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Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

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Neuroscience

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Suryawanshi, H., Sarangdhar, M. A., Vij, M., Roshan, R., Singh, V. P., Ganguli, M., Pillai, B. A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA. J. Vis. Exp. (106), e53307, doi:10.3791/53307 (2015).

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Abstract

Introduction

MicroRNAs sind als neue therapeutische Targets aufgrund ihrer universellen Rolle bei der Regulation der Genexpression und direkte Beweise für die Beteiligung an der Krankheit entstanden. MiRNAs werden aktiv auf ihr Potenzial untersucht, wie Drogen-Ziele 1,2. Ferner werden Veränderungen der miRNA-Expression mit verschiedenen Krankheiten 3 und Simulation dieser Veränderungen durch künstliche Störung der miRNA-Expression verbunden sind, können verwendet werden, um die zelluläre Signalwege in Krankheitsmanifestation beteiligt untersuchen. Gewebespezifische Lieferung von miRNA gezielt Medikamente ist derzeit eine der größten Herausforderungen für die miRNA-basierte Wirkstoffentwicklung. Antagomirs und miRNA-Mimetika sind vielversprechend Mittel zum Stören miRNA Ebenen 4-6. Spezielle Funktionen, die ihre Spezifität und Wirksamkeit erhöhen, weisen jedoch in der Gestaltung der Antagomirs eingebaut werden, bevor sie für die in vivo Störung der miRNA-Expression verwendet werden.

MicroRNAs sind besonders relevant, als Ziele in derzeit unheilbaren neurodegenerativen und neuroentwicklungs Krankheiten. Die Blut-Hirn-Schranke stellt eine Beschränkung für die Lieferung von Antagomirs im Gehirn. Stereotaktische Injektionen sind weit verbreitet in Nagetiermodellen verwendet werden, um Moleküle an bestimmten Stellen im Gehirn 7 zu liefern. Es erfordert Geschick, umfangreiche Investitionen in der Instrumentierung und Zeit. Stereotaktische Injektionen sind invasive, umfassen Chirurgie, führen zumindest leichten Verletzungen und an lokale Auslieferung beschränkt. Die Verwendung von Zelldringenden Peptide mit einer Vorliebe für die Ausrichtung Neuronen können diese Einschränkungen zu begegnen, da sie durch die trans-Kreislauf-Strecke geliefert werden, sondern durchbrechen die Bluthirnschranke. Solch ein Peptid aus der Rabies Virus Glycoprotein (RVG) abgeleitet ist, wurde zuvor verwendet, um siRNA gegen Japanische Enzephalitis-Virus bei Mäusen 8 zu liefern. Wir haben festgestellt, dass unter Verwendung des Peptids für Antagomir Lieferung, miRNAs kann wirksam sein niedergeschlagen im Gehirn der Maus 9.

NHALT "> Die zweite große Herausforderung der miRNA knock-down ergibt sich aus der geringen Größe der miRNAs und das Vorhandensein von eng verwandten Sequenz Isoformen. Wir nehmen das Beispiel des MMU-miR-29-Familie, die aus drei eng verwandte Isoformen besteht, miR-29a , b und c. Antagomire sind auch allgemein entlang der Hauptkette modifiziert werden, um ihre Stabilität zu erhöhen und machen sie beständig gegenüber Nukleasen angreifen. Locked Nucleic Acids (LNAs) bieten einen weiteren Vorteil, dass sie verbessern die thermische Stabilität und sogar dazu führen, um den Abbau über und jenseits Ziel sterische Hinderung. 10 Einführung Änderungen entlang der Hauptkette kann wirksam, aber teuer sein. Wir haben bereits gesehen, daß Modifikationen über eine optimale Anzahl kann nicht weiter die Wirksamkeit. Die Gestaltung des antagomir beinhaltet daher die optimale Änderung der antagomir.

Um die komplexen Antagomir nicht-kovalent mit dem neurotropen Peptid, einem geladenen Hepta- zu nona-Arginin-Erweiterung verwendet wird. D-ArgininRückstände werden verwendet, da sie eine höhere Stabilität zu verleihen, da sie nicht anfällig für eine Spaltung durch Proteasen. Hepta- zu nona-Arginin Strecken wirken als effiziente Zellpenetrationsmittel, obwohl sie Behandlungen nicht die Zelltyp-Spezifität. Durch kovalente Verknüpfung der RVG-Peptid an die nona-Arginin-Linker, einem neurotropen, Zelle eindringende Peptid generiert wurde. Die positiv geladenen Reste des Peptids in Wechselwirkung mit der negativ geladenen Nukleinsäure Rückgrat, um Komplexe zu bilden. Diese Komplexe können verwendet werden, um DNA oder RNA effektiv transfizieren in kultivierten Zellen und in vivo in das Gewebe wird.

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Protocol

Hinweis: Alle Verfahren einschließlich Tier Themen wurden von Institutional Tiere Ethikkommission (IAEC) am Institut für Genomik und Integrative Biologie, Neu-Delhi genehmigt worden (IGIB / AEC / 10/2013). Dieses Protokoll ist speziell für die gezielte Abgabe Antagomir-29 im Gehirn und Knockdown von miR-29 eingestellt.

1. Antagomir Design Strategy

  1. Rufen Sie die reife miRNA-Sequenz aus miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Rufen Sie den Sequenzen verwandter miRNA Familienmitglieder über den Link "Gene Family" in der miRBase Rekord
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Reverse Komplement der Sequenz: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html bietet ein komfortables Werkzeug zurreverse Komplement-Sequenzen.
  4. Markieren Sie die Positionen, die von LNA geändert werden mit Hilfe der folgenden Richtlinien:
    1. Wählen Thyminreste 3-4 Basen auseinander für den LNA Modifikation platziert, da LNA Pyrimidine sind stabiler als Purine 12.
    2. Wählen Cytosinreste um 3-4 Reste getrennt, wenn vorhergehenden Schritt erzeugt weniger als fünf Modifikationen.
    3. Priorisieren der fünf Modifikationen am 5'-Ende des antagomir, da die Saat-Sequenz vermieden wird.

2. Antagomir-Neuropeptid Complex Vorbereitung

Anmerkung: Dies ist der wichtigste Schritt im Protokoll und Standardisierung muss. Um das Protokoll zu jeder fluoreszenzmarkierte Oligonucleotid (FLO) kann anstelle des antagomir 9 verwendet werden standardisieren. Die Peptide sollten von hoher Reinheit sein (HPLC-Qualität, 98% Reinheit) .Sequences und Ladung des Peptids und antagomir sind in Tabelle 1 angegeben.

  1. Entscheiden Sie, die Anzahl der moles von antagomir bezogen auf molare Ladung auf antagomir, seiner Toxizität und Gewicht der Maus injiziert werden. Berechnen Sie die Anzahl der Mole des Peptids injiziert basieren auf molare Ladungsverhältnis von Antagomir: Peptid.
    HINWEIS: Standardisieren molaren Ladungsverhältnis von Antagomir: Peptid zur Toxizität und effektive Bereitstellung im Gehirn der Maus. Verwenden Sie unterschiedliche molare Ladungsverhältnissen von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid: Peptids zur Standardisierung. Wir fanden, dass Antagomir-29 und Kontrolle waren beide bei 4microgram / Gramm Körpergewicht der Maus giftig. Antagomir-29 und Kontrolle wurden bei 2microgram / Gramm Körpergewicht verwendet, aber das effektive Konzentration dürfte für jeden microRNA variieren.
  2. Verdünnen des Peptids und antagomir in getrennten Mikrozentrifugenröhrchen aus Stammlösungen mit steriler 10% D-Glucose auf die gewünschte Endkonzentration in Schritt 1 berechnet.
  3. Halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Peptid-Lösung auf einem Vortex bei moderaten Vortexen Geschwindigkeit.
  4. In 1/3 der einentagomir Lösung der Peptidlösung Rohr langsam tropfenweise, während es wird gründlich auf einem Vortex-Mischer gemischt.
  5. Setze das Mischen der Lösungen auf dem Vortex für den nächsten 1 min und dann lassen Sie die Mischung für 1 min stehen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 zwei weitere Male um den verbleibenden antagomir Lösung mit der Peptidlösung in die gleiche Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Langsame Zugabe ist kritisch für die Bildung von monodispersen Komplexe, die wirksam bei der Transfektion. Schnelle hinaus kann die Aggregation der Komplexe und deren Niederschlag führen.
  7. Inkubieren des Komplexes für 30 min bei RT ohne Verwirbelung. Während dieser Zeit der Inkubation akklimatisieren die Mäuse ins Labor, wo Injektionen durchgeführt.

3. Schwanzveneninjektion von Antagomir-Neuropeptid-Komplex

  1. Um das Tier zurückzuhalten, die Maus in einem Verzögerer oder decapicone der richtigen Größe.
  2. Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes mit Wattestäbchen pre getränkten in warmem Wasser (ca. 40 ° C). Dies wird Vasodilatation fördern und erhöhen die Sichtbarkeit der Vene.
  3. Nähern Sie sich dem Schwanz mit einem kleinen Volumen (0,5 bis 1,0 cc) Insulinspritze in einem 15-20 ° -Winkel. Darauf achten, dass keine Luft in die Spritze einzuführen. Beginnen an dem distalen Abschnitt des Schwanzes. Spritzen Sie die Anlage. Entfernen Sie die Nadel und wenden eine antiseptische Tupfer direkt an der Injektionsstelle (etwa 5-10 sec), um Blutungen zu stoppen.
  4. Ersetzen Sie die Maus in einem individuell belüfteten Käfig in der Gruppe von 3-5, mit dem Maiskolben und Tissue-Papier als Bereicherung. Injizierten und injizierten Mäusen halten Sie nicht in demselben Käfig.

4. Verhaltens Assays

Hinweis: Bewahren Sie die Zeitspanne von 3-4 Stunden zwischen Injektion und Verhaltenstests zur Erholung nach der Injektion zu ermöglichen. Bringen Sie die Maus, um ein ruhiges Zimmer. In dieser Zeit der Eingewöhnung der Tiere nicht stören.

  1. Akklimatisieren Sie die Maus auf dieneuer Raum für 30 Minuten und starten Sie dann die folgenden Verhaltenstests. Halten Sie einen Abstand von 10 Minuten zwischen den einzelnen Verhaltenstest.
  2. Hinterlauf clasping:
    HINWEIS: Dieser Test zeigt, motorische Störungen und neurologischen Störungen.
    1. Heben Sie die Maus sanft, indem in der Nähe Basis des Schwanzes im klaren Hintergrund.
    2. Überprüfen Sie die hinteren Gliedmaßen Position für 10-15 Sekunden. Wildtyp-Maus spreizt Hinterbeine von Bauch, während eine ataktische Maus neigt dazu, eine oder beide Hinterbeine in Richtung des Bauches mehr als 50% der Zeit ausgesetzt 13 zurückzuziehen.
    3. Bringen Sie die Maus, um den Käfig
  3. Ledge-Test:
    1. Heben Sie die Maus vorsichtig, indem Sie den Schwanz und halten Sie auf dem Sims eines Käfigs.
    2. Beachten Sie die Maus, die speziell auf die Ecke des Käfigs. Wildtyp-Maus können Sie die Ecken problemlos ohne Angst und verlieren das Gleichgewicht. Ataktische Maus verliert sein Gleichgewicht, einfrieren oder schüttelt bei einem Spaziergang entlang des Käfigs Leiste und an den Ecken.
  4. HINWEIS: Für diesen Test halten die Absorptionslage bereit, auf dem Boden einer schmalen Landebahn (~ 70 cm langen, ~ 5 cm breit mit ca. 5 cm hohe Wände.)
    1. Halten Sie die Maus sanft mit einer Hand und wenden Tinte auf den Hinterbeinen mit einem Pinsel.
    2. Legen Sie die Absorptionsschicht auf dem Boden einer schmalen Landebahn.
    3. Lassen Sie Maus zu gehen oder laufen über eine Absorptionsschicht in einer geraden Linie in einer Start- und Landebahn von einem Ende zum anderen.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal mit jeder Maus mit frischen Absorptionslage.
    5. Den Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schritten in der Vorwärtsbewegung. Fügen Sie keine ersten und letzten paar Fußspuren, wo das Tier ist nur die Einleitung und Beendigung ihrer Sicht sind.

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Representative Results

Unter Verwendung der hier vorgestellten Verfahren, Komplexe von 50microgram fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid (FLO) und ~ 850microgram RVG-Peptid von 1:15 molaren Ladungsverhältnis: wurden (FLO Peptid) hergestellt und nur einmal durch Schwanzvene injiziert. Komplexe von nicht-neurotropen Rabies Virus Matrix (RVM) Peptid und FLO wurde als Lieferkontrolle verwendet. Am nächsten Tag, Mäuse Gehirn und Leber wurden isoliert und Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt. Die Zellen wurden unter dem Mikroskop für grüne Fluoreszenz beobachtet. FLO-RVG Komplex wurde erfolgreich mit einer kürzesten Zeit von einem Tag als grüne Fluoreszenz in den Gehirnzellen geliefert und detektiert wird, aber nicht in der Leber (2B, 2D), während RVM Peptid geliefert FLO in die Leber, aber nicht in den Gehirnzellen ( 2A, 2C).

Um miR-29 im Gehirn der Maus Antagomir gegen miR-29 wurden mit fünf LNA Modifikationen entwickelt Knockdown. Das Rührei, Targeting nicht-miRNA als Antagomir-con verwendet Folgetrol. Komplex von 50microgram Antagomir-Steuerung oder Antagomir-29 mit ~ 850microgram RVG Peptid wurde hergestellt und über eine 3-tägige Zeitverlauf durch Schwanzvene injiziert, gefolgt von täglichen Verhaltens-Assays, wie in Abbildung 1 gezeigt, um eine maximale Wirkung zu erzielen Zuschlags waren Komplexen einmal pro Tag für 3 aufeinanderfolgende Tage injiziert. Am vierten Tag wurden Verhaltenstests ohne Injektion durchgeführt. Maus-Bilanz-Analyse zeigte deutliche Verringerung der Schrittlänge Antagomir-29 RVG injizierten Mäusen (3A-3B). Hindlimb umklammern Assay Antagomir-29 RVG injizierten Mäusen zeigten deutlich ataktische Verhalten mit Neigung zu einem oder beiden Hinterbeine in Richtung des Bauches zurückzuziehen. In der Leiste Test Antagomir-29 RVG injizierten Mäusen zeigte, das Einfrieren oder die an der Ecke des Käfigs Schütteln Verhalten bei Verlust des Gleichgewichts. Mäuse wurden durch Injektion von Xylazinhydrochlorid (16milligram / kg) und Thiopental-Natrium (80milligram / kg) am vierten Tag (24 h nach der letzten Injektion des Komplexes) euthanasiert.Gehirnproben wurden verwendet, um molekulare und zelluläre Analyse durchzuführen. Gesamt-RNA aus Cortex, Cerebellum und Hippokampus gesammelt. Quantitative Echtzeit-PCR-Assay zeigten deutliche Reduktion der Expression beider Isoformen von miR-29, miR-29a (4A) und miR-29b (4B), in der Antagomir-29 RVG injizierten Mäusen Gehirnteile.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schema für die Mausschwanzveneninjektion und Verhalten.
Um miR-29 im Gehirn abzielen, Antagomir-Steuerung oder Antagomir-29 mit RVG Peptid wurde einmal täglich für 3 aufeinander folgenden Tagen durch Schwanzvene injiziert. Verhaltenstests wurden täglich nach einer 3 h Periode durchgeführt, damit die Maus, um von der Injektion zu erholen. Am vierten Tag nur Verhaltenstests wurden durchgeführt und die Mäuse wurden getötet und Hirngewebe wurde für Echtzeit-PCR und zellulären ass gesammeltays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. RVG Peptid liefert fluoreszenz speziell auf das Gehirn der Maus markierte Oligonukleotid.
Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Verfahrens wurden Komplex von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden (FLO) und Peptid RVG / RVM hergestellt und nur einmal durch die Schwanzvene injiziert. FLO-RVG-Komplex wurde als grüne Fluoreszenz in den Zellen des Gehirns nachgewiesen, aber nicht in der Leber (B, D) während RVM Peptid geliefert FLO in die Leber, aber nicht im Gehirn (A, C) 9. Klicken Sie hier eine zu vergrößern Version dieser Figur.


Abbildung 3. miR-29 knock down führt zu dem ataktischen Verhalten.
Maus-Footprint-Tests (A) am vierten Tag zeigten deutliche Reduzierung der Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schritten für die Maus mit Antagomir-29 (B) behandelt (**) p-Wert <0,001; n = 3 (Abbildung 9 modifiziert.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Antagomir-29 und RVG-Komplex herunterreguliert miR-29 in Maushirn.
Gesamt-RNA aus drei Gehirnteile gesammelt. Quantitative Echtzeit-PCR-Test wurde durchgeführt, um die Expressionsniveaus der beiden Isoformen von miR-29, miR-29a (A) und miR-29b (B) zu schätzen 9 modifiziert.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Name Sequenz Ladung Länge
RVG-Peptid- YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK
RASN-GGGG-rrrrrrrrr *
11 + 41
RVM-Peptid- MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA
PLD-GGGG-rrrrrrrrr *
11 + 40
Antagomir-Kontrolle (Rührei) 5 'A C CAA T CGAC C AA C 3' 14 - 14
Antagomir-29 5'-C AC T GA T TT C AAA GG T 3 ' 16 - 16
* ArginineReste am C-terminalen Ende der RVG und RVM Peptide sind in der D-Form.
LNA-modifizierten Basen in den Antagomir Sequenzen sind unterstrichen.

Tabelle 1. Sequenzen der Peptide und Antagomire

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vortex
Restrainer or Decapicone
Narrow runway ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls.
Reagents
Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) GE Healthcare Dharmacon INC D0016300120
10% sterile D-glucose
Antagomir-29 Exiqon custom synthesis
Antagomir-control Exiqon custom synthesis
Neuropeptide RVG G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Neuropeptide RVM G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Other
Cotton
Warm water
Insulin syringes
Absorbent sheets
Ink
Brush
Antiseptic

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References

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