Génération d'agrégats de souris de cellules souches embryonnaires qui montrent la brisure de symétrie, la polarisation et le comportement collectif émergent
1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Published 11/24/2015
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Developmental Biology
 

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Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).

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Abstract

Nous avons développé un protocole amélioration de la culture actuelle embryoïde corps (EB), qui permet l'étude de l'auto-organisation, la brisure de symétrie, l'allongement axial et la spécification du destin cellulaire utilisant des agrégats de souris des cellules souches embryonnaires (mESCs) en culture en suspension. Un petit nombre de mESCs sont agrégées en milieu de base pendant 48 heures dans la non-culture de tissus traités, U-fond plaques à 96 puits, après quoi ils sont compétents pour répondre aux signaux expérimentaux. Après le traitement, ces agrégats commencent à montrer des signes de l'expression des gènes et de modifier progressivement polarisé leur morphologie à partir d'une masse sphérique de cellules à une structure allongée, bien organisé en l'absence d'indices d'asymétrie externes. Ces structures ne sont pas seulement capable d'afficher des marqueurs des trois feuillets embryonnaires, mais affichent activement les mouvements de gastrulation-like, matérialisés par un délogement directionnelle des cellules individuelles de l'ensemble, qui se produit à une région cruciale de la structure allongée. Cette protocol fournit une méthode détaillée pour la formation reproductible de ces agrégats, leur stimulation avec des signaux tels que l'activation Wnt / β-caténine et l'inhibition BMP et leur analyse par simple point de temps ou time-lapse microscopie fluorescente. En outre, nous décrivons des modifications aux procédures embryon de coloration actuels toute la montagne-souris pour l'analyse immunocytochimique de marqueurs spécifiques au sein des agrégats fixes. Les modifications de la morphologie, l'expression du gène et la longueur des agrégats peuvent être mesurées quantitativement, fournissant des informations sur la manière dont les signaux peuvent modifier sorts axiales. Il est prévu que ce système peut être appliqué à l'étude des événements précoces de développement tels que le développement axial et l'organisation, et plus largement, les processus d'auto-organisation et de décision cellulaire. Il peut également fournir un créneau adapté pour la génération de types présents dans l'embryon, qui sont impossibles à obtenir à partir de la culture de cellules adhérentes conventionnel tel que la moelle épinière et les neurones moteurs.

Introduction

L'étude et la compréhension des décisions destins cellulaires dans le développement des mammifères précoce peuvent faire usage de cultures de cellules souches embryonnaires (CSE), les populations clonales dérivées à partir de blastocystes qui ont la capacité d'auto renouveler et se différencier en tous les types d'un organisme de cellules-à-dire., ils sont le 1,2 pluripotent. Bien que ces cultures ont été et continuent d'être utile pour la compréhension de la base moléculaire de décisions destins cellulaires, ils sont incapables de reproduire certaines des dispositions spatiales et des comportements globaux qui sont générés dans les embryons pendant la gastrulation Dans l'embryon, le processus de gastrulation transforme une couche épithéliale unique dans les trois couches germinales distinctes et dote l'embryon avec une organisation antéro-postérieur manifeste 3-5. Les tentatives de récapituler ces événements ex vivo ont été basées sur la génération d'agrégats tridimensionnels de CES, appelés corps comme embryoïdes (EBS), et en les soumettant to 6,7 conditions de différenciation. Ces agrégats peuvent être amenées à se différencier en de nombreux types cellulaires différents, dont certains sont incapables d'obtenir ou induite par une faible efficacité dans la culture adhérente ou non peut être produit à tous;. Par exemple, le sang 8 et germinales primordiales cellules 9. Toutefois, une limitation de l'utilisation de ballasts électroniques est qu'ils sont incapables d'afficher le comportement morphogénétique, la distribution de la couche de germe ou une organisation axiale qui sont caractéristiques majeures du développement de l'embryon, ce qui entraîne la désorganisation spatiale 6,10. Dans un rapport, le traitement d'EBS avec Wnt conduit à une polarisation faible dans l'expression des gènes dans certains agrégats mais pas de la morphogenèse claire est observée 7. Dans les rapports les plus récents, EBS qui ont été cultivées pendant des périodes de temps prolongées développent des structures antérieures telles que la rétine, le cortex et les cellules sensorielles de l'oreille interne, qui imitent leurs homologues embryonnaires, mais se développent sans le contexte d'un organis axialeion 11-13.

Un rapport de Marikawa et al. 14, tout en travaillant avec des agrégats de P19 embryon de souris Carcinome (CE) cellules formées par la méthode goutte suspendue, a rapporté l'émergence de structures allongées d'origine mésodermique qui rappelle les allongements qui sont observés avec exogastrulae dans amphibien et les embryons d'oursins et Keller explants 15-18. Comme cela n'a pas été observé avec la souris cellules souches embryonnaires (de mESCs), nous avons tenté de reproduire le comportement observé avec P19 cellules CE utilisant des agrégats de mESCs 19 et nous présentons des conditions de culture qui conduisent à leur brisure de symétrie et l'allongement axial. Une différence importante du travail avec des cellules de P19 est que le protocole d'agrégation décrit ici est réalisée dans une plaque à 96 puits, analogue à celle décrite par Eiraku et al. 20, au lieu de gouttes de suspension. Ce changement a entraîné une plus grande efficacité en termes de récupération globale et à la foisreproductibilité intra et inter-expérimentale. Surtout, le maintien de granulats dans les puits individuels assure que la fusion entre les agrégats (commune où la mise en commun des agrégats de gouttes suspendues) ne se produit pas. En outre, un élément clé du protocole est une exposition de 24 h à l'CHI99021 inhibiteur de GSK3 (Chi), un puissant activateur de la signalisation Wnt / β-caténine, après agrégation.

La méthode décrite ici fournit une base pour la compréhension des processus d'auto-organisation, l'organisation axiale et la spécification de la couche de germe dans la culture, ce qui permet de faire des inférences concernant le développement axiale in vivo 19,21. Pour ces raisons, la méthode a le potentiel de permettre une analyse mécanistique détaillée des processus qui peuvent être difficiles à étudier chez l'embryon. En outre, une application potentielle est dans la production de tissus et d'organes qui ne sont pas faciles à obtenir dans la culture adhérent en raison de l'absence d'une niche cellulaire structuré tel que21 précurseurs de la moelle épinière et les neurones moteurs. La culture globale tridimensionnelle offre une structure physique et de l'environnement de signalisation qui peuvent ne pas être réalisable par des moyens classiques, conduisant à une nouvelle approche pour la dérivation de lignées embryonnaires d'une manière spatialement organisé.

Protocol

1. Conditions de culture avant l'agrégation

  1. Maintenir mESCs en milieu ESLIF (voir le tableau des matériaux et des équipements spécifiques pour la formulation) sur 2 de culture de tissus traités flacons revêtues de gélatine 25 cm dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 21 au 25 fév.
  2. Cultiver les cellules pendant au moins deux passages poster décongélation avant utilisation dans ce protocole; cellules à des passages inférieurs sont généralement plus réussi à générer des caractéristiques reproductibles tout au long de répétitions expérimentales (ie., pas plus de 15 passages en culture), mais légère variation entre les différentes cellules ES lignes est à prévoir (voir le tableau 2 pour les lignées cellulaires testées ).
  3. Cultiver les cellules à 40-60% de confluence Ne pas utiliser sur les cellules confluentes pour l'agrégation.

2. Génération de Granulats

  1. Pré-PBS chaud (+ Ca 2+, + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27
  2. Aspirer le milieu de culture à partir de la fiole de culture de tissu (étape 1.3). Rincer la fiole doucement avec 5 ml de PBS, deux fois. Aspirer le PBS et ajouter 1 à 2 ml de pré-chauffé trypsine-EDTA (0,25%) pour dissocier les cellules.
    1. Placer la fiole dans un incubateur à <5 min ou jusqu'à ce que les cellules sont complètement détaché de la surface du ballon. Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette de 1 ml pour produire une suspension à cellule unique pour le comptage précis et la formation de la taille des agrégats uniforme.
  3. Neutraliser la trypsine avec 5-10 ml ESLIF; arroser la surface de croissance afin de maximiser la récupération des cellules et transférer dans un tube de centrifugation de 50 ml. Supprimer un aliquote de 1 ml du tube de centrifugeuse et de compter les cellules avec un hémocytomètre.
  4. Déterminer le volume de suspension nécessaire pour donner 10 cellules / ul (toute une plaque de 96 puits nécessite 5x10 4 cellules dans une suspension 5 ml). Compter les cellules précision, aussi grand deviatdes ions à partir du nombre de cellules indiqué peuvent affecter la réponse des agrégats à des stimuli.
  5. Ajouter 5x10 4 cellules à 5 ml de PBS préchauffé dans un 50 ml tube de centrifugeuse frais et de spin à ~ 170 g pendant 5 min.
  6. Aspirer soigneusement le PBS et ajouter 5 ml préchauffé PBS doucement; Ne pas déranger le culot au fond du tube. Centrifuger à ~ 170 g pendant 5 min.
  7. Aspirer avec précaution du PBS pendant une deuxième fois. Retirez autant PBS que possible sans perturber le culot que PBS report peut nuire à l'agrégation. Reprendre le culot dans 1 ml d'une part N2B27 chaud avec une pipette P1000 pour produire une suspension cellulaire homogène, suivi par une addition supplémentaire de N2B27 au volume requis (par exemple, ajouter 4 ml de 5x10 4 cellules / ml de suspension 5).
  8. Transférer la suspension cellulaire à un réservoir stérile et la pipette une gouttelette de 40 ul dans le fond de chaque puits d'une non-culture tissulaire traitée, 'U' à fond 96-waune plaque en utilisant une pipette multicanaux. Recouvrir la plaque de 96 puits avec son couvercle correspondant et confirmer la présence de cellules avec un inversé paillasse microscope (figure 1B).
    Remarque: Il est essentiel que ces plaques sont utilisés pour limiter la possibilité de cellules adhérentes. Ne pas recouvrir le fond de la plaque à 96 puits avec de la gélatine, la fibronectine ou tout autre revêtement qui favorise l'adhésion cellulaire.
  9. Incuber les cellules pendant 48 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 pour l'agrégation.

3. L'application de stimuli et de changement de support

  1. Après la période d'incubation de 48 h, observer l'apparition des mESCs dans chaque puits de la plaque de 96 puits pour confirmer l'agrégation succès (figure 1E). Remarque: Granulats apparaîtront sphérique dans la nature et environ 150-200 m de diamètre. Reportez-vous à la section de dépannage en cas de problèmes (tableau 1).
  2. 0; 150 Ajouter moyen secondaire ul frais (3 uM Chi99021 (Chi) dans N2B27 19; mère préparée à 10 mM dans DMSO) à chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux. Introduire à la pipette avec une force suffisante pour déloger les agrégats qui peuvent avoir commencé à adhérer au fond des puits. Incuber les granulats au moyen secondaire pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 (figure 1A).
    Remarque: agrégats allongés et polarisées reproductibles sont générées en utilisant ce moyen secondaire. D'autres compositions de fluide secondaire peuvent également être utilisés en fonction des conditions expérimentales requises et des exemples sont présentées dans la figure 3.
  3. Pour les modifications ultérieures moyennes, utiliser une pipette multicanaux tenue à un angle (environ 30 °) pour enlever délicatement 150 pi du milieu secondaire du côté de chaque puits. Ensuite, pipette 150 pi frais N2B27 dans chaque puits avec suffisamment de force pour déloger les agrégats qui peuvent avoir démarrageed pour adhérer au fond des puits.
  4. Répétez le point 3. 3 tous les 24 heures jusqu'à ce que le temps bien sûr est terminée (la durée typique d'une expérience de culture globale est de 120 h).
    REMARQUE: Assurez-agrégats se déplacent librement la suite de changements à moyen terme pour assurer la reproductibilité et la cohérence au sein et entre chaque plaque de 96 puits. Moyenne doit être changé tous les jours suivant la période de l'agrégation.

4. Préparation des agrégats pour Immunocoloration et analyse par microscopie confocale

  1. Fixation et Anticorps primaire Incubation
    Remarque: Le protocole décrit par AK Hadjantonakis 28 a été modifié pour convenir à un marquage de MESC agrégats. Pour les anticorps typiques utilisés dans nos études et leurs dilutions, reportez-vous à déjà publié des travaux 19,21,24,25,29 et le Tableau 3.
    1. Utilisez une pipette multicanaux tenue à un angle (environ 30 °) pour enlever délicatement moyen de 150 pi du côté of chaque puits de la plaque de 96 puits. Laver deux fois par pipetage 150 ul de PBS dans chaque puits. Laisser un couple de minutes entre chaque lavage pour permettre aux agrégats de se déposer.
    2. Définir une pipette P1000 pour distribuer 200 pi, fixer la pointe de la pipette correspondante et couper environ 3 mm de l'extrémité de la pointe avec une paire de ciseaux stériles. Dessinez une partie de la PBS dans chaque puits de la plaque de 96 puits sur une courte distance dans la pointe et de l'expulser pour agiter l'agrégat.
    3. Utilisez la même pointe de dresser tout le volume intérieur du puits, y compris l'agrégat et la pipette dans un petit (30 mm de diamètre) en verre Drosophila dissection bien. Transférez tous les agrégats de la plaque de 96 puits qui subira régimes de immunocoloration identiques dans la même dissection de verre ainsi.
      Remarque: Utilisez une nouvelle pointe de pipette de coupe lors du transfert des agrégats de différentes conditions expérimentales pour empêcher le report des agrégats.
    4. Placez le bien de verre qui contient le aggregates sur un microscope de dissection. Agiter le verre ainsi de forcer les agrégats vers le centre et aspirer PBS d'un côté du puits avec une pipette Pasteur en verre. Utilisez le microscope pour assurer les agrégats ne sont pas aspirés. Laisser un petit volume de PBS dans le puits de verre pour couvrir les agrégats pour les empêcher de se dessécher.
    5. Ajouter 1 ml de formaldéhyde fraîchement préparée (4%) dissous dans PBS et incuber pendant 2 h à 4 ° C sur un agitateur orbital réglé à une vitesse faible. Attention: Paraformaldéhyde est connu pour être allergéniques, cancérigènes et toxiques. Porter une protection appropriée lors de la manipulation.
    6. Après la fixation, aspirer la solution de formaldéhyde de la même manière que décrit dans l'article 4. 1. 4 et laver les granulats avec 1 ml de PBS trois fois, 10 min pour à chaque lavage, sur un agitateur orbital réglé à une vitesse faible.
    7. Aspirer le PBS comme décrit dans la section 4. 1. 4 et effectuer trois autres, à 10 min lavages avec du PBS contenant 10% de sérum fœtal bovin et 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Effectuez les 10 min lavages sur un agitateur orbital réglé à une vitesse faible.
      Remarque: L'utilisation de sérum bovin fœtal (FBS) les résultats dans un tampon de lavage clair, réduire le nombre d'agrégats qui autrement seraient perdus durant le protocole si le lait a été utilisé. Il est important de noter qu'à la suite de la fixation, des procédures immunohistochimiques peuvent être effectuées de diverses manières autres que celles décrites ci-dessous et doivent être déterminées et optimisées par l'investigateur.
    8. Bloquer les agrégats pendant 1 h à 4 ° C dans PBSFT sur un rocker orbitale réglé à une vitesse faible. Le protocole peut être mis en pause à ce point, et les agrégats bloqué O / N, sous agitation constante sur une bascule giratoire horizontale à 4 ° C.
    9. Aspirer le PBSFT comme décrit précédemment (voir la section 4. 1. 4) et incuber les agrégats avec 500 pi de l'anticorps primaire nécessaire dilué dans PBSFT O / N à 4 ° C sur un agitateur orbital réglé à basse vitesse. Couvrir avec un film de paraffine pour éviter l'évaporation.
  2. L'incubation d'anticorps secondaire
    1. Aspirer la solution d'anticorps primaire et on lave avec 1 ml PBSFT (à 4 ° C) de la manière suivante: deux fois pendant 5 min; trois fois pendant 15 min; et quatre à sept fois pendant 1 heure. Effectuez chaque étape de lavage à 4 ° C et sur un rocker orbitale réglé à basse vitesse. Remarque: Réfrigérer milieu de lavage avant de les utiliser. Ne pas effectuer les lavages sur la glace car cela peut causer des agrégats à se fragmenter.
    2. Aspirer le milieu de lavage final et incuber les agrégats avec l'anticorps secondaire requis dans 500 ul PBSFT O / N à 4 ° C dans l'obscurité sur une bascule giratoire horizontale. Ajouter colorant nucléaire comme Hoechst si nécessaire.
  3. Montage et imagerie par microscopie confocale
    1. Laver les agrégats comme décrit dans la section 4. 1. 4 avec 4 ° C PBSFT. Après le lavage final, les agrégats rinçage avec 1 ml de PBS contenant 0,2% de FBS et de Triton X-100 (PBT) de la manière suivante: deux fois pendant 5 min; trois fois pendant 15 minutes. Effectuer lavagesà température ambiante sur un rocker orbitale abri de la lumière.
    2. Aspirer le milieu comme décrit précédemment (section 1. 4. 4) et incuber pendant 30 min dans l'obscurité avec une solution 1: 1 de glycérol: PBT (1 ml) suivie d'une seconde incubation de 30 min avec un 7: 3 de solution glycérol: PBT (1 ml).
      Remarque: Mélanger le glycérol et PBT solutions à 4 ° C en utilisant un rotateur.
    3. Aspirer le glycérol final: solution PBT et remplacer par 1 ml de milieu de montage 24. Le protocole peut être mis en pause à ce point avant le montage (si pause, sceller les puits avec un film de paraffine et de stocker les puits de coloration à 4 ° C).
    4. Montez les agrégats sur des lames de microscope par eux pipetage dans 17 gouttes ul avec une pointe de P20 de coupe (Figure 2). Pliez ruban adhésif double face sur elle-même quatre fois pour générer des entretoises et joindre à chaque extrémité de la glissière. Placer la lamelle supérieure (22 mm x 60 mm) sur ces entretoises (Figure 2).
      Remarque: il est essentiel que d'une pointe de coupe estutilisé à ce stade afin de ne pas endommager les échantillons. Les espaceurs empêchent la lamelle de broyage des agrégats.
    5. Une fois que les agrégats sont montés, les échantillons d'image à l'aide de la microscopie confocale en utilisant des protocoles précédemment décrits 19,21,24,25. Une fois placé sur le microscope, laisser la diapositive non perturbée sur la scène pendant quelques minutes pour permettre aux agrégats de régler au sein du milieu de montage.

Representative Results

Apparence des cellules immédiatement après l'étalement et après agrégation

Immédiatement après le placage, on peut observer la présence de cellules uniques dans chaque puits de la plaque de 96 puits avec un écart inversé culture tissulaire microscope (figure 1B). Dans 8 h de placage, ces cellules ont commencé à descendre au fond du puits en raison de la gravité et auront commencé à se regrouper en groupes discrets (figure 1C). Après 24 heures, les cellules de coalescence auront achevé de l'agrégation primaire, et auront compacté dans bien définies, des agrégats encore en lambeaux où les cellules individuelles sont indistincts les uns des autres (figure 1D). À la fin de la deuxième journée (48 h), les agrégats devraient regarder «propre», après avoir pris toutes les cellules dans le puits (figure 1E); le fond du puits peut avoir des cellules qui ont été versées à partir de l'ensemble à ce stade. Fournirque les agrégats ont été agrégées dans N2B27, à ce moment-points, ils devraient être sphérique, d'environ 150-200 m de diamètre et de se déplacer librement dans le puits (ie., pas adhéré au fond des puits). Agrégation dans d'autres médias (ie., ESLIF ou N2B27 avec des facteurs spécifiques) a le potentiel de modifier à la fois la morphologie globale initiale et la réponse à des stimuli ultérieurs (Turner et al., En préparation).

Représentant des changements morphologiques

Ajout d'une impulsion de 24 heures de milieu secondaire contenant Chi entre 48 et 72 heures (figure 1A, 5A) génère bien défini agrégats allongés qui montrent l'expression polarisée des marqueurs spécifiques des couches germinales 19,21. Immédiatement après l'impulsion Chi (72 h), les agrégats vont commencer à éliminer les cellules et de commencer à montrer leur réponse à ces signaux vers la fin de cette journée (figure 3A). Ces réponsesse manifestent par des changements dans l'expression génique et de la morphologie, les deux étant dépendante de traitement que les agrégats ont reçu après la période de 48 h agrégation initiale dans N2B27 (figure 3B). Si seulement une analyse de point de terminaison est nécessaire, le moment optimal pour l'image des agrégats est à environ 96-120 h. À ce stade, les agrégats auront développé morphologies claires et les profils d'expression génique (figure 3A), et de leur taille et de masse sont encore assez bas pour que l'éjection de milieu de pipette P200 est suffisante pour déloger toutes celles qui pourraient avoir attaché. Le défaut d'empêcher la fixation de l'ensemble au bien nuira à la formation d'agrégats (figure 5Biv). Le motif d'expression génique morphologies et des agrégats peut être modifiée en fonction du traitement. Les résultats représentatifs pour les régimes soutenus ou pulsés avec soit un traitement unique ou combinaisons de facteurs sont présentées pour BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP inhibiteur de récepteur), ActivinA, SB43 (activine / inhibiteur Nodal), bFGF ou PD03 (inhibiteur de MEK) (figure 3B).

Imagerie globale et Analyse quantitative d'images

Granulats se prêtent à l'imagerie par microscopie à champ large soit (principalement pour imagerie time-lapse 19), ou fixe et immunocolorées pour l'imagerie confocale 19,21 (figure 2). Le protocole et l'imagerie description actuelle ci-dessus permet à l'information quantitative à tirer de ces agrégats. Suite à foyer commun ou à grand champ capture d'image, la longueur et l'expression du gène correspondant le long de la colonne vertébrale ou le diamètre de l'agrégat (sphérique ou allongée respectivement; la figure 4A, B) peuvent être mesurés. Ces analyses sont aussi directement applicable aux images time-lapse, où l'on peut obtenir des informations de la vitesse de croissance, la taille et l'allongement des agrégats dans des conditions différentes (Figure 4

Figure 1
Figure 1. typique temps-cours et début des morphologies. (A) Le temps-parcours typique pour des expériences d'agrégation. Les cellules sont agrégées pour 48 h dans N2B27 contenant une suspension de cellules ES de souris (10 cellules / ul) dans une plaque de 96 puits (P1, P2). (B) immédiatement après l'étalement (t = ~ 5min), des cellules individuelles peuvent être vu dans la suspension et ont commencé à former des amas de 8h (C). (D) Après 24 heures les cellules ont formé une seule total dans chaque puits, qui est d'environ 100 um de diamètre. (E) Après l'agrégation de 48 heures, l'ensemble diamètre varie de 150 à 200 um. À ce stade, le moyen d'agrégation (N2B27) est supprimé et un moyen secondaire est ajouté soit pour le reste de l'expérience (p1 dans la partie A) ou pendant 24 heures avant d'être changé bACK à N2B27 (p2 dans la partie A). La barre d'échelle représente 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. agrégats montage sur des lames de microscope. Une fois que les agrégats ont été fixés, et immunocolorées placé dans un milieu de montage, chaque ensemble est introduit à la pipette sur une lame de microscope en gouttelettes 17 ul (A, B, B '). Suffisamment d'espace est laissé entre les gouttelettes d'agrégats pour empêcher leur fusion. Entretoises sont fabriqués avec du ruban adhésif double face et placés à chaque coin de la lame de microscope (A, A ', B). Il est sur ​​celles-ci que d'une lamelle de verre est placé. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3. L'effet des différents traitements sur la morphologie des cellules ES agrégées. Suite à 2 jours dans N2B27, les cellules ES ont formé des agrégats. L'addition de facteurs spécifiques soit comme une impulsion de 1 jour (A) ou en continu (B) peut modifier le phénotype d'agrégats par rapport à la polarité de l'expression génique, le potentiel d'allongement, ou leur forme globale. Les exemples dans ce chiffre sont des agrégats formés à partir soit Bra :: GFP 30 (A) ou Sox1 :: GFP cellules ES 27 (B) de souris imagées après 120 h et traités comme indiqué. Chi: CHIR 99021 31; SB43: SB 431542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de eest la figure.

Figure 4
Figure 4. Analyse quantitative des agrégats. Un agrégat typique formé de Bra :: mESCs GFP 25,30 après une impulsion de 24 h de Chi et imagées à 120 h. Image fusionnée du champ lumineux et le canal GFP est montré avec le marquage «colonne vertébrale» de l'agrégat d'un point A à B (A) courbe segmentée, le long de laquelle la fluorescence et la longueur de l'ensemble peuvent être mesurés (B). La longueur (C) et "rondeur" (D) 24 à partir de granulats au sein de la même expérience sont présentés. Descripteurs de forme telle que la rondeur (D), la circularité, périmètre et la surface peuvent être mesurées en utilisant l'analyse d'images Cookbook plugin à partir de l'analyse d'image logiciel FIDJI 35. Moyenne indiquée par la ligne horizontale à chaque point de temps;les barres d'erreur indiquent l'écart type; barre d'échelle dans (A) indique 200 um. Comme il y a des différences subtiles entre des lignées cellulaires rapporteurs, il est prévu que, après une impulsion de Chi, la longueur maximale moyenne minimum et de la rondeur moyenne des agrégats peuvent varier. Entre les différentes lignées cellulaires, nous constatons que la longueur maximale moyenne peut être dans la gamme de ~ 400-800 um et la rondeur minimale moyenne entre 0,4 et 0,6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Exemples de défaillances dans la formation d'agrégats. La capacité à générer des agrégats reproductibles (A) dépend de facteurs critiques tels que (Bi) de milieu secondaire fraîche et bien mélangé, (Bii, Biii) la précision à compter le n initialombre des cellules et des agents immobiliers (IPI) assurant les agrégats ne forment pas des colonies adhérentes ie., «crash» dans la surface du puits. Des exemples typiques des erreurs dans la formation d'agrégats pour chacune des conditions mentionnées (B) sont représentés. Scale-bar comme indiqué; voir tableau de dépannage pour plus de détails (tableau 1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1. Guide de dépannage. Erreurs typiques associés avec le protocole d'agrégation sont donnés avec des suggestions quant à leur résolution.

Tableau 2
Tableau 2. Tableau de lignées cellulaires testées pour la formation de aggRégates. Un certain nombre de lignées cellulaires 19,22,27,30,36-40 ont été caractérisés pour la formation d'agrégats et, bien que les différences subtiles entre les lignées cellulaires sont attendus et ont été observés, toutes les lignes ci-dessus montrent une dynamique similaire en termes de l'allongement et de la morphologie. En ce qui concerne l'expression du gène, le modèle d'expression est spécifique du gène exprimé, mais à l'intérieur de chaque lignée cellulaire, le profil d'expression est généralement constante sur un certain nombre de passages. Par souci de cohérence, nous générons des agrégats de cellules qui ont ne dépassent pas 15 passages en culture.

Tableau 3
Tableau 3. Liste des anticorps représentatifs utilisés dans ces études. Une sélection des anticorps et les facteurs de dilution utilisés pour la coloration immunologique globale.

Discussion

La technique décrite dans ce manuscrit de manière efficace et reproductible génère des agrégats de cellules embryonnaires de souris de troncs (mESCs) qui affichent organisée briser la symétrie et l'allongement 19, combinant à la fois la culture de la goutte suspendue décrite par Marikawa et al. 14 et EB formation. Ces agrégats vont développer des allongements axiaux, compléter les méthodes existantes pour la production d'organes antérieures à partir de cellules ES tels que des tasses optique 11 et le cortex cérébral 13, et contiennent des cellules aux identités des couches trois germinales qui affichent des procédés similaires à ceux au cours de la gastrulation tels que 19,21 rapide de mouvement cellulaire.

Il est intéressant de spéculer sur la nature de l'événement de briser la symétrie, car il se produit en l'absence de tissus de motifs externes et l'asymétrie zygotic cues 19. La formation spontanée d'un axe rudimentaire pourrait découler de pré-existante heterogeneities dans la culture à partir de cellules qui forment la base pour le développement de l'asymétrie. En effet, les populations de cellules cultivées dans des conditions ESLIF affichent un mélange d'auto-renouvellement et de différenciation des cellules, les proportions relatives de qui peuvent varier d'un agrégat à l'autre. En outre, des travaux préliminaires dans notre laboratoire suggèrent que les agrégats provenant d'une population de cellules pluripotentes entièrement montrent un retard de développement et les défauts dans la structuration, suggérant un rôle de l'hétérogénéité dans la formation de modèle organisé (DA Turner & A. Martinez Arias, en préparation). Il est également intéressant de considérer que un mécanisme de réaction-diffusion peut générer le modèle, avec un inhibiteur de diffusion opposé de la surface de l'agrégat. Warmflash et al., 41 suggèrent qu'un tel mécanisme pourrait être responsable de l'élaboration asymétrie radiale dans la culture adhérent, ce qui en fait un candidat possible pour la structuration en trois dimensions.

Au cours de l 'initiativel 48 h période de globalisation, les cellules atteindre un état ​​semblable à celui au sein de l'épiblaste après l'implantation, dans lequel ils sont compétents pour répondre aux signaux du milieu secondaire 19,21,24. Typiquement, le protocole décrit ici fournit des cellules à une impulsion de fluide secondaire qui contient des facteurs (tels que des agonistes Wnt / β-caténine) qui fournissent les signaux nécessaires pour l'allongement. Des méthodes de culture antérieures décrites par Lancaster et al. (À l'aide CES de l'homme 13) et Eiraku et al (avec mESCs 11). A utilisé une courte période de l'agrégation en faible adhérence plaques à 96 puits avant que les cellules agrégées ont été transférés à des gouttelettes Matrigel pour ON- la culture va. Bien que le temps entre l'insertion et l'agrégation Matrigel était différent entre les études, dans les deux cas, un grand nombre de cellules ont été utilisées pour la formation d'agrégats (environ 3,000-4,500 cellules). En revanche, le protocole décrit ici 19 utilise beaucoup moins de cellules (environ 400 cellulespar agrégat) qui a été déterminée comme étant absolument essentiel pour le processus d'allongement, briser la symétrie et la polarisation qui est observé 19. En outre, ces structures allongées sont capables d'être générés dans un temps beaucoup plus courte période sans incorporation dans des matrices artificielles: comparer la génération de régions cérébrales définies par Lancaster et al (> 20-30 jours) 13 et l'optique de tasses Eiraku. et al. (~ 11 jours) 11 avec les 5 jours nécessaires à la génération de structures allongées polarisés.

Une des limites avec la méthode de culture décrit ici cependant, est qu'ils ne peuvent être cultivées pendant environ 5-6 jours après placage jusqu'à ce que leur taille les rend compétente en vertu de la gravité pour couler au fond des puits et forcer une adhérence même sur non plastique-ware revêtu de. D'autres expériences utilisant des matrices artificielles telles que celles mentionnées précédemment, peuvent nous permettre d'augmenter la période deobservation et l'expérimentation, et des travaux sont en cours pour déterminer les effets de contraindre les agrégats de telle manière. Une autre limite de cette technique est que, afin de changer le milieu sans enlever les agrégats, un petit volume de milieu doit être laissé dans le fond du puits. Les conséquences pour la génétique chimique approches sont la nécessité d'examiner cette dilution et les effets résiduels de multimédia précédent: le jour de l'3uM Chi impulsion, 2,37 uM solution est effectivement livrée, et les variations moyennes suivantes entraîner un report de 0,499 iM (72-96 h) et 0,105 uM (96-120 h) entre les points de temps. Les travaux en cours n'a pas corrigé pour la dilution et il est supposé que les changements moyennes quotidiennes de minimiser les effets résiduels.

Il ya un certain nombre d'étapes critiques dans le protocole pour assurer la reproductibilité intra- et inter-expérimentale. Tout d'abord, la culture de départ de mESCs doit être bien entretenu et pas trop confluent, et moyen doivent toujours être bon-à-dire de la qualité., frais et bien mixte (figure 5A, B). Conditions de culture défavorables affectent négativement l'agrégation (Figure 5BI). Comptage précis des cellules pour obtenir une suspension de cellules ~ 400 cellules / 40 ul est essentiel, que les grands agrégats ne parviennent pas à l'auto-organisation et sont plus susceptibles de former des agrégats doubles dans chaque puits (Figure 5Bii) tandis que les petits agrégats sont incapables de parvenir à la bonne densité où ils sont en mesure de répondre à la relance (Figure 5Biii). Une étape d'optimisation clé était l'inclusion d'un second lavage PBS qui élimine le sérum contaminant de la suspension de cellules (étape 2.6); cette amélioration de la fréquence de l'agrégation et a accéléré le développement des agrégats d'environ 24 heures. Ensuite, en assurant à moyen modifications sont appliquées avec une force suffisante pour déloger les agrégats qui ont le potentiel d'adhérer à la surface du puits; défaut de le faire resuLTS dans le fracas de 'les agrégats (Figure 5Biv). En outre, et comme mentionné précédemment (et ci-dessous), il est indispensable de veiller à ce que les agrégats sont maintenues en culture en suspension et sont empêchées d'adhérer à toutes les surfaces. Une fois que les agrégats ont adhéré, le profil d'expression des gènes et leur potentiel d'allongement sont perturbés.

Comme cette technique est relativement simple, et bien de la compétence des individus avec de bonnes techniques de culture de tissus, la plupart des problèmes liés à l'agrégation peut être résolu assez rapidement si ces étapes critiques sont suivies; une table pleine de dépannage est disponible (tableau 1). Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier le développement axial, brisure de symétrie et de la cellule-décision événements. Plus précisément, ces agrégats ont le potentiel de générer des pools de cellules qui ont été jusqu'à présent pas disponible dans la culture, tels que la moelle épinière et motoneurones r.

Remarque éthique: Il convient de noter avec prudence que la traduction de ce protocole d'ES humaines ou culture de cellules iPS pourrait amener l'expérimentateur à proximité de la base juridique de la limite de quatorze jours sur la recherche sur l'embryon humain, à savoir la génération d'une ligne primitive, comme détaillé dans la loi sur les droits Fertilisation and Embryology 2008 (Royaume-Uni) 42. Depuis la loi couvre tous les embryons humains vivants quel que soit leur mode de création, de la culture des droits de gastruloids-delà de la primitive-série comme étape serait au-delà de la portée de la recherche sous licence.

Acknowledgements

Ce travail est financé par une bourse de chercheur ERC avancée de l'AMA (DAT, TB) avec une contribution d'une subvention de projet du Wellcome Trust à l'AMA, une bourse d'études à l'EPSRC PB-J et Erasmus, Stichting dr. Vaderlandsch Fonds de Hendrik Muller et Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude 'te' s-Gravenhage à SCvdB. Nous tenons à remercier J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, et T. Rodriguez, de discussions et de critiques constructives, Joaquin de Navascués pour le protocole milieu de montage et les deux AK Hadjantonakis et C. Budjan pour partager les protocoles de leur laboratoire relatif à la coloration des embryons entiers de montage. Une version antérieure de cet article a déjà été mis à disposition sur le serveur bioRxiv impriment 29.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25 cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50 ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO
Dissection Well (30 mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054

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