运用

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

在子宫内调查器官是胎盘哺乳动物,由于试剂的交通不便在技术上具有挑战性的过程中对子宫内的发育胚胎。新开发的体外直立滴培养法提供了一个有吸引力的替代在子宫内进行的研究。 体外液滴文化提供了检查和处理,通过使用各种保护和活化化合物的细胞相互作用和多样化的信号通路的能力;另外地,可以研究在特定器官的发展多种药理试剂的作用,而不在子宫内的全身药物递送的不需要的副作用。相对于其他的体外系统中,微滴培养不仅允许研究三维形态发生和细胞-细胞相互作用的能力,这是不能在哺乳动物细胞系被再现,同时还要求显著少řeagents比其他离体和体外协议。本文示范了正确的小鼠胎儿器官解剖和直立液滴培养技术,其次是全器官免疫证明该方法的有效性。 体外液滴培养方法允许形成器官结构可比所观察到的体内 ,并且可以用来研究由于胚胎致死性在体内模型中 ,否则难以研究的过程。作为一个模型应用系统中,小分子抑制剂将用于探测血管的睾丸形态发生中的作用。此体外液滴培养方法是可扩展到其他胎儿器官系统,如肺和潜在别人,虽然每个器官必须是广泛的研究,以确定任何器官特异性修改的协议。这个器官培养系统提供了在实验与胎儿各器官的灵活性,并导致obtained。使用这种技术将有助于研究人员深入了解胎儿的发育。

Introduction

在体内在人类器官再生是非常有限的;因此,组织工程,组织和从由主机捐献单个细胞器官的发育,是变器官更换一个有吸引力的潜在疗法。但是,对于该治疗策略是成功的,因素和参与器官的形态形成的细胞相互作用,必须彻底的研究和易于理解的。由于无法研究特定器官与传统方法的发展,研究人员已转向替代全胚胎或整个器官培养。 Kalaskar 等人 1已经表明, 体外全胚胎培养得到类似的结果(在培养的胚胎的58%),以在子宫内发育,表明体外培养方法可用于器官发生研究一个可行的替代方案。

个性化的器官培养系统,例如本体外的dro诗人盖伊培养系统,允许对整个器官分析独立的全身效应,而通过加药理学试剂或抗体的允许操作的特定信号传导途径或细胞的相互作用。传统上,胎儿器官发育的研究已不限于转基因和基因敲除小鼠的技术中,除了递送母系药理试剂。但是,也有涉及这些技术和治疗方法在体内的技术问题;最关注围绕影响各种器官同时经常导致胚胎致死性的影响。研究操纵胎儿发育的另外一个关注的药理是药物对子宫内胚胎发育的母体效应如药物产妇代谢之前到达胚胎),如果这样的试剂可以穿过胎盘屏障。

整个器官培养技术说明这里被改编自协议首先通过Maatouk 等人 2描述,其中整个胎儿性腺孵育在体外直立液滴培养物。培养的胎儿性腺之一显著优点是,小分子抑制剂能够通过简单的扩散容易地访问整个器官。 。DeFalco等人已经表明,利用在与小分子抑制剂结合本体外液滴培养方法可用于研究信令进程和性腺发育3期间发生相互作用;这些过程将难以检查体内由于技术上的挑战例如,药物通过胎盘或影响使用基因或药理学方法多个器官杀伤力通路)。

液滴文化不仅在某些方面比在子宫内的实验改进,而且它是一个改进, 在体外和VO的系统。因为它们缺乏多样的细胞类型,缺乏临界外基质(ECM)组件,其允许器官结构的形成,并且可以在信号级联放大显示的工件的使用细胞系,研究形态发生是极为困难的。虽然组织工程在创造支架模拟ECM做显著的改善,对于缺乏知识的哪些信号需要通过器官中的细胞类型使得它具有挑战性的在体外建立一个器官系统。其它体外系统已被预先建立,研究器官,或更具体形态发生,并已为胎儿器官的琼脂4实时成像非常成功的,转孔5,过滤器6,和其他支架矩阵7,8。液滴培养系统的优点是,它允许形态的研究通过提供利用较少的试剂,其分别为邻的能力FTEN昂贵,而且还给予器官表面张力,这是生长和信令能力9重要。

在小鼠中,初始睾丸形态取胚胎(E)之间发生级E11.5和E13.5;这些阶段包括的最佳时间窗口用于检查影响性别特异性分化因子。间期间睾丸形成发生的关键过程是睾丸帘线结构的产生和睾丸特异性的血管网络的形成。利用这种体外全器官液滴培养系统,一个是能够改变雄性特异性血管化和通过使用小分子抑制剂的抑制睾丸形态发生阻断了受体的血管内皮生长因子(VEGF)的活性;血管内皮生长因子介导的血管重构是睾丸发育10-12的关键。这种技术可以成功地应用于其它器官,并且可以针对特定的时间发展的窗口。全安装器官成像允许重要结构的可视化以及来自各种抑制剂的给药引起的结构和细胞变化。重要的是,这个系统是在研究人员可以绕过从母体药品监督管理部门或系统中断期间体内靶基因战略的潜在混杂影响是有利的。因此,这整个器官离体液滴培养系统可以显著改善了解哪些胎儿发育过程中特别会出现特定的器官内的相互作用和信号的能力。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

在这些研究中使用的所有小鼠是从Charles River实验室得到的CD-1小鼠。以前培养实验也已在其它菌株,如C57BL / 6J(数据未显示)进行的,但任何应变都可以使用。怀孕的成年女性约为2-3个月之久,并通过CO 2吸入颈椎脱位和前胚胎切除双侧开胸进行安乐死。小鼠饲养按照美国国立卫生研究院的指导方针,以及实验方案被批准由辛辛那提儿童医院医学中心的机构动物护理和使用委员会。

1.准备仪器仪表,文化传媒,和菜名

  1. 制备一个70%的乙醇溶液。高压灭菌去离子水(用于制作加湿室以及制造/稀释溶液)。通过喷雾用70%的乙醇消毒清扫工具(钳子,剪刀,和27G的针头注射器)。
  2. 备含有的1M钙和镁(80克NaCl,2克氯化钾,14.4克 Na 2 HPO 4,2.4克KH 2 PO 4,6.75 ml的氯化钙 ,3.75毫升的1M MgCl 2的10X磷酸盐缓冲盐水(PBS) )。搅拌使之溶解在1升无菌高压灭菌的水,然后过滤用滤纸。稀释10倍的水,使1×PBS。
  3. 热灭活的胎牛血清(FBS),在55℃进行30分钟,并过滤消毒用0.22μm注射器过滤器。
  4. 准备38个ml的1X完全培养基(称为完全DMEM,cDMEM),由Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM),10%的过滤青霉素 - 链霉素股票热灭活FBS和1/100稀释。这通常应使用新鲜,但是可以存储在4℃下1个月。
  5. 每瓶VEGFR酪氨酸激酶抑制剂II(TKIⅡ)在DMSO为原料浓度为5mg / ml,且稀释库存与cDMEM使工作溶液。最后CON中心定位为这项研究是在cDMEM 1.875微克/毫升。根据该公司的建议,储备溶液是稳定长达6个月的,在-20℃下。至于工作的解决方案,使新鲜和在同一天使用。
    注意:此药物在工作溶液的浓度应比所需的终浓度2倍高(因为它将稀释两倍以液滴)。与此同时,准备cDMEM含有DMSO中为“控制”处理相同体积相同体积。
  6. 在蒸馏水中单独准备的尾部消化试剂(50毫米氢氧化钠和1M的Tris-HCl [pH值为8.0)。
  7. 制作的XY PCR引物25μm的股票(XY正向5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3'和XY逆向5'-CCG CTG C​​CA AAT TCT TTG G-3')一起在无核酸酶水。
  8. 准备50X TAE缓冲液(242克Trizma碱57.1冰醋酸,加入100毫升0.5M的EDTA,pH值8.5,加水至1升网络纳尔体积)。制备1X TAE电泳缓冲液(20 ml的50X TAE用水稀释至1L总体积)。
  9. 要创建2.5%琼脂糖溶液(0.625克琼脂糖加入0.5ml 50X TAE缓冲24.5毫升的水),热琼脂糖溶液在微波炉直至沸腾,然后放凉至约55-65℃(能够触摸)。冷却后,加入2微升1%溴化乙锭溶液,倒入凝胶。
    注意!溴化乙锭是一种诱变剂和致畸;请用丁腈手套和处理时应适当的安全协议。备选地,其他潜在毒性较低的凝胶拆解试剂或染料都可以使用。
  10. 制备封闭液(PBS含有0.1%的Triton X-100,10%胎牛血清[FBS],和3%牛血清白蛋白[BSA]),用于免疫荧光。
  11. 制备用于免疫荧光洗液(PBS含有0.1%的Triton X-100,1%FBS,和3%BSA)中。
  12. 制备PBTx(PBS含有0.1%的Triton X-100),用于免疫荧光。
  13. 准备孵化室对Culture。补大(直径100mm)的培养皿用35ml高压灭菌的水。广场不远的地方清扫和文化将被执行。

来自小家鼠 2.隔离胎儿睾丸

  1. 检查雌性小鼠的阴栓每天早晨。当天中午,在其阴道塞检测被认为是E0.5。安乐死的怀孕雌鼠在E11.5,与经批准的动物协议的方式。
  2. 喷向下小鼠腹部用70%乙醇。
  3. 打开腹部的皮肤和腹膜使用细剪刀V形切口拉回组织瓣,露出内部器官。
  4. 定位在卵巢子宫角的两端。用剪刀切下卵巢和结缔组织分离含有从母体胚胎的子宫。
  5. 轻轻切割胎盘相对的一侧,露出了卵黄囊打开子宫壁。要小心,不要PUncture卵黄囊,以避免损坏或丢失的胚胎。
  6. 附近的胎盘切去除含胚胎卵黄囊,将它们放入含有PBS与钙和镁的一道菜。钙和镁离子的存在将有助于支持细胞粘附分子来维持组织架构和防止组织粘到清扫工具。
  7. 用钳子,通过仔细穿刺卵黄囊创建其中胚可以滑出空穴除去卵黄囊和羊膜从胚胎。一旦胚胎是卵黄囊之外,剪断脐带。
  8. 从现在开始,使用位于无菌组织培养罩显微镜。除去胚的头部,并通过与颈部的两侧镊子夹持丢弃。
  9. 取出尾部并放入新的离心管XY PCR分析,以确定胚胎的性别。
    注意:虽然它是最优的培养性腺尽快收获后,它也是POSsible去除尾部DNA和前培养执行XX / XY基因分型,以使每个胚的性别是已知的,只有所需的性需要培养。而基因型正在做,胚胎可以保持分开(以使它们能够被追踪)在4℃或在冰上直至准备培养。一个需要注意的是,这期间以外在子宫内或培养条件下培养过程中可能潜在地影响生存能力培养或后续开发。
  10. 钉扎胎的腋下有一对钳(通常在弱手持镊子)固定在对培养皿底部的仰卧位的胚胎。保持这些钳到位,在整个解剖过程中仍然保持胚胎。
  11. 与其他对镊子,去除皮肤覆盖腹部,轻轻取出肝,肠,和其他器官暴露背部体壁。
  12. 作为性腺将位于背面壁体上的背主动脉的任一侧,沿着主体的中线运行的大血管,舀泌尿生殖脊封闭镊子下方并通过打开钳子和抬起除去泌尿生殖脊。由于性腺将被松散地贴在墙壁上,注意不要拉涨过快不删除这些连接或性腺可能会拉长,造成损害的器官。
  13. 移动泌尿生殖嵴为cDMEM在培养皿中,以适应组织的媒体。
  14. 使用27G的针头泌尿生殖嵴的其余部分分隔开性腺 - 中肾复杂。使用一个针向下压切,并使用其他正确引导所述组织,以允许最佳分离。避免使用对盘底部的锯切运动,锐利的针头会造成塑料碎片,能坚持到组织。请一定要保持完全附着于性腺中肾。

3.培养性腺的具有小分子抑制剂

  1. 将两个20μ升移液器每次15微升。切成约1-2毫米断使用干净,灭菌刀片为性腺和加法的控制cDMEM转移阻挡枪头之一,而另一个吸移管将仅用于药物处理cDMEM。
  2. 排队性腺与他们平行的枪头长轴这样他们就可以很容易地使用截止尖吸管。小心性腺粘附在移液管尖的内部。
  3. 标号一侧作为控制液滴和其它如含药微滴。只有两个液滴可容纳在35毫米盘的盖子。确保盖子上的标签匹配含尾组织的离心管中的标签。
  4. 吸移管将15μlcDMEM的含有单个性腺成在小(35毫米)培养皿的盖的液滴(只使用盖,由于底部是太高,以适应加湿培养皿腔内)。将两个独立的含性腺液滴上的菜的两侧,以及分隔FROM彼此。检查显微镜下,以确保性腺已转移到液滴。
  5. 到指定为控制所述液滴,增加额外的15微升cDMEM含有DMSO(在步骤1.5制),使用30微升总体积的液滴。仅使用“控制”吸管,不会接触毒品。
  6. 的其他液滴(药物处理的样品)中,添加15微升含TKI-ⅡcDMEM,使用30微升总体积的液滴。只能使用指定药物处理的样品的吸管。
  7. 使用吸管,摊开液滴在不断扩大的圆形图案,直到他们约15-18毫米,直径性腺位于大致在中间。定向所述性腺使得其位于在其一侧和性腺和中肾很容易分辨。定向所述肺,使得两个裂片平放。
    1. 虽然液滴直径可能会略有不同,确保性腺都没有莲花灯克和在适当位置由表面张力保持。确保液滴不相互接触或盖的一侧。如果没有表面张力,该机构将在培养过程中生长到盖和扁平化,从而扭曲器官的形态。
  8. 小心地将含微滴培养皿盖直立到水在大(100毫米)加湿器皿的表面上。确保没有气泡截留在盖的底部下方,并且它平放的水的表面上。不要反转盖子,注意不要让水接触到盖洗脱液滴位于顶部。
  9. 要创建一个小的,潮湿的室内,应立即用较大的加湿器盘的盖中盖围住性腺文化。法尽快尽量减少任何媒体蒸发。确保更小的菜都有它和较大盘的盖子之间的空间自由走动;否则,冷凝可能使密封和b锁空气交换的组织。
  10. 一旦两个小盖子被放置在室中,紧接在室放入孵化器。孵育液滴培养48小时,在湿润 CO 2培养箱中在37℃。

4.聚合酶链反应确定胚胎的性别

  1. 添加胚胎尾部到1.5ml微量离心管的底部。
  2. 添加到每个管200微升的50mM NaOH中。
  3. 放置在95℃下15分钟,或直至组织完全溶解。
  4. 加入50微升1M的Tris-HCl和旋涡轻轻简单。
  5. 加入0.5μl25μM的引物溶液,2.5微升10X Taq缓冲液,0.5微升的10mM的dNTP(核苷酸),19.3微升核酸酶:在1.5ml微量离心管,通过每体积由样本的总数乘以一个最新的PCR主混合物免费的水,0.2微升DNA Taq聚合酶。拌匀。
  6. 添加23微升PCR主混合物以PCR含有消化尾3微升裂解液管。
  7. 轻弹管将它们混合,然后执行短的自旋使样品管的底部。
  8. 运行XY(短)PCR程序( 表1)。
  9. 加载样品(与5倍的染料)和梯在1X TAE缓冲液在2.5%琼脂糖凝胶。
  10. 运行琼脂糖凝胶电泳直到XX和XY波段可以解决。
  11. 图像的紫外线和捕获图像的凝胶。
  12. 分析的X染色体特异性VS Y染色体特异条带(X染色体= 331个碱基对[BP]和XY = 302基点)13; XY(男性)的样品将有331两个频段和302基点,而XX(女性)的样本将显示为一个单一的331 bp的条带。

5.整装器官免疫

第1天:

  1. 使用1000微升吸管截止尖取下文化性腺。如果需要的话,它们可以是放置在PBS一碟洗掉培养基和试剂。放入PBS中于0.5 ml离心管。较小的管子尺寸将节约试剂和更容易地跟踪样本在管。
    1. 一定要保持控制和处理的样品,以及XX和XY样品,在不同的试管和文化与移液器单独设置删除它们,以避免潜在的药物污染。
  2. 用PBS洗两次性腺。从这点上,该协议可以使用1×PBS缺乏钙和镁。把它们洗干净,允许性腺沉到管(通过重力)的底部,然后除去上面的液体。小心不要吸取太靠近他们失去性腺。
  3. 从管中除去尽可能多的PBS作为可能的。加入250微升4%多聚甲醛的PBS中含有0.1%的Triton X-100,和让孵育O / N在4℃下于一个摇杆。或者,该固定可以在4℃上的摇杆进行2小时。注意! Paraformaldehyde是一种有毒物质,因此在处理时应遵守安全协议。

第2天:

  1. 在250微升PBTx在室温两次冲洗性腺。
  2. 用250μlPBTx,每次10分钟,在室温上的摇杆洗性腺3次。
  3. 方框性腺至少1小时在250微升阻断在RT上的摇杆溶液。
  4. 染色性腺O / N,在4℃在250微升的第一抗体稀释在封闭液摇臂。

第3天:

  1. 在250微升洗液冲洗两次性腺。
  2. 洗性腺3次用250μl洗涤液用于在每个摇杆10分钟,在室温。
  3. 块中的性腺1小时的250微升阻断在RT上的摇杆解决方案。
  4. 盖上离心管铝箔保护荧光的二抗避光。
  5. 孵育性腺2-4小时,在RT上ARocker在稀释于封闭含赫斯特33342或者解决方案250微升二抗,摇臂上进行二次抗体和赫斯特33342孵化O / N在4℃。
  6. 在250微升PBTx两次冲洗性腺。
  7. 在250微升PBTx,每次10分钟,在室温上的摇杆洗性腺3次。
  8. 使用截止的枪头,转移性腺到最小的液体幻灯片。去除多余的液体,吸液管,但是要确保组织不会干。
  9. 东方在用钳子希望的方式性腺,赶紧加入一滴安装介质安装幻灯片上的性腺。确保安装介质大衣完全所有的样品;关键是要避免让样品干燥。
  10. 适当大小使用盖玻片(1.5号方式),轻轻盖样品。让安装介质传播来联系盖玻片的整个表面上。如果有必要,非常轻按盖玻片,这样的角落有没有大的气泡。
  11. 密封与周围的边缘清晰指甲油幻灯片降低安装介质的蒸发。商店安装载玻片在黑暗中在4℃。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

体外培养液滴允许一个操纵整个器官,如生殖腺,来研究细胞相互作用和动力学。 图1展示了在一个逐步的方式如何准备E11.5性腺液滴培养。在培养协议的第一个步骤包括最初除去从母小鼠1A和1B)的含胚子宫。除去从母亲子宫后,子宫壁被切断,将胚胎从卵黄囊到PBS中用于进一步解剖1C-E)的解放。去除内脏器官的后,泌尿生殖脊是沿着后身壁胚胎( 图1F)的清晰可见和分离1G)。性腺-中肾络合物然后解剖远离泌尿生殖脊1H),并且被放置到液滴培养用小分子抑制剂1I,左:“T”的处理)和不小分子抑制剂( 图1I,正确的:“C”控制)。含有液滴的小碟封闭在化妆移加湿室( 图1J),并在37℃和5%CO 2的48小时。

后48小时温育的培养的器官被除去,用PBS洗涤,并受到一个整装免疫荧光协议来评估培养和药物治疗的有效性;可替代地,他们可以为RNA提取处理用于基因表达分析。胎全性腺-中肾络合物(E11.5以上)具有高的存活率在正常条件(37℃和5%CO 2)48小时下一个干净的解剖后立即转移到培养基和培养(但他们可以是潜在培养更长,如果必要的话)。 E11.5性腺下明microscop比较的Y初始孵育后对培养24或48小时揭示了戏剧性的变化在性腺形状和条状线结构中的控制的XY性腺的外观( 图2)。因此,48小时培养后,发展是比得上E13.5 宫内性腺图2)的。此外,E11.5胎儿肺生长,并显示增加的支化,通常在该阶段中发展图2)发生。培养过程通常导致更小的器官相比, 在子宫内 ,最可能是由于事实,即培养条件没有作为最佳为相对于在子宫内的环境(见讨论)的增长。

虽然从48小时培养所得的器官的大小不同于宫内-developed器官离体培养的器官显示出类似的组织结构,并可以作为合理替代物(Figures 3和4)。为了表征器官结构和形态,标记特异性标记关键器官的细胞类型被使用,如SOX9睾丸支持细胞和肺支细胞,E-钙粘蛋白的肺上皮细胞,PECAM1为生殖细胞和脉管系统,并切割胱天蛋白酶3对于凋亡细胞图3和4)。Sox9 ,编码转录因子,在胚胎器官增殖,分化,和细胞外基质的形成中起重要作用。因此,在这两个机构,SOX9被用作通用架构标记物标记位于睾丸帘线14-16和分支结构内肺部17内支持细胞。

性腺文化在子宫内形态特别是重新创建有效。鼠标性腺规定为胚胎(E)级E10.0和最初形态相同的XY(男性)和XX(FEMALE)的胚胎。基因XY的Sry基因(Y染色体的性别决定区 )的表达性腺开始E10.5驱动器发生迅速E11.5和E13.5之间的胎儿睾丸19,包括主要分子和形态的变化:的规格支持细胞,睾丸的支持细胞谱系;形成睾丸帘线,被包括塞尔托利和生殖细胞,并且是前体胎儿到成人输精管;和主要血管重塑。雄性特异性血管重塑,从在相邻中肾血管丛释放内皮细胞迁移到性腺以形成睾丸特异性动脉系统4,20。免疫荧光分析表明发达睾丸帘线结构和脉管在E13.5 宫内睾丸相对E11.5睾丸图3)。如图3中显示的图像,液滴培养系统可以重新睾丸分化EV已废除体外的,因为它是可能的可视化SOX9的阳性支持细胞中的XY性腺成形为小管状线和脉管整个器官形成。对于肺,48小时培养结果的SOX9 / E-cadherin的双阳性上皮分支以上的2天( 图4)的过程中增加的支化。此外,我们看到细胞凋亡在控制培养并在子宫内的性腺相似的水平,同时有一些增加,细胞凋亡在肺中的相同的培养条件下( 图3和4),这表明性腺是特别适合于培养条件。

小分子抑制剂可用于通过影响细胞定位,增殖和细胞周期的状态,以及器官结构和各种信号级联来研究器官发育。 体外全器官滴方法使研究人员能够轻松地管理药物试剂FE河谷器官在一个非常小的体积的培养基。为了检测血管和血管重塑的睾丸分化和形态发生的作用,我们使用了小分子抑制剂TKI二,一个试剂,通过阻断VEGF受体的活性破坏睾丸血管发育3;胎睾丸架构的形成发生在血管依赖性,通过血管内皮生长因子A(VEGFA)11,12作用。而睾丸的血管形成是对睾酮的出口,驱动胚胎的男性化关键的,它也是睾丸帘线形态的主要驱动力:先前的工作表明,当VEGFA信令被阻塞处或之前E11.5,Sertoli细胞无法从周围的间质细胞,没有线结构形成3,12分割出去。此处示出的结果表明,在胎儿睾丸血管重塑的破坏是有效的液滴培养体系,和subsequen吨在睾丸形态即,异常睾丸帘线形成)的缺陷,可以可视化图3)。应当指出的是,PECAM1,标记为内皮细胞,也由生殖细胞图3)表示;这个生殖细胞染色是内部对照,显示了在缺乏治疗性腺血管染色的是不是由于技术上的原因,并且还表明,其它类型的细胞,如生殖细胞不会受到药物治疗。鉴于大多数初始睾丸形态发生E11.5和E13.5之间的地方,这些阶段是确定了影响性别特异性分化,尤其是血管内皮生长因子在性腺的作用和血管重塑因子的最佳窗口。

TKI二E11.5和E13.5之间肺发育期间使用表明脉管系统的小分子抑制可以在另一器官图4)被再现。这些结果表明吨的功效他离体胎儿器官液滴培养模型系统和使用小分子抑制剂以改变器官内信号传导途径的能力。由于观察到易于,灵活性和这个协议的功效,液滴培养提供了一个合适的替代用于与器官发育不能在体内处理的实验问题。

图1
图1中的步骤体外全器官液滴文化协议。 (一)安乐死怀鼠标打开腹腔。(B)角子宫与封闭的胚胎。(C)特写视图中打开子宫壁与暴露的胚胎卵黄囊。(四)单个胚胎(E)连接以卵黄囊(Y)包围的胎盘(P)。(E)胚胎分离˚F ROM胎盘和卵黄囊。(F)解剖胚胎内脏器官取出,泌尿生殖嵴暴露(内黑边尿生殖嵴生殖腺)。(G)特写孤立泌尿生殖嵴(黑边性腺-中肾复合物)。星号表示在G和H(H)分离泌尿生殖嵴(夹层由黑色虚线表示)性腺-中肾复背主动脉。克,性腺;男,中肾。(我)在35毫米培养皿的盖子建立液滴文化。黑箭头指向滴内性腺。 T,治疗; C,控制。(J)置于一个开放的湿盒内的两个小滴培养皿的盖子。 请点击此处查看该图的放大版本。

ig2.jpg“/>
图2.开发体外相滴培养机关在子宫内器官的明视场图像。E11.5 在-utero-开发机构(性腺和肺)(第一列); 24小时(第二列)和48小时墨滴控制文化(第三列)后E11.5机关; E11.5机关48小时与TKI II VEGFR抑制剂(第四列)培养;和E13.5 在-utero-开发机构(第五列)。性腺的取向是性腺(清晰的结构)以上的中肾(不透明的结构)。 E11.5性腺是双位势,并出现形态相同的XY(男性)和XX(女)样本。比例尺,500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

“SRC =”/文件/ ftp_upload / 53262 / 53262fig3.jpg“/>
图3. 体外液滴培养睾丸是可比的组织结构和细胞死亡-utero-开发对应的免疫荧光图像。E11.5宫内胎儿-developed睾丸(第一列); 48小时控制体外滴文化(第二列)后,控制E11.5睾丸; E11.5睾丸后48小时体外液滴文化与TKI II VEGFR抑制剂(第三列);和E13.5 在-utero-开发的睾丸(第四列)。虚线表明性腺 - 中肾边界(性腺是面向顶部)。 SOX9是支持细胞的标志物,用于可视化睾丸帘线结构; PECAM1表达于胚芽和血管内皮细胞(因此,剩余的PECAM1染色处理性腺是几乎完全生殖细胞);和cleav编胱天蛋白酶3是凋亡细胞的标志物。培养控制性腺表现出类似的睾丸索形成睾丸特异性血管(箭头整个图),和相对凋亡水平在-utero-开发的同行,同时展出TKI-II培养性腺破坏血管和异常睾丸线形态。括号表明性腺的面域,其中血管通常是存在的,但处理的样品中没有检测到。箭头指向死在TKI-II治疗睾丸血管细胞团块。比例尺,100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.其他胎儿各器官(肺)的液滴体外培养媲美 > IN- utero-开发机构的免疫荧光图像。E11.5 宫内 -developed肺(第一列); E11.5肺后48小时控制的体外滴文化(第二列); E11.5肺后48小时体外液滴文化与TKI II VEGFR抑制剂(第三列);和E13.5 在-utero-开发的肺(第四列)。 SOX9标签分支细胞; E-cadherin的标志肾小管上皮结构; PECAM1标签血管内皮细胞;并切割胱天蛋白酶3马克凋亡细胞。 体外培养的控制机构显示出类似的结构和SOX9,E-钙粘蛋白的表达,和PECAM1培养器官相比在-utero-开发器官,但改变的细胞死亡的量。在与TKI II治疗,血管发育是显著在肺减少(所揭示的PECAM1染色)。比例尺,100微米。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

一步体温时刻周期数
开始 94℃ 2分钟 1周期
变性 94℃ 15秒 35个循环
退火 57℃ 30秒
伸长率 72℃ 30秒
结束 72℃ 5分钟 1周期

表1:XY PCR分析程序循环参数为“XY(短)”PCR技术用于胚胎XX / XY基因分型方案

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

这项研究表明,具有研究胎儿发育许多潜在的应用体全器官液滴的方法。这种技术可以用于多种器官,和允许研究者解决生物学问题,是很难使用体内检查方法由于胚胎和潜在胚胎致死的交通不便。此培养方法比其他体外附加利益的方法,如哺乳动物细胞系:整个器官都可以使用,因此维持存在子宫内临界细胞间的相互作用;而培养体积很小(约30微升),因此使用非常少量的稀有或昂贵的药物试剂。

液滴文化协议的关键内容包括:器官的)干净的夹层。干净的夹层允许保持组织架构,减少暴露的切割或损坏河畔的数面,其可以被吸引到培养皿表面,可能会打破培养; b)该液滴内的脏器适当定向,以便允许器官的生长和形态发生; c)在进行液滴的适当的尺寸,从而使液滴由表面张力保持器官中的地方,但也不会变干; D)使用正确的液滴体积的器官。液滴体积应根据经验来确定,并根据器官大小。然而,30微升应该是一个合理的起点。五)选择显影,以解决感兴趣的生物问题的相关阶段;和f)维持无菌培养环境,以避免污染,可在液滴中损坏组织。

本文主要集中在E11.5-E13.5性腺即,在初始性分化),而且还表明,该协议可以被应用到其他器官。该协议对其他器官的潜在的修改包括:)改变液滴体积为发展的特定器官和/或阶段。这种培养方法适用于对性腺的所有胎儿阶段,但音量应调整为更大的器官后胎儿阶段。有可能是一个限制到胎儿阶段可用于较大的器官,因为简单的扩散不会允许营养物质或试剂在稍后阶段非常有效地穿透大组织。因此,建议使用这种培养胎儿器官在用于实验尽可能早的阶段。 b)将外源性生长因子,激素,或其他因素,以培养基。某些器官可能需要一个特定的蛋白质或激素,以进行正常的形态;因此,该协议可以通过加入这些试剂的到培养基进行修改。三)调整培养时间的长短。而初始睾丸发育可发生在仅仅24小时,其他器官可能需要的培养时间较长。如果液滴是保持无菌的,所述组织可以是适合于在培养最多4或甚至5天。对于培养(超过48小时)的时间较长,以除去氨或其他内置式废物副产物,可能有必要每天刷新介质(具有相关的试剂)在液滴通过除去液滴的集合体积和更换的同样体积的新鲜介质;对处理过的液滴,新鲜的培养基应含有药物/试剂的相同的浓度在初始治疗​​。四)改变的媒体和/或相关的试剂组合物。某些组织可能需要更多的给定药物试剂或以下以引发期望的效果。它建议尝试系列稀释浓度和评估细胞死亡(通过裂解的胱天蛋白酶3染色),以找到一个最佳浓度,这会阻碍/激活所需的途径,但不诱导显著细胞死亡培养器官。 E)使用的内部控制。由于器官如性腺成对出现,人们性腺可以服务作为对侧治疗性腺一个理想的内部控制。其他器官如肝不来对;如果所用的小鼠品系是罕见的,样品被限定,也能够解剖器官中一半,并使用每一半,用于控制和处理的样品。我们必须牢记,器官,甚至那些成对出现的,可能会表现出不对称性(如不同数量的叶为肺的每一侧),所以人们一定要注意其中的器官一侧被用于控制和处理样品。

虽然液滴的文化有可能重新宫内发育几乎所有的方面,也有一些限制,这种技术。其中之一是,液滴文化和体外培养的一般技术,导致相对于在子宫内发育1,5一贯较慢的增长速度;这可能是由于多种因素,如低级的所需的生长因子的浓度在培养基(和它们的访问到组织)和有限新生血管发生离体进行。除了器官的大小,存在,若外植体不正确取向或液滴是不正确的大小,组织形态可能会变得扁平或扭曲与缺乏的支撑结构,它是通过琼脂床提供的关注在其他协议。然而,能够避免此问题与协议参数的优化。另一个潜在的限制因素是如何的媒体和试剂可以在整个器官扩散;而这些培养组织有血管,存在通过这些血管离体无灌注营养素和氧气由于缺乏血液流动,所以代替扩散变得一个因素。这个限制是在出生后的睾丸培养尤其明显,在这种体外精子是公持在植体的外周,但组织的最中心的部分即,最远离媒体)degeneraTES 21-23。鉴于这些观察,看来大​​小为整个器官培养或大尺寸的外植体的协议的一般限制因素。然而,一般的形态发生的程序,如在胎儿肺和从头睾丸帘线形成在胎儿性腺分支形态,还是发生在液滴培养物。因此,这些基本过程仍然可以使用这种技术的研究。

这整个器官协议首先由Maatouk 等所述 2,谁从以前的基于琼脂培养法适于它由Coveney 等人 4,而不是培养器官离体通过液滴在琼脂孔中的好处是,它使用在至少10倍的降低培养物体积,从而节约试剂;另外,液滴方法不涉及预孵育琼脂井试剂含有介质,从而节省了时间并绕过约试剂是德的效率的任何疑虑胆小通过琼脂的组织。而琼脂为基础的方法,一般认为以保持更忠实地三维的组织结构,外植体和培养条件的优化(见上文)的正确取向将确保液滴培养器官的正常形态。

这些结果表明, 体外培养的液滴胎儿性腺展览生长和形态发生媲美,在-utero-开发器官。此培养技术不限于生殖腺,但也可以适用于其他胎儿器官如肺。这离体器官液滴法将成为整个器官的信令和器官特异性细胞相互作用的研究非常有用,帮助部分由培养及药物治疗后的能力,图像整体器官。这里描述利用的小分子抑制剂,调查血管形态发生的影响的研究,但过多的市售的ava可ilable药物试剂,研究多种信号通路和生物过程。因此,有许多潜在的未来使用这种液滴培养方法,使研究人员探测发育生物学有趣和显著的问题。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
  2. Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
  3. DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
  4. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
  5. Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
  6. Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
  7. Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  10. Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
  11. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
  12. Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
  13. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
  14. Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
  15. Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
  16. Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
  17. Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
  18. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
  19. Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
  20. Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
  21. Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
  22. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
  23. Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics