דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה
1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Published 11/24/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פיתחנו פרוטוקול שיפור תרבות נוכחית Embryoid הגוף (EB) המאפשרת הלימוד של ארגון-עצמי, שבירת סימטריה, התארכות צירית ומפרט גורל תא באמצעות אגרגטים של תאי גזע העובריים של עכבר (mESCs) בתרבות השעיה. מספר קטן של mESCs יקובצו במדיום בסיסי במשך 48 שעות ב96-גם צלחות שאינן רקמות שטופלו תרבות, תחתית-U, לאחר שהם המוסמכים להגיב לאותות ניסיוניים. בעקבות טיפול, אגרגטים אלה מתחילים להראות סימנים של ביטוי גנים מקוטב ולשנות בהדרגה המורפולוגיה שלהם ממסה כדורית של תאים למבנה מוארך, מאורגן היטב בהיעדר רמזי סימטריה חיצוניים. מבנים אלה הם לא רק מסוגלים להציג סמנים של שלוש השכבות נבט, אך באופן פעיל להציג תנועות כמו gastrulation-, שמעידות ליפה כיוונית של תאים בודדים מהצבירה, אשר מתרחשת באופן מכריע אזור אחד של המבנה המוארך. protoc זהol מספק שיטה מפורטת ליצירה לשחזור של אגרגטים אלה, גירוים עם אותות כגון הפעלת Wnt / β-קטנין ועיכוב BMP וניתוחם על ידי נקודת זמן אחת או מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות. בנוסף, אנו מתארים שינויים נהלים מכתים עובר הנוכחיים כל הר עכבר לניתוח immunocytochemical של סמנים ספציפיים בתוך אגרגטים קבועים. השינויים במורפולוגיה, ביטוי גנים ואורך של אגרגטים ניתן למדוד כמותית, מתן מידע על איך אותות יכולים לשנות גורלות צירי. זה שחזה כי מערכת זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר אירועים התפתחותיים המוקדמים כגון פיתוח צירי וארגון, ואופן רחב יותר, התהליכים של ארגון עצמי וקבלת החלטות סלולרית. היא עשויה גם לספק נישה מתאימה לדור של סוגי תאים קיימים בעובר, כי הם בלתי ניתנים להשגה מהתרבות חסיד קונבנציונלית כגון תאי עצב בחוט השדרה ומוטוריים.

Introduction

הלימוד וההבנה של החלטות תא-גורל בפיתוח יונקים המוקדם יכולים לעשות שימוש בתרביות של תאי גזע העובריים (ESCs), אוכלוסיות משובטים נגזרות מblastocysts שיש את היכולת עצמית לחדש ולהתמיין לכל סוגי התאים של אורגניזם כלומר., הם 1,2 pluripotent. בעוד תרבויות אלה היו וממשיכים להיות שימושיים להבנת הבסיס המולקולרי של תא החלטות-גורל, הם אינם מסוגלים להתרבות חלק מההסדרים במרחב ובהתנהגויות הגלובליות שנוצרו בעוברים במהלך gastrulation בעובר, התהליך של gastrulation הופך שכבת האפיתל אחת לשלוש שכבות נבט שונות ומעניק את העובר עם ארגון anteroposterior גלוי 3-5. ניסיונות לשחזר את האירועים הללו vivo לשעבר היו מבוססים על הדור של אגרגטים תלת ממדיים של ESCs, התייחס לגופי embryoid כ( EBS), ולהעמיד אותם לאo תנאי בידול 6,7. ניתן שידלו אגרגטים אלה להתמיין לסוגים רבים ושונים של תאים, שחלקם גם אינם מסוגלים להשיג או מושרה עם יעילות נמוכה בתרבות חסיד או לא יכול להיות מיוצרים בכל;. לדוגמא, תאי דם 8 ונבט קדמוני 9. הגבלה בשימוש בEBS עם זאת, היא שהם אינם מסוגלים להציג את התנהגות המוךפו"גנטי, הפצת שכבת נבט או ארגון צירי כי הם מאפיינים עיקריים של העובר המתפתח, וכתוצאה מכך חוסר הארגון המרחבי 6,10. בדו"ח אחד, טיפול של EBS עם Wnt מוביל לקיטוב חלש בביטוי גנים בחלק אגרגטים אבל לא המורפוגנזה ברורה הוא ציין 7. בדיווחים האחרונים יותר, EBS שכבר בתרבית לתקופות ממושכות של זמן לפתח מבנים קדמי כגון רשתית, קליפה ותאי חישה באוזן פנימית, המחקים את העמיתים העובריים שלהם, אבל בלי לפתח ההקשר של organizat ציריהיון 11-13.

דו"ח של Marikawa et al. 14, תוך עבודה עם אגרגטים של קרצינומה תאים עובריים P19 העכבר (EC) שהוקמו על ידי שיטת תלייה-הטיפה, דיווח את הופעתה של מבנים מוארכים ממוצא mesodermal מזכיר המוארכים שהם נצפו עם exogastrulae בדו-חיים ועוברי קיפודי הים וקלר explants 15-18. כמו זה שלא נצפה עם תאי גזע עוברי של עכבר (mESCs), ניסינו לשחזר את ההתנהגות שנצפתה עם P19 תאי EC באמצעות אגרגטים של mESCs 19 ואנו מדווחים תנאי תרבות שמובילים לסימטריה שלהם לשבור והתארכות צירית. הבדל חשוב מהעבודה עם תאי P19 הוא שפרוטוקול הצבירה המתואר כאן מתבצע בצלחת 96-היטב, דומה לזה שתואר על ידי Eiraku et al. 20, במקום תלוי טיפות. שינוי זה הביא להתייעלות במונחים של התאוששות כוללת והן בשחזור התוך והבין-ניסיוני. חשוב לציין, שמירת אגרגטים בבארות בודדות מבטיחה היתוך שבין אגרגטים (נפוץ כאשר איגום אגרגטים מטיפין תלויות) אינו מתרחש. בנוסף, תכונה מרכזית של הפרוטוקול היא 24 שעות חשיפה לCHI99021 מעכב GSK3 (צ'י), activator חזק של איתות Wnt / β-קטנין, הבאים צבירה.

השיטה המתוארת כאן מספקת בסיס להבנת התהליכים של ארגון עצמי, ארגון צירי ומפרט שכבת נבט בתרבות, המאפשרת הסקת מסקנות להתבצע לגבי פיתוח צירי in vivo 19,21. מסיבות אלה השיטה יש הפוטנציאל לאפשר ניתוח מכניסטית מפורט של תהליכים שעלולות להיות קשה ללמוד בעובר. יתר על כן, יישום פוטנציאל הוא בדור של רקמות ואיברים שאינם בר השגה בקלות בתרבות חסיד בשל חוסר נישה סלולרית מובנה כגוןחוט השדרה מבשרי 21 ומנוע תאי עצב. תרבות הכוללת תלת ממדים מציעה מבנה פיזי וסביבה מאותתת כי לא יכול להיות בר השגה באמצעים קונבנציונליים, שהוביל לגישה חדשה לגזירה של שושלות עובריות באופן מאורגן במרחב.

Protocol

1. תנאי תרבות לפני הצבירה

  1. לשמור mESCs במדיום ESLIF (ראה טבלה של חומרים וציוד ספציפיים לניסוח) על צלוחיות 2 רקמות שטופלו תרבות ג'לטין המצופה 25 סנטימטר בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 21-25 פבואר.
  2. לגדל תאים לפחות שני קטעים לפרסם הפשרה לפני השימוש בפרוטוקול זה; תאים במעברים נמוכים הם בדרך כלל מוצלחים יותר ביצירת מאפיינים לשחזור בכל משכפל ניסוי (כלומר., לא יותר מ 15 קטעים בתרבות), וריאציה קלה אך בין תא-קווי ES השונים היא צפויה (ראה טבלה 2 לשורות התאים שנבדקו ).
  3. לגדל תאים לconfluency 40-60%. אל תשתמשו בתאים על-מחוברות לצבירה.

2. דור של אגרגטים

  1. PBS טרום חם (+ 2 + Ca, Mg + 2 +), ESLIF, N2B27 26,27
  2. בינוני לשאוב תרבות מהבקבוק בתרבית הרקמה (שלב 1.3). יש לשטוף את הבקבוק בעדינות עם 5 מיליליטר PBS, פעמיים. לשאוב PBS ולהוסיף 1 עד 2 מיליליטר של מחומם מראש טריפסין EDTA (0.25%) לנתק את התאים.
    1. מניחים את הבקבוק בחממה ל< 5 דקות או עד שתאים יש מנותקים לחלוטין מהמשטח של הבקבוק. פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת מיליליטר 1 כדי ליצור תא בודד השעיה לספירה מדויקת והיווצרות גודל כוללת אחידה.
  3. לנטרל טריפסין עם 5-10 מיליליטר ESLIF; לשטוף את משטח הצמיחה למקסם את התאוששות תא ולהעביר לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. להסיר aliquot 1 מיליליטר מצינור צנטריפוגות ולספור את התאים עם haemocytometer.
  4. לקבוע את עוצמת הקול של ההשעיה נדרשה לתת 10 תאים / μl (צלחת 96-היטב כל דורשת 5x10 4 תאים ב5 מיליליטר השעיה). ספירת תאים במדויק, כdeviat גדוליונים ממספר התא האמור יכולים להשפיע לרעה על התגובה של אגרגטים לגירויים.
  5. להוסיף 5x10 4 תאים 5 מיליליטר PBS המחומם מראש בצינור טרי 50 מיליליטר צנטריפוגות וספין ב ~ 170 XG במשך 5 דקות.
  6. בזהירות לשאוב PBS ולהוסיף 5 מיליליטר מראש חימם PBS בעדינות; לא להפריע גלולה בחלק התחתון של הצינור. צנטריפוגות ב ~ 170 XG במשך 5 דקות.
  7. לשאוב PBS בזהירות בפעם שנייה. להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מבלי להפריע גלולה כשריד PBS יכול להשפיע לרעה על צבירה. Resuspend גלולה ראשית בN2B27 החם 1 מיליליטר עם טפטפת P1000 ליצור השעיה תא הומוגנית, ואחריו תוספת נוספת של N2B27 להיקף הנדרש (לדוגמא, להוסיף 4 מיליליטר ל5x10 4 תאים / 5 מיליליטר השעיה).
  8. מעבירים את ההשעיה התא למאגר סטרילי ופיפטה אגל 40 μl לתחתית היטב בכל שאינן רקמות תרבות טופלה, 'U'תחתית-96-Wצלחת ell בעזרת פיפטה רבה. מכסה את הצלחת 96-היטב עם המכסה המתאים לו ולאשר את קיומם של תאים עם מיקרוסקופ ספסל העליון הפוך (איור 1).
    הערה: זה חיוני כי צלחות אלה משמשות כדי להגביל את האפשרות של תאי שמירה. האם לא מעיל התחתון של הצלחת 96-היטב עם ג'לטין, פיברונקטין או כל ציפוי אחר שמקדם את הידבקות תא.
  9. דגירה התאים עבור 48 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לצבירה.

3. החלת גירויים ושינוי בינוני

  1. לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, להתבונן במראה של mESCs בתוך היטב בכל הצלחת 96-היטב כדי לאשר צבירה מוצלחת (איור 1E). הערה: מצרפים יופיעו כדוריים בטבע וכ 150-200 מיקרומטר בקוטר. עיין בסעיף פתרון הבעיות אם תתעוררנה בעיות (טבלה 1).
  2. 0; להוסיף 150 בינוניות משניים μl טרי (3 מיקרומטר Chi99021 (צ'י) בN2B27 19; המניה מוכנה ב 10 מ"מ בDMSO) לכל אחד גם בעזרת פיפטה רבה. פיפטה עם מספיק כוח כדי לסלק כל אגרגטים שאולי התחילו לדבוק בתחתית הבארות. דגירה אגרגטים במדיום המשני למשך 24 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (איור 1 א).
    הערה: אגרגטים מוארכים ומקוטבים לשחזור נוצרים באמצעות מדיום המשני זו. גם יצירות בינוניות משניים אחרות, ניתן להשתמש בהתאם לתנאי הניסוי הנדרשים ודוגמאות שמוצגים באיור 3.
  3. לשינויים בינוניים שלאחר מכן, להשתמש פיפטה רבה שנערכה בזווית (כ -30 מעלות) כדי להסיר בעדינות 150 μl של המדיום המשני מהצד של כל טוב. לאחר מכן, פיפטה μl 150 טרי N2B27 לתוך זה גם עם מספיק כוח כדי לסלק כל אגרגטים שייתכן שיש לי התחלהאד לדבוק בתחתית הבארות.
  4. נקודה חזור 3. 3 כל שעה 24 עד זמן הקורס היא מלאה (האורך הטיפוסי של ניסוי תרבות כולל הוא 120 שעות).
    הערה: ודא אגרגטים בחופשיות נעים בעקבות שינויים בינוניים כדי להבטיח שחזור ועקביות בתוך ובין כל צלחת 96-היטב. בינוני יש לשנות יומי לאחר תקופת הצבירה.

4. הכנת אגרגטים לImmunostaining וניתוח על ידי מיקרוסקופיה confocal

  1. קיבעון ויסודי נוגדן דגירה
    הערה: הפרוטוקול שתואר על ידי AK Hadjantonakis 28 שונתה כדי להתאים immunostaining של המסקלין צובר. לנוגדנים האופייניים בשימוש במחקרים שלנו ודילוליהם, מתייחס לפרסמנו את עבודת 19,21,24,25,29 וטבלה 3 בעבר.
    1. השתמש בפיפטה רבה שנערכה בזווית (כ -30 מעלות) כדי להסיר בעדינות 150 בינוני μl מo הצדF היטב בכל צלחת 96-היטב. לשטוף פעמיים על ידי pipetting 150 μl PBS לכל אחד. השאר כמה דקות בין כל שטיפה כדי לאפשר אגרגטים להתיישב.
    2. הגדר פיפטה P1000 לוותר 200 μl, לצרף את קצה פיפטה המקבילה ומנותק כ 3 מ"מ מהקצה של הקצה עם זוג המספריים סטרילי. לצייר חלק של PBS בתוך היטב בכל הצלחת 96-היטב דרך קצרה לקצה ולגרש אותו כדי להתסיס את כוללת.
    3. השתמש באותו הקצה לצייר את כל הנפח בבאר כולל המצטבר ופיפטה לנתיחת תסיסנית זכוכית קטן (30 מ"מ קוטר) כן. העבר את כל אגרגטים מ96-גם הצלחת שתעבור משטרי immunostaining זהים לאותו נתיחת הזכוכית היטב.
      הערה: השתמש בקצה פיפטה לחתוך חדש בעת העברת אגרגטים מתנאי ניסוי שונים כדי למנוע שריד של אגרגטים.
    4. מניחים את הכוס המכילה גם aggregates על מיקרוסקופ לנתיחה. מערבולת הזכוכית גם לכפות המצרפים למרכז ולשאוב PBS מצד אחד של היטב עם פיפטה פסטר זכוכית. השתמש במיקרוסקופ כדי להבטיח המצרפים אינם להישאף. השאר נפח קטן של PBS בתוך באר הזכוכית לכסות המצרפים כדי למנוע מהם מהתייבשות.
    5. הוסף 1 מיליליטר פורמלדהיד מוכן טרי (4%) מומס בPBS ו דגירה של השעה 2 ב 4 ° C על שייקר מסלולית מוגדרת מהירות נמוכה. זהירות: Paraformaldehyde ידוע להיות אלרגני, מסרטנים ורעיל. ללבוש הגנה ראויה תוך טיפול.
    6. בעקבות קיבעון, לשאוב את פתרון פורמלדהיד באותו אופן כפי שתואר בסעיף 4. 1. 4 ולשטוף אגרגטים עם 1 מיליליטר PBS שלוש פעמים, 10 דקות לעם כל שטיפה, על שייקר מסלולית מוגדר מהירות נמוכה.
    7. לשאוב PBS כמתואר בסעיף 4. 1. 4 ולבצע שלוש, 10 שטיפות דקות נוספות עם PBS המכיל 10% עובריים בסרום שור ושל 0.2% TriX-100 טון (PBSFT). לבצע שטיפות 10 דקות על שייקר מסלולית מוגדר מהירות נמוכה.
      הערה: שימוש בסרום שור עוברי תוצאות (FBS) בחיץ לשטוף ברור, צמצום מספר אגרגטים שאחרת היה אבודים בפרוטוקול אם חלב היה בשימוש. חשוב לציין כי בעקבות קיבעון, ניתן לבצע הליכי immunohistochemical בדרכים שונות אחרות מאלה המפורטים להלן וצריכים להיקבע ומותאמים על ידי החוקר.
    8. לחסום המצרפים עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס בPBSFT על נדנדה מסלול מוגדרת במהירות נמוכה. הפרוטוקול יכול להיות מושהה בשלב זה, ומצרפים חסומים O / N, עם תסיסה מתמדת על כיסא נדנדה gyratory אופקי ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. לשאוב PBSFT כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 4. 1. 4) ודגירת המצרפים עם 500 μl של הנוגדן הראשוני הנדרש בדילול המלא PBSFT O / N ב 4 ° C על שייקר מסלולית מוגדר מהירות נמוכה. מכסים בסרט פרפין למניעת אידוי.
  2. דגירה נוגדנים משני
    1. לשאוב את פתרון הנוגדן הראשוני ולשטוף עם 1 מיליליטר PBSFT (4 ° C) באופן הבא: פעמיים במשך 5 דקות; שלוש פעמים במשך 15 דקות; וארבעה עד שבע פעמים במשך שעה 1. לבצע כל שלב לשטוף ב 4 ° C ועל נדנדה מסלול מוגדרת במהירות נמוכה. הערה: צ'יל לשטוף בינוני לפני השימוש. אל תבצע את שוטף על קרח כמו זה יכול לגרום המצרפים לבר.
    2. לשאוב את המדיום לשטוף הסופי ודגירת המצרפים עם הנוגדנים משני הנדרשים ב500 O PBSFT μl / N ב 4 ° C בחושך על כיסא נדנדה gyratory אופקי. להוסיף כתם גרעיני כגון Hoechst אם נדרש.
  3. הרכבה והדמיה על ידי Confocal microcopy
    1. שטוף את אגרגטים כמתואר בסעיף 4. 1. 4 עם 4 מעלות צלזיוס PBSFT. לאחר לשטוף הסופי, לשטוף אגרגטים עם 1 מיליליטר PBS המכיל FBS 0.2% וTriton X-100 (PBT) באופן הבא: פעמיים במשך 5 דקות; שלוש פעמים במשך 15 דקות. לבצע שטיפותב RT על נדנדה מסלול מוגן מפני אור.
    2. לשאוב את המדיום כפי שתואר לעיל (סעיף 4. 1. 4) דגירה במשך 30 דקות בחושך עם 1: 1 פתרון של גליצרול: PBT (1 מיליליטר) ואחרי דגירה 30 דקות שנייה עם 7: 3 פתרון של גליצרול: PBT (1 מיליליטר).
      הערה: מערבבים את גליצרול ופתרונות PBT ב 4 ° C באמצעות הכתף.
    3. לשאוב גליצרול הסופי: פתרון PBT ולהחליף עם 1 מיליליטר הרכבה בינוני 24. הפרוטוקול ניתן עצר בנקודה זו לפני ההרכבה (אם עצר, לאטום את הבארות עם סרט פרפין ולאחסן את בארות צביעה על 4 מעלות צלזיוס).
    4. הר המצרפים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי pipetting אותם ב -17 טיפות μl עם קצה P20 חתך (איור 2). מקפלים קלטת דו צדדית חזרה על עצמה ארבע פעמים כדי ליצור מפרידי ולצרף לכל קצה של השקופית. מניחים את coverslip העליון (22 מ"מ x 60 מ"מ) על מפרידי אלה (איור 2).
      הערה: זה חיוני כי קצה חתך הואמשמש בשלב זה כדי לא לפגוע בדגימות. מפרידי למנוע coverslip ריסוק המצרפים.
    5. ברגע שהמצרפים הם רכובים, תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה confocal באמצעות פרוטוקולים שתוארו קודם לכן 19,21,24,25. הניח פעם במיקרוסקופ, לעזוב את השקופיות ללא הפרעה על הבמה לכמה דקות כדי לאפשר אגרגטים להתיישב בתוך ההרכבה בינונית.

