Beskriver en transkriptionsfaktor beroende reglering av MicroRNA transkriptom

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rozovski, U., Hazan-Halevy, I., Calin, G., Harris, D., Li, P., Liu, Z., Keating, M. J., Estrov, Z. Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome. J. Vis. Exp. (112), e53300, doi:10.3791/53300 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Medan transkriptionsreglering av proteinkodnings generna omfattande studerat, lite är känt om hur transkriptionsfaktorer är involverade i transkription av icke-kodande RNA, speciellt av mikroRNA. Här föreslår vi en strategi för att studera den potentiella rollen av transkriptionsfaktor vid reglering transkription av mikroRNA använder offentligt tillgängliga data, dataresurser och hög genomströmning uppgifter. Vi använder H3K4me3 epigenetiska signatur att identifiera mikroRNA promotorer och kromatin immunoprecipitation (chip) -sequencing data från ENCODE projektet identifiera mikroRNA promotorer som är berikade med transkriptionsfaktorbindningsställen. Genom att transfektera celler av intresse med shRNA inriktning en transkriptionsfaktor av intresse och utsätta cellerna för mikroRNA array, studerar vi effekten av denna transkriptionsfaktor på mikroRNA transkriptom. Som ett illustrativt exempel använder vi vår studie på effekten av STAT3 på mikroRNA transkriptom av kronisk lymphocytic leukemi (CLL) celler.

Introduction

MicroRNAs är endogena små icke kodande regulatoriska RNA som normalt fungerar som negativa regulatorer av mRNA-expression på posttranskriptionell nivå. Ca 1000 icke-kodande 20 till 25 nukleotider lång mikroRNA påträffas i det mänskliga genomet 1,2. MicroRNAs reglera genuttrycket genom kanoniska baspaming mellan fröet sekvensen för mikroRNA och dess komplementära frö match sekvens, som vanligen är belägen vid 3'-otranslaterade regionen (UTR) av målar mRNA. Tillsammans mikroRNA reglera mer än 30% av proteinkodande gener 3, men bara lite är känt om transkriptionen från DNA av mikroRNA. Det har föreslagits att regleringen av mikroRNA transkription är liknande den i mRNA 4,5. I synnerhet, i likhet med sin verksamhet för att främja transkription av proteinkodande gener, är transkriptionsfaktorer tros aktivera transkription av mikroRNA 6. Transkriptionsfaktor-microRNA samspel har rapporterats som en modulator faktor genuttryck 7, och kan också bilda feed-back och feed-forward slingor. Exempelvis Yamakuchi et al. Rapporterade en återkopplingsslinga i vilken p53 leder till uttryck av microRNA34a, vilket i sin tur inhiberar translation av p53-repressor SIRT och därigenom öka p53-aktivitet åtta.

Medan specifika exempel på transkriptionsfaktor beroende uttryck av mikroRNA har rapporterats, är en accepterad metod som ger information om hur en transkriptionsfaktor av intresse reglerar uttrycket av microRNA-transkriptom saknas. Syftet med protokollet föreslås häri är att tillhandahålla en ingående beskrivning av transkriptionsfaktorberoende reglering av microRNA-transkriptom. Genom att kombinera allmänt tillgängliga uppgifter, bioinformatiska verktyg och använda microarray-teknik, skulle forskare som följer denna algoritm kunna fånga på en genomisk skala hur någontranskriptionsfaktor i ett celltypen av intresse reglerar uttrycket av microRNA-transkriptom och att utforska en förmodad bidrag av transkriptionsfaktorn-mRNA vid reglering av mikro-RNA-expression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Identifiera transkriptionsfaktorbindningsställen i promotorn av mikroRNA gener Använda Data Mining Approach

  1. Använd University of California Santa Cruz (UCSC) genomet webbläsare för att extrahera kromatin immunoprecipitation (chip) sekvense data som genereras som en del av Encyclopedia of DNA-element (KODA) projekt.
    1. Öppna tabellen webbläsaren i UCSC genomet webbläsare.
    2. Använd följande specifikationer för att extrahera tabellen: Clade: (däggdjur), genom: (Human), Montering: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), grupp: (reglering), spår (TxnFactorChIP), tabell: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), region (Genome), utdataformat (alla gener från valda tabellen).
    3. Spara resultatet från 1.1.2 som en txt-fil och i ett kalkylblad.
    4. Sortera och filter för transkriptionsfaktorn av intresse (t.ex. STAT2).
  2. Använd listan över mikroRNA promotorer baserade på H3K4me3 epigenetik signatur finns på Baeer et al. 9
  3. För att matcha enligt koordinater på det mänskliga genomet, kartlägga data från 1,1 och 1,2 (t ex STAT3 bindande för förmodade mikroRNA promotorer) och bestämma medianen bindningsaffiniteten med hjälp av kod skriven i C skarp som beskrivs i kompletterande kodning fil 1.

2. Använd shRNA att nedreglera uttrycket av en transkriptionsfaktor av intresse

  1. Platta 1,5 x 10 6 celler från 293 humana embryonala njurcellinjen i 10 cm platta vid ungefär 50% sammanflytning (DMEM med 10% FBS).
  2. Transfektera celler från 293 humana embryonala njurcellinjen med 5 | j, g av grönt fluorescerande protein (GFP) lentivirus innehållande shRNA riktad till transkriptionsfaktorn av intresse och med 5 | j, g av förpacknings vektorer med användning av transfektion reagens för adherenta celler enligt tillverkarens protokoll.
  3. Som en kontroll, transfektera cellerna från 293 humana embryonala njurcellinjen medäggröra shRNA och förpackningsvektorerna enligt tillverkarens protokoll.
  4. Hålla transfektion mix på celler under 16 timmar (vid 37 ° C, CO2 inkubator), sedan ändra media till 10 ml färskt 10% DMEM-medium med 10% FBS.
  5. Vänta 48 timmar efter transfektion, centrifugera cellkultur (300 xg, 5 min) och samla smitt supernatant. Filtrera supernatanten genom ett 0,45 | j, m sprutfilter (25-mm tensidfri cellulosaacetatmembran) för att avlägsna eventuella flytande celler.
  6. Koncentrera supernatanten och samla lentivirus med användning av en ultracentrifugal filteranordning med tröskelvärde på 100 kDa. Spin vid 950 xg under 30-60 min tills volymen har varit koncentrat till mindre än 250 l. Lagra den koncentrerade viruset vid -80 ° C.
  7. Transfektera cellerna med lentivirus. Avlägsna frysta lentivirus från -80 ° C frys och tina till rumstemperatur. Överför 100 | il av virus supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrofugrör.
    1. bring upp volymen i röret till 1 ml med nedsatt serummedium. Lägg hexadimetrinbromid till 1 ml virussuspension för slutlig koncentration av 10 ng / ml, blanda försiktigt och låt blandningen stå i 5 minuter.
  8. Centrifugera 5 x 10 6 celler för varje transduktion och försiktigt återsuspendera cellpelleten i 0,5 ml media innehållande virus. Låt cellerna stanna i inkubatorn under 4-24 h, tillsätt sedan 0,5 ml medium med 20% FBS till en slutlig koncentration av 10% FBS.
  9. Vänta 48 till 72 timmar och ge fläckar cellerna med propidiumjodid (PI) och grön fluorescerande protein (GFP) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Skyddar cellerna från ljus och använda en FACS sorterare för att mäta andelen GFP + / PI - celler. Eftersom PI fläckar endast död cell, är denna hastighet en uppskattning av transfektionseffektiviteten i levande celler.
  10. Sortera positiva cellpopulationen till GFP uttryck (GFP +) genom FACS sorterare som tidigare beskrivits 10.
  11. användning Western immunblotting som tidigare beskrivits 10 för att bestämma nivåerna av en transkriptionsfaktor intresse före och efter att infektera cellerna av intresse (till exempel, CLL-celler) med utsedda shRNA.

3. Bestäm Uttrycksnivå av MicroRNA transkriptom i celler transfekterade med transkriptionsfaktor-shRNA

  1. Isolera RNA med användning av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll.
  2. Märk RNA och hybridisera det till microRNA mikromatris 11.
  3. Bestämma differentiellt uttryckta mikroRNA i celler transfekterade med transkriptionsfaktor-shRNA eller med tomma vektorkontroller 5.
  4. Validera microarray resultat för de differentiellt uttryckta mikroRNA med hjälp av realtids-PCR 5.

4. Bestäm överlappningen mellan bioinformatik och shRNA metoden för att beskriva transkriptionsfaktor Beroende transkriptom

  1. till Dethermelin de förväntade och observerade förhållanden av mikroRNA gener som hyser transkriptionsfaktorbindningsställen i sina promotorer och var nedreglerade i transkriptionsfaktor shRNA transfekterade celler, gör följande:
    1. Erhålla förhållandet av gener som härbärgerar transkriptionsfaktorn av intresse för deras promotor / total mikroRNA från listan genereras i 1,3. Denna lista är den förväntade förhållandet (t.ex. mikroRNA gener med STAT3 bindningsställen / totala mikroRNA gener testas = 0,25).
    2. Bestäm antalet gener som nedregleras i transkriptionsfaktor shRNA transfekterade celler från listan som genereras i 3.3 och har transkriptionsfaktor av räntebindningsställen i listan som genereras i 1.3. Detta nummer / Totalt antal nedregleras gener är det observerade förhållandet (t.ex. mikroRNA gener med STAT3-bindningsställen / totalt antal nedregleras mikroRNA = 0,6).
    Använd χ2 statistik att jämföra de observerade och förväntade förhållanden som genererades ovan och bestämma om listan av gener som nedregleras i transkriptionsfaktor shRNA transfekterade cellerna är berikade med transkriptionsfaktorbindningsställen i deras promotor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

STAT3 är en transkriptionsfaktor som typiskt inducerar transkriptionen av gener som har anti apoptotisk och proliferativa effekter 12. Huruvida STAT3 påverkar också den icke-kodande RNA transkriptom är för närvarande okänt. I alla CLL celler STAT3 är konstitutivt fosforylerade på serin 707 rester 10,13. Fosfoserin STAT3 transfer till kärnan, binder till DNA och aktiverar gener som är kända för att aktiveras av tyrosin pSTAT3 i andra celltyper 10. Eftersom CLL kännetecknas av global avreglering av mikroRNA nätet 14, hypotes vi att närvaron av serin pSTAT3 påverkar uttrycket av mikroRNA hos KLL-celler.

För att testa denna hypotes främjare av mikroRNA som härbärgerar STAT3-bindningsställen måste identifieras. Genom att korsa data som genereras av Baer et al. 9 regioner med H2K4me3 histon modifiningen som kännetecknar promotor platser, med STAT3 bindningsställen som identifierats av Chip-punkter experiment 15, var förmodade STAT3 bindningsställen identifieras. Med hjälp av denna metod 160 förmodade promotorer upptäcktes i nästan 25% av de undersökta (N = 200) med bindande poäng från 100 (den lägsta poängen) till 1000 (den högsta poängen) (tabell 1) mikroRNA gener.

Därefter CLL-celler transfekterades med STAT3-shRNA eller med en tom vektor och använda mikro-RNA array och identifierade 63 mikroRNA som var ner reglerade efter transfektion (Figur 1) vilket tyder på att STAT3 främjar transkription av dessa mikroRNA. För 60% av de 63 nedregleras mikroRNA gener (n = 38) Chip-punkter uppgifter bekräftade STAT3 bindning i en förmodad promotor uppströms om genen plats betydligt fler än väntat av en slump (p <0,0001). Nio mikroRNA som var nedreglerade efter transfektionen,vilket tyder på att STAT3 reglera sina nivåer av transkription negativt.

Figur 1
Figur 1. Transfektion av CLL-celler med STAT3-shRNA minskar uttrycksnivåer av STAT3-protein och STAT3 mRNA. A:. Efter transfektion av CLL-celler med STAT3-shRNA nivåer av STAT3-mRNA (vänster fält, detekteras genom kvantitativ RT-PCR) och nivåer av STAT3-proteinet (högra panelen, som upptäckts av västra immunoblotting) minskade signifikant B: mikroRNA utbud av CLL celler avbildas 23 mikroRNA vars uttryck skilde sig signifikant mellan CLL-celler transfekterade med STAT3-shRNA och CLL-celler transfekterade med en tom vektor. P-värde av mindre än 0,01 ansågs vara statistiskt signifikant C:. Medelvärdet expression kvantifierades genom RT-PCR av 7 mikroRNA som hade differentiell expression efter STAT3-shRNA behandlingen med användning avmikro-RNA array. Staplar representerar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Coding fil 1. Klicka här för att ladda ner filen.

MIR-1537
Mikro-RNA-gen Kromosom Promotor startkoordinater Promotor end koordinater Median (intervall) STAT3 bindande poäng *
MIR-1205, MIR-1206, MIR-1207 8 q24.21 128961454 128962791 1000 (1000-1000)
1 q42.3 236045425 236047415 1000 (1000-1000)
MIR-21 17 q23.1 57901872 57921277 1000 (112-1000)
MIR-3124 1 Q44 249115404 249123965 1000 (1000-1000)
MIR-451 17q11.2 27222251 27224114 1000 (1000-1000)
MIR-92b 1 q22 155162340 155168439 1000 (1000-1000)
MIR-3197 21 q22.2 42537544 42543023 943 (943-943)
MIR-646 20 q13.33 58712550 58715320 789 (789-789)
MIR-629 15 q23 70383751 70394586 773 (661-885)
MIR-30e, MIR-30C-1 1 p34.2 41173077 41177703 759 (759-759)
MIR-3125 2 p24.3 12855381 12862915 756 (756-756)
MIR-3145 6 q23.3 138776942 138779365 743 (487-1000)
MIR-645 20 q13.13 49199911 49201187 743 (743-743)
MIR-1256 1 p36.12 21346830 21350211 725 (725-725)
MIR-619 12 q24.11 109248263 109253306 719 (719-719)
MIR-181a-2, miR-181b-2 9 q33.3 127418928 127426139 710 (710-710)
MIR-29a, MIR-29b-1 7 q32.3 130583383 130597803 697 (482-1000)
MIR-202 10 q26.3 135069499 135077337 696 (393-1000)
MIR-3142, MIR-146a 5 q34 159890882 159899475 671 (671-671)
MIR-548c 12 q14.2 65000968 65011503 660 (660-660)
MIR-630 15 q24.1 72764289 72769197 627 (255-1000)
MIR-135b 1 q32.1 205416952 205452990 622 (245-1000)
MIR-29c, MIR-29b-2 1 q32.2 207991044 208002382 608 (608-608)
MIR-1825 20 q11.21 30791020 30798310 604 (209-1000)
MIR-548h-1 14 q23.2 64578834 64581657 587 (174-1000)
MIR-612 11 q13.1 65183633 65198528 581 (157-1000)
MIR-148b 12 q13.13 54717640 54721204 578 (578-578)
MIR-3174 15 q26.1 90543381 90549092 576 (152-1000)
let7a-3, let7b 22 46480680 46481826 573 (146-1000)
MIR-1255a 4 Q24 102263848 102272541 557 (557-557)

Tabell 1. Förmodade mikroRNA s initiativtagare med STAT3-bindningsställen. Protokollet ger en metod för att identifiera transkriptionsfaktor bindande för förmodade promotorerna mikroRNA med hjälp av data mining av publicerade data. Som ett exempel, presenterar vi här en tabell som skildrar bindning av STAT3 till förmodade mikroRNA promotorer. Bindnings poäng ges på 0 till 1000 skala från hela genomet CHIP seq uppgifter som publicerats som en del av ENCODE projektet 15. Promotor identifieras genom närvaron av H3K4me3 epigenetiska signatur 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mekanism som ligger bakom den RNA-polymeras II-beroende transkription av proteinkodande gener har studerats ingående. Även om dessa faktorer utgör endast 1% - 2% av det mänskliga genomet, bevis från ENCODE projektet tyder på att över 80% av det mänskliga genomet kan genomgå transkription 17 och vad som reglerar transkriptionen av den icke-kodande DNA-element är i stort sett okänd 6 .

Flera studier, som indikerade att Pol II är också ansvarig för överföring av vissa icke-proteinkodande gener inklusive mikroRNA 6, ledde oss att utveckla en strategi som kombinerar data från offentligt tillgängliga resurser, beräkningsalgoritmer och in vitro studier för att dechiffrera den potentiella funktion av en transkriptionsfaktor av intresse i regleringen transkription av mikroRNA. Strategin föreslås häri inkluderar 2 kritiska steg. Först använder vi allmänt tillgängliga data för att identifiera transkriptionsfaktor Binding i mikroRNA promotorer. För detta ändamål använder vi Chip-seq uppgifter som offentliggjorts av ENCODE konsortium för att identifiera transkriptionsfaktor bindande och epigenetisk signatur som kännetecknar promotor som en indirekt markör för mikroRNA-promotorer. Passerar de genetiska koordinater från dessa dataset ger en grov uppskattning av hur ofta en transkriptionsfaktor av intresse binder till microRNA-promotorn. Andra genom att använda shRNA teknik för att tysta ett uttryck för en transkriptionsfaktor och utsätta cellerna för mikroRNA-array, är det möjligt att utforska den funktionella betydelsen av en transkriptionsfaktor på microRNA-transkriptom.

Variationen i mikroRNA uttryck endast delvis förklaras av transkriptionsfaktor beroende reglering. Stökiometriskt variabilitet och andra cellulära eller extracellulära faktorer spelar en viktig roll och inte simuleras i den föreslagna algoritmen. Andra begränsningar inkluderar följande: Promotor analys baserad på H3K4me3signatur gjordes på 939 kommenterade mikroRNA. Sedan dess de genomiska platser för många fler mikroRNA har identifierats. Men det bästa av vår kunskap en mer omfattande lista som är baserad på en uppdaterad databas inte har publicerats ännu. Av de 939 mikroRNA gener, var H3K4me3 som kännetecknar promotorregionen identifieras i 781 mikroRNA gener (83%). Därför, medan denna analys grundar sig uppenbarligen på en ofullständig dataset den fångar en betydande del av microRNA-transkriptom.

Dessutom epigenetik signaturen delvis tryckt och delvis cellspecifik. Därför kan generability av förmodade promotorer som definierades av Epigenetik markörer ifrågasättas. Eftersom H3K4me3 kvarstår oberoende av transkription 18 det anses allmänt som en markör för präglade promotorer. Analys algoritm vi föreslår här kan därför missa cellspecifika mikroRNA promotorer om dessa promotorer identifierades på en annan cell-typ. Slutligen bör någon slutsats testas och bekräftas empiriskt. Framför allt, sambandet mellan nedreglering av en transkriptionsfaktor (med shRNA metod) och mikroRNA uttryck (identifieras av mikroRNA array) kan bara föreslå en direkt transkriptionell roll som ska bekräftas genom godtagbara analyser såsom kromatin immunoprecipitation (chip) eller elektro rörlighet shift assay (EMSA). Modifieringar av den metod som föreslås häri inkluderar olika sätt att identifiera mikroRNA promotor och olika sätt att knacka ner uttrycket av en transkriptionsfaktor, till exempel, små störande RNA istället för shRNA. Transkriptions reglering av mikroRNA kan vara väsentligen olika för mikroRNA som vistas inom proteinkodnings gener (intragenic mikroRNA) och de som inte gör (intergena mikroRNA). Eftersom intragenic mikroRNA vanligen transkriberas tillsammans med sina värdgener 19 promotorn är vanligtvis omedelbart upstream transkriptionsstartplatsen. Men för många intergena mikroRNA transkriptionsstartsätet är dåligt kommenterade, och prognosverktyg som vanligen används för proteinkodande gener fungerar dåligt 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av ett bidrag från CLL Global Research Foundation. University of Texas MD Anderson Cancer Center stöds delvis av National Institutes of Health genom en Cancer Center Support Grant (P30CA16672).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamin 2000 Life Technologies 11668027
0.45 µm syringe filter Thermo Scientific (Nalgene) 190-2545
Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa Merck Millipore
Polybrene Merck Millipore TR-1003-G
TRIzol reagent Life Tachnologies (Invitrogen) 15596-026
293 Cell line human Sigma-Aldrich 85120602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
  14. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
  15. Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
  16. Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
  17. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
  18. Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
  19. Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics