मानव mesenchymal स्टेम सेल की immunomodulatory गुण (MSCs) का आकलन

1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center
Published 12/24/2015
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Immunology and Infection

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Summary

मानव mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण नैदानिक ​​आवेदन के लिए तेजी से प्रासंगिक दिखाई देते हैं। फ्लोरोसेंट रंजक Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ पूर्व दाग MSCs और परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स के सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम प्रेरक ल्युकोसैट प्रसार और विशिष्ट उप-जनसंख्या पर एमएससी immunomodulation की इन विट्रो मूल्यांकन का वर्णन है।

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Hsu, P. J., Liu, K. J., Chao, Y. Y., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs). J. Vis. Exp. (106), e53265, doi:10.3791/53265 (2015).

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Abstract

Introduction

मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) कुछ extramesodermal प्रजातियों से 5 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, हड्डी, उपास्थि, और वसा ऊतकों 1-4 की paraxial mesodermal प्रजातियों में अंतर कर सकते हैं कि दैहिक पूर्वज हैं। पहले वयस्क अस्थि मज्जा से अलग, इन multilineage पूर्वज अब नैदानिक ​​आवेदन 9-12 के लिए अत्यधिक उत्तरदायी दिखाई देते हैं कि मजबूत इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण है दिखाया, अप्रत्याशित रूप से, कई ऊतकों 6-8 में पाया गया है। Immunomodulatory प्रभाव में शामिल विस्तृत तंत्र को सक्रिय रूप से विशेष बीमारी संस्थाओं पर प्रभावी आवेदन के लिए जांच की जा रही है। Immunomodulation मूल्यांकन करने के लिए सबसे सरल तरीकों में से एक प्रेरक ल्युकोसैट प्रसार 13 के दमन के लिए आकलन कर रहा है। उत्तेजित या सक्रिय जब इस तरह के टी lymphocytes और monocytes के रूप में सबसे प्रेरक ल्यूकोसाइट्स अनोखे ढंग से पैदा करना। Immunomodulatory समारोह का आकलन किया जा सकता है जब के दमनप्रसार इसका सबूत है।

परंपरागत रूप से, प्रेरक ल्युकोसैट प्रसार डीएनए में [3 एच] thymidine निगमन का पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन किया गया है। हालांकि, इस पद्धति की वजह से विकिरण और बाद के उपयोग के निपटान की चिंताओं के महत्वपूर्ण कमियां हैं, साथ ही जरूरत जटिल उपकरण है। सेल प्रसार का आकलन करने के लिए गैर रेडियोधर्मी assays के देखते हैं, वहीं Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) परख ऐसे अनेक प्रकार की कोशिकाओं को शामिल सह संस्कृति प्रयोगों में विशेष रूप से उपयोगी है, जो विशिष्ट सेलुलर आबादी, की पहचान के लिए अनुमति के रूप में अन्य लाभ हैं। CFSE प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो एक फ्लोरोसेंट सेलुलर डाई है। कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, इस सेलुलर लेबल की तीव्रता आनुपातिक रूप से कमी आई है; यह न केवल समग्र सेल प्रसार के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन यह भी प्रतिदीप्ति det करने के लिए मुश्किल हो जाता है इससे पहले 8 डिवीजनों अप करने के लिए कोशिका विभाजन की संख्या पर मूल्यांकन के लिए अनुमति देता हैect के पृष्ठभूमि संकेत के खिलाफ। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट CFSE की स्थिरता कोशिकाओं कई महीनों से 14 तक देखे जा सकते हैं कि इस तरह के लेबल की कोशिकाओं के vivo नज़र रखने के लिए अनुमति देता है।

यह परख भी प्रेरक ल्यूकोसाइट्स या की विशिष्ट आबादी के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी समारोह के विशिष्ट प्रकार के मूल्यांकन करने के लिए अलग किया जा सकता का चुंबकीय मनका सतह मार्कर चयन प्रदर्शन से इम्यूनोमॉड्यूलेटरी ल्यूकोसाइट्स-तरह के इंटरल्यूकिन 10 (आईएल -10) का निर्माण CD14 + monocytes 15 के रूप में एमएससी प्रेरित पहले या उचित रूप में सह संस्कृति बाद ब्याज की सेल आबादी। हमारी प्रोटोकॉल (प्रवाह चार्ट से पता चला (प्रवाह चार्ट चित्र 1 में दिखाया गया है) प्रेरक ल्यूकोसाइट्स पर MSCS की immunomodulatory प्रभाव का आकलन करने के बुनियादी परख और अल्लोजीनिक सीडी 4 + प्रेरक टी lymphocytes पर एमएससी प्रेरित ल्युकोसैट immunomodulation के मूल्यांकन के लिए इस बुनियादी परख पर एक बदलाव का वर्णन चित्रा 4 में)।

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Protocol

संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित के रूप में रोगी सूचित सहमति मानव कोशिकाओं के उपयोग के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए।

मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear 1. घनत्व ढाल अलगाव (PBMCs)

  1. एक 25 मिलीलीटर पिपेट द्वारा एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पूरे रक्त heparinized 25 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 25 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं पतला।
  2. एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में है Ficoll Paque घनत्व ढाल के 15 मिलीलीटर जोड़ें, और ट्यूब झुकने जबकि पूरे रक्त का कोई मिश्रण के साथ इतना है कि वहाँ बहुत धीरे धीरे और सावधानी से घनत्व ढाल से ज्यादा पतला सेल निलंबन के 25 एमएल में जोड़ने घनत्व ढाल, अर्थात्।, रक्त-घनत्व ढाल इंटरफ़ेस का कोई अशांति।
  3. अपकेंद्रित्र 20 डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के बिना 30 एक तापमान नियंत्रित झूल बाल्टी रोटर में से 40 मिनट के लिए 400 × छ पर 1.2 कदम से निलंबन।
    नोट: तीन अलग परतों centrifugation के बाद स्पष्ट हो जाना चाहिए: गुई ऊपरी परत से किया जा रहा प्लाज्मा; नीचे स्पष्ट परत है Ficoll Paque घनत्व ढाल जा रहा है; और एक पतली, मध्य सेलुलर परत PBMCs किया जा रहा है
  4. महाप्राण और मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (यानी, लिम्फोसाइटों, monocytes, और प्लेटलेट्स) की अंतरावस्था परत को परेशान करने के लिए नहीं देखभाल के साथ, एक पाश्चर विंदुक के साथ सक्शन द्वारा ऊपरी परत त्यागें।
  5. ध्यान से एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ इस मोनोन्यूक्लियर सेल परत लीजिए।
  6. पीबीएस के 20 मिलीलीटर के साथ ट्यूब भरने मिश्रण अच्छी तरह से, और 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 × छ पर अपकेंद्रित्र। Centrifugation के बाद पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  7. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए 200 × छ पर सेल पीबीएस के 20 मिलीलीटर में गोली और सेंट्रीफ्यूज Resuspend। Centrifugation के बाद पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    नोट: यह कदम प्लेटलेट्स-जो अवांछित-भीतर PBMCs हैं निकालता है; इस कदम के प्लेटलेट्स की पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए दोहराया जा सकता है।
  8. विशिष्ट आबादी का कोई चयन हैएक कोशिका गिनती 16 के प्रदर्शन के बाद संवर्धन के लिए वांछित है, ल्युकोसैट पूरा मध्यम में resuspend सेल गोली (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% एल glutamine, और 1% पेनिसिलिन / RPMI 1640 मध्यम में स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 1 मिलीलीटर निलंबित करने के लिए अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 10 7 PBMCs प्रति मध्यम।

ल्युकोसैट आबादी के 2. चुंबकीय लेबलिंग (विशिष्ट आबादी का कोई चयन आवश्यक है, तो चार कदम को छोड़)

  1. पूरी तरह से 10 मिनट और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला के लिए 300 × छ पर अपकेंद्रित्र PBMC निलंबन।
  2. 10 7 कुल कोशिकाओं प्रति पीबीएस के 80 μl में Resuspend सेल गोली।
  3. 10 7 कुल कोशिकाओं प्रति (टी lymphocytes के अलगाव के लिए monocytes, सीडी 4 चुंबकीय मोतियों के अलगाव के लिए यानी, CD14 चुंबकीय मोती) निर्दिष्ट चुंबकीय मोतियों की 20 μl जोड़ें।
  4. अच्छी तरह मिक्स और फ्रिज में 8 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. धोने के लिए 10 7 कोशिकाओं प्रति पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें, और सेंट्रीफ्यूज10 मिनट के लिए 300 × छ पर।
  6. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से और पीबीएस के 500 μl में 10 8 कोशिकाओं को resuspend।

ल्युकोसैट उप-जनसंख्या का 3. चुंबकीय चयन

नोट: चुंबकीय मनका विभाजक और स्तंभों की एक किस्म के निर्माताओं में से एक नंबर से कोशिका की सतह मार्कर द्वारा ल्यूकोसाइट्स की विशिष्ट आबादी के अलगाव के लिए उपलब्ध हैं। अलगाव एक या कुछ सकारात्मक मार्करों पर या अवांछित आबादी की कमी के बाद नकारात्मक सेलेक्शन आधारित सकारात्मक सेलेक्शन हो सकता है। (यानी, monocytes के लिए सीडी 4 टी सहायक लिम्फोसाइटों के लिए, या CD14) एक मार्कर का उपयोग सकारात्मक चयन के प्रदर्शन का एक सामान्य दृष्टिकोण से नीचे उल्लिखित है।

  1. तैयार है और प्रधानमंत्री चुंबकीय विभाजक निर्माता के निर्देशों के अनुसार जुदाई स्तंभ भी शामिल है।
  2. लेबल PBMCs का नमूना युक्त ट्यूब को लागू करें। सकारात्मक लेबल और unlabel के संग्रह के लिए दो 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रदान करेंनिर्माता के निर्देशों का पालन एड सेल भिन्न,।
  3. 10 7 कोशिकाओं प्रति के माध्यम से 1 मिलीलीटर का उपयोग कर, सेल नंबर 15 की गिनती और ल्युकोसैट पूरा मध्यम में सकारात्मक चयनित ल्यूकोसाइट्स (यानी, सीडी 4+ टी lymphocytes या CD14 + कोशिकाओं) resuspend।

प्रसार के आकलन के लिए leukocytes की 4. CFSE धुंधला

नोट: CFSE व्यापक रूप से vivo में इन विट्रो अध्ययन में दोनों के लिए, रोग प्रतिरोधक जांच में इस्तेमाल किया गया है। हमारी प्रोटोकॉल एमएससी / PBMC (या अन्य ल्युकोसैट) बातचीत की इन विट्रो अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया है। CFSE इन विट्रो लेबलिंग के संचालन में शामिल सामान्य चरण समान हैं, प्रोटोकॉल 14 के विशिष्ट खुराक और समय में मतभेद हो सकता है। इस कारण कारकों की एक संख्या है, यानी, इस्तेमाल विशेष सेल प्रकार, सेल नंबर करने के लिए हो सकता है इस्तेमाल किया-जो संभावना CFSE फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं।

10 माइक्रोन (CFSE-काम समाधान) के वांछित काम कर एकाग्रता के लिए पीबीएस में CFSE शेयर समाधान (10 मिमी) पतला। CFSE-काम समाधान के साथ लेबलिंग के लिए 10 7 कोशिकाओं (यानी, PBMCs या टी कोशिकाओं) तैयार करें।
  • 10 मिनट के लिए 300 × छ पर अपकेंद्रित्र एक सेल गोली प्राप्त करने और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करने के लिए।
  • धीरे पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) CFSE-काम समाधान के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं।
  • अतिरिक्त CFSE को धोने के लिए, precooled (4 डिग्री सेल्सियस) RPMI मध्यम 10% FBS युक्त (मात्रा से) 10x के साथ सेल निलंबन पतला। 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं तलछट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। दो बार से अधिक इस तरह से सेल गोली धो लें।
  • Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को फिर से गोली और सेल नंबर 15 गिनती। 1 मिलीलीटर ताजा prewarmed ल्युकोसैट पूरा मध्यम में 10 7 कोशिकाओं (PBMCs या टी कोशिकाओं या तो) Resuspend।
  • एम 5. सह संस्कृतिLeukocytes और leukocytes की सक्रियता के साथ अनुसूचित जाति

    1. कोई 30 से अधिक मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म एमएससी पूरा मध्यम (इष्टतम एमएससी विकास के लिए pretested 10% FBS (), 1% एल glutamine, और 1% पेनिसिलिन / DMEM-कम ग्लूकोज माध्यम में स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
    2. 24 अच्छी तरह प्लेटें में एमएससी पूरा माध्यम के 1 मिलीलीटर में 50,000 कोशिकाओं (एमएससी घनत्व: 25,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) पर बीज MSCs एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लगाव हे / N के लिए, स्टेम कोशिकाओं की अनुमति के लिए 80% संगम तक पहुँचने के लिए।
    3. वरीय एमएससी संख्या के आधार पर महाप्राण माध्यम है, और, CFSE लेबल PBMCs जोड़ने (पहले लेबल-कृपया ऊपर प्रोटोकॉल चरण 4 को देखें) एक पर ल्युकोसैट पूरा माध्यम से 1 मिलीलीटर में (24 अच्छी तरह प्लेटें में पिछले दिन वरीयता प्राप्त) सुसंस्कृत MSCs के लिए 01:10 (सेल अनुपात) PBMCs को MSCS की सह संस्कृति अनुपात।
    4. 1 मिलीलीटर ल्युकोसैट पूरा मध्यम की कुल मात्रा में 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए, माइटोजन phytohemagglutinin (पीएचए), एक गैर विशिष्ट ल्युकोसैट उत्प्रेरक जोड़ें प्रति अच्छी तरह से।
      1. ALTERNATIVइली, विशेष रूप से टी lymphocytes के क्रियान्वयन के लिए प्रोत्साहित करने के लिए: α-CD3 / 28 microbeads का उपयोग करें और एक का मनका-टू-टी लिम्फोसाइट अनुपात प्राप्त करने के लिए दो-सेल सह संस्कृति को जोड़ने के लिए: 1।
    5. 500,000 PBMCs / अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण, प्लेट (; सेल घनत्व या एक विशिष्ट प्रेरक ल्युकोसैट जनसंख्या: 250000 ल्यूकोसाइट्स / 2 सेमी) के लिए केवल 1 मिलीलीटर ल्युकोसैट पूरा मध्यम के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में; सकारात्मक नियंत्रण के लिए, इसके अलावा में, अच्छी तरह से PBMCs / की एक ही नंबर चढ़ाना के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीएचए जोड़ें।
    6. 3 और सह संस्कृति प्रयोग के 5 वें दिन, fluorescein के लिए उचित 488 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर के साथ प्रवाह cytometric विश्लेषण 17 से CFSE लेबल ल्यूकोसाइट्स के प्रसार (दौर नीचे ट्यूब में रखा) का आकलन करें।
      नोट: प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए intracellular साइटोकाइन धुंधला भी मो रूप ल्युकोसैट साइटोकाइन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में परिवर्तन के लिए आकलन करने के लिए इस बिंदु पर इन CFSE लेबल ल्यूकोसाइट्स करने के लिए किया जा सकता हैMSCs द्वारा dulated। CFSE fluorescein के लिए एक फिल्टर उचित साथ मूल्यांकन किया जाता है के बाद से, एंटीबॉडी के विभिन्न साइटोकिन्स fluorescein या इसी तरह के स्पेक्ट्रम के अलावा अन्य fluorochromes संयुग्मित करने की आवश्यकता का आकलन करने के लिए चुना है (यानी, phycoerythrin, क्लोरोफिल प्रोटीन परिसर (PerCP) peridinin)।

    6. रूपांतर: प्रेरक दमन परख चुंबकीय सक्रिय CFSE लेबल प्रेरक सीडी 4+ टी कोशिकाओं पर immunomodulatory Leukocytes एमएससी प्रेरित, मनका-चयनित

    1. 6 अच्छी तरह प्लेटें में एमएससी पूरा मध्यम के 3 मिलीलीटर में 250,000 कोशिकाओं (एमएससी घनत्व: 25,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) पर बीज MSCs एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लगाव हे / N के लिए, स्टेम कोशिकाओं की अनुमति के लिए 80% संगम तक पहुँचने के लिए। कम से कम 3 से 6 अच्छी तरह प्लेटें उप-जनसंख्या के चयन के लिए पर्याप्त एमएससी cocultured PBMCs सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं।
    2. महाप्राण मध्यम, और चरण 1 के अनुसार, लेकिन अच्छी तरह / (सेल घनत्व 2.5 x 10 6 कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह प्लेटें में अलग PBMCs जोड़ें: 250,000 Leल्युकोसैट पूरा मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ ukocytes / 2 सेमी)। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 48-72 घंटे के लिए सह संस्कृति।
    3. चुंबकीय धारा 2-3 के अनुसार एमएससी प्रेरित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी ल्यूकोसाइट्स (यानी, CD14 + कोशिकाओं) की विशेष आबादी मनका का चयन करें।
      नोट: प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए intracellular साइटोकाइन धुंधला ल्युकोसैट साइटोकाइन अभिव्यक्ति प्रोफाइल, यानी, की अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए आकलन करने के लिए इस बिंदु पर किया जा सकता है इंटरल्यूकिन-10-के रूप में MSCs द्वारा संग्राहक।
    4. में 24 अच्छी तरह प्लेटें में धारा 2-4 के अनुसार उत्पन्न अल्लोजीनिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं CFSE लेबल जोड़ें 1 ल्युकोसैट पूरा मध्यम (टी सेल घनत्व: 250,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) के मिलीलीटर विभिन्न अनुपात में मनका चयनित एमएससी प्रेरित ल्यूकोसाइट्स के लिए , यानी, 1:10, 1: 5: 1, 2, और 1: 1 अनुपात (सेल करने के लिए सेल)।
    5. सीडी 4+ टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, 1 का मनका करने वाली कोशिका अनुपात प्राप्त करने के लिए α-CD3 / 28 संयुग्मित microbeads जोड़ें: 1।
    6. एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, 5 थाली00,000 सीडी 4+ टी कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली (टी सेल घनत्व: 250,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) में केवल 1 मिलीलीटर ल्युकोसैट पूरा मध्यम के साथ; सकारात्मक नियंत्रण के लिए, इसके अलावा में 1 का मनका करने वाली कोशिका अनुपात प्राप्त करने के लिए α-CD3 / 28 संयुग्मित microbeads जोड़ने के लिए, अच्छी तरह / सीडी 4+ टी कोशिकाओं की संख्या में एक ही चढ़ाना के लिए: 1।
    7. सह संस्कृति के 3 दिन, fluorescein के लिए उचित 488 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर के साथ प्रवाह cytometric विश्लेषण 16 द्वारा (दौर नीचे ट्यूब में रखा) CFSE लेबल सीडी 4+ टी कोशिकाओं के प्रसार का आकलन करें।

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    Representative Results

    चित्रा 1 प्रयोग के समग्र स्कीमा अर्थ है, और चित्रा 2 चरण विपरीत उल्टे माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना के रूप में विभिन्न सेल संस्कृति शर्तों की उपस्थिति को दर्शाता है। PBMCs और ल्यूकोसाइट्स छोटे गोल गैर पक्षपाती कोशिकाओं रहे हैं जबकि MSCs, एक fibroblastic, धुरी के आकार आकृति विज्ञान के साथ पक्षपाती कोशिकाओं रहे हैं। इन दो आकृति विज्ञान के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं स्पष्ट रूप से सह-संस्कृति में देखा जा सकता है। परख के अंत में, PBMCs (या leuckotyes) प्रवाह cytometric के लिए aspirated कर रहे हैं जब पक्षपाती MSCs अनजाने का आकलन करने के साथ कोई समस्या नहीं होनी चाहिए, (कारण गरीब लगाव या जोरदार आकांक्षा द्वारा dislodgement करने के लिए, यानी) शामिल किए गए हैं, भले ही विश्लेषण करती है इन कोशिकाओं के बाद से PBMC / ल्युकोसैट अंश CFSE के साथ चिह्नित किया जाएगा। कोई प्रसार होता है, CFSE लेबल की कोशिकाओं के लिए हिस्टोग्राम परिणाम एक बेहद सकारात्मक और तेज शिखर के रूप में देखा जाता है; सक्रियण आयी हुई है हालांकि, जब प्रसार प्रकट ख के रूप में स्पष्ट हो जाएगाएक नुकसान और प्रतिदीप्ति तीव्रता के बाईं पारी (चित्रा 3) के साथ वाई कई छोटे चोटियों। प्रसार का दमन हुआ है जब सही के तीखेपन में सही और बढ़ जाती है चोटियों के स्थानांतरण द्वारा सबूत के रूप में, यानी।, MSCS की सह-संस्कृति के साथ, कई छोटे चोटियों फ्लोरोसेंट तीव्रता का एक सहवर्ती वृद्धि के साथ कम हो जाएगा । सक्रिय allogenic प्रेरक सीडी 4+ टी कोशिकाओं पर एमएससी प्रेरित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी ल्यूकोसाइट्स की प्रेरक दमन का आकलन: गैर विभाजित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व सबसे ऊंची चोटी 4 चित्रा प्रयोग से एक भिन्नता का समग्र स्कीमा को दर्शाता है। प्रयोग पर एक बदलाव के रूप में इस तरह के परिणामों के प्रसार को देखा (चित्रा 5) की खुराक पर निर्भर दमन की अतिरिक्त जानकारी के साथ, मूल परख के समान हैं।

    आकृति 1
    अल्लोजीनिक प्रेरक ल्यूकोसाइट्स पर mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) की immunomodulatory प्रभाव के आकलन के लिए चित्रा 1 फ्लो चार्ट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    MSCs, ल्यूकोसाइट्स, और दो ​​सेल आबादी के सह संस्कृति की चित्रा 2. सेल आकृति विज्ञान। MSCs या ल्यूकोसाइट्स की एकल कोशिका संस्कृति के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी तस्वीरें, और एमएससी-ल्युकोसैट सह संस्कृति। स्केल बार, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    आकृति ल्यूकोसाइट्स proliferating पर 3. एमएससी दमनकारी प्रभाव। Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर की cytometric हिस्टोग्राम (CFSE) -labeled ल्युकोसैट प्रसार (ए) MSCs साथ सुसंस्कृत अकेले unstimulated, (बी) के सह-संस्कृति, विरोधी CD3 / CD28 microbead साथ सुसंस्कृत (सी) प्रवाह उत्तेजना (α-CD3 / CD28) अकेले, (डी) और MSCs साथ। Histograms में दिखाया प्रतिशत proliferating ल्यूकोसाइट्स के अनुपात में निरूपित करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    अल्लोजीनिक सीडी 4 + प्रेरक टी lymphocytes पर एमएससी प्रेरित ल्युकोसैट immunomodulation के आकलन के लिए चित्रा 4. फ्लो चार्ट।/ 53,265 / 53265fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "अपलोड> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    सीडी 4 लिम्फोसाइट proliferating पर एमएससी-सह-सुसंस्कृत CD14 monocytes की चित्रा 5. दमनकारी क्षमता। भूखंड तितर बितर और विरोधी CD3 / CD28 microbead पर एमएससी-सह-सुसंस्कृत CD14 + monocytes (एम-CD14 +) के दमनकारी क्षमता की cytometric हिस्टोग्राम प्रवाह -stimulated, CFSE लेबल सीडी 4 + प्रेरक टी lymphocytes (एस सीडी 4 +)। एम CD14 + करने के लिए एस-सीडी 4+ के सह संस्कृति अनुपात दिखाया गया है। सीडी 4+ टी लिम्फोसाइटों (आर 1) gated और CFSE तीव्रता के लिए मूल्यांकन किया गया। Histograms में दिखाया प्रतिशत सीडी 4+ टी कोशिकाओं proliferating के अनुपात में निरूपित। वें में से एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 71-7167-00 AG Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
    Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) Life Technologies V12883 Cellular label for detection of cell division
    Phytoagglutinin (PHA) Sigma L8902 Activation of human PBMCs
    Dynabeads Human T-Activator CD3/28 Life Technologies 111.32D Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
    autoMACS™ Separator Miltenyi Biotec autoMACS™ Separator Magnetic based cell separator
    autoMACS® Columns Miltenyi Biotec 130-021-101 separation columns
    CD14 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-050-201 For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
    CD4 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-045-101 For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
    RPMI 1640 Medium Life Technologies 11875 Human PBMC/leukocyte culture medium
    DMEM, Low glucose, pyruvate Life Technologies 11885 Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
    L-glutamine Life Technologies 25030-081 Supplementation for MSC complete medium
    Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
    Fetal bovine serum (FBS) 1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) 1) SH30070.03M 2) 10091-148 Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
    24-well cell culture plate Corning COR3524 Co-culture plate
    50 ml centrifuge tube Corning 430291 Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
    15 ml centrifuge tube  Corning 430766 Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
    Round-bottom tubes BD Falcon  352008 Collection of cells for flow cytometric analysis

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    References

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    2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
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