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Developmental Biology

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Potter, S. J., DeFalco, T. Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis. J. Vis. Exp. (104), e53262, doi:10.3791/53262 (2015).

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Abstract

Untersuchung der Organogenese in utero ist eine technisch anspruchsvolle Prozess in Plazentatiere aufgrund der Unzugänglichkeit der Reagenzien an Embryonen, die in der Gebärmutter entwickeln. Ein neu entwickeltes ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturverfahren bietet eine attraktive Alternative zum Studium in utero durchgeführt. Die ex vivo Tröpfchen Kultur bietet die Möglichkeit, zu prüfen, und zelluläre Wechselwirkungen und diverse Signalwege durch Verwendung verschiedener Blockierungs- und aktivierende Verbindungen zu manipulieren; Zusätzlich können die Wirkungen der verschiedenen pharmakologischen Reagenzien auf die Entwicklung von spezifischen Organen ohne unerwünschte Nebenwirkungen der systemischen Arzneimittelabgabe in utero sucht werden. Im Vergleich zu anderen in vitro-Systemen, die Tropfenkultur ermöglicht nicht nur die Fähigkeit, dreidimensionale Morphogenese und Zell-Zell-Interaktionen zu studieren, die in Säugerzelllinien wiedergegeben werden kann, sondern auch deutlich weniger reagents als andere ex vivo und in vitro-Protokolle. Dieses Papier zeigt richtige Maus fetalen Organ Dissektion und aufrecht Tröpfchenkultur-Techniken, gefolgt von ganzen Organs Immunfluoreszenz, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu demonstrieren. Die ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ermöglicht die Bildung von Organarchitektur vergleichbar zu dem, was in vivo beobachtet und kann genutzt werden, um auf andere Weise schwierig zu Studienprozesse durch embryonale Letalität in vivo-Modellen untersucht werden. Als Modell-Anwendungssystem wird ein niedermolekularer Inhibitor verwendet werden, um die Rolle der Vaskularisation in testikulären Morphogenese sondieren. Diese ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ist erweiterbar auf andere fetale Organsystemen wie Lungen und möglicherweise andere, obwohl jedes Organ müssen ausgiebig untersucht werden, um alle organspezifische Modifikationen des Protokolls zu bestimmen. Diese Organkultursystem bietet Flexibilität bei Experimenten mit fetalen Organen und führt obtained mit dieser Technik hilft Forschern Einblicke in die fetale Entwicklung.

Introduction

Organregeneration in vivo beim Menschen ist sehr begrenzt; daher, Tissue Engineering, die Entwicklung von Geweben und Organen aus einzelnen Zellen durch eine Vielzahl gespendet, wird immer eine attraktive potenzielle Therapie für Organersatz. Doch für diese therapeutische Strategie, um erfolgreich zu sein, Faktoren und zellulären Interaktionen in Morphogenese der Orgel beteiligt sind, müssen gründlich untersucht werden, und gut verstanden. Aufgrund der Unfähigkeit zur Entwicklung spezifischer Organe mit herkömmlichen Ansätzen zu untersuchen, haben die Forscher alternative gesamten Embryo oder ganze Organkulturen gedreht. Kalaskar et al. 1 haben, in utero Entwicklung gezeigt, dass ex vivo ganze Embryokultur liefert vergleichbare Ergebnisse (in 58% der kultivierten Embryonen), was darauf hindeutet, dass die Ex-vivo-Kulturverfahren sind eine praktikable Alternative zur Organstudien.

Eine individualisierte Organkultursystem, wie dieses ex vivo droplet Kultursystem ermöglicht eine ganze Organ Analyse unabhängig von systemischen Wirkungen, während eine Betätigung eines spezifischen Signalweg oder zellulären Wechselwirkungen durch Zugabe pharmakologische Reagenzien oder Antikörpern. Traditionell wurde die Untersuchung der fetalen Organentwicklung, transgene und Knockout-Maus Technologien beschränkt, die neben pharmakologische Reagenzien maternal geliefert. Allerdings gibt es technische Probleme im Zusammenhang mit diesen Techniken und Behandlungen in vivo; esten betrifft kreisen um die Effekte der Beeinflussung verschiedener Organe gleichzeitig, was oft in der embryonalen Letalität. Eine weitere Sorge der Studien manipulieren fetale Entwicklung pharmakologisch ist der mütterliche Einfluss von Drogen auf die embryonale Entwicklung in utero (zB mütterlichen Stoffwechsel des Medikaments, bevor sie den Embryo erreicht), und wenn eine solche Reagenzien können durch die plazentagängig ist.

Die ganze Organkultur-Technik beschrieben,Hier wurde aus einem Protokoll zuerst durch Maatouk et al. 2, bei dem ganze fetalen Gonaden in ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturen inkubiert angepasst. Ein wesentlicher Vorteil des Kultivierens fetalen Gonaden ist, dass niedermolekulare Inhibitoren können leicht Zugriff auf das ganze Organ durch einfache Diffusion. . DeFalco et al haben gezeigt, dass die Nutzung dieser ex vivo Tröpfchenkulturverfahren in Verbindung mit niedermolekularen Inhibitoren können verwendet werden, um zu studieren Signalprozessen und Interaktionen während Gonadenreifung 3 auftretende werden; Diese Verfahren würden aufgrund technischer Herausforderungen schwierig, in vivo zu untersuchen (zB Durchgang von Medikamenten durch die Plazenta oder Letalität, die mehrere Organe mit genetischen oder pharmakologischen Ansätzen).

Die Tropfenkultur ist nicht nur eine Verbesserung in bestimmten Aspekten auf die in utero Experimente, aber es ist auch eine Verbesserung gegenüber in vitro und ex vivo Systemen. Die Verwendung von Zelllinien zur Morphogenese zu studieren, ist äußerst schwierig, da sie nicht über die verschiedenen Zelltypen, nicht über eine kritische extrazellulären Matrix (ECM) Komponenten, die die Bildung von Organarchitektur zu ermöglichen, und kann Artefakte in Signalkaskaden aufweisen. Obwohl Tissue Engineering hat signifikante Verbesserungen bei der Schaffung von Gerüsten Simulation ECM gemacht, der Mangel an Wissen in Bezug auf die Signale von jedem Zelltyp während der Organogenese erforderlich macht es schwierig, ein Organsystem in vitro zu bauen. Andere ex vivo-Systeme wurden bereits eingerichtet worden, um die Organogenese zu studieren, oder genauer gesagt die Morphogenese und sehr erfolgreich für die Bildgebung von fötalen Organen in Agar 4 gewesen, Transwells 5, Filter 6 und anderen Gerüst Matrizen 7,8. Der Vorteil des Tröpfchens Kultursystems ist, dass es die Untersuchung der Morphogenese durch Bereitstellen der Fähigkeit, weniger Reagenzien, die o sind, zurückgegriffenften teuer, sondern auch was die Orgel Oberflächenspannung, die wichtig für das Wachstum und Signalisierungsfunktionen 9 ist.

Bei der Maus findet Anfangs Hoden Morphogenese zwischen embryonalen (E) inszeniert E11.5 und E13.5; diese Stufen umfassen die optimale Zeitfenster für die Prüfung Faktoren, die geschlechtsspezifische Differenzierung beeinflussen. Unter den kritischen Prozessen, die während testis Bildung auftreten, sind die Erzeugung von Testis Kabel Architektur und die Bildung einer Hoden-spezifische vaskuläre Netzwerk. Verwendung dieses ex vivo ganze Organ Tröpfchenkultursystem ist in der Lage, eine männlich-spezifische Vaskularisierung verändern und hemmen testis Morphogenese durch die Verwendung eines niedermolekularen Inhibitor blockiert die Aktivität der Rezeptoren für vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF); VEGF-vermittelte vaskuläre Remodeling ist entscheidend für die Hodenentwicklung 10-12. Diese Technik kann erfolgreich auf andere Organe angewendet werden und kann bestimmten ZeitzielFenstern der Entwicklung. Ganzkörper-Halterung Organ Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von lebenswichtigen Strukturen sowie strukturelle und zelluläre Veränderungen nach der Verabreichung verschiedener Inhibitoren resultieren. Wichtig ist, dass dieses System den Vorteil, dass der Forscher können potentielle verwirrende Wirkungen von Arzneimittelverabreichung mütterlichen oder systemischen Störungen beim in vivo Zielgen Strategien umgehen. Somit kann diese ganzen Organs ex vivo Tröpfchenkultursystem die Fähigkeit, die Wechselwirkung und die Signalisierung, die spezifisch in bestimmte Organe während der fetalen Entwicklung auftreten Verständnis deutlich zu verbessern.

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Protocol

Alle Mäuse, die in diesen Studien verwendet wurden, waren CD-1-Mäuse von Charles River Laboratories erhalten. Vorherige Kulturexperimenten auch andere Stämme, wie C57BL / 6J (Daten nicht gezeigt) durchgeführt, jedoch jeder Stamm verwendet werden. Pregnant erwachsenen Frauen waren etwa 2-3 Monate alt und wurden durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte und bilaterale Thorakotomie vor Embryoentnahme euthanasiert. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien untergebracht und experimentelle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Cincinnati Kinder-Hospital Medical Center bestätigt.

1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte

  1. Bereiten Sie eine 70% Ethanollösung. Autoklaven entionisiertem Wasser (für die Herstellung befeuchteten Kammern und für die Herstellung / Verdünnung Lösungen). Sterilisieren Dissektion Werkzeugen (Zangen, Scheren und 27 G-Nadel Spritzen) durch Spritzen nach unten mit 70% Ethanol.
  2. Bereiten10X Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) mit Calcium und Magnesium (80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml 1 M CaCl 2, 3,75 ml 1 M MgCl 2 ). Stir in 1 L sterile autoklaviertem Wasser zu lösen und dann mit Filterpapier filtern. Verdünnen Sie das 10-fache mit Wasser auf 1 × PBS zu machen.
  3. Wärme inaktivieren fötalem Rinderserum (FBS) bei 55 ° C für 30 min und Filter sterilisieren mit einem 0,22 & mgr; m Spritzenfilter filtriert.
  4. Bereiten Sie 38 ml 1X komplettem Kulturmedium (genannt kompletten DMEM, cDMEM), bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% gefiltert hitzeinaktiviertem FBS und 1/100 Verdünnung von Penicillin-Streptomycin Lager. Dies sollte in der Regel frisch verwendet werden, kann jedoch bei 4 ° C für 1 Monat gelagert werden.
  5. Rekonstituieren Sie den VEGFR Tyrosinkinase-Inhibitor II (TKI II) in DMSO für eine Stammkonzentration von 5 mg / ml, und verdünnte Aktie mit cDMEM um eine Arbeitslösung zu machen. Die endgültige conZentrierung für diese Untersuchung ist 1,875 & mgr; g / ml in cDMEM. Gemäß den Empfehlungen der Gesellschaft sind Stammlösungen für bis zu 6 Monate bei -20 ° C stabil. Wie für Arbeitslösungen, machen frisch und verwenden Sie am selben Tag.
    Anmerkung: Die Konzentration dieses Wirkstoffs in der Arbeitslösung sollte das Zweifache höher als die gewünschte Endkonzentration (da sie zweifach in dem Tröpfchen zu verdünnen). Zur gleichen Zeit, bereiten Sie das gleiche Volumen cDMEM das gleiche Volumen an DMSO für die "Kontrolle" Behandlung enthält.
  6. Bereiten Sie die tail Aufschlussreagenzien (50 mM NaOH, 1 M Tris-HCl [pH 8,0]), die getrennt in destilliertem Wasser.
  7. Machen Sie eine 25 uM Lager der XY-PCR-Primer (XY Vorwärts 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 'und XY umge 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3') zusammen in Nuklease-freies Wasser.
  8. Bereiten 50X TAE-Puffer (242 g Trizma Basis, 57,1 ml Essigsäure, 100 ml 0,5 M EDTA, pH 8,5, und Wasser bis zu 1 l final Volumen). Bereiten 1X TAE Laufpuffer (20 ml 50X TAE verdünnt mit Wasser auf 1 L Gesamtvolumen).
  9. Um ein 2,5% Agarose-Lösung (0,625 g Agarose, 0,5 ml 50X TAE-Puffer, 24,5 ml Wasser), Wärme Agarose-Lösung in der Mikrowelle zum Kochen zu schaffen, dann abkühlen lassen, bis etwa 55 bis 65 ° C (in der Lage zu berühren). Nach dem Abkühlen, fügen Sie 2 ul 1% Ethidiumbromidlösung, und gießen Gel.
    VORSICHT! Ethidiumbromid ist mutagen und teratogen; benutzen Sie bitte Nitril-Handschuhen und Sicherheitsprotokoll bei der Handhabung. Alternativ können andere möglicherweise weniger toxisch Gel Trennmittel oder Farbstoffe verwendet werden.
  10. Vorbereitung Blocking Solution (PBS mit 0,1% Triton X-100, 10% fötales Rinderserum [FBS] und 3% Rinderserumalbumin [BSA]) für die Immunfluoreszenz.
  11. Vorbereitung Waschlösung (PBS mit 0,1% Triton X-100, 1% FBS, 3% BSA) für Immunfluoreszenz.
  12. Vorbereitung PBTx (PBS mit 0,1% Triton X-100) für die Immunfluoreszenz.
  13. Bereiten Sie die Inkubationskammern für culture. Füllen großen (Durchmesser 100 mm) Petrischalen mit 35 ml autoklaviertem Wasser. Ort in der Nähe, wo Dissektion und Kulturen durchgeführt.

2. Isolierung von fetalen Hoden aus Mus musculus

  1. Jeden Morgen Überprüfen Sie die weibliche Maus für vaginale Steckern. Uhr am Tag, an dem die Vaginalpfropf erkannt wird gilt als E0.5. Euthanize der schwangeren weiblichen Maus am E11.5, im Einklang mit genehmigten Tier Protokolle.
  2. Sprühen Sie die Mausunterleib mit 70% Ethanol.
  3. Öffnen Sie die Bauchhaut und Bauchfell mit einem V-förmigen Einschnitt mit einer feinen Schere und ziehen Sie Klappe des Gewebes zu inneren Organen aus.
  4. Auffinden der Eierstöcke an beiden Enden des Uterushorns. Mit einer Schere, schneiden Sie am Eierstock und das Bindegewebe um die Gebärmutter, die die Embryonen aus dem Körper der Mutter zu trennen.
  5. Öffnen Sie die Uteruswand durch leichtes Schneiden der Seite gegenüber der Plazenten, Freilegung der Dottersäcke. Achten Sie darauf, puncture Dottersack zu beschädigen oder zu verlieren Embryonen zu vermeiden.
  6. Schneiden Sie in der Nähe der Plazenten, um den Embryo enthaltenden Dottersäcke zu entfernen und legen Sie sie in eine Schale mit PBS mit Calcium und Magnesium. Die Anwesenheit von Calcium- und Magnesiumionen wird dazu beitragen, Zelladhäsionsmoleküle, um Gewebe-Architektur erhalten und zu verhindern, dass das Gewebe aus Festhalten an den Dissektion Werkzeuge.
  7. Mit einer Pinzette, entfernen Sie den Dottersack und Amnion aus dem Embryo durch vorsichtiges Durchstechen der Dottersack, ein Loch in dem der Embryo kann gleiten erstellen. Sobald der Embryo außerhalb der Dottersack, die Nabelschnur.
  8. Von diesem Punkt an, mit einem Mikroskop in einem sterilen Gewebekultur Haube. Entfernen Sie den Kopf des Embryos und entsorgen durch Kneifen mit einer Pinzette auf beiden Seiten des Halses.
  9. Entfernen Sie den Schwanz aufnehmen und in neue Mikrozentrifugenröhrchen für die XY-PCR-Analyse zum Geschlecht des Embryos zu bestimmen.
    Hinweis: Obwohl es optimal ist Kultur Gonaden so bald wie möglich nach der Ernte ist es auch poslich, Schwanz-DNA zu entfernen und führen XX / XY Genotypisierung vor Kultur, so dass das Geschlecht jedes Embryos bekannt ist und nur das gewünschte Geschlecht muss kultiviert werden. Während die Genotypisierung getan wird, können Embryonen getrennt gehalten werden (so dass sie können aufgespürt werden) bei 4 ° C oder auf Eis, bis sie zur Kultur. Ein Nachteil ist, dass diese Zeit draußen in utero oder Kulturbedingungen kann möglicherweise während der Kultur beeinflussen Lebensfähigkeit für Kultur oder folgende Entwicklung.
  10. Sichern Sie den Embryo in Rückenlage gegen den Boden der Kulturschale durch Pinning den Achseln der Embryo mit einer Pinzette (in der Regel die Zange in der schwachen Hand gehalten). Pflegen Sie diese Zange in Ort, um den Embryo während der gesamten Dissektion Prozess noch halten.
  11. Mit anderen Pinzette, entfernen Sie Haut, die Bauch und entfernen Sie vorsichtig Leber, Darm und anderen Organen zu entlarven zurückKörperWand.
  12. Als die Gonaden werden auf der hinteren Körperwand auf beiden Seiten der dorsalen Aorta befinden,ein großes Blutgefäß entlang der Mittellinie des Körpers läuft, Schaufel unter dem Urogenitalleiste mit geschlossenen Pinzette und entfernen Sie die Urogenitalleiste durch Öffnen der Pinzette und anheben. Da die Keimdrüsen werden lose an der Wand befestigt werden, darauf achten, nicht zu schnell, ohne dass diese Verbindungen hochziehen oder die Gonaden können strecken, was zu Schäden an den Organen.
  13. Bewegen Sie den Urogenitalleiste in cDMEM in einer Schale, um Gewebe zu Medien akklimatisieren.
  14. Trennen Sie die Gonaden-Mesonephros-Komplex aus dem Rest der Urogenitalleiste mit 27 G Nadeln. Verwenden Sie eine Nadel durch Drücken abgeholzt, und mit der anderen, um das Gewebe richtig zu führen, um eine optimale Trennung zu ermöglichen. Vermeiden Sie das Sägen Bewegung gegen die Schale unten, so scharf, Nadeln Scherben aus Kunststoff, die mit dem Gewebe haften kann. Achten Sie auf die Mesonephros vollständig auf die Gonaden angebracht halten.

3. Kultivierung der Gonade mit einem niedermolekularen Inhibitor

  1. Stellen Sie zwei 20 μl Pipetten zu je 15 ul. Schneiden Sie etwa 1-2 mm an einer der Sperrpipettenspitzen mit einem sauberen, sterilisiert Rasierklinge für die Übertragung der Keimdrüsen und der Zugabe von Steuer cDMEM, während die andere Pipette werden ausschließlich für Arzneimittel behandelten cDMEM verwendet werden.
  2. Line up Gonaden mit ihren langen Achse parallel zur Pipettenspitze so dass sie leicht mit dem Cut-off-Spitze pipettiert werden. Seien Sie vorsichtig, der Gonaden Festhalten an der Innenseite der Pipettenspitze.
  3. Kennzeichnen einen Seite als Steuertröpfchens und der andere als der wirkstoffhaltigen Tröpfchen. Nur zwei Tröpfchen auf einem 35 mm Schalendeckel passen. Stellen Sie sicher, dass die Etiketten auf Deckel passen Sie die Etiketten auf Schwanzgewebe haltigen Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Pipette 15 ul cDMEM die ein einzelnes Gonade in einem Tröpfchen auf dem Deckel einer kleinen (35 mm) Petrischale (verwenden nur die Deckel, wie die Böden sind zu groß, um in einem befeuchteten Petrischale Kammer passen). Legen Sie zwei separate gonad haltige Tröpfchen auf beiden Seiten der Schale, gut getrennte from einander. Check unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Keimdrüsen an die Tröpfchen übertragen.
  5. Auf den als Steuer bezeichnet Tröpfchen, fügen Sie eine zusätzliche 15 ul cDMEM enthält DMSO (in Schritt 1.5 gemacht), um ein Tröpfchen mit einer 30 & mgr; l Gesamtvolumen. Verwenden Sie nur die "Kontrolle" Pipette, die nicht in Kontakt mit den Drogen.
  6. Auf die andere Tröpfchen (Arzneimittel behandelten Probe), fügen Sie 15 ul TKI-II-haltige cDMEM, um ein Tröpfchen mit einer 30 & mgr; l Gesamtvolumen. Verwenden Sie nur das für Arzneimittel behandelten Proben bezeichnet Pipette.
  7. Mit der Pipette, verteilt die Tröpfchen in einem expandierenden kreisförmigen Muster, bis sie etwa 15 bis 18 mm im Durchmesser und die Gonaden wird etwa in der Mitte befindet. Richten Sie die Gonaden, so dass es auf seiner Seite liegt und die Gonaden und Mesonephros sind leicht zu unterscheiden. Richten Sie die Lunge, so dass die zwei Lappen lag flach.
    1. Obwohl Tropfendurchmesser können leicht variieren, sicherzustellen, dass Gonaden nicht floating und werden durch Oberflächenspannung gehalten. Stellen Sie sicher, dass Tröpfchen sich nicht gegenseitig oder die Seite des Deckels berühren. Ohne die Oberflächenspannung, werden die Organe auf den Deckel während der Kultur zu wachsen und zu glätten, so verzerren Organmorphologie.
  8. Vorsichtig die Kulturschalendeckel enthält, der Tröpfchen aufrecht auf der Oberfläche des Wassers in der großen (100 mm) Befeuchter Schale. Sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Boden des Deckels eingeklemmt, und dass es auf der Oberfläche des Wassers liegen flach. Kehren Sie nicht die Deckel und achten Sie darauf, lassen Sie kein Wasser berühren Sie die Oberseite des Deckels, wo die Tropfen entfernt.
  9. Um einen kleinen, feuchten Kammer zu schaffen, sofort mit dem Deckel des größeren Befeuchter Teller abdecken, um die Gonaden Kulturen einzuschließen. Handeln, so schnell wie möglich, die Verdunstung von Medien zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass die kleinere Schüssel hat Raum zwischen ihm und dem Deckel der größeren Schüssel frei bewegen; Andernfalls kann es zu Kondensation einer Dichtung und b zu machenSchloss Luftaustausch an das Gewebe.
  10. Sobald zwei kleine Deckel werden in die Kammer gebracht, sofort platzieren die Kammer in den Inkubator. Die Tröpfchen Kulturen für 48 Stunden in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator bei 37 ° C.

4. Polymerase-Kettenreaktion zur Bestimmung des Geschlechts des Embryos

  1. Fügen Sie die embryonale Schwänze zu Boden eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Hinzufügen zu jedem Röhrchen wurden 200 ul 50 mM NaOH.
  3. Stellen bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis die Gewebe vollständig gelöst ist.
  4. In 50 ul 1 M Tris-HCl und Wirbel leicht und kurz.
  5. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, einen frischen PCR-Mastermix durch Multiplizieren jedes Volumen durch die Gesamtzahl der Proben: 0,5 ul 25 uM Primer-Lösung, 2,5 ul 10x Taq-Puffer, 0,5 ul 10 mM dNTPs (Nukleotide), 19,3 ul nuclease- freies Wasser, 0,2 & mgr; l DNA-Taq-Polymerase. Gut mischen.
  6. In 23ul PCR-Master-Mix in Röhrchen gegeben, 3 ul Lysat verdaut tails der PCR.
  7. Flick Rohre, um sie zu mischen, dann einen kurzen Spin, um die Proben auf den Boden des Röhrchens zu bringen.
  8. Führen XY (Short) PCR-Programm (Tabelle 1).
  9. Laden Sie die Proben (mit 5-fach-Farbstoff) und Leiter in einem 2,5% igen Agarosegel in 1 × TAE-Puffer.
  10. Führen Sie die Agarose-Gelelektrophorese, bis XX und XY Bands aufgelöst werden kann.
  11. Bild das Gel mit UV-Licht und Bilderfassung.
  12. Analyse der X-Chromosom-spezifischen vs Y-Chromosom-spezifischen Banden (X Chromosom = 331 Basenpaaren [bp] und XY = 302 bp) 13; XY (männlich) Proben werden zwei Banden von 331 und 302 bp aufweisen, während XX (weiblich) Proben wird als eine einzelne 331 bp-Bande erscheinen.

5. Ganze Berge Orgel Immunfluoreszenz

Tag 1:

  1. Entfernen Sie die Gonaden aus der Kultur mit einem 1000 ul Pipette mit einem Cut-off Spitze. Falls gewünscht, kann sie in derin eine Schüssel mit PBS zu waschen Medien und Reagenzien gelegt. Legen Sie in PBS in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Der kleinere Schlauchgröße wird Reagenzien zu sparen und machen es einfacher, den Überblick über Proben in der Röhre zu halten.
    1. Achten Sie darauf, Kontrolle und behandelten Proben sowie XX und XY Proben zu halten, in getrennten Röhren und entfernen Sie sie aus der Kultur mit getrennten Gruppen von Pipetten, um potenzielle Wirkstoff Kontamination zu vermeiden.
  2. Zweimal mit PBS waschen Sie die Gonaden. Von diesem Punkt an, kann dieses Protokoll 1X PBS verwenden ohne Calcium und Magnesium. Um sie zu waschen, damit die Keimdrüsen, auf den Boden des Rohres (durch die Schwerkraft) sinken und dann die Flüssigkeit über. Seien Sie vorsichtig, nicht zu verlieren Gonaden durch Pipettieren zu nah an ihnen.
  3. Zu entfernen, so viel wie möglich von PBS Rohres. Fügen Sie 250 ul 4% Paraformaldehyd in PBS, das 0,1% Triton X-100, und lassen inkubieren O / N bei 4 ° C auf einer Wippe. Alternativ kann diese Fixierung für 2 h bei 4 ° C auf einem Schüttler durchgeführt werden. VORSICHT! Parafor-Formaldehyd ist eine giftige Substanz, so folgen Sie Sicherheitsprotokoll bei der Handhabung.

Tag 2:

  1. Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul PBTx bei RT.
  2. 3 Mal Waschen Sie die Gonaden mit 250 ul PBTx für jede 10 min bei RT auf einer Wippe.
  3. Blockieren die Gonaden mindestens 1 Stunde in 250 ul Blockierungslösung bei RT auf einer Wippe.
  4. Färben die Gonaden O / N bei 4 ° C auf einer Wippe in 250 ul primären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt.

Tag 3:

  1. Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul Waschlösung.
  2. 3-mal mit 250 ul Waschlösung je 10 min bei RT auf einem Schüttler waschen den Gonaden.
  3. Sperrung der Gonaden 1 h in 250 ul Blocking Solution bei RT auf einer Wippe.
  4. Decken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie, um fluoreszierende Sekundärantikörper vor Licht zu schützen.
  5. Inkubieren Sie die Gonaden 2-4 h bei RT auf arocker in 250 ul sekundären Antikörper in Blockierungslösung enthält Hoechst 33342. Alternativ verdünnt, führen sekundäre Antikörper und Hoechst 33342 Inkubation O / N bei 4 ° C auf Wippe.
  6. Zweimal Spülen Sie die Gonaden in 250 ul PBTx.
  7. 3 Mal Waschen der Gonaden in 250 ul PBTx für jede 10 min bei RT auf einer Wippe.
  8. Unter Verwendung eines Cut-off-Pipettenspitze, übertragen Gonaden auf einen Objektträger mit minimaler Flüssigkeit. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Pipette, aber stellen Sie sicher, dass Gewebe trocknet nicht aus.
  9. Richten Sie die Gonaden mit einer Pinzette in gewünschter Weise, und schnell einen Tropfen Eindeckmedium auf die Gonaden auf dem Objektträger zu montieren. Sicherstellen, dass die Befestigungsmittel Mäntel alle Proben komplett; ist es wichtig zu verhindern, dass Proben austrocknen.
  10. Verwenden Deckgläser (Nummer 1.5-Stil) von geeigneter Größe, um sanft bedecken Proben. Lassen Sie die Montage Medien Ausbreitung auf die gesamte Oberfläche des Deckglases zu kontaktieren. Falls erforderlich, sehr leicht auf den Ecken des Deckglases, so dass drückenes gibt keine großen Luftblasen.
  11. Verschließen Sie die Dias mit klarem Nagellack an den Rändern um die Verdampfung der Befestigungsmittel zu reduzieren. Shop gerahmte Dias im Dunkeln bei 4 ° C.

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Representative Results

Die ex vivo Tropfenkultur ermöglicht eine ganze Organe, wie zB die Gonaden zu manipulieren, um zelluläre Wechselwirkungen und Dynamik zu studieren. 1 zeigt, in einer schrittweisen Art und Weise, wie man eine E11.5 gonadalen Tropfenkultur herzustellen. Die ersten Schritte in dem Kulturprotokoll umfassen die anfängliche Entfernung des Embryos enthaltenden Uterus der Mutter Maus (1A und 1B). Nach Entfernung der Gebärmutter der Mutter wird die Gebärmutterwand geschnitten und die Embryos aus dem Dottersack in PBS für weitere Dissektion (1C-E) freigesetzt. Nach dem Entfernen der Eingeweide, der Urogenitalleiste entlang der hinteren Gehäusewand des Embryos (1F) deutlich sichtbar und ist isoliert (Figur 1G). Die Gonaden-Mesonephros-Komplex wird dann von der Urogenitalleiste (Abbildung 1H) seziert und in Tröpfchenkultur mit niedermolekularen Inhibitor (1I platziert,links: "T" für behandelt) und ohne niedermolekularer Inhibitor (1I, rechts: "C" für die Steuerung). Die kleinen Schalen, die die Tröpfchen in einem provisorischen befeuchteten Kammer (Figur 1J) bei 37 ° C für 48 Stunden eingeschlossen und inkubiert und 5% CO 2.

Nach 48 h Inkubation wurden die kultivierten Organe werden entnommen, mit PBS gewaschen und mit einer whole mount Immunofluoreszenz-Protokoll, um die Wirksamkeit der Kultur und der Arzneimittelbehandlung zu beurteilen unterworfen; alternativ können sie zur RNA-Extraktion verarbeitet werden für Genexpressionsanalysen. Fetale ganze Gonaden-mesonephros Komplexe (E11.5 und älter) eine hohe Überlebensrate bei den Kulturmedien unmittelbar nach einer sauberen Dissektion unter Normalbedingungen (37 ° C und 5% CO 2) für 48 Stunden überführt und kultiviert (sie können aber für mehr falls notwendig) potenziell kultiviert. Vergleiche von E11.5 Gonaden unter Hell microscopy im anfänglichen Inkubation Vergleich nach 24 oder 48 Stunden der Kultur zeigen eine dramatische Veränderung in Gonade Form und das Aussehen der streifenartigen Kordstrukturen im Steuer XY Gonade (Abbildung 2). Deshalb wird nach dem Kultivieren für 48 Stunden, ist die Entwicklung vergleichbar mit derjenigen von E13.5 in utero Gonaden (Abbildung 2). Zusätzlich wächst der E11.5 fetalen Lunge und zeigt erhöhte Verzweigung, die normalerweise während dieser Phase in der Entwicklung (2) auftritt. Das Kulturverfahren führt im allgemeinen zu kleineren Organen im Vergleich zu in utero, wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass die Kulturbedingungen sind nicht als optimal für das Wachstum gegenüber der in utero Umgebung (siehe Diskussion).

Obwohl die Größe der Organe von der 48 Stunden Kultur resultierenden unterscheidet sich von der in utero -developed Organen, ex vivo kultiviert Organen zeigen ähnliche Gewebearchitektur und kann als sinn Surrogate dienen (Figures 3 und 4). Organarchitektur und Morphogenese, Marker, der spezifisch kritis Zelltypen kenn wurden verwendet, wie zum Beispiel SOX9 für testis Sertolizellen und Lungenverzweigungszellen E-Cadherin für Lungenepithelzellen, PECAM1 für Keimzellen und Gefäßsystem und gespalten Caspase 3 zur Charakterisierung apoptotische Zellen (3 und 4). Sox9, einen Transkriptionsfaktor kodiert, eine wichtige Rolle spielt bei der fetalen Organ Proliferation, Differenzierung und der extrazellulären Matrixbildung. Daher wird in beiden Organen SOX9 als gemeinsamer architektonischen Marker, Sertoli-Zellen in den Hoden Schnüre 14-16 und Verzweigungsstrukturen in der Lunge 17 angeordnet Etiketten genutzt.

Gonaden Kulturen insbesondere recreate in utero Morphogenese effektiv. Die Maus ist an embryonalen Gonade (E) Stadium E10.0 spezifiziert und zunächst morphologisch identisch in XY (männlich) und XX (femALE) Embryonen. Die Expression des Sry (geschlechtsbestimmenden Bereich des Y-Chromosoms) -Gen in XY Gonaden ab E10.5 treibt großen molekularen und morphologischen Veränderungen, die rasch auftreten zwischen E11.5 und E13.5 im fetalen Hoden 19, einschließlich: die Spezifikation Sertoli-Zellen, die tragende Zelllinie der Hoden; die Bildung von Hoden Schnüre, die von Sertoli-Zellen und Keimzellen enthalten sind, und gibt die fetalen Vorläufer Erwachsenen Samenkanälchen; und schwerwiegenden vaskulären Umbau. Bei männlichen spezifische vaskuläre Remodeling, Endothelzellen aus einer Gefäßplexus in den Nachbar Mesonephros veröffentlicht wandern in die Gonaden, einen Hoden spezifische arteriellen Systems 4,20 zu bilden. Immunfluoreszenz-Analysen zeigen gut entwickelte Hoden Kabel Strukturen und Gefäßsystem in E13.5 in utero Hoden in Bezug auf E11.5 Hoden (Abbildung 3). Wie die Bilder in Abbildung 3 zeigen, kann die Tröpfchenkultursystem Hoden Differenzierung ev neuents ex vivo, da es möglich ist, SOX9 positive Sertolizellen in XY Gonaden Formung in Tubulus artige Kabel und Gefäßsystem bilden ganzen Organs zu visualisieren. In Bezug auf die Lungen, 48-Stunden-Kultur zu erhöhter Verzweigung der SOX9 / E-Cadherin doppelt positiven epithelialen Zweige im Laufe von 2 Tagen (Abbildung 4). Darüber hinaus sehen wir ein ähnliches Niveau der Apoptose in Steuer kultiviert und in utero Gonaden, während es eine gewisse Erhöhung der apoptotischen Zellen in der Lunge in den gleichen Kulturbedingungen (3 und 4), was darauf hindeutet, dass die Gonade besonders zugänglich den Kulturbedingungen.

Niedermolekulare Inhibitoren können verwendet werden, um die Organentwicklung durch Einwirkung auf zelluläre Lokalisation, Proliferation und Zellzyklus-Status sowie Organarchitektur und verschiedene Signalkaskaden zu untersuchen. Die ex vivo ganze Organ Tröpfchen Methode erlaubt dem Forscher, pharmakologische Reagenzien leicht an fe verwaltental Organen in einem sehr kleinen Volumen Kulturmedien. Um die Auswirkungen der Vaskularisierung und vaskuläre Umgestaltung auf Testis Differenzierung und Morphogenese zu untersuchen, verwendeten wir den Inhibitormolekül TKI II, ein Reagens, das Testis Gefäßentwicklung 3 stört durch Blockieren der Aktivität von VEGF-Rezeptoren; die Bildung von fötalem testis Architektur erfolgt in einem Gefäßabhängiger Weise durch den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA) 11,12 wirkt. Während Gefäßbildung des Hodens ist entscheidend für die Ausfuhr von Testosteron, die Virilisierung des Embryos treibt, ist es auch ein wichtiger Motor für Hoden Kabel Morphogenese: bisherige Arbeit hat gezeigt, dass, wenn VEGFA Signalisierung wird bei oder vor der E11.5, Sertoli-Zellen blockiert fehlschlagen, um aus den umliegenden interstitiellen Zellen und keine Kabel Strukturen 3,12 partitionieren aus. Die hier gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Auflösung von Gefäßumbau im fötalen Hoden der Tröpfchenkultursystem effektiv und subsequent Fehlern testis Morphogenese (dh abnormale testis Kabel Bildung) visualisiert werden (Abbildung 3). Es sollte beachtet werden, dass PECAM1, ein Marker für Endothelzellen, wird auch von Keimzellen (3) ausgedrückt werden; Diese Keimzellfärbung ist eine interne Kontrolle, die zeigt, dass der Mangel an vaskuläre Färbung in behandelten Keimdrüsen nicht aus technischen Gründen, und zeigt, dass andere Zelltypen wie Keimzellen werden nicht von der Arzneimittelbehandlung beeinflusst auch. Da die meisten anfänglichen Hoden Morphogenese zwischen E11.5 und E13.5 stattfindet, sind diese Phasen das optimale Fenster für die entscheidenden Faktoren, die geschlechtsspezifische Differenzierung der Rolle von VEGF und Gefäßumbau in der Gonade beeinflussen, insbesondere.

Die Verwendung von TKI II während Lungenentwicklung zwischen E11.5 und E13.5 zeigt, dass niedermolekulare Hemmung der Gefäß kann in einem anderen Organ (4) wiedergegeben werden. Dies Ergebnis zeigt die Wirksamkeit von ter ex vivo fetalen Organtröpfchenkultur-Modellsystem und die Fähigkeit, niedermolekulare Inhibitoren verwenden, um zu verändern Signalwege innerhalb von Organen. Angesichts der Leichtigkeit, Flexibilität und Wirksamkeit dieses Protokoll sieht der Tropfenkultur eine geeignete Alternative für experimentelle Fragen betreffend Organentwicklung, die in vivo nicht angesprochen werden können.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schritte in der in vitro ganze Organ Tröpfchenkultur Protokoll. (A) Euthanized schwangere Maus mit geöffneter Bauchhöhle. (B) Uterushorn mit Embryonen umschlossen. (C) Close-up Ansicht der geöffneten Gebärmutterwand mit sichtbaren Embryo enthaltenden Dottersack. (D) Ein einzelner Embryo (E) angebracht ist zur Plazenta (p) im Dottersack (y) eingeschlossen ist. (E) Embryo getrennt f rom Plazenta und Dottersack. (F) seziert Embryo mit inneren Organe entfernt und Urogenitalleiste ausgesetzt (Gonaden innerhalb Urogenitalleiste schwarz umrandet). (G) Close-up der isoliert von Urogenitalleiste (Gonaden-Mesonephros-Komplexe schwarz umrandet). Asterisk bezeichnet dorsalen Aorta in G und H (H) Die Trennung der Gonaden-Mesonephros-Komplex aus Urogenitalleiste (Dissektion von schwarzen gestrichelten Linie dargestellt). g, Gonaden; m, Mesonephros. (I) Aufbau von Tröpfchen Kulturen innerhalb von 35-mm-Kulturschale Deckel. Schwarze Pfeile zeigen auf den Keimdrüsen innerhalb der Tröpfchen. T, behandelt wird; C, Kontrolle. (J) Zwei Tröpfchenkulturschale Deckel in einem offenen Feuchtkammer gestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Entwicklung von ex vivo kultiviert Tröpfchen Organe in Bezug auf in utero Organe Hellfeldbilder:. E11.5 in-utero- entwickelt Organen (Gonaden und Lunge) (erste Spalte); E11.5 Organe nach 24 Stunden (zweite Spalte) und 48 h Tropfenkontrollkultur (dritte Spalte); E11.5 Organe für 48 Stunden mit TKI II VEGFR-Inhibitor (vierte Spalte) kultiviert; und E13.5 in-utero- entwickelten Organen (fünfte Spalte). Gonaden sind mit Gonaden (klare Struktur) über Mesonephros (undurchsichtige Struktur) ausgerichtet ist. E11.5 Gonaden sind Bipotential und scheinen morphologisch identisch in XY (männlich) und XX (weiblich) Proben. Maßstabsbalken, 500 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3 Ex vivo Tropfenkultur Hoden in Gewebearchitektur und Zelltod vergleichbare in-utero- entwickelten Gegenimmunfluoreszenzbilder. E11.5 in-utero -developed fötalen Hoden (erste Spalte); Steuer E11.5 Hoden nach 48 h Kontrolle ex vivo Tröpfchenkultur (zweite Spalte); E11.5 Hoden nach 48 h ex vivo Tröpfchenkultur mit TKI II VEGFR-Inhibitor (dritte Spalte); und E13.5 in-utero- entwickelte Hoden (vierte Spalte). Gestrichelten Linien Gonaden-Mesonephros Grenze (Gonaden wird oben ausgerichtet). SOX9 ist ein Marker von Sertoli-Zellen und wird zur testis Kabel Architektur zu visualisieren; PECAM1 im Keim und vaskulären Endothelzellen (daher restlichen PECAM1 Färbung in behandelten Keimdrüsen fast ausschließlich Keimzellen) ausgedrückt; und cleaved Caspase 3 ist ein Marker von apoptotischen Zellen. Kultivierten Kontroll Gonaden zeigten ähnliche testis Kabel Bildung, Hoden-spezifische Vaskularisierung (Pfeile ganzen Zahl) und Apoptoseniveaus relativ zum in-utero- entwickelt Pendants, während TKI-II-kultivierten Gonaden zeigte gestört Vaskulatur und abnorme testis Kabel Morphogenese. Klammern zeigen Oberflächendomäne Gonade wo Gefäß normalerweise vorhanden ist, aber nicht in den behandelten Proben nachgewiesen. Pfeilspitzen zeigen auf Sterben Gefäßzellklumpen in TKI-II-behandelten Hoden. Maßstabsbalken, 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Andere fetalen Organen (Lunge) ex vivo kultiviert in Tröpfchen sind vergleichbar mit > Ein- utero- ausgebildete Organe Immun Bilder. E11.5 in-utero -developed Lungen (erste Spalte); E11.5 Lunge nach 48 Stunden der Kontrolle ex vivo Tröpfchenkultur (zweite Spalte); E11.5 Lunge nach 48 Stunden von ex vivo Tröpfchenkultur mit TKI II VEGFR-Inhibitor (dritte Spalte); und E13.5 in-utero- entwickelten Lungen (vierte Spalte). SOX9 Etiketten Verzweigungszellen; E-Cadherin-Noten epithelialen röhrenförmige Strukturen; PECAM1 Etiketten vaskulären Endothel; und gespalten Caspase 3 Mark apoptotischen Zellen. Ex-vivo-Steuer kultivierten Organen zeigen ähnliche Architektur und Ausdruck SOX9, E-Cadherin und PECAM1 in kultivierten Organen im Vergleich zu in-utero- entwickelte Organe, aber unterschiedliche Mengen von Zelltod. Bei Behandlung mit TKI II wird Gefäßentwicklung deutlich in der Lunge verringert (wie durch PECAM1 Färbung ergab). Maßstabsbalken, 100 um.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen
Beginnend 94 ° C 2 min 1 Zyklus
Denaturierung 94 ° C 15 sec 35 Zyklen
Glühen 57 ° C 30 sec
Dehnung 72 ° C 30 sec
Ende 72 ° C 5 Min 1 Zyklus

Tabelle 1: XY-PCR-Analyse-Programm Zyklusparameter für "XY (Short)" PCR für XX / XY-Genotypisierung von Embryonen verwendeten Programms..

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Discussion

Diese Studie zeigt eine ex vivo ganze Organ Tröpfchenmethode, die viele mögliche Anwendungen für die Untersuchung der fetalen Entwicklung hat. Diese Technik kann für mehrere Organe der Forscher verwendet werden und erlaubt es, biologischer Fragestellungen, die schwierig zu prüfen unter Verwendung von in vivo-Vorgehensweisen, werden wegen Unzugänglichkeit von Embryonen und Potential embryonaler Letalität adressieren. Diese Kultur-Methode hat zusätzliche Vorteile gegenüber anderen In-vitro-Ansätze wie Säugetier-Zelllinien: ganze Organe verwendet werden, daher Aufrechterhaltung wichtiger interzelluläre Wechselwirkungen, die in utero vorhanden sind; und das Kulturvolumen ist sehr gering (~ 30 & mgr; l), so dass mit sehr geringen Mengen von seltenen oder teuren pharmazeutischen Reagenzien.

Kritische Aspekte der Tröpfchenkultur Protokoll enthalten: a) saubere Präparation der Orgel. Saubere Dissektion ermöglicht Gewebearchitektur beibehalten werden und die Anzahl der freiliegenden Schnitt oder beschädigt sur minimiertFlächen, die in die Kulturschale Oberfläche angezogen werden kann und die Kultur zu stören; b) die richtige Orientierung des Organs innerhalb des Tröpfchens, um Organwachstum und Morphogenese zu ermöglichen; c) dass das Tröpfchen die passende Größe, so dass die Tröpfchen hält die Orgel im Ort durch die Oberflächenspannung, sondern auch trocknet nicht aus; d) mit der korrekten Tröpfchenvolumen für das Organ. Tropfenvolumen sollte empirisch und nach Organgröße bestimmt werden. Allerdings sollte 30 & mgr; ein vernünftiger Ausgangspunkt sein. e) Auswahl eines entsprechenden Entwicklungsstadium, um die biologische interessante Frage anzugehen; und f) die Aufrechterhaltung eines sterilen Kulturumgebung, um eine Kontamination, die das Gewebe innerhalb des Tröpfchens Schäden zu vermeiden.

Dieses Dokument konzentriert sich hauptsächlich auf den E11.5-E13.5 Gonade (dh während der anfänglichen sexuellen Differenzierung), zeigt aber auch, dass dieses Protokoll auf andere Organe angewendet werden. Potenzielle Modifikationen dieses Protokoll für andere Organe umfassen: a) Zur Änderung des Tropfenvolumens für eine bestimmte Organ- und / oder Entwicklungsstadium. Dieses Züchtungsverfahren ist für alle fötalen Stadien der Gonade, jedoch sollte das Volumen für die spätere fötalen Stadien größerer Organe eingestellt werden. Es ist wahrscheinlich, eine Grenze, auf die fetale Stufen für größere Organe verwendet werden, da die einfache Diffusion wird nicht zulassen, Nährstoffe oder Reagenzien, um große Geweben sehr effektiv in späteren Phasen zu durchdringen. Es wird daher empfohlen, diese Kultur für fetale Organe auf einem möglichst frühen Stadium für das Experiment verwendet. b) Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren, Hormone oder andere Faktoren zu den Kulturmedien. Bestimmte Organe kann ein gegebenes Protein oder Hormon erfordern normale Morphogenese unterziehen; daher kann dieses Protokoll durch die Zugabe von solchen Reagenzien zu den Kulturmedien modifiziert werden. c) Einstellen der Länge der Zeit in der Kultur. Während erste Hodenentwicklung kann in weniger als 24 Stunden auftreten, kann andere Organe erfordern längere Zeit in der Kultur. Wenn die Tröpfchensteril gehalten wird, kann das Gewebe zugänglich bis zu 4 oder sogar 5 Tagen in Kultur. Bei längerer Kultur (mehr als 48 Stunden), um Ammoniak zu entfernen oder anderen bebauten Abfälle Nebenprodukte kann es notwendig sein, um die Medien täglich zu aktualisieren (mit zugehörigen Reagenzien) in den Tröpfchen durch Entfernen eines Satzes Volumen des Tröpfchens und ersetzt wird gleiche Volumen durch frisches Medium; für behandelte Tröpfchen sollte frisches Medium die gleiche Konzentration an Wirkstoff / Reagenz nach der Anfangsbehandlung enthalten. d) Verändern der Medienzusammensetzung und / oder assoziierte Reagenzien. Einige Gewebe können mehr oder weniger einer gegebenen pharmazeutischen Reagenz, um eine gewünschte Wirkung hervorzurufen. Es wird empfohlen, eine serielle Verdünnung von Konzentrationen und der Beurteilung Zelltod (via gespaltene Caspase 3-Färbung) versuchen, eine optimale Konzentration, die zu sperren / aktivieren Sie den gewünschten Weg wird aber signifikanten Zelltod in den kultivierten Organe nicht dazu verleiten zu finden. e) die Verwendung von internen Kontrollen. Seit Organen wie der Gonaden kommen in Paaren kann man gonad dienenals ideale interne Kontrolle für die kontralaterale behandelt Gonaden. In anderen Organen wie der Leber nicht in Paaren; wenn der Mausstamm verwendet wird, ist selten und Proben beschränkt ist, ist es möglich, die Orgel in der Hälfte zu sezieren und verwenden Sie jede Hälfte für die Kontrolle und behandelten Proben. Man muss bedenken, dass Organe, auch diejenigen, die in Paaren kann Asymmetrie (wie unterschiedliche Anzahl von Lappen für jede Seite der Lunge) zeigen, so muss man zur Kenntnis, welcher Seite des Organs übernehmen wird zur Steuerung verwendet und Behandlungsproben.

Während Tröpfchen Kulturen potentiell neu praktisch alle Aspekte der in utero Entwicklung, gibt es einige Einschränkungen dieser Technik. Einer ist, dass Tröpfchen Kulturen und Ex-vivo-Kulturverfahren in der Regel dazu führen, konsequent langsamere Wachstumsraten in Bezug auf in utero Entwicklung 1,5; Dies beruht wahrscheinlich auf einer Anzahl von Faktoren, wie beispielsweise niedrigere Konzentrationen der erforderlichen Wachstumsfaktoren in Kulturmedien (und ihreZugriff auf das Gewebe) und begrenzte Gefäßneubildung, die auftritt, ex vivo. Zusätzlich zur Größe des Organs, besteht die Sorge, dass, wenn das Explantat wird nicht richtig ausgerichtet oder das Tröpfchen die falsche Größe kann Gewebemorphologie abgeflachten oder mit einem Mangel an einer Tragstruktur, die von einer Agar-Bett vorgesehen ist verzerrt in anderen Protokollen. Jedoch kann dieses Problem mit Optimierung der Protokollparameter vermieden werden. Eine andere mögliche limitierende Faktor ist, wie gut Medien und Reagenzien können in der gesamten Orgel diffundieren; Während diese kultivierten Geweben Blutgefßen, besteht keine Perfusion von Sauerstoff und Nährstoffen durch diese Gefäße ex vivo aufgrund mangelnder Durchblutung, so dass anstelle Diffusion wird zu einem Faktor. Diese Einschränkung ist besonders offensichtlich in der postnatalen testis Kulturen, in denen ex vivo Spermatogenese ist in der Peripherie des Explantats aber der mittelsten Abschnitt des Gewebes (das heißt, die am weitesten von den Medien) degenera gut aufrechterhaltentes 21-23. Angesichts dieser Beobachtungen scheint es, dass die Größe eine allgemeine Begrenzungsfaktor für ganze Organkultur oder großforma Explantat Protokolle. Jedoch allgemeine morphogenetic Programme, wie Verzweigung Morphogenese in der fetalen Lunge und de novo testis Kabel Bildung im fötalen Gonade in Tröpfchen Kulturen immer noch auftreten. Daher können diese grundlegenden Prozesse weiterhin diesen untersucht werden.

Diese ganze Organ Protokoll wurde zuerst von Maatouk et al. 2, der sie von der vorhergehenden auf Agar-Basis-Kulturverfahren nach Coveney et al angepasst. 4 Der Vorteil des Kultivierens Organe ex vivo durch Tröpfchen statt in Agar Vertiefungen ist, dass es zumin verwendet mindestens eine 10-fache verringert Kulturvolumen und damit die Erhaltung Reagenzien; Darüber hinaus wird die Tröpfchenmethode nicht mit Pre-Inkubation der Agar-Brunnen in Reagenz enthaltenden Medien, was Zeit spart und umgeht Bedenken im Hinblick auf die Effizienz der Reagenzien seiendauf das Gewebe durch Agar livered. Während Agarbasis Verfahren sind allgemein angenommen, getreuer dreidimensionalen Struktur des Gewebes zu erhalten, wird die richtige Ausrichtung der Explantation und Optimierung von Kulturbedingungen (siehe oben) zu gewährleisten normale Morphologie der Tröpfchen-kultivierten Organe.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die ex-vivo kultivierte fötale Tröpfchen Gonaden Ausstellungs Wachstum und Morphogenese vergleichbar mit der in-utero- ausgebildete Organe. Diese Kultur-Technik ist nicht auf die Gonaden beschränkt, sondern kann auch auf andere fötalen Organen wie der Lunge verwendet werden. Diese ex vivo Organtröpfchenmethode nützlich für die Untersuchung der ganzen Organs Signalisierung und organspezifischen zellulären Interaktionen sein, half zum Teil von der Fähigkeit, Bild ganzen Organen nach Kultur und medikamentöse Behandlung. Das hier beschriebene verwendete einen kleinen Molekül-Hemmstoff, um den Einfluss auf die Vaskularisierung Morphogenese untersuchen Studie, aber eine Vielzahl von kommerziell Available pharmakologische Reagenzien verfügbar ist, um eine Vielzahl von Signalwegen und biologische Prozesse zu untersuchen. Daher gibt es viele mögliche Zukunft für diese Tröpfchenkulturverfahren, die es den Forschern ermöglichen interessante und wichtige Fragen in der Entwicklungsbiologie Sonde verwendet.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) Fisherbrand 12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible Sally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps GeneMate T3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L Gilson FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
Fine Scissors FST 91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes Denville C2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes Denville C2176
10 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1121
200 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier Tips Denville P1126
1 ml syringe with 27 gauge needles BD PrecisionGlide 309623
10 ml syringe BD 305559
0.2 μM PES syringe filter VWR 28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm Whatman 1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish Falcon/Corning 353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) VWR 25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator Eppendorf CO14S-120-0000
Biosafety Cabinet Nuare NU-425-400
Mini-centrifuge  Fisher Scientific 05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XL GeneMate R-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel Eppendorf 950040015
SMZ445 stereomicroscope Nikon SMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software Alpha Innotech Corporation Discontinued
Absolute 200 proof Ethanol Fisher BP2818-500
Triton X-100 Fisher BP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 Fisher S374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S671-3
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma M2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C5670-100g
Ambion Nuclease-Free Water Life Technologies AM9938 
XY PCR Primer  IDT N/A
Glacial Acetic Acid Fisher A38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher BP2482-1
1% Ethidium bromide solution Fisher BP1302-10 Toxic
Agarose GeneMate E-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 367176-2.5KG
Trizma Base Sigma T1503-1KG
dNTP Set, 100 mM Solutions Thermo Scientific R0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer Denville CB-4050-3
Paraformaldehyde Fisher O4042-500 Toxic
FluorMount-G Southern Biotech 0100-01
Hydrogen Chloride (HCl) Fisher A144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation Bioexpress 0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered Fisher 03-600-511 Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered Sigma D2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem EMD Millipore 676481
Rabbit Anti-Sox9 Antibody Millipore AB5535 Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody BD Pharmingen 553370 Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody Cell Signaling 9661S Use at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) Life Technologies 13-1900 Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate Invitrogen (Molecular Probes) H1399 Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-165-153 Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 712-605-153 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A31572 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21206 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A21208 Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Life Technologies A31573 Use at dilution: 1:500

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References

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