Author Produced

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Suryawanshi, H., Sarangdhar, M. A., Vij, M., Roshan, R., Singh, V. P., Ganguli, M., Pillai, B. A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA. J. Vis. Exp. (106), e53307, doi:10.3791/53307 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

MikroRNA'lar, gen ekspresyonu ve hastalık dahil olmak için doğrudan kanıt düzenlenmesinde, evrensel rolüne yeni tedavi yaklaşımları olarak ortaya çıkmıştır. İlaç 1,2 hedef olarak MiRNA aktif olarak potansiyeli araştırılmaktadır. Dahası, miRNA ifade değişiklikler çeşitli hastalıkların 3 ve miRNA ifade yapay pertürbasyon bu değişikliklerin simülasyonu ile ilişkili hastalık tezahürü katılan hücresel yollar incelemek için kullanılabilir. MiRNA hedef ilaçların dokuya özgü dağıtım şu anda miRNA tabanlı ilaç gelişimi için önemli bir sorundur. Antagomirs ve miRNA taklit miRNA düzeyleri 4-6 perturbing için umut verici maddelerdir. Bununla birlikte, bunların özgüllük ve etkinliğini arttırmak vasıflar da MiRNA ekspresyonu in vivo olarak bir pertürbasyon için kullanılmadan önce antagomirs tasarımına dahil edilmesi gerekir.

MikroRNA'lar alakalı olan Şu anda tedavi edilemeyen nörodejeneratif ve nöro-gelişimsel hastalıklarda hedef olarak. Kan-beyin bariyeri beyindeki antagomirs teslim bir kısıtlama teşkil etmektedir. Stereotaksik enjeksiyonlar beyne 7 belirli yerlere molekülleri sağlamak için kemirgen modelleri kullanılmaktadır. Bu beceri, enstrümantasyon ve zamanla geniş yatırım gerektirir. Stereotaktik enjeksiyonları en azından ufak yaralanmalara neden, ameliyat dahil ve yerel teslimat sınırlıdır, invaziv bulunmaktadır. Hedefleme nöronlar için bir tercih hücre delici peptidler kullanımı trans-damar yoldan teslim edilebilir çünkü bu sınırlamaları karşı ancak kan beyin bariyerini ihlal edebilir. Kuduz virüsü glikoproteini (RVG) elde edilen bu tür bir peptid, daha önce farelerde 8 Japon Ensefaliti Virüs karşı siRNA teslim etmek için kullanılmıştır. Biz antagomir teslimat için peptid kullanarak, miRNA'lar etkin olarak fare beyninde 9 devrilen bulmuşlardır.

ontent "> miRNA ikinci büyük zorluk knock-down miRNA'lar küçük boyutu ve yakından ilişkili dizi izoformlarının varlığı ortaya çıkar. Biz üç yakından ilişkili izoformlannın oluşur-miR-29 MMU ailesi örnek almak, miR-29a Nükleik asitler (LNA'lar) bile termal stabilitesini arttırmak ve bir avantajı da kilitli, b ve c. Antagomirs ayrıca genel olarak stabiliteyi artırmak ve nükleazlar tarafından saldırılara karşı dirençli kılmak için omurgası boyunca modifiye edilir. üzerinde ve ötesinde bozunmasını hedef yol sterik engelleme 10. tüm omurga boyunca değişiklikler Tanıtımı etkili ama pahalı olabilir. Biz daha önce optimal sayıda ötesinde değişiklikler ayrıca etkinliğini artırmak olmayabilir gördük. antagomir tasarımı dolayısıyla antagomir optimal değişiklik içerir.

Karmaşık için antagomir kovalent olmayan nona-arginin uzantısı nörotropik peptid, bir yüklü hepta kullanılır. D-ArgininOnlar proteazlar tarafından bölünmesi kolay olan olmadığında daha yüksek stabilite kazandırabilir yana kalıntıları kullanılır. Nona-arginin uzanıyor hepta- ve hücre tipine spesifısitesi olmayan, ancak verimli hücre nüfuz etkenler olarak hareket etmektedir. Kovalent nona-arginin linker, bir nörotropik, hücre delici peptid oluşturulan için RVG peptid bağlayarak. Peptidin pozitif yüklü tortuları, kompleksler oluşturmak için, negatif yüklü nükleik asit omurgasıyla ilişki kurar etkileşim. Bu kompleksler, etkili bir şekilde kültürlenmiş hücrelere ve dokulara in vivo olarak DNA veya RNA transfekte etmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Hayvan konuları içeren tüm prosedürü Kurumsal Hayvanlar Etik Genomik Enstitüsü Komitesi (IAEC) ve Bütünleştirici Biyoloji, Yeni Delhi tarafından onaylanmış (IGIB / AEC / 10/2013). Bu protokol, spesifik olarak miR-29 beyin ve demonte olarak Antagomir-29 hedefli uygulama için ayarlanır.

1. Antagomir Tasarım Stratejisi

  1. MiRBase 11 olgun miRNA dizisi Al (http://www.mirbase.org/).
  2. MiRBase kaydında "Gen Aile" bağlantısını kullanarak ilgili miRNA aile üyelerinin dizileri Al
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Diziyi tamamlayacak Ters: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html için uygun bir araç sağlarKompleman dizileri ters.
  4. Aşağıdaki yönergeleri kullanarak LNA tarafından modifiye edilmesi pozisyonları işaretle:
    1. LNA pirimidinler pürin 12 daha stabil olduğu için, LNA değişiklik için 3-4 bazlar ayrı yerleştirildiğinde Timin artıkları seçin.
    2. Önceki adımı az beş değişiklikler üretiyor eğer 3-4 artıkları ile ayrılmış Cytosine artıklarını seçin.
    3. Bu tohum dizisini önler, çünkü antagomir 5 'ucuna beş değişiklikler öncelik.

2. Antagomir-nöropeptid Kompleks hazırlanması

Not: Bu protokolde en kritik adımdır ve standardizasyon ihtiyacı vardır. Herhangi bir floresan etiketli oligonükleotid (FLO) antagomir 9 yerine kullanılabilir protokolü standardize etmek. Peptidler yüksek saflıkta olmalıdır (HPLC derece,% 98 saflık) .Sequences ve peptit ve antagomir yük Tablo 1 'de verilmiştir.

  1. Mo sayısına kararantagomir les fare antagomir, toksisite ve ağırlığı molar ücret dayalı enjekte edilecek. Peptit: peptidin mol sayısını hesaplayın enjekte antagomir molar yük oranı dayalı olması.
    NOT: fare beyninde toksisite ve etkin verilme için bir peptit: antagomir molar yük oranı standart hale getirilmiştir. Standardizasyon peptid: floresan etiketli oligonükleotid farklı molar ücret oranları kullanın. Biz Antagomir-29 ve kontrol fare 4microgram / gram vücut ağırlığı toksik ikisi de bulundu. Antagomir-29 ve kontrol 2microgram / gram vücut ağırlığı kullanılmıştır, ancak bu etkili konsantrasyon, her microRNA için farklı muhtemeldir.
  2. Aşama 1 'de hesaplanan arzu edilen son konsantrasyona ve steril% 10 D-glükoz ile stok çözeltileri ayrı mikrofüj tüplerinde peptid ve antagomir seyreltilir.
  3. Orta girdaplama hızında bir girdap üzerindeki peptid solüsyonu ile mikrofuge'de tüp tutun.
  4. A 1/3 rd eklebir vorteks karıştırıcıda iyice karıştırıldı ise peptid solüsyonu tüpe ntagomir çözeltisi yavaş yavaş, damla damla.
  5. Bir sonraki 1 dakika boyunca vorteks çözümlerden karıştırmaya devam edin ve daha sonra karışım, 1 dakika boyunca bekletin.
  6. Aynı mikrofuge'de tüp peptid çözeltisi ile kalan antagomir çözüm karıştırmak için adım 4 ve 5 iki kez daha tekrarlayın. Yavaş ekleme, transfeksiyon etkili olan mono-dispers kompleksleri oluşumu açısından büyük önem taşımaktadır. Hızlı ilaveli kompleksleri ve çökelme topaklanmasına yol açar olabilir.
  7. Vorteks RT'de 30 dakika boyunca bir kompleks inkübe edin. Inkübasyon Bu süre boyunca, enjeksiyonlar yapılacaktır laboratuara fareler ACCLIMATIZE.

Antagomir-nöropeptid Kompleksi'nin 3. Kuyruk Ven Enjeksiyon

  1. Hayvan dizginlemek için, uygun büyüklükte bir süzgeç ya da decapicone fare yerleştirin.
  2. Pamuklu çubukla pr kullanarak kuyruk yüzeyini temizleyinE-batırılmış, sıcak su (yaklaşık 40 ° C). Bu vazodilatasyon teşvik etmek ve ven görünürlüğünü artıracak.
  3. 15-20 ° açıyla - (1.0 cc 0.5) insülin şırınga küçük bir hacme sahip kuyruk yaklaşın. Şırınganın içine herhangi bir hava tanıtmak için dikkatli olun. Kuyruk distal kısmında başlatın. Karmaşık enjekte edilir. İğneyi çıkarın ve herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon yerinde (yaklaşık 5-10 sn) doğrudan bir antiseptik bez uygulayın.
  4. Zenginlik olarak corncob ve kağıt mendil ile 3-5 grubundaki bir tek havalandırılan bir kafes içinde fare değiştirin. Aynı kafeste uninjected ve enjekte fareler tutmayınız.

4. Davranışsal Tahliller

Not: enjeksiyondan sonra iyileşme sağlamak için enjeksiyon ve davranışsal tahliller arasında 3-4 saat zaman aralığını tutun. Sessiz bir odada fare getirin. Alışma sürecinden bu dönemde hayvanların rahatsız etmeyin.

  1. Fareyi iklime alıştırmakYeni oda 30 dakika boyunca ve daha sonra da aşağıdaki davranış testleri başlar. Her bir davranış tahlilinde arasında 10 dakikalık bir boşluk bırakın.
  2. Arka bacak kopça:
    NOT: Bu test, motor disfonksiyon ve nörolojik bozukluğu gösterir.
    1. Net arka planda kuyruk yakın tabanını tutarak yavaşça fareyi kaldırın.
    2. 10-15 saniye hindlimb pozisyonunu kontrol edin. Bir fare ataksik zaman% 50'den fazla 13 süspansiyon haline karın yönelik bir veya her iki arka ayaklarının geri gelme eğilimi Yaban tip fare komponenti uzak karın arka ayaklarının.
    3. Kafes fare dönün
  3. Ledge testi:
    1. Kuyruk tutarak yavaşça kaldırın ve fareyi bir kafes çıkıntıya tutmak.
    2. Kafesin köşesinde özellikle fare gözlemleyin. Yabani tip fare korku ve dengesini kaybetmeden kolayca köşeleri geçebilir. Kafes çıkıntı boyunca ve köşelerde yürürken ataksik fare kendi denge, dondurma kaybetmek ya da sallıyor.
  4. NOT: Bu tahlil için dar bir pist katta hazır emici tabakanın tutmak (~ 70 cm uzunluğunda, ~ 5 cm genişliğinde ~ 5 cm yüksekliğinde duvarlarla.)
    1. Tek elle nazikçe fareyi tutun ve bir fırça ile arka bacaklarda mürekkep uygulayın.
    2. Dar bir pist katta emici yaprak yerleştirin.
    3. Fare yürümek ya da diğer bir ucundan bir pist düz bir çizgide bir emici tabaka üzerinde çalışmasına izin verir.
    4. Taze emici sayfasını kullanarak her fare ile sürecini iki kez daha tekrarlayın.
    5. Ileri hareketinde iki ardışık adımlar arasındaki mesafeyi ölçün. Hayvan sadece sırasıyla başlatılması ve koşmak bitirme nerede ilk ve son birkaç ayak izleri dahil etmeyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada yer alan prosedür kullanılarak, 50microgram floresan etiketli oligonükleotid (FLO) ve • 01:15 mol yük oranı 850microgram RVG peptid kompleksleri (FLO: peptid) hazırlanmış ve kuyruk damarı yoluyla sadece bir kez enjekte edilmiştir. Olmayan nörotropik Kuduz Virüsü Matrisi (RVM) peptid ve FLO komple bir besleme kontrol olarak kullanılmıştır. Bir sonraki gün, fareler, beyin ve karaciğer izole edildi ve tek hücre süspansiyonları hazırlandı. Hücreler, yeşil floresan mikroskop altında gözlendi. FLO-RVG kompleksinin başarılı bir değil RVM peptid karaciğer ancak beyin hücrelerindeki FLO teslim ederken, karaciğer (Şekil 2B, 2D) içindeki bir (beyin hücrelerindeki yeşil floresan gibi bir günlük kısa zaman teslim edilen ve tespit edildi Şekil 2A, 2C).

MiR-29 beş LNA değişikliklerle tasarlanmış karşı fare beyin antagomir içinde miR-29 demonte etmek. Bir Antagomir-con olarak kullanılan şifreli olmayan miRNA hedef dizisitrol. 50microgram Antagomir kontrollü veya Antagomir-29 en yüksek yok etme etkisi elde etmek için, şekil 1 'de gösterildiği gibi, ~ 850microgram RVG peptid günlük davranışı deneyleri ile hazırlanabilir, ardından ve 3 günlük süre boyunca, kuyruk damarından içinden enjekte edildi ile komplekslerin kompleks 3 Sürekli gün boyunca günde bir kez enjekte edilir. Dördüncü günde davranış testleri enjeksiyonu olmadan yapıldı. Fare ayak izi analizi farelerin (Şekil 3A-3B) enjekte Antagomir-29 RVG aşaması uzunluğunda belirgin bir azalma göstermiştir. Antagomir-29 RVG deneyini clasping hindlimb açıkça fareler enjekte karın doğru bir veya her iki arka ayaklarında geri eğilimi ile ataksik davranış gösterdi. Çıkıntı testinde Antagomir-29 RVG fareler enjekte dondurma veya kafesin köşesinde denge kaybı ile davranışını sallayarak gösterdi. Fareler ksilazin hidroklorür (16milligram / kg) ve dördüncü gün tiyopental sodyum (80milligram / kg) (kompleks son enjeksiyondan sonra 24 saat) bir enjeksiyonu vasıtasıyla boğuldu.Beyin örnekleri, moleküler ve hücresel analiz gerçekleştirmek için kullanıldı. Korteks, beyincik ve hipokampus toplanan toplam RNA. Kantitatif gerçek zamanlı PCR deneyi Antagomir-29 RVG farelerde beyin parçaları enjekte edilen, ekspresyon düzeylerinde miR-29, miR-29a (Şekil 4A) ve miR-29b (Şekil 4B) izoformlarının net azalma göstermiştir.

figür 1
Fare kuyruğu damar enjeksiyonu ve davranışları Şekil 1. Şema.
Beyinde miR-29 hedef için, RVG peptidi ile Antagomir-kontrol veya Antagomir-29 kuyruk damarlarının içerisinden doğru 3 gün boyunca günde bir kez enjekte edilmiştir. Davranışsal deneyler fare enjeksiyon kurtarmak için izin vermek için, bir 3 saatlik bir süre sonra, her gün uygulandı. Dördüncü günde, sadece bir davranış testleri yapılmıştır ve farelere ötenazi edildi ve beyin dokusu, gerçek zamanlı PCR ve hücresel eşek için toplandıays. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. RVG peptid floresan fare beyin spesifik oligonükleotid etiketli teslim eder.
Bu makalede açıklanan yöntem kullanılarak, kompleksin floresan markajlı oligonükleotidlerin (FLO) ve peptid RVG / RVM hazırlanabilir ve kuyruk damarı yoluyla sadece bir kez enjekte edilmiştir. FLO-RVG karmaşık ama değil karaciğer (B, D) beyin hücrelerinde yeşil floresan olarak tespit edildi RVM peptid karaciğer değil, beyin (A, C) 9. Için FLO teslim ederken bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.


Şekil 3. miR-29 ataksik davranışa yol açar yıkmak.
Dördüncü günde fare ayak izi deneyleri (A) Antagomir-29 (B) ile muamele edilmiş bir fare için birbirini takip eden iki kademe arasındaki mesafe açık bir azalma (**) p-değeri <0,001 göstermiştir; n = 3 (9 değiştirilmiş Şekil.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Antagomir-29 ve RVG kompleksi fare beyninde miR-29 aşağı düzenler.
Toplam RNA üç beyin bölgelerinden toplanan. Kantitatif gerçek zamanlı PCR deneyi miR-29, miR-29a (A) ve miR-29b izoformlarının her iki ekspresyon seviyelerini (B) hesaplamak için gerçekleştirilmiştir (9 değiştirilmiş Şekil.) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Isim Sekans Ücret Uzunluk
RVG peptit YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK
RASN-GGGG-rrrrrrrrr *
11 + 41
RVM peptit MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA
PLD-GGGG-rrrrrrrrr *
11 + 40
Antagomir kontrol (Pişmiş) 5 'A C CAA T CGAC C AA C 3' 14 - 14
Antagomir-29 5 'C AC T GA T AAA T GG 3 TT C' 16 - 16
* ArgininRVG ve RVM peptidlerinin C-terminal ucunda bulunan tortular D-şeklindedir.
Antagomir dizileri LNA modifiye bazlar altı çizilmiştir.

Peptit ve Antagomirs Tablo 1. Diziler

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vortex
Restrainer or Decapicone
Narrow runway ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls.
Reagents
Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) GE Healthcare Dharmacon INC D0016300120
10% sterile D-glucose
Antagomir-29 Exiqon custom synthesis
Antagomir-control Exiqon custom synthesis
Neuropeptide RVG G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Neuropeptide RVM G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. custom synthesis >98% purity
Other
Cotton
Warm water
Insulin syringes
Absorbent sheets
Ink
Brush
Antiseptic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
  2. Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
  3. Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
  4. Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
  5. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
  6. Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
  7. Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
  8. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  9. Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
  10. Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
  11. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
  12. Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
  13. Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
  14. Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
  15. Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
  16. Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics