Beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC)

1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center
Published 12/24/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

De immuunmodulerende eigenschappen van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) lijken steeds belangrijker voor klinische toepassing. Het gebruik van een co-kweeksysteem van MSCs en perifeer bloed leukocyten vooraf gekleurd met de fluorescerende kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE), beschrijven we de in vitro beoordeling van MSC immunomodulatie bij effector leukocyt proliferatie en specifieke subpopulaties.

Cite this Article

Copy Citation

Hsu, P. J., Liu, K. J., Chao, Y. Y., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs). J. Vis. Exp. (106), e53265, doi:10.3791/53265 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn somatische voorlopers die kunnen differentiëren tot het paraxiale mesodermale lineages bot, kraakbeen en vetweefsel 1-4, alsmede enkele extramesodermal lineages 5. Eerst geïsoleerd uit volwassen beenmerg, zijn deze multilineage progenitors nu gevonden in talrijke weefsels 6-8 en onverwachts aangetoond sterke immunomodulerende eigenschappen die zeer ontvankelijk zijn voor klinische toepassing 12/09 weergegeven zijn. Gedetailleerde mechanismen betrokken bij de immunomodulerende effecten actief onderzocht voor effectieve uitvoering op bepaalde ziektebeelden. Een van de eenvoudigste manieren om immunomodulatie te beoordelen is door beoordeling van de onderdrukking van effector leukocyt proliferatie 13. De meeste effector leukocyten zoals T-lymfocyten en monocyten prolifereren prodigiously wanneer gestimuleerd of geactiveerd. Immunomodulerende functie kan worden beoordeeld bij de onderdrukking vanproliferatie blijkt.

Traditioneel is effector leukocyt proliferatie geëvalueerd door detectie van [3 H] thymidine incorporatie in DNA. Deze methode heeft belangrijke nadelen vanwege de zorgen van bestraling en na gebruik verwijdering, en de complexe apparatuur nodig. Hoewel er niet-radioactieve assays celproliferatie te beoordelen, de succinimidyl ester carboxyfluoresceïne (CFSE) test heeft andere voordelen zoals ter identificatie van specifieke cellulaire populaties, wat vooral nuttig in co-kweek-experimenten waarbij meerdere celtypen. CFSE is een fluorescente kleurstof die cellen kan worden bepaald door flow cytometrische analyse. Als cellen delen, wordt de intensiteit van de cellulaire label proportioneel verminderd; Dit maakt niet alleen de bepaling van de totale celproliferatie maar ook zorgt voor de beoordeling van het aantal celdelingen tot 8 divisies voordat de fluorescentie wordt het moeilijk om detect tegen achtergrond signaal. Bovendien is de stabiliteit van de fluorescerende CFSE maakt in vivo volgen van gemerkte cellen, die cellen kunnen worden gevisualiseerd vele maanden 14.

Deze test kan ook worden gevarieerd om bepaalde soorten effector leukocyten of immunomodulerende functie van specifieke populaties van evaluatie MSC-geïnduceerde immunomodulerende leukocyten-zoals interleukine-10 (IL-10) producerende CD14 + monocyten 15 door het uitvoeren van magnetische korrels oppervlaktemerker winkelwagentje celpopulaties van belang voor of na co-cultuur geschikt. Ons protocol beschrijft de basis assay beoordeling van de immunomodulerende effecten van MSCs voor effector leukocyten (stroomdiagram getoond in figuur 1) en een variatie op deze basis assay voor evaluatie van MSC-geïnduceerde leukocyt immunomodulatie bij allogene CD4 + effector T lymfocyten (getoonde stroomschema in figuur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Patiënt geïnformeerde toestemming zoals goedgekeurd door de institutionele review board moet worden verkregen voor het gebruik van menselijke cellen.

1. dichtheidsgradiënt Isolatie van humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)

  1. Voeg 25 ml gehepariniseerd bloed in een 50 ml buisje met een pipet 25 ml.
    1. Verdun cellen met 25 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Voeg 15 ml Ficoll-Paque density in een nieuwe 50 ml buis en terwijl het kantelen van de buis langzaam en voeg voorzichtig in 25 ml van de verdunde celsuspensie via dichtheidsgradiënt zodat er geen menging van het volbloed met de dichtheidsgradiënt, dwz., een verstoring van de bloed-dichtheidsgradiënt interface.
  3. Centrifugeer de suspensie van stap 1,2 bij 400 xg gedurende 30 tot 40 minuten in een temperatuurgecontroleerde swinging-bucket rotor zonder rem bij 20 ° C.
    Opmerking: Drie verschillende lagen moet duidelijk zijn na centrifugeren: the bovenlaag wezen plasma; de onderste duidelijke laag die de Ficoll-Paque dichtheid; en een dunne, midden cellaag zijnde de PBMCs
  4. Zuig en gooi de bovenlaag door afzuigen met een Pasteur pipet voorzichtig de interfase laag van mononucleaire cellen (bijvoorbeeld lymfocyten, monocyten en bloedplaatjes) niet te verstoren.
  5. Verzamel zorgvuldig deze mononucleaire cellaag met een pipet 10 ml van een nieuwe 50 ml centrifugebuis.
  6. De buis met 20 ml PBS, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant volledig na centrifugeren.
  7. Resuspendeer de celpellet in 20 ml PBS en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10-15 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant volledig na centrifugeren.
    Opmerking: Deze stap verwijdert de plaatjes-die ongewenste-binnen de PBMC zijn; Deze stap kan worden herhaald om volledige verwijdering van de bloedplaatjes te waarborgen.
  8. Als er geen selectie van specifieke bevolkingsgroepen isgewenst hersuspenderen celpellet in leukocyten volledig medium (10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine in RPMI-1640 medium) te kweken na het uitvoeren van een aantal cellen 16 om 1 ml slaapstandmethoden gemiddeld per 10 7 PBMCs alvorens naar de volgende stap.

2. Magnetische Labeling van Leukocyte populaties (Ga naar stap 4 als er geen selectie van specifieke populaties is vereist)

  1. Centrifugeer PBMC suspensie bij 300 x g gedurende 10 min en zuig supernatant volledig.
  2. Resuspendeer de cel pellet in 80 ul PBS per 10 7 totale cellen.
  3. Voeg 20 ul van gespecificeerde magnetische korrels (dat wil zeggen, CD14 magnetische korrels voor isolatie van monocyten, CD4 magnetische korrels voor isolatie van T-lymfocyten) per 10 7 totale cellen.
  4. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 2 tot 8 ° C in de koelkast.
  5. Voeg 1-2 ml PBS per 10 7 cellen te wassen, en centrifugeerbij 300 xg gedurende 10 min.
  6. Zuig supernatant en resuspendeer helemaal tot 10 8 cellen in 500 pl PBS.

3. Magnetische Selectie van leukocytsubpopulaties

Opmerking: Een verscheidenheid van magnetische bead scheiders en kolommen zijn voor isolatie van specifieke populatie van leukocyten door celoppervlaktemarker van een aantal fabrikanten. Isolatie kan worden door positieve selectie op basis van één of enkele positieve markeringen of negatieve selectie na uitputting van ongewenste populaties. Een algemene benadering van het uitvoeren van positieve selectie met behulp van een marker (dwz CD4 voor T-helper lymfocyten of CD14 voor monocyten) wordt hieronder uiteengezet.

  1. Bereiden en prime magnetische separator waaronder separatiekolom volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Breng buis met het monster gelabeld PBMCs. Bieden twee 15 ml centrifugebuizen voor het verzamelen van de positief gelabeld en unlabeled celfracties, volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Celgetal nummer 15 en resuspendeer de positief geselecteerde leukocyten (dwz CD4 + T-lymfocyten of CD14 + cellen) in leukocyten compleet medium, met behulp van 1 ml medium per 10 7 cellen.

4. CFSE kleuring leukocyten voor de Beoordeling van proliferatie

Opmerking: CFSE is op grote schaal gebruikt in immunologische onderzoeken, zowel in vivo als in vitro studies. Ons protocol is geoptimaliseerd voor in vitro onderzoek van MSC / PBMC (of andere leukocyt) interacties. De algemene stappen voor het uitvoeren van CFSE in vitro labeling vergelijkbaar zijn, kunnen er verschillen in specifieke dosering en tijdstip van het protocol 14. Dit kan te wijten zijn aan een aantal factoren, dat wil zeggen, de specifieke gebruikte celtype, celaantallen tweedehands die waarschijnlijk invloed hebben op de intensiteit van CFSE fluorescentiesignaal.

Verdun de CFSE voorraadoplossing (10 mM) in PBS met de gewenste werkconcentratie van 10 pM (CFSE-werkoplossing). Bereid 10 7 cellen (dwz PBMC of T-cellen) voor de etikettering met de CFSE-werkende oplossing.
  • Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min om een ​​celpellet te verkrijgen en zuig de supernatant.
  • Resuspendeer de cellen in 1 ml voorverwarmde (37 ° C) CFSE-werkende oplossing zachtjes en incubeer de cellen gedurende 10 min bij 37 ° C.
  • Te wassen overtollige CFSE Verdun de celsuspensie met 10x (vol) van tevoren gekoeld (4 ° C) RPMI medium met 10% FBS. Sediment de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Was de celpellet op deze wijze tweemaal.
  • Re-pellet de cellen door centrifugeren en tel het aantal cellen 15. Resuspendeer 10 7 cellen (PBMC ofwel of T-cellen) in 1 ml vers voorverwarmd leukocyten volledig medium.
  • 5. Co-cultuur van MSC's met leukocyten en activering van leukocyten

    1. Pre-warm MSC compleet medium (10% FBS (gepretest voor een optimale groei MSC), 1% L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine in DMEM laag-glucose medium) tot 37 ° C gedurende maximaal 30 min.
    2. Seed MSCs bij 50.000 cellen in 1 ml van MSC compleet medium in 24-wells platen (MSC dichtheid: 25.000 cellen / cm2) voor bevestiging O / N in een 37 ° C incubator, waardoor de stamcellen tot 80% confluentie bereiken.
    3. Zuig medium, en op basis van geënte MSC nummers toevoegen CFSE-gelabelde PBMCs (voorheen gemerkte zie protocol stap 4 hierboven) gekweekte MSC's (gezaaid gisteren in 24-well platen) in 1 ml van leukocyten compleet medium bij een 01:10 (cel ratio) co-cultuur verhouding van MSC's te PBMCs.
    4. Voeg het mitogeen fytohemagglutinine (PHA), een niet-specifieke leukocyt activator, tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml in een totaalvolume van 1 ml leukocyt compleet medium per putje.
      1. AlternativEly, te stimuleren voor de activering van T-lymfocyten specifiek: Gebruik α-CD3 / 28 microbolletjes en aan de twee-cel co-kweken van een hiel-tot-T-lymfocyt-verhouding van 1 te verkrijgen: 1.
    5. Voor de negatieve controle, plaat 500.000 PBMC / goed (of een specifieke effector leukocyten bevolking; celdichtheid: 250.000 leukocyten / cm2) in een 24-well plaat met 1 ml leukocyten compleet enige medium; positieve controle, naast hetzelfde aantal PBMCs / plating goed, voegen PHA tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml.
    6. Op 3 en 5 dagen van co-kweek experiment evalueren proliferatie van CFSE-gelabelde leukocyten (geplaatst in ronde bodem tubes) door flow cytometrische analyse 17 met 488 nm excitatie en emissiefilters geschikt voor fluoresceïne.
      Opmerking: Intracellulaire cytokine kleuring voor flowcytometrische analyse kan worden uitgevoerd om deze CFSE-gelabelde leukocyten op dit punt te gaan op veranderingen in leukocyten cytokine expressieprofiel als modulated door MSC. Omdat CFSE wordt geëvalueerd met een filter geschikt voor fluoresceïne, gekozen antilichamen te beoordelen verschillende cytokinen moeten worden geconjugeerd aan andere dan fluoresceïne of soortgelijke spectrum fluorochromen (dwz, fycoerythrine, peridinin chlorofyl eiwitcomplex (PerCP)).

    6. Variatie: Effector Onderdrukking Assay Magnetic Bead-geselecteerd, MSC-geïnduceerde Immuunmodulerende leukocyten op geactiveerde CFSE-gelabelde Effector CD4 + T-cellen

    1. Seed MSCs bij 250.000 cellen in 3 ml MSC compleet medium in 6-well platen (MSC dichtheid: 25.000 cellen / cm2) voor bevestiging O / N in een 37 ° C incubator, waardoor de stamcellen tot 80% confluentie bereiken. Minstens 3 6-well platen zijn nodig om voldoende MSC-PBMC gekweekt samen voor subpopulatie selectie garanderen.
    2. Zuig medium en PBMC gescheiden volgens stap 1 maar in 6-well platen bij 2,5 x 10 6 cellen / putje (celdichtheid commentaar: 250.000 leukocytes / cm 2) met 3 ml van leukocyten volledig medium. Co-kweek van 48-72 uur in een 37 ° C incubator.
    3. Magnetische bead-selecteer specifieke populatie van MSC-geïnduceerde immunomodulerende leukocyten (dwz, CD14 + cellen) als per secties 2-3.
      Opmerkingen: Intracellulaire cytokine kleuring voor flowcytometrische analyse kan op dit moment worden uitgevoerd om na te gaan voor veranderingen in leukocyten cytokine expressie profiel, dat wil zeggen, de expressie van interleukine-10-as gemoduleerd door MSC.
    4. Voeg CFSE-gelabelde allogene CD4 + T-cellen geproduceerd volgens secties 2-4 in 24 putjes in 1 ml compleet medium leukocyt (T celdichtheid: 250.000 cellen / cm 2) naar bead geselecteerde MSC geïnduceerde leukocyten in verschillende verhoudingen , dwz 1:10, 1: 5, 1: 2 en 1: 1 (cel naar cel) verhoudingen.
    5. Om CD4 + T cellen te stimuleren, voeg α-CD3 / 28 geconjugeerd microbolletjes een hiel-tot-cel-verhouding van 1 te verkrijgen: 1.
    6. Voor een negatieve controle, plaat 500.000 CD4 + T-cellen / putje in een 24-well plaat (T celdichtheid: 250.000 cellen / cm 2) met 1 ml leukocyt pas compleet medium; positieve controle, naast hetzelfde aantal CD4 + T-cellen plating / putje, voeg α-CD3 / 28 geconjugeerd microbolletjes een hiel-tot-cel-verhouding van 1 te verkrijgen: 1.
    7. Op 3 dagen van co-kweek beoordeelt proliferatie van CFSE-gelabelde CD4 + T-cellen (geplaatst in ronde bodem tubes) door flow cytometrische analyse 16 met 488 nm excitatie en emissiefilters geschikt voor fluoresceïne.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Figuur 1 geeft het algemene schema van het experiment, en figuur 2 toont het uiterlijk van de verschillende celkweekomstandigheden zoals gevisualiseerd door fase-contrast omgekeerde microscoop. MSC's zijn hechtende cellen met een fibroblast, spoelvormige morfologie, terwijl PBMC en leukocyten zijn kleine ronde niet-hechtende cellen. Deze twee morfologisch verschillende celtypes is duidelijk te zien in de co-kweek. Aan het einde van de test, als de PBMC's (of leuckotyes) aangezogen voor flowcytometrische analyses, zelfs als hechtende MSCs onbedoeld zijn opgenomen (dat wil zeggen, als gevolg van slechte hechting of losraken van intensieve afzuigen), er geen problemen beoordeling van de te PBMC / leukocyten fractie omdat deze cellen zouden met CFSE worden geëtiketteerd. Als er geen proliferatie, worden histogram resultaten voor CFSE-gelabelde cellen gezien als een zeer positief en scherpe piek; echter, wanneer de activering is opgetreden, proliferatie zoals blijkt duidelijk zijn by meerdere kleinere pieken met verlies en linkershifttoets van de fluorescentie-intensiteit (Figuur 3). Wanneer onderdrukking van proliferatie heeft plaatsgevonden, dwz., De co-cultuur van MSC's, zal de meervoudige kleinere pieken af met een gelijktijdige toename van de fluorescentie-intensiteit zoals blijkt uit het verschuiven van de toppen naar rechts en verhogingen van de scherpte van de rechter . grootste piek die de niet-delende cellen Figuur 4 geeft het algemene schema van een variant van het experiment: beoordeling van de effector onderdrukking van MSC-geïnduceerde immunomodulerende leukocyten op geactiveerde effector allogene CD4 + T-cellen. De resultaten van bijvoorbeeld een variant van het experiment zijn vergelijkbaar met de oorspronkelijke bepaling, met de aanvullende informatie van de dosis-afhankelijke onderdrukking van proliferatie waargenomen (figuur 5).

    Figuur 1
    Figuur 1. Stroomdiagram voor de beoordeling van immunomodulerende effecten van mesenchymale stamcellen (MSC) op allogene effector leukocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2. Cell morfologie van MSC, leukocyten, en co-cultuur van twee celpopulaties. Fase-contrast microscopie foto's van single-cell cultuur van MSC's of leukocyten, en MSC-leukocyten co-cultuur. Schaal bar, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 3
    Figuur 3. MSC onderdrukkende effecten op prolifererende leukocyten. Flowcytometrische histogram van carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) -gemerkte leukocyt proliferatie (A) gekweekt alleen gestimuleerde, (B) co-cultuur met MSC's (C) gekweekt met anti-CD3 / CD28 microkorrel stimulatie (α-CD3 / CD28) alleen, (D) en MSC's. Percentages in histogrammen duiden aandeel proliferende leukocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 4
    Figuur 4. Stroomschema voor de beoordeling van de MSC-geïnduceerde leukocyten immunomodulatie op allogene CD4 + effector-T-lymfocyten.upload / 53.265 / 53265fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 5
    Figuur 5. Suppressieve capaciteit van MSC-co-gekweekte CD14 monocyten op prolifererende CD4-lymfocyten. Scatterplot en flow cytometrische histogram van de onderdrukkende capaciteit van MSC-co-gekweekte CD14 + monocyten (M-CD14 +) op anti-CD3 / CD28 microkorrel gestimuleerde, CFSE-gelabelde CD4 + effector T-lymfocyten (CD4 + S-). Co-kweek verhouding S-CD4 + M-CD14 + weergegeven. CD4 + T lymfocyten werden afgesloten (R1) en beoordeeld op CFSE-intensiteit. Percentages in histogrammen geven aandeel van prolifererende CD4 + T-cellen. Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 71-7167-00 AG Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
    Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) Life Technologies V12883 Cellular label for detection of cell division
    Phytoagglutinin (PHA) Sigma L8902 Activation of human PBMCs
    Dynabeads Human T-Activator CD3/28 Life Technologies 111.32D Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
    autoMACS™ Separator Miltenyi Biotec autoMACS™ Separator Magnetic based cell separator
    autoMACS® Columns Miltenyi Biotec 130-021-101 separation columns
    CD14 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-050-201 For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
    CD4 microbeads, human  Miltenyi Biotec 130-045-101 For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
    RPMI 1640 Medium Life Technologies 11875 Human PBMC/leukocyte culture medium
    DMEM, Low glucose, pyruvate Life Technologies 11885 Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
    L-glutamine Life Technologies 25030-081 Supplementation for MSC complete medium
    Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
    Fetal bovine serum (FBS) 1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) 1) SH30070.03M 2) 10091-148 Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
    24-well cell culture plate Corning COR3524 Co-culture plate
    50 ml centrifuge tube Corning 430291 Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
    15 ml centrifuge tube  Corning 430766 Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
    Round-bottom tubes BD Falcon  352008 Collection of cells for flow cytometric analysis

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
    2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
    3. Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
    4. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
    5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
    6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
    7. Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
    8. Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
    9. Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
    10. Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
    11. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
    12. Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
    13. Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. Wiley & Sons, Inc. (2011).
    14. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
    15. Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
    16. Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
    17. Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
    18. Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
    19. Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
    20. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
    21. Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
    22. Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
    23. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
    24. Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Video Stats