Representative Results

הופעתו של תאים מייד לאחר ציפוי ולאחר צבירה

מייד לאחר ציפוי, ניתן לראות את הנוכחות של תאים בודדים בתוך היטב בכל הצלחת 96-היטב עם מיקרוסקופ רקמות תרבות סטנדרטי הפוך (איור 1). בתוך 8 שעות של ציפוי, תאים אלו החלו לרדת לתחתית הבאר בשל כוח הכבידה והחלו להתגבש לאשכולות בדידים (איור 1 ג). לאחר 24 שעות, התאים התגבשו יהיו השלימו צבירה הראשונית, ויהיה נדחסו לתוך מוגדר היטב אגרגטים, עדיין מרופטים שבו תאים בודדים הם לא ברורים מזה (1D איור). בסופו של היום השני (48 שעות), המצרפים צריכים להיראות "נקיים", שלקח את כל התאים בתוך היטב (איור 1E); תחתית הבאר יכולה להיות כמה תאים שנשפכו מהצבירה בשלב זה. מתןשהמצרפים כבר מצטברים בN2B27, בנקודת זמן זו, הם צריכים להיות כדוריים, כ 150-200 מיקרומטר בקוטר לנוע בחופשיות בתוך היטב (כלומר., לא פעל בהתאם לחלקו התחתון של הבארות). צבירה באמצעי תקשורת אחרת (כלומר., ESLIF או N2B27 עם גורמים ספציפיים) יש את הפוטנציאל לשנות גם את המורפולוגיה כוללת הראשונית והתגובה לגירויים שלאחר מכן (טרנר et al., בהכנה).

נציג מורפולוגי שינויים

תוספת של דופק 24 שעות של מדיום המשני המכיל צ'י בין 48 ו -72 שעות (איור 1 א, 5 א ') מייצרת מוגדרת היטב אגרגטים מוארכים המציגים ביטוי מקוטב בסמנים ספציפיים של השכבות הנבט 19,21. מייד לאחר דופק צ'י (72 שעות), המצרפים יתחילו לשפוך תאים ולהתחיל להראות את תגובתם לאותות הללו לקראת סוף היום זה (איור 3 א). תגובות אלובאים לידי ביטוי על ידי שינויים בביטוי גנים ומורפולוגיה, שניהם תלויים בטיפול שהמצרפים קיבלו לאחר תקופת צבירת 48 שעות הראשונית בN2B27 (איור 3). אם נדרש רק ניתוח נקודת סיום, הזמן האופטימלי לתמונת המצרפים הוא על כ 96-120 שעות. בשלב זה המצרפים יהיו פיתחו מורפולוגיות ברורות ודפוסי ביטוי גנים (איור 3 א), והגודל והמסה שלהם הם עדיין נמוכים מספיק כך שהפליטה של מדיום מפיפטה P200 היא מספיק כדי לסלק כל שאולי מצורף. אי מניעת התקשרות של המצרפי ולישפיע לרעה על היווצרות המצרפי (איור 5Biv). דפוס מורפולוגיות וגן הביטוי של אגרגטים ניתן לשנות בהתאם לטיפול. תוצאות נציג למשטרים מתמשכים או פעם גם עם טיפול או שילוב של גורמים יחידים מוצגות לBMP4, Dorsomorphin H1 (Bחבר פרלמנט מעכב קולט), ActivinA, SB43 (Activin / מעכב קטרים), bFGF או PD03 (מעכב MEK) (איור 3).

הדמיה כוללת וניתוח תמונת כמותית

אגרגטים נוחות להדמיה או על ידי מיקרוסקופ widefield (בעיקר להדמיה הזמן לשגות 19), או קבוע immunostained עבור ההדמיה confocal 19,21 (איור 2). תיאור הפרוטוקול וההדמיה הנוכחי לעיל מאפשר מידע כמותי כדי להיות שנרכש מאגרגטים אלה. confocal הבא או לכידת תמונה רחב בתחום, לאורכה והביטוי המקביל הגן לאורך הקוטר או עמוד השדרה של המצרף (כדורי או מוארך בהתאמה; איור 4 א ', ב') ניתן למדוד. ניתוחים אלה גם ישירות החלים על הזמן לשגות תמונות, שבו אפשר לקבל מידע על קצב צמיחה, גודל והתארכות של אגרגטים בתנאים שונים (איור 4

איור 1
איור 1. בזמן כמובן אופייני ומורפולוגיות מוקדמות. (א) בזמן כמובן האופייני לניסויי צבירה. תאים מצטברים במשך 48 שעות בN2B27 מכילים השעיה של תאי הגזע העובריים של עכבר (10 תאים / μl) בצלחת 96-היטב (P1, P2). (ב) מייד לאחר ציפוי (t = ~ 5min), תאים בודדים יכולים להיות ראה בהשעיה והחלה ליצור גושים ידי 8h (C). (ד) לאחר 24 שעות התאים יצרו כולל אחת בכל טוב שהוא כ 100 מיקרומטר בקוטר. (E) לאחר צבירת 48 שעות, במצטבר קוטר נע 150-200 מיקרומטר. בשלב זה, את מדיום הצבירה (N2B27) הוא שהוסר ובינוני משני מתווסף גם לשאר הניסוי (P1 בחלק) או למשך 24 שעות לפני שהשתנה ב Ack לN2B27 (P2 בחלק). בר סולם מייצג 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. מצרפי הרכבה על גבי שקופיות מיקרוסקופ. ברגע שהמצרפים תוקנו, immunostained והניח בהרכבה בינונית, כל כולל הוא pipetted על שקופיות מיקרוסקופ כאגל 17 μl (A, B, B '). מרחב מספיק נותר בין הטיפות מצטברות כדי למנוע המיזוג שלהם. מפרידי הם עשו עם סרט דו צדדי והוצבו בכל פינה של שקופיות מיקרוסקופ (, ', ב'). זה על אלה שcoverslip זכוכית ממוקם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. ההשפעה של טיפולים שונים על המורפולוגיה של תאי גזע עובריים מצטברים. בעקבות 2 ימים בN2B27, תאי גזע עובריים יצרו אגרגטים. תוספת של גורמים ספציפיים או כדופק יום 1 (א) או ברציפות (ב) יכול לשנות את הפנוטיפ של אגרגטים ביחס לקוטביות של ביטוי גנים, פוטנציאל התארכות, או את צורתם הכללית. דוגמאות בנתון זה הם אגרגטים נוצרו משתי חזייה :: GFP 30 (א) או Sox1 :: תאי הגזע העובריים של עכבר 27 (ב) GFP הדמיה לאחר 120 שעות וטופלו כפי שצוין. צ'י: CHIR 99,021 31; SB43: SB 431,542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ההוא דמות.

איור 4
איור 4. ניתוח כמותי של אגרגטים. המצרפי טיפוסי נוצרו מהחזייה :: mESCs GFP 25,30 הבאים דופק 24 שעות של צ'י וצלם ב 120 שעות. תמונה ממוזגת של השדה הבהיר וערוץ ה- GFP מוצגת עם קו מפולח לציון 'עמוד השדרה' של הצבירה מנקודת A ל- B (), שאורכו הקרינה והאורך הכולל ניתן למדוד (B). האורך (C) ו'העגלגלות '(D) מ -24 אגרגטים באותו הניסוי מוצגים. מתארי צורה כגון עגלגלות (ד '), מעגלי, האזור ההיקפי וניתן למדוד באמצעות תמונת תוסף ניתוח ספר מתכונים מהתוכנה פיג'י ניתוח תמונה 35. אומר שצוין על ידי קו אופקי בכל נקודת זמן;ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן; סרגל קנה מידה ב() מציין 200 מיקרומטר. כמו שיש הבדלים דקים בין שורות תאי כתב, צפוי כי לאחר דופק של צ'י, האורך הממוצע מרבי ועגלגלות מינימום ממוצעת של אגרגטים ישתנו. בין שורות תאים שונות, אנו מוצאים שהאורך המרבי הממוצע יכול להיות בטווח של 400-800 מיקרומטר ~ ועגלגלות המינימום הממוצעת בין 0.4 ו -0.6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. דוגמאות לכשלים במערך כולל. היכולת ליצור אגרגטים לשחזור () תלויה בגורמים קריטיים כגון (BI) בינוני משני טריים וגם מעורב, (Bii, Biii) הדיוק בספירת n הראשוניחום-אדמדם של תאים ו( ביב) להבטיח המצרפים לא יוצר מושבות חסיד כלומר., "התרסקות" לתוך השטח של הבאר. דוגמאות אופייניות לשגיאות במבנה כולל של כל אחד מהתנאים שהוזכרו (B) מוצגות. Scale-בר כפי שצוין; ראה טבלת בעיות ירי לפרטים (טבלת 1). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
שולחן מדריך 1. לפתרון בעיות. שגיאות אופייניות הקשורים לפרוטוקול הצבירה ניתנים עם הצעות לגבי ההחלטה שלהם.

טבלה 2
הטבלה 2. טבלה של שורות תאים שנבדקה להיווצרות של AGGregates. מספר שורות תאים 19,22,27,30,36-40 מתאפיינים ליצירת אגרגטים ו, למרות הבדלים דקים בין שורות תאים צפויים ונצפו, כל הקווים מעל להראות דינמיקה דומה במונחים של התארכות ומורפולוגיה. במונחים של ביטוי גנים, דפוס הביטוי הוא ספציפי לגן הביע, אבל בתוך כל שורת תאים, דפוס הביטוי הוא בדרך כלל עקבי לאורך מספר הקטעים. לעקביות, אנו יוצרים אגרגטים מהתאים שלא עלו על 15 קטעים בתרבות.

טבלה 3
רשימת טבלה 3. נוגדני נציג משמשים במחקרים אלה. בחירה של הנוגדנים והגורמים המשמשים לדילול immunostaining הכולל.

Discussion

הטכניקה המתוארת בכתב היד הזה ביעילות ובreproducibly יוצרת אגרגטים של תאי גזע העובריים של עכבר (mESCs) שתצוגה מאורגנת סימטריה-שבירה והתארכות 19, שילוב של שניהם תרבות ירידת תלייה שתוארה על ידי Marikawa et al. 14 וEB היווצרות. אגרגטים אלה להמשיך לפתח מוארכים וציריים, משלימים שיטות קיימות לדור של איברים קדמי מתאי גזע עובריים כגון כוסות אופטיות 11 וקליפת המוח 13, ומכילים תאים עם זהותם של שכבות שלוש נבט בי תצוגת תהליכים דומים לאלה בgastrulation כמו 19,21 תנועת תאים מהירות.

זה מעניין, להעלות השערות על אופי האירוע שבירת הסימטריה, שכן הוא מתרחש בהעדר רקמות דפוסים חיצוניים וסימטרית zygotic מקלות 19. ההיווצרות הספונטנית של ציר בסיסי יכולה לנבוע מקיימת מראש heterogeneities בתרבות החל מתאים, המהווים את הבסיס לפיתוח של א-סימטריה. ואכן, אוכלוסיות של תאים בתרבית בתנאי ESLIF להציג תערובת של עצמי חידוש והבחנת תאים, הפרופורציות היחסית של אשר עשויות להשתנות מצבירה אחד למשנהו. יתר על כן, עבודה ראשונית במעבדה שלנו מצביעה על כך שאגרגטים מאוכלוסייה מלא pluripotent של תאים להראות התפתחות מאוחרת ופגמים בדפוסים, המצביע על תפקיד להטרוגניות בהיווצרות דפוס מאורגן (DA טרנר וא מרטינז אריאס, בהכנה). כדאי גם בהתחשב בכך שמנגנון תגובה-דיפוזיה עלול ליצור הדפוס, עם דיפוזיה של מעכב מהמשטח של כולל. Warmflash et al. 41 מצביע על כך שמנגנון כזה יכול להיות אחראי על פיתוח סימטריה רדיאלית בתרבות חסיד, מה שהופך אותו למועמד אפשרי לדפוסים בשלושה ממדים.

במהלך initiaתקופת צבירת 48 שעות l, תאים להגיע למצב דומה לזה שבתוך epiblast postimplantation, שבו הם המוסמכים להגיב לאותות מהמדיום המשני 19,21,24. בדרך כלל, הפרוטוקול המתואר כאן מספק תאים עם דופק של מדיום המשני המכיל גורמים (כמו אגוניסטים Wnt / β-קטנין) המספקים את האותות מספיק להתארכות. שיטות קודמות תרבות שתוארו על ידי et al לנקסטר. (באמצעות ESCs 13 בני האדם) וEiraku אל. (עם mESCs 11) משמש et תקופה קצרה של צבירה נמוכה בהידבקות 96-גם צלחות לפני תאים מצטברים הועברו לטיפי Matrigel למאזניים הולך תרבות. למרות הזמן בין הצבירה והכנסת Matrigel היה שונה בין המחקרים, בשני המקרים, מספר גדול של תאים ששימשו להיווצרות המצרפי (כ 3,000-4,500 תאים). בניגוד לכך, הפרוטוקול מתואר כאן 19 משתמשים בהרבה פחות תאים (כ 400 תאיםלצבירה) שנקבע להיות חיוני לתהליך של התארכות, סימטריה-שבירה והקיטוב שהוא ציין 19. בנוסף, מבנים מוארכים אלה יכולים להיות שנוצרו בתקופת זמן קצרה הרבה יותר ללא הטבעה במטריצות מלאכותיות: להשוות את הדור של אזורים במוח שהוגדרו על ידי אל נקסטר et (> 20-30 ימים) 13 ואופטי כוסות מEiraku. et al. (~ 11 ימים) 11 עם 5 ימים הנדרשים לייצור מבנים מוארכים מקוטבים.

אחת המגבלות בשיטת התרבות המתוארת כאן לעומת זאת, הוא שהם יכולים להיות מתורבת רק כ 5-6 ימים לאחר ציפוי עד הגודל שלהם הופך אותם מוסמך תחת כובד לשקוע לתחתית של הבארות ולאלץ את הידבקות אפילו על אי פלסטיק כלי -coated. ניסויים נוספים באמצעות מטריצות מלאכותיות כגון אלה שהוזכרו קודם לכן, אולי יאפשר לנו להגדיל את התקופה שלתצפית וניסויים, ועבודה הוא לקבוע את ההשפעות של הגבלת המצרפים באופן שוטף. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שכדי לשנות את המדיום מבלי להסיר אגרגטים, נפח קטן של מדיום יש להשאיר בתחתית הבאר. ההשלכות לגנטיקה כימית גישות הצורך לשקול דילול זה וכל השפעה שיורית מתקשורת הקודמת: ביום דופק צ'י 3 מיקרומטר, 2.37 מיקרומטר פתרון הוא למעשה נמסר, ושינויים בינוניים לאחר לגרום לשאת על של .499 מיקרומטר (72-96 שעות) ו0.105 מיקרומטר (96-120 HR) בין נקודות הזמן. העבודה נוכחית לא תיקנה לדילול, ויש להניח כי שינויים בינוניים יומיים יהיו למזער השפעה שיורית.

ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול כדי להבטיח שחזור שני התוך והבין-ניסיוני. ראשית, תרבות המוצא של mESCs חייבת להיות מטופחת ולא על שיתוףnfluent, ובינוני תמיד צריך להיות כלומר באיכות טובה., (איור 5 א ', ב') הטרי וגם מעורבים. תנאי תרבות עניים להשפיע לרעה על הצבירה (איור 5Bi). ספירה מדויקת של תאים להשיג השעיה תא ~ 400 תאים / μl 40 היא חיונית, כמו אגרגטים גדולים נכשלים עצמי לארגן ונוטה יותר ליצור אגרגטים כפולים בתוך כל טוב (איור 5Bii) ואילו אגרגטים קטנים יותר אינם יכולים להגיע לנכון צפיפות בו הם יכולים להגיב לגירוי (איור 5Biii). צעד אופטימיזציה מפתח היה הכללת לשטוף PBS שני שמסיר סרום מזהם מהשעית התא (שלב 2.6); זה שיפר את תדירות הצבירה והאיץ את התפתחות המצרפים של כ 24 שעות. בשלב הבא, שינויים בינוניים להבטיח מיושמים בכוח מספיק כדי לסלק כל אגרגטים שיש לו את הפוטנציאל לדבוק פני השטח של הבאר; כישלון לעשות זאת resuLTS ב'מתרסק 'המצרפים (איור 5Biv). בנוסף, וכפי שהוזכר קודם לכן (ומטה), זה חיוני כדי להבטיח כי המצרפים נשמרים בתרבות השעיה ומנועים מהקפדה על כל משטח. ברגע שהמצרפים דבקים, הדפוס של ביטוי גנים ופוטנציאל התארכותם הם שיבשו.

כטכניקה זו היא פשוטה יחסית, וגם במסגרת גבולות של אנשים עם טכניקות רקמות תרבות טובות, רוב הבעיות הקשורות לצבירה ניתן לפתור במהירות יחסית, אם הם אחרי השלבים הקריטיים אלה; שולחן מלא בעיות ירי נגיש (טבלה 1). ברגע שמשתלט עליו, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור פיתוח צירי, אירועי שבירת סימטריה ותא-החלטה. באופן ספציפי יותר, יש לי אגרגטים אלה הפוטנציאל ליצור בריכות של תאים שהיו זמין עד כה בתרבות, כגון כבל, אופנועים ואופניים השדרהנוירונים r.

הערה אתית: יש לציין בזהירות הראויה שהתרגום של פרוטוקול זה לES אדם או תרבית תאי iPS יכול להביא הניסוי קרוב לבסיס המשפטי של מגבלת ארבע עשרה יום על מחקר בעוברים אנושיים, כלומר הדור של פס פרימיטיווי, כמפורט באדם ההפריה ואמבריולוגיה החוק (2008 בריטניה) 42. מאז החוק מכסה את כל עוברי האדם חיים ללא קשר לאופנם של יצירה, התרבות של gastruloids האנושי מעבר לפרימיטיבי-פס כמו שלב תהיה מעבר להיקף של מחקר רישוי.

Acknowledgements

עבודה זו ממומנת על פרס חוקר ERC מתקדם לAMA (DAT, שחפת) על ידי עם תרומה של גרנט פרויקט של קרן Wellcome לAMA, מלגת לימודי EPSRC לPB-J וארסמוס, ד"ר Stichting. Vaderlandsch חטיבות של הנדריק מולר וFundatie ואן דה ואן Vrijvrouwe Renswoude 'te S-Gravenhage לSCvdB. אנחנו רוצים להודות לג 'בריסקו, ס מוניוז-Descalzo, ג Schroeter, וט רודריגז, לדיונים וביקורת בונה, חואקין דה Navascués לפרוטוקול ההרכבה הבינוני ושני AK Hadjantonakis וג Budjan לשיתוף הפרוטוקולים של המעבדה שלהם הנוגע להכתמה של עוברים כל הר. גרסה קודמת של מאמר זה היה זמינה בעבר על שרת bioRxiv טרום 29.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25 cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50 ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO
Dissection Well (30 mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, (5819), 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  3. Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146, (3), 488-488.e2 (2011).
  4. Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
  5. Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).
  6. Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371, (2), 170-179 (2012).
  7. ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3, (5), 508-518 (2008).
  8. Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2, (1), 60-71 (2008).
  9. Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
  10. Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284, (1), 67-81 (1999).
  11. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, (7341), 51-56 (2011).
  12. Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9, (6), 1229-1244 (2014).
  13. Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, (7467), 373-379 (2013).
  14. Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47, (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).
  15. Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103, (1), 193-209 (1988).
  16. Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220, (2), 227-233 (1982).
  17. Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14, (2), 132-179 (1939).
  18. Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129, (4), 669-793 (1933).
  19. van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141, (22), (2014).
  20. Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, (5), 519-532 (2008).
  21. Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141, (22), (2014).
  22. Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140, (6), 1171-1183 (2013).
  23. Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7, (7), e1000149 (2009).
  24. Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3, (7), 614-626 (2014).
  25. Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12, (1), 63 (2014).
  26. Ying, Q. -L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  27. Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21, (2), 183-186 (2003).
  28. Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. Molecular Embryology of the Mouse. CSHL. 1-90 (2011).
  29. Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. (2014).
  30. Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130, (17), 4217-4227 (2003).
  31. Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52, (3), 588-595 (2003).
  32. Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62, (1), 65-74 (2002).
  33. Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3, (8), e2904 (2008).
  34. Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3, (6), 482-491 (2012).
  35. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  36. Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24, (3), 312-326 (2010).
  37. Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, (7173), 1230-1234 (2007).
  38. Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44, (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).
  39. Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5, (6), 956-966 (2012).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326, (6110), 292-295 (1987).
  41. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11, (8), 847-854 (2014).
  42. Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. The Stationery Office. (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats