontroller (fluer ~ 12 dage gammel, graf repræsenterer betyde ydeevne indeks ± SEM:% af fluer i øverste halvdel af hætteglasset ved 5 sek valg, to halet t-test med Welch korrektion; n = 6 på ~ 60 fluer, hvert bogstav angiver grupper statistisk forskellige p = 0,08) (D - F):. lodret og vandret placerede kamre, enten trekantede eller runde, blev anvendt til at sammenligne det sociale rum i Canton-S (CS) medden for W 1118 Cs 10 (W). Dataene er repræsenteret i en kasse og whisker plot af afstanden til den nærmeste nabo i kammeret, med boksen repræsenterer den 1. kvartil (25 th procent) og 3. kvartil (75 th procent), linjen i boksen repræsenterer medianen, og Tukeys knurhår. I både sociale rum kammer orienteringer og former, w 1118 Cs 10 havde en større social plads end Canton-S ((D), vertikal trekant: Kruskal-Wallis test, hvert bogstav indikerer grupper statistisk forskellige p <0,0001, (E), vandret cirkel: Kruskal-Wallis test, hvert bogstav indikerer grupper statistisk forskellige p <0,01). (F)) En modstrøm Apparatet blev anvendt til at vurdere klatring adfærd både Canton-S og W 1118 Cs 10stammer (fluer 3-5 dage gamle, graf repræsenterer gennemsnitlige ydeevne indeks ± SEM:% af fluer i top hætteglas ved 15 sek valg). Der var ingen forskel i evnen mellem enten Canton-S eller w 1118 Cs 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Sociale rum af hanner øges i løbet af aftenen. (A) repræsentative data viser en øget social afstand mellem mandlige fluer i aftentimerne ("aften" ZT 11-12, før lyset slukket) i forhold til midten af dag timer ("dag "ZT 4-7). Grupper på 40 Canton-S-fluer og w 1118 Cs 10fluer blev sat i et socialt rum kammer under enten dagtimerne eller aftentimerne og tilladt at nøjes med 30 min. Afstanden til den nærmeste nabo for hver flue blev registreret. For begge genotyper, fluer øget sociale rum i aften og forskelle mellem stammer blev holdt uanset tidspunktet på dagen (n = 6-7, Kruskal-Wallis test p <0,0001, Dunns multiple sammenligning test: hvert bogstav indikerer grupper statistisk forskellig p < 0,01). (B) Når Canton-S-fluer var adskilt af sex kun hanner har vist en stigning i det sociale rum i aften (t p <0,01), selv om en ikke-signifikant tendens til større intern variation ses hos kvinder (Kruskal -Wallis test, hvert bogstav angiver grupper statistisk forskellig p <0,0002). Dataene er repræsenteret i en kasse og whisker plot af afstanden til den nærmeste nabo i kammeret, med boksen repræsenterer den 1. kvartil (25 th procent) og 3rd kvartil (75 th procent), linjen i boksen repræsenterer medianen, og Tukeys knurhår. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Genetiske baggrund af fluer påvirker sociale rum. Grupper på 40 Canton-S, Samarkand, Oregon, og Elwood fluer blev sat i et socialt rum kammer og tilladt at nøjes med 30 min. Afstanden til nærmeste nabo af hver flue blev registreret. Fordelinger af grupperne er forskellige (Kruskal-Wallis test, p <0,0001), grupper ikke deler en fælles brev er væsentligt anderledes. Dataene er repræsenteret i en kasse og whisker pmasse af afstanden til den nærmeste nabo i kammeret, med boksen repræsenterer den 1. kvartil (25 th procent) og 3. kvartil (75 th procent), linjen i boksen repræsenterer medianen, og Tukeys whiskers (Dunnets multiple sammenligningstest, p <0,05 [d], p <0,001 [a, b, c], 3 uafhængige gentagelser med 1-2 interne gentagelser, således at der for Elwood og Samarkand n = 3, Oregon og Canton-S n = 4 ). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, blev en detaljeret procedure til kvantificering af sociale rum beskrevet. Nogle afgørende skridt til at sikre eksperimentet er vellykket, er: 1) altid bruge handsker ved rengøring og opsætning af apparatet, for at holde dine egne olier og dufte fra indre kammer af apparatet, 2) sikre fluer indsamles mindst én dag før eksperimentet for at reducere den eventuelle påvirkning af kold anæstesi, 3) 2 timer før forsøget give nye hætteglas indeholder friske fødevarer for at sikre fluer ikke udsultes, og har renset sig selv, 4) Under disse 2 timer, lad fluerne akklimatisere til deres nye omgivelser, 5) notere temperatur- og fugtighedsforhold, når du udfører eksperimenter; forsøge at holde dem i overensstemmelse mellem 24-25 ° C og 50% luftfugtighed, 6) sørg for at ikke forstyrre det sociale rum kamre, mens du kører eksperimentet, og 7) udføre eksperimentet på samme tidspunkt af dagen, fortrinsvis mellem zeitgeber tid ZT4 og ZGT7.

Sociale rum er kun afhængig af densiteten af ​​fluer inde i kammeret, og ikke afhængig af størrelsen af ​​gruppen, så længe der er en minimal Gruppestørrelse opfyldt.Fluer vil opretholde den samme sociale afstand mellem sig selv, uanset mængden af ​​medlemmer af gruppen. Dog er afstanden til alle fluer i kammeret, som forventet, påvirket af gruppens størrelse, samt kammeret orientering. Det er vigtigt at bemærke, at på trods af den vandrette orientering er udfordrende at bruge (fluer ikke nøjes så let), og fører til reduceret adskillelse mellem genotyper i vores hænder (figur 3D forhold til 3E), Burg et al. 3 med held anvendt en horisontal , firkantet kammer. I deres forsøg, afstanden til nærmeste nabo var mest ligner vores vertikalt orienterede sociale rum resultater. Men i deres kammer, var der en kontinuerlig luftstrøm, der kan have bidraget til fluerne sociale gruppe afstand er mest ligner vores vertikale kammer i stedet for vores horisontale kammer. En begrænsning at bruge lodrette kamre er evnen til at teste Drosophila der har mobility nedskrivninger. Det sociale rum kammer kræver fluerne til at være mobile, så de kan vælge på hvilken afstand fra deres nabo, de ønsker at være. Hvis fluer var immobile eller havde underskud på en eller anden måde, kan de ikke være i stand til at danne stabile grupper ordentligt i kammeret. En potentiel middel mod dårlig bevægelse ville være at så bruge vandrette kamre, eller at give mere tid til fluerne at bosætte før du tager billedet. Forskerne skal også vurdere, klatring evne og mulige geotactic nedskrivninger af fluer at se, om den vertikale sociale rum kammer er passende. Hvis der er underskud i en af ​​disse, kan horisontalt placerede kamre anvendes til at undgå dem.

Notatet hvis klatring aktivitet eller generelle udholdenhed og sundhed fluen vil påvirke målingen af ​​sociale rum, viser vi, at aktivitet eller bevægelseskomponenter niveauer, der ikke er korreleret med det sociale rum. I en anden undersøgelse viser vi, at en behandling, der nedsætter bevægelse, (fodring BPA) også mindske socialplads 2. Men mutanter af rynket (en Drosophila ortholog af autisme kandidat gen neurobeachin) display hyperaktivitet og øget sociale rum 4. Endelig viser hvide mutant fluer en stigning i det sociale rum 1,3, uden nogen stigning i bevægelse eller geotaxis 18. Kort sagt har flere kombinationer af aktivitetsniveau og social afstand hidtil blevet observeret, hvilket indikerer nogen sammenhæng mellem de to adfærd. Faktisk er sociale rum ikke nødvendigvis korrelerer til andre sociale adfærd enten, såsom social undgåelse 8,25, hvilket tyder på andet underliggende neurale kredsløb. For eksempel, mutanter af rynket / neurobeachin display øget social plads og reducerede sociale undgåelse 4; men hvid har både øget socialt rum, og meget stærk social undgåelse 4.

Som tiden på dagen påvirker sociale rum, i det mindste hos mænd, er det critical at forskere er bevidste om tidspunktet på dagen, hvor deres eksperimenter udføres, og gøres alt for at opretholde en konstant tid for alle forsøg. Andre overvejelser, der bør tegnede sig for omfatter alder, køn og parring status fluerne. Vi ved, at social afstand øges i forhold til jomfru parret enkelte, både for både mænd og kvinder 1, og vi har nu vist, at hanner er mindre tæt end kvinder i aften (figur 4B). Er tidligere beskrevet Strain specifikke kønsforskelle i aktivitetsniveauet af enkelt fluer i løbet af dagen, at foreslå, at hanner højere bevægelsesaktiviteten i morgen og aften i forhold til dagen tid kan være relateret til deres frieri adfærd 26,27. Men i vores tilfælde, er kønnene adskilt, men fluerne er grupperet, og med den tid, vi måle deres sociale rum, har fluerne afviklet. Fujii et al. 27 rapport, døgnrytme i par af mandlige holdestilsammen har en uregelmæssig døgnrytme, uden klare toppe, når rytmen af ​​kvindelige par ligne enkelte fluer. Så er den øgede afstand hos mænd i aften sandsynligvis ikke relateret til en stigning i frieri adfærd eller specifik stigning i lokomotorisk aktivitet, og grunden ligger til grund for seksuelle dimorphism af denne adfærd skal undersøges nærmere.

Med dette i betragtning, bør fluer altid adskilles af køn til forsøget, så det kan ses forskelle i social interaktion mellem mænd og kvinder. Endelig er vi i øjeblikket ved endnu ikke, hvordan alder påvirker sociale interaktioner af fluer. Vi anbefaler derfor, at det sociale rum eksperimenter udføres med fluer ikke ældre end syv dage, som forskellige adfærd forestillinger, herunder klatring aktivitet er kendt for at være påvirket i fluer mere end en uge gamle 22.

En sidste overvejelse for sociale rum er ændringer observeret i mediansocial afstand. Sociale rum målinger blev taget fra forskellige steder, herunder (Los Angeles, Californien: figur 2A, New-York, NY: 2B, figur 3D, figur 4, Figur 5, London, ON: Figur 2C-F, Ithaca, NY: Figur 3A, B, alle i samme Canton-S baggrund). Ukendte variabler, der ikke var konstant mellem geografiske steder, eller laboratorie-indstillinger, påvirkede medianen sociale afstand. Mulige faktorer omfatter forskellige fødevarer, højde, atmosfærisk tryk i sig selv, og ændringer i det atmosfæriske tryk 28. Selv medianerne ikke var konstant mellem steder inden for en placering medianerne er meget konstant og reproducerbar; og tendenser og mønstre ses i det sociale rum målinger forblev den samme blandt lokationer. Derfor så længe forskere opretholder internt konstante betingelser, vil de være enble til at opdage forskelle i det sociale rum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope  Nikon   SMZ-645 Any other standard scope for fly handling would work
Small paint brushes  for pushing flies
Jazz-mix Fisher 33545 any other standard drosophila food would work
Mini-Alarm Timer/Stopwatch
 Sharpie pens
Adhesive Tape
Medium size binder clips Staples to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity
small SupportStands Carolina  707161 to hold the chambers in a vertical orientation
Buret clamps Carolina 707362
Digital Camera Nikon  Coolpix S8000  to take the still pictures
small ruler to be able to scale the picture
trifold board and white bench cover to provide a white background, and a homogeneous light.
pounding pad any mouse pad works.
Prism 6 GraphPad Software Inc. Prism 6 for Mac OS X Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila.: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
  2. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on the behavior of Drosophila melanogaster. - Potential use of Drosophila as a model in the study of neurodevelopmental disorders. Behavioural Brain Research. (2015).
  3. Burg, E. D., Langan, S. T., Nash, H. A. Drosophila social clustering is disrupted by anesthetics and in narrow abdomen ion channel mutants. Genes Brain Behav. 12, 338-347 (2013).
  4. Wise, A., et al. The autism candidate gene Neurobeachin (Rugose) mutants in Drosophila exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurosci. 1-9 (2015).
  5. Parrish, J. K., Edelstein-Keshet, L. Complexity, pattern, and evolutionary trade-offs in animal aggregation. Science. 284, 99-101 (1999).
  6. Sokolowski, M. B. Social interactions in ‘‘simple’’ model systems. Neuron. 65, 780-794 (2010).
  7. Rittschof, C. C., Robinson, G. E. Genomics: moving behavioural ecology beyond the phenotypic gambit. Animal Behaviour. 92, 263-270 (2014).
  8. Fernandez, R. W., et al. Straightforward assay for quantification of social avoidance in Drosophila melanogaster. JoVE. (94), e52011 (2014).
  9. Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila. social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
  10. Mogilner, A., Edelstein-Keshet, L., Bent, L., Spiros, A. Mutual interactions, potentials, and individual distance in a social aggregation. J Math Biol. 47, 353-389 (2003).
  11. Liu, L., Davis, R. L., Roman, G. Exploratory activity in Drosophila requires the kurtz nonvisual arrestin. Genetics. 175, 1197-1212 (2007).
  12. Soibam, B., et al. Open-field arena boundary is a primary object of exploration for Drosophila. Brain Behav. 2, 97-108 (2012).
  13. Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology - A laboratory Manual., Ch. Cold Spring Harbor Press. 475-481 (2010).
  14. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
  15. Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 1, 2nd, IRL Press. 265-317 (1998).
  16. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
  17. Rasband, W. S. ImageJ. US National Institutes of Health. Maryland, U.S.A. (1997).
  18. Simon, A. F., et al. Drosophila, vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  19. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila .dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. JoVE. (74), e50339 (2013).
  20. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila. models of neurodegeneration. JoVE. e2504 (2011).
  21. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  22. Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster. with age. Mech Ageing Dev. 127, 647-650 (2006).
  23. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. JoVE. (2015).
  24. Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, Washinton D.C., (2013).
  25. Suh, G. S. B., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  26. Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster.--Sex-specific differences suggest a different quality of activity. J. Biol. Rhythms. 15, 135-154 (2000).
  27. Fujii, S., Krishnan, P., Hardin, P. E., Amrein, H. Nocturnal male sex drive in Drosophila. Curr Biol. 17, 244-251 (2007).
  28. Pellegrino, A. C., et al. Weather forecasting by insects: modified sexual behaviour in response to atmospheric pressure changes. PLoS One. 8, e75004 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics