마우스 배아 줄기 세포의 집계의 세대 대칭 속보, 양극화 및 응급 집단 행동은보기가
1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Published 11/24/2015
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Developmental Biology
 

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Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).

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Abstract

우리는 현재 배아 바디 (EB) 자기 조직의 연구를 할 수 있습니다 문화, 대칭 파괴, 축 신장 및 현탁 배양에 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 집계를 사용하여 세포의 운명 사양을 개선하는 프로토콜을 개발했습니다. mESCs의 작은 번호가 실험 신호에 응답 할 능력이 후 비 조직 문화 처리, U 바닥 96 웰 플레이트에서 48 시간 동안 기초 매체에 집계됩니다. 치료 후, 이러한 응집체는 편광 된 유전자 발현의 흔적이 점차 외부 비대칭 단서의 부재하에 연장 된, 잘 조직 된 세포 구조의 구형 질량에서 자신의 형태를 변경하기 시작한다. 이러한 구조는 단지 세 배엽의 마커를 표시 할 수 있지만, 적극적으로 결정적 장형 구조의 영역에서 발생 집합체로부터 개별 세포의 탈락에 의해 입증 방향성 낭배 같은 움직임을 표시. 이 protocOL이 집계의 재현 형성 등의 Wnt / β-catenin의 활성화와 BMP 억제 및 단일 시간 포인트 또는 시간 경과 형광 현미경으로 자신의 분석과 같은 신호와의 자극에 대한 자세한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 고정 된 집합 내의 특정 마커의 면역 세포 화학 분석을 위해 현재 전체 마운트 마우스 배아 염색 절차에 대한 수정을 설명합니다. 형태학, 유전자 발현 및 응집체의 길이 변화는 양적 신호 축 운명을 변경할 수있는 방법에 대한 정보를 제공하고, 측정 될 수있다. 또한이 시스템은 축선 개발 및 조직으로 발달 초기 사건 연구 모두에 적용될 수 있음을 예상하고,보다 광범위하게, 자기 조직화 및 셀룰러 의사 결정 프로세스. 그것은 또한 척수 뉴런과 같은 종래의 모터 부착 배양 물로부터 구할 수있는 본 배아 세포 유형의 생성에 적합한 틈새를 제공 할 수있다.

Introduction

초기 포유류 개발 연구 및 세포 운명 결정에 대한 이해는 배아 줄기 세포의 배양 물 (는 ESC), 갱신 및 생물체의 모든 종류의 세포로 분화 자체로 기능이 배반포로부터 유도 된 클론 집단을 사용할 수있다, 즉., 그들은 능성 1,2입니다. 이러한 문화가되었습니다 및 세포 운명 결정의 분자 기준의 이해에 도움이 될 것을 계속하는 동안, 그들은 낭 배기 동안 배아에서 생성되는 공간 배치 및 글로벌 행동의 일부를 재현 할 수 없습니다. 배아에서 낭배의 프로세스는 세 가지 배엽으로 단일 상피층 변환하고 명백한 전후 조직 3-5와 배아를 부여한다. 이러한 이벤트 생체 요점을 되풀이하는 시도는 ESC 입체 응집체의 생성에 기초 된, 같은 배아 체 EBS () 라하고, 그들이 t를 실시분화 조건 6,7 오. . 예를 들면, 피도 8 및 원시 생식 세포 (9) 이들 응집체가 얻어 또는 접착 배양에서 낮은 효율로 유도 될 하나 없거나 전혀 생성 될 수없는 일부의 많은 다른 유형의 세포로 분화 할 기른 수있다. 사채의 사용에 제한은 있지만, 이들이 공간적 해체 6,10에서 얻어진 배아의 주요 특징이다 형태 형성 동작, 배아 층 분포 축 또는 조직을 표시 할 수없는 점이다. 한 보고서에서의 Wnt와 사채의 치료는 일부 집계에서 유전자 발현에 약한 편광에 이르게하지만 명확한 형태 형성은 7 관찰되지 않는다. 최근 보고서에서 장기간 배양 된 사채는 배아 대응을 모방 등의 망막, 피질과 내이 감각 세포와 같은 전방 구조를 개발하지만 축 organizat의 맥락없이 개발이온 11-13.

의 보고서는 Marikawa 등. (14), 매달려 드롭 방법에 의해 형성 마우스 P19 배아 암종 (EC) 세포의 집합체로 작업하는 동안, 양서류에 exogastrulae으로 관찰되는 신장의 연상 중배엽 기원의 연장 된 구조의 출현을보고 와 성게 배아 및 켈러는 15 ~ 18 외식. 이 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)으로 관찰되지 않았다, 우리는 P19 EC 세포가 mESCs (19)의 집계를 사용하여 관찰 동작을 재현하려고하고 우리는 그들의 파괴 대칭 및 축 신장으로 이어질 배양 조건을보고합니다. P19 세포와 작업에서 중요한 차이는 여기에 설명 된 통합 프로토콜 대신 방울 매달려, Eiraku 외. (20)에 의해 설명 된 것과 유사한 96- 웰 플레이트에서 수행된다는 점이다. 이러한 변화는 집계 회복과 모두 측면에서 효율성의 결과인트라 간 실험 재현성. 발생하지 않습니다 (매달려 방울에서 집계를 풀링 할 때 공통) 중요한 것은, 개별 우물에 집계를 유지하는 골재 사이의 융합을 보장합니다. 또한, 프로토콜의 주요 기능은 다음과 응집 GSK3 억제제 CHI99021 (CHI)의 Wnt / β 카테닌 신호의 강력한 활성화 제에 24 시간 노출된다.

여기에 기재된 방법은 추론 생체 (19, 21)에 축 방향에 관한 개발 될 수 있도록 배양에서 자기 조직화, 축 조직 및 배아 층 규격의 과정을 이해하기위한 기초를 제공한다. 이러한 이유로이 방법은 배아 유학 어렵다 프로세스의 상세한 기전 분석을 허용 할 수있는 잠재력을 갖는다. 또한, 잠재적 인 응용 인해 구조적 틈새 세포의 부족 등으로 접착 배양에서 쉽게 얻을 수없는 조직과 기관의 발생에척수 (21)와 모터 뉴런을 전구체. 입체 집계 문화가 공간적으로 조직 된 방식으로 배아 계통의 유도에 대한 새로운 접근 방식을 선도, 통상적 인 방법에 의해 달성되지 않을 수 있습니다 물리적 구조 및 신호 환경을 제공합니다.

Protocol

1. 문화 조건 집계 이전

  1. CO 2월 21일부터 25일까지 37 ℃에서 가습 인큐베이터에 젤라틴 코팅 25cm 2 조직 문화 처리 된 플라스크에 ESLIF 매체에 mESCs을 (제제에 대한 특정 재료 및 장비의 표 참조)를 유지하고 5 %.
  2. 이 프로토콜에서 사용하기 전에 해동을 게시 적어도 두 구절에 대한 세포를 성장; 낮은 통로에서 세포 실험 복제를 통해 재현 특성을 생성에 일반적으로 더 성공 (즉., 문화에 더 이상 15 유로), 다른 ES 세포 라인 사이 그러나 약간의 변화가 (참조 예상 할 수있다 테스트 세포주 표 2 ).
  3. 40 % -60 %의 포화 상태로 세포를 성장. 집계 오버 합류 세포를 사용하지 마십시오.

집계의 2 세대

  1. 사전 따뜻한 PBS (+ 칼슘 + 마그네슘 2+), ESLIF, N2B27 (26, 27)
  2. 조직 배양 플라스크에서 대기음 배양 배지 (단계 1.3). 두 번, 5 ml의 PBS로 조심스럽게 플라스크를 씻어. PBS를 기음과 세포를 떼어 놓다 1 미리 예열 트립신 - EDTA (0.25 %) ml의 2를 추가합니다.
    1. <5 분 또는 세포가 완전히 플라스크의 표면에서 분리 될 때까지 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다. 피펫까지 정확한 계산하고 균일 한 골재 크기의 형성을위한 단일 세포 현탁액을 생성하는 1 ML의 피펫 아래.
  3. 5 ~ 10 ml의 ESLIF와 트립신을 중화; 세포 회수를 최대화하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 전송할 성장 표면을 씻어 내린다. 원심 분리 관에서 1 ML의 나누어지는을 제거하고 혈구와 세포를 계산합니다.
  4. 세포를 10 / μl를 제공해야 현탁액의 부피를 (전체의 96 웰 플레이트를 5 ㎖ 현탁액에 5 × 104 세포를 요구한다)을 결정. 큰 deviat으로, 정확하게 세포를 계산명시된 세포 수로부터 이온 악영향 자극 응집체의 응답에 영향을 미칠 수있다.
  5. 5 분 ~ 170 XG에 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브와 스핀에 5 ml를 미리 예열 PBS에 5 × 4 셀을 추가합니다.
  6. 조심스럽게 PBS를 대기음 및 5 mL를 추가 PBS를 부드럽게 미리 예열; 튜브의 하단에있는 펠렛을 방해하지 않습니다. 5 분 ~ 170 XG에 원심 분리기.
  7. 조심스럽게 두 번째 PBS를 대기음. 나쁜 집계에 영향을 미칠 수있는 PBS 이월로 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. 필요한 부피 N2B27 더 첨가하여 균일 한 세포 현탁액을 생성 P1000 피펫으로 1 ml의 따뜻한 N2B27에 먼저 펠렛을 재현 탁 (예를 들어, 5 × 4 셀 / 5 ㎖ 현탁액 4 ml를 추가).
  8. 멸균 저장조에 세포 현탁액을 전송하고 처리되지 않은 조직 배양의 각 웰의 바닥에 40 μL 방울을 피펫 '96 w를 U'는 바닥멀티 채널 피펫을 사용하여 엘 판. 해당 뚜껑 96 웰 플레이트를 커버하고 반전 벤치 탑 현미경 (그림 1B)와 세포의 존재를 확인합니다.
    주 :이 판은 부착 세포의 수를 제한하는 데 사용되는 것이 필수적이다. 하지 피막을 젤라틴, 피브로넥틴 또는 세포 부착을 촉진 다른 코팅 된 96- 웰 플레이트의 바닥을한다.
  9. 집계 CO 2, 37 ℃에서 가습 된 배양기에서 48 시간 동안 세포를 인큐베이션하고, 5 %.

3. 자극을 적용하고 중간 변경

  1. 48 시간의 인큐베이션 기간 후에, 성공적인 응집 (도 1E)를 확인하기 위해 96 웰 플레이트의 각 웰 내에 mESCs의 외관을 관찰한다. 참고 : 집계 자연 구형 직경 약 150 ~ 200 μm의 표시됩니다. 문제는 (표 1) 발생하는 경우 문제 해결 섹션을 참조하십시오.
  2. 0 (N2B27 19에 3 μm의 Chi99021 (치) DMSO에 10 밀리미터에서 준비 주식) 150 μL 신선한 보조 매체를 추가 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 충분한 힘으로 피펫은 우물의 바닥에 부착하기 시작했습니다 수있는 집계을 제거합니다. 37 ° C, 5 % CO 2 (그림 1A)에 가습 배양기에서 24 시간 동안 보조 매체에서 집계를 품어.
    참고 : 재현 연장 및 편광 집계는이 보조 매체를 사용하여 생성됩니다. 다른 이차 배지 조성물은 또한 실험 조건 요구 및 실시 예는도 3에 도시된다에 따라 사용될 수있다.
  3. 이후 중간 변경, 부드럽게 잘 각각의 측면에서 보조 매체의 150 μl를 제거하는 각도 (약 30도)에서 열린 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 그런 다음, 충분히 힘으로 각에 N2B27 신선한 피펫 150 μL 시작을 가질 수있는 집계을 제거하는ED는 우물의 바닥을 준수합니다.
  4. 시간 코스까지 매 24 시간 반복 포인트 3. 3가 완료 (총 배양 실험의 전형적인 길이는 120 시간이다).
    참고 : 확인 집계 자유롭게 내에서 각 96 웰 플레이트 사이에 재현성과 일관성을 보장하기 위해 매체의 변화에​​ 따라 이동하고있다. 중간 집계 기간 다음 매일 변경해야합니다.

공 초점 현미경으로 면역 염색 및 분석을위한 골재 4. 준비

  1. 고정 및 기본 항체 인큐베이션
    주 : AK Hadjantonakis (28)에 의해 설명 된 프로토콜은 MESC는 집계의 면역 염색에 맞게 수정되었습니다. 우리의 연구와 자신의 희석에 사용되는 일반적인 항체를 들어, 이전에 작업 19,21,24,25,29 표 3 게시를 참조하십시오.
    1. 각도에서 열린 멀티 채널 피펫을 사용하여 (약 30 °)를 부드럽게 쪽 (O)에서 150 μL 매체를 제거합니다96- 웰 플레이트의 각 웰 F. 물론 각에 150 μL PBS를 피펫 팅에 의해 두 번 씻으십시오. 집계가 정착 할 수 있도록 각 세척 사이에 몇 분을 남겨주세요.
    2. 200 μl를 분배 해당 피펫 팁을 부착하고 멸균 가위와 팁의 끝에서 약 3mm을 차단 P1000 피펫을 설정합니다. 끝으로 96 웰 플레이트의 각 웰 내에 짧은 방법을 PBS의 부분을 그리고 골재를 교반 할 추방.
    3. 잘 잘 소형 (30mm 직경) 유리 초파리 절개로 집계과 피펫을 포함하여 내 전체 볼륨을 작성하기 위해 같은 팁을 사용합니다. 잘 같은 유리 해부에 동일한 면역 체계를 받게 될 것이다 96 웰 플레이트에서 모든 집계를 전송합니다.
      참고 : 골재의 이월을 방지하기 위해 다른 실험 조건에서 집계를 전송할 때 새로운 컷 피펫 팁을 사용합니다.
    4. aggregat이 들어있는 유리 잘 배치해부 현미경 상으로 말이지. 유리 파스퇴르 피펫으로 웰의 일측으로부터 중심과 흡 PBS로 집계를 강제로 잘 유리 소용돌이 친다. 집계가 흡입되지 않도록하기 위해 현미경을 사용합니다. 건조되는 것을 방지하기 위해 집계를 충당하기 위해 유리 잘 내 PBS의 작은 볼륨을 남겨주세요.
    5. 1 ml의 새로 제조 된 포름 알데히드 (4 %) PBS에 용해 낮은 속도로 설정 궤도 진탕 기에서 4 ℃에서 2 시간 동안 부화를 추가합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 알레르기 발암 및 독성 것으로 알려져있다. 처리하는 동안 적절한 보호구를 착용 할 것.
    6. 제 1 섹션 4에 기술 된 바와 같이 고정 후, 동일한 방법으로 포름 알데히드 용액을 흡인하고 낮은 속도로 설정 오비탈 진탕 기에서, 각 세척에 대해, 1 ml의 PBS로 3 회 10 분 세척 집합체.
    7. 제 1 섹션 4에 기술 된 바와 같이 PBS를 흡인하고 PBS 10 % 태아 소 혈청 및 0.2 % 트리를 포함하여 상기 세, 10 분 세척을 수행톤 X-100 (PBSFT). 낮은 속도로 설정 궤도 진탕 기에서 10 분 세척을 수행합니다.
      주 : 우유 사용한 경우 그렇지 않은 프로토콜 동안 손실 될 응집체의 수를 감소, 맑은 세척 완충액에서 태아 소 혈청 (FBS)을 사용하여 결과. 그것은 고정 다음, 면역 절차 아래 설명 이외 다양한 방법으로 수행 될 수 있으며 결정에 의해 최적화 조사자되어야한다는 것이 중요하다.
    8. 낮은 속도로 설정 궤도 로커에 PBSFT에서 4 ° C에서 1 시간 동안 집계를 차단합니다. 이 프로토콜은이 시점에서 일시 정지 및 집계는 4 ℃에서 수평 자이 러 토리 로커에 일정한 교반, O / N을 차단 될 수 있습니다.
    9. 전술 한 바와 같이 PBSFT를 대기음 (섹션 4. 1. 4 참조)과 낮은 속도로 설정 궤도 흔드는에 4 ° C에서 PBSFT O / N에 희석 필요한 일차 항체 500 μL와 집계를 품어. 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름 커버.
  2. 차 항체 보육
    1. 일차 항체 용액을 흡인하고 다음과 같이하여 (4 ℃에서) 1 mL로 세척한다 PBSFT : 회 5 분간; 세 번 15 분 동안; 1 시간 동안 4-7 번. 4 ° C에서 낮은 속도로 설정 궤도 로커의 각 세척 단계를 수행합니다. 참고 : 칠이 사용하는 매체 이전에 씻는다. 이 단편을 집계을 일으킬 수있는 얼음에 세척을 수행하지 마십시오.
    2. 최종 세척 매체를 기음과 수평 자이 러 토리 로커에 어둠 속에서 4 ° C에서 500 μL PBSFT의 O / N에서 필요한 이차 항체와 집계를 품어. 필요한 경우 같은 헥스로 핵 얼룩을 추가합니다.
  3. 공 초점 축소 복사하여 설치 및 이미지
    1. 4 ° C PBSFT과 4 절 1. 4에 설명 된대로 집계를 씻으십시오. 최종 세척 후, 1 ml의 PBS가 다음의 방식으로 0.2 % FBS 및 트리톤 X-100 (PBT)를 포함하여 응집체 린스 : 회 5 분간; 15 분 동안 세 번. 세척을 수행실온에서 궤도 로커에 빛으로부터 보호.
    2. 글리세롤 용액 1 : PBT (1 mL)을 7 초, 30 분 인큐베이션 하였다 : 3 용액 1과 어둠 속에서 30 분 동안 전술 한 바와 같은 매체 대기음 (제 4 1. 4) 및 부화 글리세롤 : PBT (1 mL)을 첨가 하였다.
      참고 : 회전을 사용하여 4 ° C에서 글리세롤과 PBT 솔루션을 섞는다.
    3. 최종 글리세롤을 대기음 : PBT 솔루션과 매체 (24)를 장착 한 ㎖로 대체합니다. 이 프로토콜은 (일시 정지하는 경우, 파라핀 필름 우물​​을 봉인하고 4 ℃에서 염색 우물을 저장) 이전에 설치에이 시점에서 일시 정지 할 수있다.
    4. 컷 P20 팁 (그림 2) 17 μL 방울에서 그들을 피펫 팅에 의해 현미경 슬라이드에 집계를 탑재합니다. 스페이서를 생성하고 슬라이드의 양 끝을 연결하는 다시 자체에 네 번 양면 테이프를 접습니다. (그림 2)이 스페이서에 따라 상단 커버 슬립 (22mm X 60mm)를 놓습니다.
      주 : 절단 팁은 필수적이다샘플 손상되지 않도록,이 단계에서 사용 하였다. 스페이서는 집계를 분쇄 커버 슬립을 방지 할 수 있습니다.
    5. 골재가 장착되면, 프로토콜을 사용하는 공 초점 현미경을 사용하여 화상 샘플 이전에 설명 19,21,24,25. 일단 현미경에 배치, 집계가 장착 매체 내에 정착 할 수 있도록 몇 분 동안 무대에 평온 슬라이드를 둡니다.

Representative Results

즉시 도금 후 집계 후 세포의 모양

도금 후 즉시, 하나는 역전 표준 조직 배양 현미경 (도 1b)를 96- 웰 플레이트의 각 웰 내 단일 세포의 존재를 관찰 할 수있다. 도금의 8 시간 내에서 이러한 세포가 중력에 잘 때문에 아래쪽으로 하강하기 시작하고 별도의 클러스터 (그림 1C)로 합체하기 시작했다합니다. 24 시간 후, 세포 유착 차 응집을 완료 한 것이며, 각각의 세포가 서로 (도 1D)에서 뚜렷 잘 정의 아직 비정형 응집체로 압축 한 것이다. 둘째 날 (48 시간), 골재, '깨끗한'보여야 말 잘 (그림 1E) 내의 모든 세포를 촬영 한; 웰의 바닥이 단계에서 골재로부터 흘려 된 일부 셀을 가질 수있다. 제공응집물이 시간 시점에서, 집계 N2B27되었는지들은 직경이 약 150 ~ 200 μm의 자유도 내에서 이동 (예., 웰의 바닥에 부착되지 않은), 구형이어야한다. 다른 매체에서 집계 (예., ESLIF 또는 특정 요인 N2B27)는 (준비, 터너 등.) 초기 집계 형태 및 후속 자극에 대한 반응을 모두 변경할 수있는 잠재력을 가지고있다.

대표적인 형태 학적 변화

(그림 1A, 5A) 시간 48 사이 (72)를 치를 포함하는 보조 매체의 24 시간 펄스의 추가는 물론 세균 층 (19, 21)의 특정 마커에 편광 식을 보여 연장 집계를 정의 생성합니다. 즉시 치 펄스 (72 시간) 후, 집계 세포를 버리고 오늘 (그림 3A)의 끝으로이 신호에 대한 반응을 표시하기 시작하기 시작합니다. 이러한 응답집계가 N2B27 (그림 3B)의 초기 48 시간 집계 기간 다음받은 치료에 의존 둘 다 유전자 발현 및 형태의 변화에 의해 명시된다. 전용 종료점 분석이 필요한 경우, 화상 집계에 최적의 시간은 약 96-120 시간이다. 이 시점에서 응집체는 명확 모폴로지 및 유전자 발현 패턴 (도 3a)을 개발하며, P200 피펫으로부터 매체의 토출 결합 가질 수있는을 제거하기에 충분하도록 그 크기 및 질량은 아직 충분히 낮다. 우물에 골재의 부착을 방지하기 위해 실패에 악영향 골재 형성 (그림 5Biv)에 영향을 미칠 것입니다. 응집체의 모폴로지 및 유전자 발현 패턴에 따라 처리를 변경할 수있다. 하나의 치료 또는 요소의 조합 중 하나와 지속 또는 펄스 정권에 대한 대표적인 결과는 BMP4, Dorsomorphin H1 (B에 대해 표시됩니다MP 수용체 억제제), ActivinA, SB43 (티빈 / 마디 억제제), bFGF를 또는 PD03 (MEK 억제제) (그림 3B).

집계 이미징 및 양적 이미지 분석

집계는 (주로 시간 경과 이미징 19) 중 하나 위드 현미경 이미징 의무, 또는 고정 및 공 초점 영상 (19, 21) (그림 2)에 대한 면역 염색입니다. 현재 프로토콜 및 이미징 기술은 위의 정량적 정보는이 집계에서 얻을 수 있습니다. 다음 촛점 또는 넓은 필드 촬상, 길이 (각각 구형 또는 신장도 4A, B)의 집합체 직경 또는 척추를 따라 대응하는 유전자 발현을 측정 할 수있다. 이러한 분석은 또한 하나가 서로 다른 조건에서 응집체의 성장, 크기 및 연신 속도의 정보를 얻을 수 시간 경과 화상 (도 4에 직접 적용 할 수있다

그림 1
그림 1. 일반적인 시간 코스와 초기 형태학. () 집계 실험의 일반적인 시간 코스. 세포를 96- 웰 플레이트 (P1, P2)을 마우스 ES 세포 현탁액 (10 세포 / μL)을 함유 N2B27에서 48 시간 동안 응집된다. (B) 직후 (t = ~ 5 분)을 도금 한 후에에게 개별 세포 일 수있다 정지에서 볼 수와 세포가 약 100 μm의 직경을 각각 잘 단일 집합체를 형성 한 24 시간 후 8 시간 (C). (D)로 덩어리를 형성하기 시작했다. (E) 48 시간 집계 한 후, 총 직경은 150 ~ 200 μm의 범위. 이 시점에서, 집계 매체 (N2B27)는 제거되고 보조 매체 B를 변경하기 전에 (부품의 P1) 실험의 나머지 또는 24 시간 동안 첨가하거나N2B27 (부품의 P2)에 ACK. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 현미경 슬라이드 위에 설치 집계. 집계가 해결되고 나면, 면역 염색과 매체를 장착 배치는, 각 집계는 17 μL 방울로 현미경 슬라이드에 피펫된다 (A, B, B '). 충분한 공간들은 병합을 방지하기 위해 골재 방울 사이 남겨진다. 스페이서는 양면 테이프로 만든 현미경 슬라이드 (A, A ', B)의 각 모서리에 배치됩니다. 그것은 유리 coverslip에 배치되어 이들에있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


도 3 집계 ES 세포의 형태에 다른 치료의 효과. N2B27에 2일 다음은, ES 세포 응집체를 형성했다. 요소들 외에도 하나의 유전자 발현, 신장 전위 또는 전체적인 형상의 극성에 대하여 집계 표현형을 변화시킬 수 일일 펄스 (A) 또는 연속적으로 (B) 등. 이 그림의 예는 120 시간 후 이미징 및 표시된대로 처리 중 브라 형성 집계 :: GFP (30) (A) 또는 Sox1 :: GFP (27) (B) 마우스 배아 줄기 세포이다. 치 : CHIR 99021 (31); SB43 : SB 431542 (32), DM : DorsomorphinH1 33, 34; PD03 :. PD0325901 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.

그림 4
집계 그림 4. 정량 분석. 브라 형성 전형적인 집계 :: 치의 24 시간 펄스 다음 120 시간에서 몇 군데 GFP mESCs 25, 30. 명 시야 및 GFP 채널의 병합 된 이미지는 골재의 형광 및 길이를 측정 할 수있는 따라 B (A) 내지 시점에서 골재 '척추'마킹 분할 선 (B)으로 도시된다. 길이 (C)와 같은 실험 내에서 24 집계에서 '원형'(D)가 표시됩니다. 이러한 원형 (D), 원형도, 경계 지역과 형태 설명은 이미지 분석 소프트웨어 피지 35에서 이미지 분석 해설서 플러그인을 사용하여 측정 할 수있다. 각 시간 지점에서 수평 선으로 표시 평균;오차 막대는 표준 편차를 나타낸다; (A) 규모 바는 200 μm의를 나타냅니다. 리포터 세포주 간의 미묘한 차이가있는 한, 그것은 치의 펄스 후, 응집체의 평균 최대 길이와 최소 평균 진원도가 다를 것이 예상된다. 다른 세포주 사이에, 우리는 평균 최대 길이는 400 ~ 800 μm의 0.4과 0.6 사이의 평균 최소 원형 ~의 범위 내에서 될 수 있음을 찾을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 골재 형성의 실패 5. 예. 재현성 집합체 (A)를 생성하는 능력은 초기 N을 계산하는 그러한 (BI) 신선하고 잘 혼합 보조 매체 (BII, Biii) 같은 중요한 요인에 정확성을 좌우집계를 보장 세포 (BIV)의 암갈색이 부착 식민지 형성하지 않는다. '충돌'우물의 표면에. 언급 한 조건 (B)의 각각에 대한 총 에러 형성의 전형적인 예는 도시된다. 표시된 바와 같이 스케일 바; 자세한 내용은 문제 해결 표 (표 1)를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1
문제 해결 표 1. 가이드. 집계 프로토콜과 관련된 일반적인 오류는 자신의 해결 방법으로 제안 주어진다.

표 2
표 세포주 2. 표 AGG의 형성에 대해 시험regates. 세포주 간의 미묘한 차이가 예상되지만, 응집체의 형성에있어서되었고 관찰되었다 19,22,27,30,36-40 세포주의 개수는, 상기 모든 라인은 측면에서 유사한 동성을 보여 신장과 형태의. 유전자 발현의 관점에서, 발현 패턴은 유전자 발현에 고유하지만, 각각의 세포주 내에서 발현 패턴은 통로의 수에 일반적으로 일치한다. 일관성을 위해, 우리는 문화에 15 유로를 초과하지 않은 세포에서 집계를 생성합니다.

표 3
이 연구에 사용 된 대표적인 항체의 표 3. 목록. 항체 집계 면역 염색에 사용되는 희석 ​​요인 중 하나를 선택합니다.

Discussion

이 논문에서 설명하는 기술은 효율적이고 재현성 Marikawa 등. (14)와 EB 형성에 의해 설명 모두 매달려 드롭 문화를 결합, 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)이 디스플레이 구성 대칭 깨는과 신장 (19)의 집계를 생성합니다. 이 집계는 광학 컵 (11)과 대뇌 피질 (13) 등의 ES 세포에서 전방 장기의 생성을위한 기존의 방법을 보완, 축 신장 개발을 계속하고있는 디스플레이 낭 배기 동안 유사한 프로세스 세 배엽의 정체성과 세포를 포함 이러한 빠른 세포 이동 (19, 21)로.

그것이 외부 패터닝 조직의 부재하에 발생 접합체 비대칭 19 큐 이래로, 대칭 깨는 이벤트의 성격에 추측하는 것은 흥미 롭다. 초보 축 자발적인 형성은 기존 heterogen에서 발생할 수비대칭의 개발을위한 기초를 형성하는 세포의 배양 개시 eities. 실제로, ESLIF 조건에서 배양 된 세포의 집단이 자기 ​​- 갱신 및 세포 분화의 혼합물을 표시의 상대적 비율은 다른 하나의 집계 다를 수 있습니다. 또한, 우리의 실험실에서 예비 작업은 세포의 전액 만능 인구에서 집계 (DA 터너 및 준비 A. 마르티네즈 아리아) 조직 패턴 형성의 이질성에 대한 역할을 제안, 패턴의 지연 개발 및 결함을 보여주는 것이 좋습니다. 이 반응 - 확산 장치 멀리 집합체의 표면으로부터의 확산 억제제와, 패턴을 생성 할 수 있음을 고려할 가치가있다. Warmflash 등. (41)는 이러한 메커니즘이 세 가지 차원 패터닝 가능한 후보 만들기, 자기편 문화에 방사상 비대칭 개발을 담당 할 수 있음을 시사한다.

initia 중L 48 시간 통합 기간, 셀은 이차 19,21,24 매체로부터의 신호에 응답 할 능력이있는 postimplantation의 epiblast 내의 유사한 상태에 도달한다. 일반적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 신장 충분한 신호를 제공한다 (예를 들면이 Wnt / β 카테닌 작용제와 같은) 요소를 포함 보조 매체의 펄스로 세포를 제공한다. 랭카스터 등에 의해 설명 전 배양 방법.와 (인간는 ESC (13)를 사용하여) Eiraku는 외. (mESCs 11)는 응집 세포 온을 위해 매트 리겔 방울로 옮겼다 96 웰 플레이트 전에 저 밀착성 응집 단기간 사용 문화를 것. 응집 및 마트 리겔 삽입 간의 시간 간의 상이한 연구되었지만, 두 경우 모두, 세포는 다수의 골재 형성 (약 3,000-4,500 세포)를 사용 하였다. 대조적으로, 프로토콜은 19 훨씬 적은 세포 (약 400 셀을 사용하여 여기에 설명신도 대칭 깨는 19을 관찰 분극 처리로 절대적으로 필요한 것으로 판단 된 골재) 당. 또한, 이러한 연장 된 구조는 인공 매트릭스에 포함시키지 않고 더 짧은 시간주기에서 생성 될 수있다 : 랭카스터 동부 등에 의해 정의 된 뇌 영역의 발생과 비교 (> 20~30일) Eiraku 13 및 광섬유 컵. 등의 알. (~ 십일일) 편광 연장 된 구조의 생성에 필요한 오일 11.

그러나 여기에 기술 된 배양 방법에 제한 중 하나는, 그들의 사이즈가 웰의 바닥에 가라 비 심지어 밀착성을 강제하는 중력들을 관할 렌더링 전까지 만 도금가 게시 약 5~6일 배양 될 수 있다는 코팅 된 플라스틱 제품. 이러한 앞서 언급 한 것과 같은 인공 행렬을 사용하여 추가 실험은, 우리가 기간을 증가 할 수있다관찰하고 실험 한 작업에 진행되는 방식으로 골재를 구속 효과를 결정하는 것이다. 이 기술의 또 다른 제한은 응집체를 제거하지 않고 매체를 변경하기 위해서, 매체의 작은 부피가 웰의 바닥에 남아 있어야한다는 것이다. 화학 유전학 접근 방식의 결과가이 희석 및 이전 미디어에서 잔류 효과를 고려할 필요가있다 : 3 μm의 치 펄스의 날을, 2.37 μm의 솔루션을 실제로 전달, 이후 매체의 변화는 0.499의 이월의 결과입니다 μM (72-96 시간) 및 시간 지점 사이 0.105 μM (96-120 시간). 현재 작업은 희석에 대해 보정하지 않았으며 그것은 매일 매체 변경 후유증을 최소화 할 수있는 것으로한다.

인트라 및 인터 두 실험의 재현성을 보장하기 위해 프로토콜의 중요한 단계가 있습니다. 첫째, mESCs의 시작 문화가 잘 유지되지 공동 이상이어야합니다nfluent, 중간은 항상 좋은 품질의 예를해야합니다. 신선하고 잘 혼합 (그림 5A, B). 불쌍한 배양 조건에 악영향을 집계 (그림 5Bi)에 영향을. 큰 집계가 실패로 ~ 400 셀 / 40 μL 세포 현탁액을 얻기 위해 세포의 정확한 계산은 필수적이며 자기 조직하고 작은 집계 올바른 도달 할 수없는 반면, 각 웰 (그림 5Bii) 내에서 두 번 집계를 형성 할 가능성이 높다 그들이 자극 (그림 5Biii)에 응답 할 수 있습니다 밀도. 키 최적화 단계는 세포 현탁액으로부터 오염물을 제거 혈청 제 PBS 세척 (260 단계)를 포함 하였다; 이것은 응집 주파수 개선 약 24 시간에 의해 응집체의 개발을 가속화. 다음으로, 확보 매체 변경은 웰의 표면에 부착 할 가능성이있는 모든 응집물을 제거하기에 충분한 힘이인가된다; 그래서 resu을하지 않으면집계 '충돌'(그림 5Biv)에 LTS. (아래의) 전술 한 바와 같이 또한, 그것은 골재가 현탁 배양에서 유지되고있는 표면에 부착되는 것이 방지되는 것을 보장하기 위해 필수적이다. 응집체가 부착되면, 유전자 발현 및 그 신장 가능성의 패턴은 중단된다.

이 기술은 비교적 간단하고도 양호한 조직 배양 기술을 가진 사람들의 송금 이내로서, 응집과 관련된 문제의 대부분은 상대적으로 빠르게 이러한 중요한 단계를 따르지 않으면 해결 될 수있다; 문제 해결의 전체 테이블을 사용할 수있다 (표 1)입니다. 마스터되면,이 기술은 개발 축 대칭 파괴 및 세포 판정 사건을 연구하는데 사용될 수있다. 보다 구체적으로, 이러한 응집체는 척수 모터 차량 등 종래 배양에서 사용할왔다 세포 풀을 생성 할 수있는 잠재력을 가지고R의 뉴런.

윤리 참고 :이 인간 배아 또는 유도 만능 줄기 세포 배양에이 프로토콜의 변환이 가까운 인간 배아 연구에 십사일 제한, 원시적 행진, 즉 세대의 법적 근거로 실험을 가져올 수 있다고 때문에주의를 주목해야한다, 인간의로 수정 및 발생학 법 2008 (영국) (42)에 설명 된대로. 법에 관계없이 창조의 자신의 방식으로 모든 살아있는 인간 배아를 다루고 있기 때문에, 무대와 같은 원시적 인-행진을 넘어 인간의 gastruloids의 문화는 라이선스 연구의 범위를 벗어나는 것입니다.

Acknowledgements

이 작품은 AMA, PB-J와 에라스무스에는 Stichting의 DR에 EPSRC 학생이기로 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에서 프로젝트 그랜트의 기여와 AMA에 ERC 고급 탐정 상 (DAT, TB)에 의해 지원된다. SCvdB에 헨드릭 뮬러의 Vaderlandsch 퐁과 Fundatie 밴 드 Vrijvrouwe 반 Renswoude 테의-Gravenhage. 우리는 토론과 건설적인 비판에 대해, 제이 브리스 코, 미 노즈 - Descalzo, C. 참조 : Schroeter 및 T. 로드리게스 감사드립니다, 설치 매체 프로토콜에 대한 호아킨 드 Navascués 모두 AK Hadjantonakis와 C Budjan 그들의 실험실의 프로토콜을 공유 전체 마운트 배아의 염색에 관한. 이 문서의 이전 버전은 이전에 bioRxiv 프리 프레스 서버 (29)에 이용할 수있게했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25 cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50 ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO
Dissection Well (30 mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054

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